CN117214369A - 一种检测磷酸奥司他韦干混悬剂有关物质的液相色谱方法 - Google Patents
一种检测磷酸奥司他韦干混悬剂有关物质的液相色谱方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于药物分析技术领域，提供了一种检测磷酸奥司他韦干混悬剂有关物质的液相色谱方法，该方法可同时分离样品中多种杂质，同时也可有效分离磷酸奥司他韦干混悬剂辅料中苯甲酸钠峰与杂质Ⅲ峰，并提高磷酸奥司他韦与杂质V分离度的方法，整体操作简便易行，普遍适用性较高，并能达到较高灵敏度，能更好地控制磷酸奥司他韦干混悬剂的产品质量。
Description
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种分析测定磷酸奥司他韦干混悬剂有关物质的液相色谱方法。
背景技术
磷酸奥司他韦，是一种治疗和预防成人及小儿（具体年龄因国家而异，有的包括新生儿）甲、乙型流感病毒感染的药物，它是口服神经氨酸酶抑制剂类药物，它能通过人体代谢为神经氨酸酶抑制剂(NI)，从而抑制新的病毒颗粒形成，减少其在人体内的传播，缓解流感症状。磷酸奥司他韦被我国推荐为治疗H1N1和H7N9流感的首选药物。目前已在美国、日本、欧洲、中国等多个国家和地区上市，上市剂型有胶囊、干混悬剂及糖浆剂等。
磷酸奥司他韦化学名为（3R，4R，5S）-4-乙酰氨基-5-氨基-3-（1-乙基丙氧基）-1-环己烯-1-羧酸乙酯磷酸盐，结构式如下：
。
磷酸奥司他韦干混悬剂除印度药典（IP）收载外，未被其他药典收载。目前各国药典收载的主要是磷酸奥司他韦原料、磷酸奥司他韦胶囊及磷酸奥司他韦小儿口服液，各药典标准中有关物质检测方法均为等度洗脱，流动相组成基本一致，仅比例略有差异。
磷酸奥司他韦干混悬剂中可见的杂质包括杂质I、杂质II、杂质III、杂质IV、杂质V、杂质VII，其结构如下所示。除此之外，磷酸奥司他韦干混悬剂辅料中还含有苯甲酸钠，在以上药典方法中苯甲酸钠与杂质Ⅲ依次出峰，苯甲酸钠峰与杂质Ⅲ峰无法达到有效的分离，且磷酸奥司他韦干混悬剂原料与辅料山梨醇中的残存的还原糖发生美拉德反应可以产生杂质V与杂质Ⅶ，其中的杂质V与主峰分离差，即现有技术均无法实现磷酸奥司他韦干混悬剂中多种杂质的有效同时分离。
。
因此，目前各国药典方法均不适用于磷酸奥司他韦干混悬剂有关物质的检查，也未检索到其他适用的公开的方法，所以研发一种适用于磷酸奥司他韦干混悬剂的有关物质检查方法非常有必要，以实现对磷酸奥司他韦干混悬剂的质量控制。
发明内容
为了解决目前技术问题，本发明提供了一种可同时分离样品中多种杂质的分析方法，该方法也可同时有效分离磷酸奥司他韦干混悬剂辅料中苯甲酸钠峰与杂质Ⅲ峰，并提高磷酸奥司他韦与杂质V分离度的方法，整体操作简便易行，普遍适用性较高，并能达到较高灵敏度，能更好地控制磷酸奥司他韦干混悬剂的产品质量。
本发明提供了一种检测磷酸奥司他韦干混悬剂中有关物质的液相色谱方法，包括以下步骤：
(1)系统适用性溶液的配制：取磷酸奥司他韦对照品及杂质Ⅰ对照品、杂质Ⅱ对照品、杂质Ⅲ对照品、杂质Ⅳ对照品、杂质Ⅴ对照品与杂质Ⅶ对照品各适量，加溶剂溶解并稀释制成系统适用性溶液；
(2) 供试品溶液的配制：取磷酸奥司他韦干混悬剂适量，用溶剂溶解并稀释制成供试品溶液；
(3)空白辅料溶液的配制：取磷酸奥司他韦干混悬剂空白辅料适量，用溶剂溶解并稀释制成空白辅料溶液；
(4)色谱试验：取系统适用性溶液、供试品溶液和空白辅料溶液各适量，注入液相色谱仪，记录色谱图；
其中，步骤(1)~(3)中所述溶剂为0.003mol/L磷酸溶液-甲醇-乙腈（620∶245∶135），步骤(4)中的色谱条件具体为：
检测器：紫外检测器；
色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，Inertsil C8 4.6mm×250mm 5μm或效能相当的色谱柱；
流动相：流动相A：磷酸二氢钾溶液，其浓度为0.02~0.07mol/L，优选0.05mol/L，用碱性试剂调节pH值至7.0~7.4，优选7.2，所述碱性试剂为氢氧化钾溶液，浓度为2mol/L~7mol/L，优选5mol/L；流动相B：甲醇：乙腈=345~145: 35~235，优选比例245:135；梯度洗脱，具体程序为：
；
流速：0.8～1.5ml/min，优选1.2ml/min；
柱温：40~50℃，优选45℃；
检测波长：200～220nm，优选207nm；
进样体积：75µl。
