CN1170587C - 刺槐凝集素及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于医药方面的刺槐(Robinia pseudoacacia,RPA)凝集素,涉及分离的刺槐凝集素同聚多肽,涉及含有刺槐凝集素的组合物,涉及刺槐凝集素在制备用于减轻和/或治疗疾病之药物中的用途,涉及控制、减轻和/或治疗疾病的方法,还涉及含有刺槐凝集素的食物或食物添加剂。
Description
本发明涉及用于医药方面的刺槐(Robinia pseudoacacia,RPA)凝集素,涉及分离的刺槐凝集素同聚多肽,涉及含有刺槐凝集素的组合物,涉及刺槐凝集素在制备用于减轻和/或治疗疾病之药物中的用途,涉及控制、减轻和/或治疗疾病的方法,还涉及含有刺槐凝集素的食物或食物添加剂。
凝集素是具有识别特异性复合糖结构特征的蛋白质或糖蛋白(Pusztai,1991)。一些口服的凝集素能抵抗胃内的消化并保持完整地到达肠内。在肠内,凝集素可附着到在各种肠粘膜细胞表面表达的碳水化合物结构上(Pusztai等,1995)。凝集素附着肠细胞的结果各异。例如,生物学反应依赖于给药剂量。高剂量时,菜豆凝集素(PHA)会引起上皮细胞绒毛可逆性结构破坏。这种结构破坏可被内源过程迅速修复。同样,小肠内大量PHA的存在会引起内源大肠杆菌(Escherichia coli)过度生长。此外,还会增加脂动员和葡萄糖氧化并降低骨骼肌中蛋白质合成。然而,PHA为低剂量时,可观察到隐窝细胞形成速率增加,导致肠增生性生长(Bardocz等,1995),但没有高剂量时发生的损伤作用。
刺槐(Robinia pseudoacacia)(洋槐)是北美和中欧常见的一种豆科树种。刺槐的树皮、根、根瘤、韧皮部、木质部(wood)和叶(Geitl和Ziegler,1980)以及种子(Van Damme等,1995b)产生凝集素。尽管这些凝集素的确切功能未知,但是人们认为,这些凝集素可能用作休眠期的氮源储备(Yoshida等,1994)。还已知树皮内的凝集素水平在冬天期间增加。由于已知刺槐属凝集素对哺乳动物有毒(Nishiguchi等,1997),树皮凝集素也有可能充当一种在冬天抵抗草食动物如野兔的防卫机制。
人们已经在生化和分子水平描述了刺槐树皮和种子凝集素的特性(Van Damme等,1995a,1995b)。根凝集素也已得到分离和特性描述(Duverger等,1997)。刺槐凝集素(主要来自种子)已有许多用途,主要用作诊断和研究工具。RPA的特异碳水化合物(N-乙酰-D-半乳糖胺)结合性质已被用于研究生物组织的碳水化合物组成(Raedler等,1982)。RPA的促有丝分裂特性也已被用于体外研究分离的淋巴细胞的生物学性质(Sabeur等,1986;Sharif等,1978 & 1977)。Banach等(1983)显示小鼠RPA腹腔内给药导致了肝毒性作用,包括肝糖原迅速降低。Pusztai(1993)也显示在高剂量时RPA强烈结合大鼠肠壁并导致胰腺生长,提示RPA可能破坏肠壁,促使大肠菌过度生长,并引起胰腺炎。
来源于刺槐树皮的凝集素可用一系列凝胶分离、DNA和蛋白质序列测定技术进行特性分析(Van Damme等,1995a)。从柱上洗脱下来的天然树皮凝集素包括两种凝集素:RPbAI和RPbAII,它们在表观分子量大约120kDa共纯化。SDS PAGE胶分析表明RPbAI由两个亚基组成:多肽a和多肽b,分子量分别为31.5kDa和29kDa。RPbAI是四聚体,由a、b多肽单体所有可能的组合方式组成。多肽a和b已进一步用标准cDNA克隆和测序技术进行了特性分析。多肽a和b的预测蛋白质序列见图1。
RPbAII是四聚体,由单一的分子量26kDa的单体多肽(亚基)c组成。对多肽c做了进一步特性分析,所测cDNA和预测的蛋白质序列也见图1。
刺槐种子含有两种凝集素:RPsAI和RPsAII,它们在表观分子量大约120kDa共纯化(Van Damme等,1995b)。两种凝集素的SDSPAGE胶分析表明,每种凝集素都是由单一的单体亚基组成(分别为34和29kDa)。已用cDNA克隆和测序技术对种子凝集素进行了特性分析,预测的蛋白质序列见图2。最近发表的关于根凝集素的工作显示,它们包含两种凝集素(Duverger等,1997)。根凝集素看来与种子和树皮凝集素不同:它们是二聚体分子,分为RPrAI和RPrAII,其分子量分别为58和63kDa。RPrAI是由一个31kDa的亚基和一个29kDa的亚基组成的异型二聚体。RPrAII是由单一的30kDa亚基组成的同型二聚体。