本发明进一步提供了一种检测磷酸奥司他韦干混悬剂中有关物质的相色谱方法，包括以下步骤：
(1)系统适用性溶液的配制：取杂质Ⅰ对照品、杂质Ⅱ对照品、杂质Ⅲ对照品、杂质Ⅳ对照品、杂质Ⅴ对照品、杂质Ⅶ对照品与磷酸奥司他韦对照品各适量，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含各杂质0.75μg与奥司他韦0.15mg的混合溶液；
(2) 供试品溶液的配制：取磷酸奥司他韦干混悬剂混悬液，精密称取适量（约相当于奥司他韦15mg；按测定每毫升重量，用于称样折算），置100ml量瓶中，加溶剂适量，超声振摇5分钟使磷酸奥司他韦溶解，放冷，用溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；
(3)空白辅料溶液的配制：取空白辅料混悬液约1.3g（或空白辅料细粉约0.25g），置50ml量瓶中，加溶剂约25ml，超声振摇5分钟使溶解，用溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为空白辅料溶液；
(4)色谱试验：取系统适用性溶液、供试品溶液和空白辅料溶液各适量，注入液相色谱仪，记录色谱图；
其中，步骤(1)~(3)中所述溶剂为0.003mol/L磷酸溶液-甲醇-乙腈（620∶245∶135），步骤(4)中的色谱条件具体为：
色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Inertsil C8 4.6mm×250mm 5μm或效能相当的色谱柱）；
流动相：流动相 A：0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（用5mol/L氢氧化钾溶液调节pH值至7.2）；流动相 B：甲醇-乙腈（245:135）；
梯度洗脱程序：
；
流速：1.2ml/min；
柱温：45℃；
检测波长：207nm；
进样体积：75µl。
本发明的有益技术效果为：
（1）本发明能同时分离杂质I、II、III、IV、V、VII多种杂质且分离度均良好，同时实现了磷酸奥司他韦干混悬剂中辅料峰苯甲酸钠峰与杂质Ⅲ峰的有效分离，并提高了磷酸奥司他韦峰与杂质Ⅴ峰的分离度。本发明所使用的检测方法，分离能力强，操作过程简单，专属性强，辅料峰不干扰检测，操作更方便，能够更有效地实现对产品生产过程环节的质量控制，提高最终产品品质，保证临床用药的安全有效。
（2）本发明具有很高的灵敏度，而且准确度高、重复性好、检测时间短，为产品研发和生产过程提供了更加简便、稳定、可靠的分析检测方法。
附图说明
图1为实施例1测试条件1与测试条件2柱温优化系统适用性色谱重叠图。
图2为实施例1测试条件2与测试条件3流动相及梯度优化色谱重叠局部放大图。
图3为实施例1测试条件3 供试品溶液色谱图。
图4为实施例1测试条件4系统适用性溶液色谱图。
图5为实施例1测试条件4供试品溶液色谱图。
图6为实施例1测试条件5系统适用性溶液色谱图。
图7为实施例1测试条件5供试品与空白辅料溶液色谱重叠图。
图8为实施例2灵敏度溶液色谱图。
图9为实施例3有关物质检查回收率试验重叠图。
图10为实施例4有关物质检查对照品溶液稳定性试验重叠图。
图11为实施例4有关物质检查供试品溶液稳定性试验重叠图。
图12为实施例5有关物质检查线性趋势图。
图13为实施例7有关物质检查重复性试验重叠图。
图14为实施例8有关物质检查耐用性试验系统适用性试验色谱图（色谱柱）。
图15为实施例8有关物质检查耐用性试验供试品溶液色谱图（色谱柱）。
图16为实施例8有关物质检查耐用性试验系统适用性试验色谱图（柱温）。
图17为实施例8有关物质检查耐用性试验供试品溶液色谱图（柱温）。
图18为实施例8有关物质检查耐用性试验系统适用性试验色谱图（pH值）。
图19为实施例8有关物质检查耐用性试验供试品溶液色谱图（pH值）。
具体实施方式
下面详细描述本发明的具体实施例，需要说明的是下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
仪器与试剂
仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪，紫外检测器。
试剂：磷酸二氢钾和氢氧化钾均为分析纯，甲醇和乙腈为色谱级。磷酸奥司他韦对照品为申请人采用磷酸奥司他韦原料进行自主标定，杂质对照品均为申请人外购。