对刺槐凝集素的研究产生了一些关于各种凝集素的准确分子量和亚基组成的混乱。Wantyghem等(1986)在种子中鉴定了两种凝集素:二聚体的RPA1和四聚体的RPA3。然而,同年Fleischmann等(1986)描述了称为RPA1和RPA2的两种四聚体凝集素的分离,二者具有相似的亚基分子量。因此,这些凝集素似乎可以以单体、二聚体、三聚体和四聚体的形式存在。
粘膜由粘膜细胞组成,是衬在生物体许多管状结构和腔内的潮湿膜。它们包括肠、口腔、鼻通道、食管、胃、肺、小肠和大肠(包括直肠)的粘膜层。长期以来人们已认识到粘膜对生物体生存的重要性,但控制粘膜和非粘膜细胞增生的能力以前从未被认为是说明许多生理问题(包括患病和损伤细胞和/或组织)的机会。粘膜细胞的许多疾病都是已知的,包括细胞分裂加速、减速的疾病,粘膜细胞受到损伤或失去保护性外层例如粘膜的疾病。与粘膜细胞增殖失控有关的疾病包括皮肤癌、牛皮癣、易激性肠综合征、炎性疾病和粘膜炎。
粘膜炎是一种痛苦的消耗性疾病,在该疾病中迅速生长的上皮和粘膜细胞受到损伤,外层粘膜层被除去和/或不能被迅速取代。粘膜炎可导致微生物感染,所述微生物存在于例如口腔或肠道中。在本文中,粘膜炎覆盖所有肠道病变(可能是粘膜损伤的后果)。这种疾病被认为是癌症治疗的主要副作用。粘膜炎的发病率和严重程度可随癌症治疗轮次的增加而增加,并最终影响患者治疗的顺应性和存活率。本发明提供的技术方案利用了凝集素对生物学材料的组织保护性和代谢影响。
病变细胞和损伤细胞不能足够迅速地修复或再生,会导致严重并潜在威胁生命的健康危险。代谢性疾病,如肥胖、高血糖症、心血管疾病、中风和胃肠道疾病(包括肠易激综合症,炎性肠病和腹腔疾病),也是维持正常细胞功能的问题。
细胞和组织的患病和损伤有各种各样的原因。引起细胞损伤的因素包括:化疗试剂,放射疗法,化学品(有机的或无机的),毒素,酸,碱,放射源,自由基以及在试图治疗另一更有问题的疾病时进行外科手术或治疗引起的损伤。癌症治疗是作为其它操作的副作用而引起有机体细胞和/或组织损伤的一个最佳实例。癌症治疗主要基于单独、同时或联合外科手术使用化疗或放疗。化疗使用细胞毒性剂直接破坏靶细胞的DNA。如果向靶组织即肿瘤施用了足够剂量的细胞毒性剂,DNA的错误修复可导致DNA突变、损伤和染色体畸变的积累并最终导致细胞死亡。放疗使用辐射直接损伤靶细胞DNA,或利用电离辐射产生能断裂DNA链之自由基的潜能(Steel,1996)。因此,化疗或放疗的使用是通过导向辐射最大程度损伤癌细胞同时避免无可挽回地破坏正常组织的折衷。
尽管放疗和化疗是最广泛使用的癌症治疗手段,但由于多种因素存活率有限。关键因素是细胞毒性药物或辐射不能区分正常组织和癌症组织。在大多数情况下,不可能提供足够剂量的细胞毒性药物或辐射以可靠地杀死所有癌组织,因为所述剂量对于患者也是致死性的。现有治疗方案共有的副作用包括头发脱落、骨髓抑制、恶心、呕吐和腹泻(Paulsen等,1996)。另外,在将放疗用于特别是骨盆区的情况下,还会导致胃肠功能发生改变(Yeoh等,1993),并会对肠造成长期损伤,从而需要进行外科手术(van Halteren等,1993)。
在过去10年里,利用造血生长因子已取得了重要的突破。现在可以施用较高剂量的细胞毒性药物,然后通过施用重组生长因子例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子拯救组织例如骨髓和白细胞(Erkisis等,1996)。所述方法能改善预后和期望达到的存活率。尽管表皮特异性生长因子例如表皮生长因子是已知的,但是肠生长调节的复杂性使得很难开发有效的肠“拯救”方法(Podolsky,1993)。由于目前没有用于肠的这类生长因子,细胞毒性药物和辐射给胃肠道造成的损伤现在已成为剂量限制。
本发明通过提供一种有效的新产品及其用途,使得生物学材料能够有效而受控制地生长,从而克服了此领域的问题。
因此,本发明的第一个方面是提供用于医药领域的刺槐凝集素。其医药用途是广泛的,包括控制粘膜细胞增殖,减轻和/或治疗因细胞损伤剂引起的损伤,减轻和/或治疗代谢性疾病,或其两种或多种情况的组合。在本文中,“减轻”指减轻任何损伤或医学疾病至任何程度的任何效果,包括预防(预防性用途)。在本文中,“治疗”指失调、疾病、综合征、病症、疼痛或其两种或多种组合情况的任何缓解。本发明的治疗(或组合物的使用)可在其它治疗如化疗和/或放疗期间进行。
就减轻和/或治疗粘膜炎(包括肠道损伤)而言,刺槐凝集素用于控制粘膜细胞增殖是特别有用的。控制粘膜细胞增殖对减轻和/或治疗细胞损伤剂引起的损伤特别有用。本发明所有方面涉及的典型细胞损伤剂包括放疗、化疗或其组合。在本申请中,术语“辐射”和“放疗”具有相同的含义,它是一种用作治疗技术或否的辐射源。
本发明特别适用于减轻和/或治疗哺乳动物组织、尤其是人组织的损伤。本发明对人组织尤其重要,因为在癌症治疗过程中需要相当多的放疗和/或化疗。然而,本发明也可用于其它动物和生物学材料,尤其是兽医业,包括畜牧动物和宠物。
刺槐在医学中的用途涉及所有细胞和/或组织,包括整个肌体内的细胞和组织以及整个肌体外的细胞和组织,包括分离的细胞和组织。刺槐涉及所有生物学材料,包括整个肌体及其部分。本发明还涉及故意地或非故意地接触过任何细胞损伤剂的材料。
本发明特别用于对细胞损伤剂如放疗和/或化疗剂特别敏感的生物学材料。这些生物学材料包括粘膜,特别是肠、口腔、鼻通道、食管、胃、肺、小肠、大肠(包括结肠和直肠)、上皮组织(如覆盖眼睛的)的粘膜层以及任何其他粘膜细胞和/或组织,还包括非粘膜细胞和组织如骨髓、脾、所有造血细胞、血液组织、胸腺、生发组织、眼组织、生殖道、睾丸/前列腺组织或其两种或多种的组合。本发明尤其与衬在体内中空结构内的粘膜层相关,包括衬在眼内的永远潮湿的组织。细胞和组织对细胞损伤剂的敏感性与其代谢状态有关。在施用细胞损伤剂之前、过程中和/或之后,刺槐凝集素的生长因子作用、特别是对肠(特别是小肠)的作用被认为是对预防和/或治疗效果非常重要的。
刺槐凝集素在放疗、化疗或其组合治疗前、过程中和/或之后对控制粘膜细胞增殖特别有效。本发明是由于凝集素的保护和修复能力而达到目的的。
粘膜细胞是组成任何粘膜(衬在许多管状结构和腔中的湿膜)的细胞。它们中的许多在动物的外界环境和内部器官之间提供一个保护层。粘膜细胞/组织包括肠、口腔、鼻通道、食管、胃、肺、小肠、大肠、上皮组织、生殖道和其它器官的粘膜层。本发明的第一个方面涉及所有这些粘膜细胞/组织。本发明第一个方面涉及的其它细胞和组织包括:骨髓、脾、造血细胞、血液组织、胸腺、生发组织、眼组织、生殖道、睾丸/前列腺组织和其两种或多种的组合。
根据本发明,刺槐凝集素在医学中的使用可与细胞保护剂联合。所述细胞保护剂优选放射致敏剂、化学保护剂(包括自由基清除剂)、生长因子或其两种或多种物质的组合。在上述细胞保护剂名单中,下列物质是优选的:放射致敏剂-维生素K模拟剂例如磷钠甲萘醌或亚硫酸氢钠甲萘醌,texaphyrin钆配合物或碘苄胍(([[3-碘-13311)苯基]甲基]胍);化学保护剂-Sulcraphate,半胱氨酸,巯基乙胺,Ethyol,balazipone或多司马酯;自由基清除剂-WR3689(磷酸二氢2-[[3-甲基氨基)丙基]氨基]乙二醇酯,AD20(2-[[2-甲氧基苯基)乙酰]氨基]-2-丙烯酸或硝基氧抗氧化剂;生长因子-粒细胞集落刺激因子(G-CSF),粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF),促红细胞生成素(EPO),表皮生长因子(EGF),角质细胞生长因子(KGF),转化生长因子(TGFα和β),任何种类的白细胞介素包括IL-11和IL-15,胰岛素样生长因子(IGF),神经生长因子(NGF),血小板衍生的生长因子(PDGR),铃蟾肽,松弛素,降钙素,初乳衍生的生长因子(CDGF),氨氯地平或amoxanox,protegrin,盐酸匹鲁卡品,干细胞因子(STF),血小板生成素,青灰因子(SF),任何一种干扰素,包括干扰素α,或任何一种细胞因子。
除细胞保护剂外,刺槐凝集素还可与一种或一种以上其它化合物/试剂(优选药物)联用。具体地讲,可包含抗微生物剂。可包含所述试剂以抵抗继发感染,例如与粘膜炎有关联的继发感染。
就胃肠道细胞(用于减轻和修复损伤)和代谢性疾病而言,刺槐凝集素在医学中的用途是特别有用的。所述控制可以是为了胃肠道的功能和/或长度的提高或为了控制胃肠-细胞表达的表面糖蛋白的性质和/或密度。在控制粘膜细胞增殖方面的其他用途包括减轻和/或治疗肠疾病如炎性肠疾病和易激性肠综合征以及减轻和/或治疗肠损伤,及在放疗、化疗或其两种或多种组合治疗前、过程中或之后修复和替换粘膜细胞。
这些控制特征的应用包括:
(a)肠细胞增殖导致功能肠面积和长度增加,这对于例如因外科手术或事故引起的肠功能损伤是一种有用的治疗,和/或
(b)控制肠细胞更新率,这样可以控制被表达的表面糖结合物的性质和密度,因为这些会随着细胞老化而逐渐变得更复杂。由于糖结合物影响特定的肠特性,例如细菌附着的倾向,因此,可设想将凝集素施用作为对这些特性的治疗或预防性控制。
具体地说,可将细胞增殖的控制用于使小肠营养能力提高和/或控制肠细胞的糖结合物表达。所述作用不必是对医学疾病,除了令人满意的医学方面外,可以仅仅是在美容性或功能性方面。