系统适用性溶液的配制：取杂质Ⅰ对照品、杂质Ⅱ对照品、杂质Ⅲ对照品、杂质Ⅳ对照品、杂质Ⅴ对照品、杂质Ⅶ对照品与磷酸奥司他韦对照品各适量，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含各杂质0.75μg与奥司他韦0.15mg的混合溶液。
供试品溶液的配制：取磷酸奥司他韦干混悬剂混悬液，精密称取适量（约相当于奥司他韦15mg；按测定每毫升重量，用于称样折算），置100ml量瓶中，加溶剂适量，超声振摇5分钟使磷酸奥司他韦溶解，放冷，用溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
对照品溶液的配制：取磷酸奥司他韦对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含奥司他韦0.3μg的溶液。
空白辅料溶液的配制：取空白辅料混悬液约1.3g（或空白辅料细粉约0.25g），置50ml量瓶中，加溶剂约25ml，超声振摇5分钟使溶解，用溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为空白辅料溶液。
灵敏度溶液的配制：精密量取对照品溶液5ml，置20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
实施例1 色谱条件筛选
取仪器与试剂项下溶液进行检测分析。液相色谱条件：用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Inertsil C8-3，4.6mm×250mm，5μm或效能相当的色谱柱），流动相及柱温见表1，紫外检测波长207nm，流速1.2ml/min，进样量75μl，记录色谱图。
表1 磷酸奥司他韦干混悬剂有关物质检查色谱条件的选择
由表1色谱条件的筛选结果可知，测试条件5的色谱条件中磷酸奥司他韦峰与相邻杂质之间的分离度，杂质之间的分离度均符合要求，辅料峰不干扰有关物质检查，供试品溶液图谱中苯甲酸钠峰与杂质Ⅲ峰能达到基线分离。以测试条件5为最优选色谱条件进行下述方法验证试验。
实施例2 专属性试验
取磷酸奥司他韦对照品与各杂质对照品，按上述实施例1筛选所得的最优测定法进行测定。系统适用性试验结果见表2和图6，系统适用性溶液色谱图中系统适用性溶液色谱图中，杂质Ⅲ、杂质Ⅱ、杂质Ⅰ、杂质Ⅴ、奥司他韦、杂质Ⅳ与杂质Ⅶ依次出峰，各色谱峰之间的分离度均大于1.5，分离良好。取空白辅料溶液75µl，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见表2及图7，空白辅料在相对保留时间0.1之前、约0.17出峰，空白溶剂在相对保留时间约0.25出峰，与各已知杂质峰及主峰分离良好。取灵敏度溶液75µl，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见表3灵敏度试验，主成分峰峰高的信噪为32，大于10，结果见表3及图8。
表2 磷酸奥司他韦有关物质检查系统适用性试验结果
表3 磷酸奥司他韦有关物质检查空白干扰与灵敏度试验结果
实施例3 准确度试验
方法的准确度通过考察样品中加入不同量的杂质的准确度来实现的。考察各杂质的浓度包括定量限浓度、限度浓度的50%、限度浓度、限度浓度的150%。每个浓度重复3次，回收率平均值及相对标准偏差均符合要求，方法准确度良好，结果见表4~表9及图9。
准确度由测得量/加入量×100%计算所得。
表4 杂质III回收率试验结果
表5 杂质Ⅱ回收率试验结果
表6 杂质I回收率试验结果
表7 杂质Ⅳ回收率试验结果
表8 杂质Ⅴ回收率试验结果
表9 杂质VII回收率试验结果
实施例4 溶液稳定性试验
配制供试品溶液（按100%浓度加标）、对照品溶液，室温自然光下放置，分别于0、2、4、6、8、24小时时进样检测，与0小时比较，计算峰面积或杂质检出量的变化值。对照品溶液各时间点峰面积的RSD均小于5%，供试品溶液杂质III、杂质IV及总杂检出量变化值均小于10%，其余各杂质检出量变化值均小于20%，均未检出其他单个杂质，无大于报告限度的新色谱峰，符合接受标准，表明对照品溶液与供试品溶液在24小时内稳定性良好，结果见表10、表11以及图10、图11。
表10 磷酸奥司他韦有关物质检查对照品溶液稳定性试验结果
表11 磷酸奥司他韦有关物质检查供试品溶液稳定性试验结果
实施例5线性试验
方法的线性通过考察至少7个不同浓度溶液的线性来实现。以测得的峰面积对浓度作曲线，用最小二乘法计算回归方程、相关系数及截距，方法线性良好，结果见表12及图12。