这些作用对刺槐凝集素用于减轻和/或治疗代谢性疾病也可能很有用。
代谢性疾病包括任何与身体代谢和/或是代谢结果有关的疾病,具体地说是肥胖和与肥胖有关疾病如高血糖(II型糖尿病)、心血管疾病、中风、胃肠和胃肠相关的疾病。代谢性疾病可能需要控制粘膜细胞的增殖,或者粘膜细胞增殖的控制可能与代谢性疾病无关。还包括非医学性的纯粹美容的减肥。
根据本发明,凝集素浓度越高,就可以更快地减轻和/或治疗任何医学疾病或其它非医学症状。但是,正如本文所讨论的,各方面因素可能影响凝集素剂量的优选浓度。
本发明中刺槐凝集素可以是在天然组合物中的或从中纯化的凝集素、化学合成的或通过重组技术产生的凝集素。该凝集素可以是修饰的凝集素或衍生物(天然或合成的)。用于生产凝集素的方法是本领域已知的,所述生产方法包括从天然来源中纯化凝集素或用重组技术生产凝集素(Pusztai and Palmer,1977;Carvalho,1993以及美国专利4889842)。本发明凝集素优选为“最初”分离的刺槐凝集素在功能上的等同物。任何刺槐凝集素的功能均可根据其附着特异糖结合物结构的能力而确定。最优选的是,如果一种多肽是任何已知刺槐凝集素的等同物(或下文定义的凝集素变体),即在氨基酸水平或DNA序列水平有40%,优选50%,优选60%,更优选70%,最优80%或更高相同性,则该多肽就是本发明的刺槐凝集素,例如与图1或2所列凝集素相比。
本文所述“凝集素变体”是指与天然凝集素基本上同源、但因一个或多个缺失、插入或替换而与天然凝集素(人、鼠或其它哺乳类物种)氨基酸序列不同的多肽。变体氨基酸序列优选与天然凝集素氨基酸序列至少80%相同,最佳至少90%相同。相同性百分比可通过例如用Devereux等(Nucl.Acids Res.12:387,1984)描述的GAP计算机程序6.0版比较序列信息而确定。GAP程序可从威斯康星大学遗传学计算机研究组(UWGCG)得到。GAP程序采用Needleman和Wunsch(J.MoL BioL 48:443,1970)提出、Smith和Waterman(Adv.Appl.Math 2:482,1981)修改的对齐方式。
因为凝集素是蛋白质,许多参数例如热、酸、碱等,可明显地将其去稳定/变性。由于凝集素在本发明(整个)中的用途需要其蛋白质特性,因此在凝集素使用前或使用过程中(例如在胃的强酸条件和下段小肠的温和碱性条件下),所述凝集素不会被完全破坏或变性是很重要的。因此,首先需就用于本发明的刺槐凝集素在加工和/或施用过程中如何受到影响来表征所述凝集素。所述表征是标准技术,而且任何本领域技术人员可以很容易完成。如果凝集素已经经任何方法被变性或去稳定,则本发明任何方面所需的凝集素的浓度就会发生变化。
本文已提供的刺槐凝集素的浓度是以其没有通过变性或去稳定有效降低其活性的天然特性为基础的。因此,所提供的凝集素的浓度不是绝对的,但反映了凝集素的活性。因此,其凝集素活性降低了一半但浓度加倍了的组合物与凝集素的量降低了一半但凝集素活性未改变的组合物是相同的。此外,例如通过在重组生产中的修饰和/或通过生产活性已提高的截短突变体,可以提高任何凝集素的活性。有关凝集素浓度对活性的考虑也同样适用于活性提高了的凝集素。所有修饰的刺槐凝集素或其衍生物均被本发明所覆盖,包括活性提高或降低的凝集素,还包括例如截短凝集素亚基和/或具有全部或修饰活性的不同糖基化的凝集素。本发明还包括含有任何凝集素之生物活性所涉及的一个或多个关键氨基酸(优选所有这些氨基酸和所有生物活性)的蛋白质序列。例如Nishiguchi等1997描述的RPA多肽b序列的活性区域,包括如下(氨基酸:位置):天冬氨酸:87,苯丙氨酸:130,苏氨酸215,亮氨酸:217,丝氨酸:218。
本发明第一方面的刺槐凝集素可以来源于刺槐植物的任何部分,优选树皮、种子、根、根瘤、韧皮部、木质部或其两种或多种情况的组合;或者是上述凝集素的等同物。根据本发明,刺槐凝集素可以包含仅一种多肽亚基。所述多肽亚基可以是本领域任何已知任何多肽亚基(如RPbAI(a或b)、RPbAII(c)、RPsAI或RPsAII、RPrAI或RPrAII)或其等同物,或者是还没有鉴定的多肽亚基。优选地,本发明第一方面的刺槐凝集素包含亚基的单体、二聚体、三聚体或四聚体或其两种或多种的组合。这里允许模拟天然存在的多肽组合。所述单体、二聚体、三聚体和四聚体可由同种或一种以上聚合亚基组成。四聚体优选由四个树皮多肽a亚基,四个树皮多肽b亚基或a、b亚基的中间混合物组成。所述凝集素多肽可包含或相应于图1或图2列出的一种或多种氨基酸序列,优选至少40、50、60、70、80、90、100%同源(如上所述凝集素变体)。
本发明的第二方面提供了分离的同型四聚体、同型三聚体、同型二聚体或单亚基刺槐凝集素,优选纯化至60%或更高水平。本文中,“纯化的”是指基本上无杂质。在药物组合物和医学中的应用优选此纯度的凝集素。刺槐凝集素优选纯化至70%,80%,90%或更高水平,最佳为95%,99%或100%。上述本发明第一方面的优选特征也适用于本发明的第二方面。
本发明的第三方面提供了包含优选纯度60%(优选70,80,90,95或100%)的刺槐凝集素或者根据本发明第二方面的RPA凝集素并结合可药用赋形剂的组合物。优选地,此组合物是一种包含可药用赋形剂的药物组合物。适宜的赋形剂包括药物级淀粉、明胶、油、糖、乙醇或水(优选无菌)。此组合物可以是一种混合给药制剂,或为同时、分开或依次使用(或给药)的组合制品。在组合制品中,所述凝集素和任何其它成分可分开、以任何顺序给药。上述本发明第一和第二方面的特征和优选特征也适用于本发明第三方面。特别地,如上文所述,此组合物可由刺槐凝集素联合细胞保护剂组成。
本发明第四方面提供了制备根据本发明第三方面之组合物的方法,所述方法包括将所述凝集素与可药用赋形剂混合。第四方面的优选特征同第一到第三方面所述。
本发明第五方面提供了刺槐凝集素在制备药物中的用途,所述药物用于控制粘膜细胞增殖、减轻和/或治疗细胞损伤剂造成的损伤、减轻和/或治疗代谢性疾病或其组合。本发明第一至第四方面的特征和优选特征也适用于第五方面。
本发明第六方面提供了在需要的患者中控制粘膜细胞增殖、减轻和/或治疗细胞损伤剂造成的损伤、减轻和/或治疗代谢性疾病或其组合的治疗方法,所述方法包括给患者施用有效量的刺槐凝集素。本发明第一至第五方面的特征和优选特征也适用于第六方面。具体地,将要、正在或已经经历放疗和/或化疗的尤其是正患有癌症的患者被认为需要这种方法的治疗。
本发明第七方面提供了含有刺槐凝集素的食物或食物添加剂。所述食物和/或食物添加剂具有本发明第一方面的用途。所述食物和/或食物添加剂可有助于非医学目的的体重减轻。所述食物和/或食物添加剂适用于任何动物,包括人。
根据本发明第七方面的食物或食物添加剂优选用于2到5天的期间,或一个不确定(长期)期间。上述本发明第一至第六方面的特征也适用于第七方面。所述食物或食物添加剂优选含有总量达0.3g/kg体重/天、优选0.2g/kg体重/天的凝集素。所述凝集素至少一些应来自于刺槐(优选占此食物或食物添加剂凝集素含量的1%至100%)。如上所述,刺槐凝集素可以是本发明第一方面的任何一种凝集素,或者其两种或多种凝集素的组合。这种食物或食物添加剂在医学中,尤其在控制粘膜细胞增殖、减轻和/或治疗细胞损伤剂造成的损伤、减轻和/或治疗代谢性疾病、或以上两种或多种方面的组合中非常有用。
在接着供给一段时期的高质量食物时,本发明第七方面的食物和/或食物添加剂是特别有用的。根据本发明,可将高质量食物定义为可提供动物正常生长所需的所有必需蛋白质、脂肪、碳水化合物、矿物质和维生素的食物。高质量食物的必需成分优选是最佳比例的。高质量食物不应含有会延缓或抑制动物生长发育的任何成分。高质量食物的优选特征是被摄入的食物可完全转化成瘦体重。
在本发明第七方面的凝集素食物和/或食物添加剂后,优选立即或相隔很短的时间(最多2天)就继续供给所述高质量食物。所述高质量食物对于达7天的期间来说是最有用的,对于达5天的期间也是有利的。所述食物和/或食物添加剂还可用于长期(一个月以上,优选一年以上)治疗代谢性疾病和美容目的的体重减轻。
当与细胞损伤剂联用时(尽管不需同时给药),最好将饮食中供给凝集素的部分限于达5天的时间,因为48-72小时通常不足以完成一个完整的肠更新循环并由此在所述食物的控制供食部分产生较高的营养吸收和利用率。最好将所述循环的高质量供食部分限于约5天的时间以便对食物转化效率产生最大的提高。
优选将包括供给刺槐凝集素时期、然后是供给高质量食物时期的食物和/或食物添加剂重复至少两次以形成周期性的饮食。可将所述饮食周期重复达20次,优选达10次,最佳达6次。
所述周期性的饮食提供了由刺槐凝集素施用介导的暂时的营养摄入效率增加。因此,含凝集素和不含凝集素食物的周期性供给,可使营养依赖性状态提高。例如,通过适宜食物的定时供给,运动员可优化主要项目的运动能力。
在用辐射和/或化疗进行治疗前或之后,本发明第七方面的食物和/或食物添加剂是特别有用的。在这种情形中,当与细胞保护剂,例如本发明第一方面所述的那些联用时,所述食物甚至更有效。第一至第六方面的特征和优选特征也可适用于第七方面。