表12 磷酸奥司他韦有关物质线性试验结果
实施例6 定量限与检测限试验
取磷酸奥司他韦及各杂质对照品各适量，用溶剂溶解并逐步稀释，摇匀，精密量取75μl注入液相色谱仪，至测得各成分峰的响应值约为噪音信号的10倍高和3倍高，即为相应成分的定量限和检测限。结果见表13、表14。
表13 磷酸奥司他韦有关物质检查定量限结果表
表14 磷酸奥司他韦有关物质检查检测限结果表
实施例7 精密度试验
通过方法重复性和中间精密度两项来进行精密度试验。方法重复性通过重复配制同一批100%浓度加标供试品溶液6次，按加校正因子的主成分外标法，并以空白溶液校正，根据各杂质的检出量，计算回收率，并计算6次测定结果的相对标准偏差；中间精密度通过不同的分析人员、在不同的日期、用不同的仪器来重复进行“方法重复性”验证；并且方法重复性和中间精密度的结果的相对偏差，符合要求。结果见表15及图13。
表15 磷酸奥司他韦有关物质检查精密度试验结果
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实施例8 耐用性试验
通过改变色谱柱品牌及批次、柱温、流动相A 的pH值，以考察方法的耐用程度。每次测试仅改变其中一个参数，其结果与不改变参数时的测定结果进行比较。与标准条件相比，改变色谱柱品牌及批次、柱温变化±5℃、流动相中缓冲盐pH值变化±0.2，空白辅料均不干扰有关物质检查，系统适用性试验均符合要求，各杂质检出量与标准条件相比变化值均小于0.1%，符合接受标准，表明这些条件下磷酸奥司他韦干混悬剂有关物质检查方法耐用性良好。结果见表16、表17及图14~图19。
表16 有关物质耐用性试验结果（系统适用性、空白辅料干扰）
注*：表示标准条件。
表17 有关物质耐用性试验结果（杂质检出量）
注：*表示标准条件。
Claims (10)
1.一种检测磷酸奥司他韦干混悬剂中有关物质的液相色谱方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)系统适用性溶液的配制：取磷酸奥司他韦对照品及杂质Ⅰ对照品、杂质Ⅱ对照品、杂质Ⅲ对照品、杂质Ⅳ对照品、杂质Ⅴ对照品与杂质Ⅶ对照品各适量，加溶剂溶解并稀释制成系统适用性溶液，各杂质结构如下所示：
；
(2)供试品溶液的配制：取磷酸奥司他韦干混悬剂适量，用溶剂溶解并稀释制成供试品溶液；
(3)空白辅料溶液的配制：取磷酸奥司他韦干混悬剂空白辅料适量，用溶剂溶解并稀释制成空白辅料溶液；
(4)色谱试验：取系统适用性溶液、供试品溶液和空白辅料溶液各适量，注入液相色谱仪，记录色谱图；
其中，步骤（4）中的色谱条件为：
色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
流动相：流动相A：磷酸二氢钾溶液；流动相B：甲醇-乙腈；梯度洗脱；梯度洗脱程序为：
。
2.根据权利要求1所述的检测磷酸奥司他韦干混悬剂中有关物质的液相色谱方法，其特征在于，色谱条件还包括：
检测器：紫外检测器；
流速：1.2ml/min；
柱温：40~50℃；
检测波长：207nm；
进样体积：75µl。
3.根据权利要求1所述的检测磷酸奥司他韦干混悬剂中有关物质的液相色谱方法，其特征在于，步骤（1）~（3）中所述溶剂为0.003mol/L磷酸溶液：甲醇：乙腈=620∶245∶135。
4.根据权利要求1所述的检测磷酸奥司他韦干混悬剂中有关物质的液相色谱方法，其特征在于，所述色谱柱为Inertsil C8 4.6mm×250mm 5μm或效能相当的色谱柱。
5.根据权利要求1所述的检测磷酸奥司他韦干混悬剂中有关物质的液相色谱方法，其特征在于，所述流动相A的浓度为0.05mol/L。
6.根据权利要求1所述的检测磷酸奥司他韦干混悬剂中有关物质的液相色谱方法，其特征在于，所述流动相A用碱性试剂调节pH值至7.0~7.4。
7.根据权利要求6所述的检测磷酸奥司他韦干混悬剂中有关物质的液相色谱方法，其特征在于，所述pH值为7.2。
8.根据权利要求6所述的检测磷酸奥司他韦干混悬剂中有关物质的液相色谱方法，其特征在于，所述碱性试剂为5mol/L氢氧化钾溶液。
9.根据权利要求1所述的检测磷酸奥司他韦干混悬剂中有关物质的液相色谱方法，其特征在于，所述流动相B中甲醇：乙腈=245:135。
10.根据权利要求2所述的检测磷酸奥司他韦干混悬剂中有关物质的液相色谱方法，其特征在于，所述柱温为45℃。
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