本发明第八方面提供了制备上述本发明第二、第四和第七方面的产品的方法。根据本发明第二方面的纯化凝集素的制备包括从刺槐(例如从植物或组织培养物)中分离和纯化刺槐凝集素,或者合成制备(如通过重组技术)。根据第四方面的组合物的制备包括结合所述凝集素和用于该组合物的任何一种或多种成分。所述食物和/或食物添加剂的制备包括刺槐凝集素的获得和选择性地与用于食物和/或食物添加剂的任何一种或多种成分结合。本发明一至七方面的优选特征也适用于第八方面。
对于可能涉及医学或给生物学组织给药的本发明每一方面,具体剂量方案由主治医生最终确定并考虑下列因素,例如所使用的凝集素、动物类型、年龄、体重、症状严重程度和/或正在或将施用的治疗方法的严重性、给药方法、不利反应和/或其它禁忌症等。具体确定的剂量范围可根据被完全监测之患者的疾病发展和恢复情况,通过标准设计的临床试验来确定。所述试验可使用逐步升高的剂量方案,所述方案以动物中最大耐受剂量的低百分数作为人中的开始剂量。可以从在本文试验部分给出的结果并通过已经外推至人的下列范围得出有关剂量范围的初步指导。
适宜的上限可以是高达约0.3g/kg体重/天的凝集素浓度。0.3g/kg体重/天的浓度可能会使患者发生胃肠道不适,但对于所述患者从疾病例如癌症中存活下来的机会提高来说,这些症状是可接受的。适宜的下限可以是0.0001mg(0.1μg)/kg体重/天左右的凝集素。优选的中间剂量浓度包括存在高达约0.2g、0.15g和0.05g/kg体重/天的凝集素,此后,存在浓度约1mg、0.5mg、0.1mg、0.01mg和0.005mg/kg体重/天的凝集素。
本发明所有方面的药物均可用于提供在每天的一次或多次“摄取”(“摄取”包括任何形式的给药并描述剂量单位)中所需的凝集素浓度。本发明的某些方面适于一次摄入高浓度凝集素,而其他方面适于在同一时期内以均匀的或不均匀的间隔多次摄入,但是每次摄入较低浓度的凝集素。
可将用于本发明任何药物(包括药物的制备)的凝集素与适宜的药物载体和/或赋形剂结合。所述载体和赋形剂是本领域熟知的(例如药物赋形剂手册(Handbook of PharmaceuticalExcipients)(1994)第二版,A.Wade/P.J.Weller编,药物出版社,美国药物协会(The Pharmaceutical Press,American PharmaceuticalAssociation))。根据本发明,特别有用的是使用以结肠药物传递系统、漱口剂、乳膏剂、糊剂或胶囊剂配制的组合物和/或药物。
根据本发明任何方面制备的药物,尽管也可以将药物通过胃肠外途径或静脉内途径给药,但优选通过口、鼻(如通过鼻内喷雾)或直肠(对于消化道的一个或多个部分的方便的途径)给药。
现在通过如下实施例来说明本发明。
实施例
从刺槐树皮制备凝集素
刺槐属树皮凝集素可基本上按Van Damme等(1995a)所述从固定化胎球蛋白上的部分纯化的树皮提取物中制备。
将树皮组织用混和器在含有200mg/l抗坏血酸的20mM乙酸(10ml/g鲜重)中匀浆。匀浆液通过粗棉布(cheesecloth)榨出,(用1MNaOH)调节pH值至5.0,于10,000g离心10分钟。所得上清液通过玻璃棉过滤去除漂浮颗粒。提取物中加1.5g/l CaCl2后,(用1MNaOH)调节pH值至9.0,放置在4℃过夜。离心除去所得沉淀,澄清的提取物用1M HCl调节pH值至3.8。再次于4℃放置过夜后,将提取物离心澄清,用1M NaOH调节pH值至7.0,加硫酸铵固体盐至1M。然后将所得溶液脱气并再次离心。将澄清的上清液上样至1M硫酸铵(pH7.0)平衡过的胎球蛋白琼脂糖柱上。提取物通过后,用硫酸铵洗柱至A280降至0.01以下。然后用20mM二氨基丙烷(pH11)解吸凝集素。解吸之凝集素用1M HCl调节pH值至7.0,加硫酸铵固体盐至1M。于15,000g离心20分钟后,将上清液上样至1M硫酸铵(pH7.0)平衡过的苯基Sepharose柱上。用1M硫酸铵洗脱除去杂质,用从1M硫酸铵到水的线性梯度解吸凝集素。收集各馏分,根据测得的A280确定含有凝集素的馏分。
已知刺槐随着日长的缩短即冬天开始而产生树皮凝集素。通过使用冬天的树皮材料,可以得到大约10mg/g的凝集素产量。
A
4
和B
4
RPA树皮凝集素同种型的制备
A4和B4同型四聚体同种型可采用分级梯度离子交换层析法制备。100ml的Hyper-D S柱(BioSepra)用5倍柱体积50mM乙酸钠(pH4.75)平衡。将冷冻干燥的RPA(按上述制备所述得到)溶解在乙酸缓冲液(50mM乙酸钠,pH4.75)中,于20,000g离心10分钟。将澄清的上清液上样于上述层析柱,接着用乙酸缓冲液以3ml/min的流速洗脱。用50mM乙酸钠(pH4.75)+NaCl构建分级梯度。以递增浓度加入NaCl至5、7、9、12和100%的分级梯度。通过测量280nM的吸光度来选择含有凝集素的馏分。A4四聚体洗脱在5.7%NaCl的馏分中,而B4四聚体洗脱在9-12%NaCl的馏分中。
用传统PAGE和SDS-PAGE方法进一步确认了含有纯A4或B4的馏分。
刺槐树皮凝集素的特性分析
刺槐树皮凝集素可用离子交换层析、凝胶过滤和体外细胞凝集实验进一步进行特性分析。这些方法是本领域熟知的并在Van Damme等1995a和b有描述。
动物处理
35只年轻雄性Hooded Lister(Rowett系)大鼠(出生19天,重30-40克)各个单独安置在网格底笼子中。给它们饲喂含10%乳白蛋白的高质量半合成食物(表1)。
表1.食物组成
(g/kg食物)
玉米淀粉 373
马铃薯淀粉 100
葡萄糖 150
玉米油 150
维生素混合物 50
矿物质混合物 50
乳白蛋白 127
硅酸 0.4
有关维生素和矿物质混合物的组成见Carvalho(1992)。
除第19天所给食物量限制到10g/只大鼠外,其它所有时间自由供给食物和水。第19天大鼠体重为100-104克。
施用RPA
预先施用RPA的动物用管饲法给予相当于25、50或100mg/kg体重的溶于0.9%生理盐水中的RPA(表2)。这些动物在注射5-氟尿嘧啶之前预先连续施用3天。
施用生理盐水
不预先施用RPA的动物用管饲法施用1ml 0.9%生理盐水。
施用5-FU
将300毫克5-氟尿嘧啶(5-FU)在14毫升蒸馏水中搅拌。缓慢加入1M氢氧化钠直到5-FU溶解。将溶液配成20毫升的终体积。所述溶液的最终pH为8.3。通过腹腔内注射,按150mg/kg体重的剂量施用给动物。注射后,立即给大鼠提供15克的对照食物。
口服刺槐凝集素保护大鼠免于高剂量化疗危害的能力,特别是
其对肠的组织保护作用
对5组、每组5只大鼠喂给含乳白蛋白的标准食物(表1)。一组大鼠每天喂给8克标准食物,持续3天,然后按150mg/kg体重注射5-FU(表2)。
表2.食物方案
处理 食物方案
1 LA3天,注射5-FU,LA6天
2 25mg/kg RPA3天,注射5-FU,LA6天
3 50mg/kg RPA3天,注射5-FU,LA6天
4 100mg/kg RPA3天,注射5-FU,LA6天
5 100mg/kg RPA3天,LA6天
关键词
LA=乳白蛋白
RPA=刺槐凝集素
5-FU=5-氟尿嘧啶
所述大鼠头三天配对饲喂,注射5-FU之后无限制饲喂。三组动物用管饲法喂给25、50或100mg/kg体重/天的刺槐凝集素(RPA)3天,然后在第4天注射150mg/kg的5-FU。剩下的一组动物预先施用100mg/kg体重的RPA,然后回到喂给含乳白蛋白的食物,而不注射5-FU。注射5-FU后,所述动物回到无限制地喂给含乳白蛋白的食物。实验开始7天后将动物杀死,解剖尸体,记录小肠、空肠和回肠的鲜重。结果显示在表3。
表3.预先施用刺槐凝集素3天对小肠、空肠和回肠之鲜重的影响
(克)
处理 剂量方案 小肠(克) 空肠(克) 回肠(克)
1 LA+5-FU 5.62 1.0 1.0
2 25mg/kg RPA+5-FU 5.41 1.03 0.98
3 50mg/kg RPA+5-FU 5.74 1.12 1.08
4 100mg/kg RPA+5-FU 6.33 1.27 1.12
5 100mg/kg RPA 6.99 1.27 1.17
结果表明随着RPA剂量的增加所有检测组织的鲜重均呈剂量依赖性增加。因此,预施用RPA能保护小肠、空肠和回肠的组织免受5-FU引起的损伤。与仅饲喂乳白蛋白的动物(处理1)相比,预施用100mg/kg的RPA(处理4)产生了最佳组织保护作用。预施用100mg/kg的RPA并注射5-FU的动物(处理4)与仅饲喂100mg/kg RPA的动物(处理5)有类似的小肠、空肠和回肠鲜重。
对小肠、空肠和回肠的视诊表明仅用5-FU处理的动物(处理1)其肠组织上没有或只有非常薄的粘膜层。而用5-FU和RPA处理的动物其肠组织状态健康,有正常的粘膜层。
本实施例说明在注射5-FU之前口服刺槐凝集素(RPA)对小肠、空肠和回肠产生了显著的组织保护作用。
口服刺槐同型四聚体凝集素A
4
和B
4
保护大鼠免于高剂量化疗危
害的能力,特别是其对肠的组织保护作用
对5组、每组5只大鼠喂给含乳白蛋白的标准食物(表1)并按下列食物方案(表4)饲喂。
表4.食物方案
处理 食物方案
1 LA7天
2 LA3天,注射5-FU,LA4天
3 200mg/kg A4同型四聚体3天,注射5-FU,LA4天
4 200mg/kg B4同型四聚体3天,注射5-FU,LA4天
一组动物(处理1)全过程均喂给标准食物。第2组用管饲法每天施用生理盐水,持续3天,然后按150mg/kg体重注射5-FU(处理2)。剩下两组(处理3和4)动物用管饲法每天喂给A4或B4 RPA同型四聚体,持续3天,然后按150mg/kg体重注射5-FU。注射5-FU之后,处理2-4组动物回到饲喂无限制的标准食物,持续4天。实验开始7天后杀死动物,解剖尸体并记录小肠、空肠和回肠干重。结果显示于表5。
表5.预施用刺槐A
4
或B
4
同型四聚体凝集素3天对小肠、空肠和
回肠干重(毫克)的影响
处理 施药方案 小肠 空肠 回肠
(毫克) (毫克) (毫克)
1 LA 2531 519 415
2 LA+5-FU 1789 336 405
3 200mg/kg A4 2597 632 421
4 200mg/kg B4 2093 439 419
所有干重均以100克干体重标准化。
结果表明用5-FU处理对小肠特别是空肠有很大影响。用5-FU处理的动物比未处理的对照(处理1和2)其组织干重显著减少。而用A4或B4同型四聚体凝集素预处理产生了显著的组织保护作用(处理3和4)。特别地,用A4同型四聚体凝集素处理的动物其组织干重和未处理动物基本上相同。
对小肠、空肠和回肠的视诊表明仅用5-FU处理的动物其肠组织粘膜大面积损伤,但用A4或B4同型四聚体凝集素处理的动物基本上具有正常状态的粘膜层。
本实施例说明刺槐A4和B4同型四聚体凝集素在注射5-FU之前施用均能产生对肠的显著保护作用。
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Claims (24)
1.刺槐凝集素在制备用于控制粘膜细胞增殖、减轻和/或治疗由细胞损伤剂造成的损伤或其组合的药物中的用途。
2.权利要求1的刺槐凝集素的用途,其中所述药物施用于正在接受、已经接受了或将要接受放疗和/或化疗的患者,特别是所述患者患有癌症。
3.权利要求1的刺槐凝集素的用途,其中所述用途是用于减轻和/或治疗粘膜炎或肠损伤。
4.权利要求1的刺槐凝集素的用途,其中所述用途是用于减轻和/或治疗肠疾病。
5.权利要求4的刺槐凝集素的用途,其中所述肠疾病是炎性肠疾病或肠易激综合症。
6.权利要求1-5任一项的用途,其中所述刺槐凝集素包括树皮、种子、根、根瘤、韧皮部、木质部、叶凝集素或其两种或多种的组合。
7.权利要求1-5之任一项的用途,其中所述凝集素包括亚基的单体、二聚体、三聚体或四聚体,或其两种或多种的组合。
8.权利要求7的用途,其中所述凝集素含有一种同聚多肽。
9.权利要求1-5之任一项的用途,其中所述凝集素是树皮亚基a或b的同型四聚体。
10.权利要求1-9之任一项的用途,其中凝集素是纯化至60%或以上水平的同型四聚体、同型三聚体、同型二聚体或单亚基或其组合,任选树皮亚基a或b或在权利要求21或22的组合物中。
11.权利要求1-10之任一项的用途,其用于哺乳动物细胞和/或组织,特别是人细胞和/或组织。
12.权利要求11的用途,其中所述细胞和/或组织是粘膜细胞,包括粘膜层。
13.由树皮亚基a的同型四聚体、同型三聚体、同型二聚体或单亚基或其两种或多种的组合构成的刺槐凝集素在制备用于控制粘膜细胞增殖、减轻和/或治疗由细胞损伤剂造成的损伤或其组合的药物中的用途。
14.由树皮亚基b的同型四聚体、同型三聚体、同型二聚体或单亚基或其两种或多种的组合构成的刺槐凝集素在制备用于控制粘膜细胞增殖、减轻和/或治疗由细胞损伤剂造成的损伤或其组合的药物中的用途。
15.权利要求13或14的用途,所述药物用于治疗正在接受、已经接受了或将要接受放疗和/或化疗的患者,特别是所述患者患有癌症。
16.权利要求13或14的用途,其中所述药物是用于控制或减轻和/或治疗粘膜炎或肠损伤。
17.权利要求13或14的用途,其中所述药物是用于减轻和/或治疗肠疾病。
18.权利要求17的用途,其中所述肠疾病是炎性肠疾病或肠易激综合症。
19.含有刺槐凝集素的组合物,其中刺槐凝集素由纯化至60%或以上水平的同型四聚体、同型三聚体、同型二聚体或单亚基或其组合构成。
20.权利要求19的组合物,其中所述组合物包含可药用赋形剂。
21.权利要求19或20的组合物用于制备药物的用途。
22.权利要求20或21的组合物的生产方法,所述方法包括混合所述凝集素和可药用赋形剂。
23.一种组合物,其含有纯化至60%或以上的刺槐凝集素。
24.一种组合物,其含有刺槐凝集素与细胞保护剂的联合。
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