CN116732229B - 一种鉴定水芹品种的ssr引物组及其应用 - Google Patents

一种鉴定水芹品种的ssr引物组及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种鉴定水芹品种的SSR引物组及其应用，所述SSR引物组由Oj‑084、Oj‑112、Oj‑156三对引物构成。该SSR引物组特异性强，多态性高且分辨率好，能够快速对水芹材料进行鉴定与分析，可用三对引物将目前不同已知水芹品种完全区分开，还可以对从不同地区取样的水芹材料完全区分开，经分析计算可获得该不同地区的水芹材料与目前已知水芹品种的亲缘关系，本发明利用引物组对品种鉴定技术具有取材方便、鉴定技术简便快速、结果高度准确稳定的特点。

Description

一种鉴定水芹品种的SSR引物组及其应用
技术领域
本发明属于水芹品种鉴定技术领域，具体涉及一种鉴定水芹品种的SSR引物组及其应用。
背景技术
水芹(Oenanthe javanica(Blume)DC)是伞形科多年生草本植物，茎直立或基部匍匐，以其嫩茎和叶柄供食用，作炒菜或凉拌，风味鲜美清香，水芹富含维生素、碳水化合物、钙、磷、铁等多种营养元素，并且具有抗癌、抗衰老、抗炎等多种药用功效。在我国，水芹作为一种特色水生蔬菜，具有丰富的营养价值和独特的风味，深受广大消费者喜爱。水芹在中国的大部分地区都有分布，尤其是在江浙沪沿水一带，极易发现水芹的存在，河流分布较广，地理位置的独特，导致水芹品种交杂，不断繁殖扩增。水芹种质资源十分丰富，大多以产地命名，但品种差异较大，目前有关水芹的研究主要集中在栽培技术、净化水体、药理活性及功能研究，而有关水芹种质资源的分类研究较少，关于水芹种质资源的分类研究中，其存在的问题在于：通过常规手段，即依靠形态对比和观察鉴定分辨是很难对水芹进行准确鉴定的，无法对水芹进行准确区分，在水芹育种种植过程中会给育种者带来极大的困难。
因此，开发一种快速准确检测水芹品种的方法，用于水芹资源遗传多样性分析，这对于水芹种质资源的鉴定保护、有效利用和创新具有十分重要意义。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种鉴定水芹品种的SSR引物组及其应用，旨在解决现有技术中多是通过常规手段，即依靠形态对比和观察鉴定分辨，很难对水芹的品种进行准确鉴定，无法对水芹品种进行准确区分，在水芹育种种植过程中会给育种者带来极大的困难。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
一种鉴定水芹品种的SSR引物组，所述SSR引物组由Oj-084、Oj-112、Oj-156三对引物构成；
所述Oj-084的序列为：
SEQ ID NO.1：正向引物：GCCTGGAGAGGTGTGCTC；
SEQ ID NO.2：反向引物：GGCAAACTGGCCGAATGC；
所述Oj-112的序列为：
SEQ ID NO.3：正向引物：TGTGTCTGGGTGTGAGAGTG；
SEQ ID NO.4：反向引物：AGTGGAAGCTGATACGCGG；
所述Oj-156的序列为：
SEQ ID NO.5：正向引物：TGCCGGTGACTTTCGAGG；
SEQ ID NO.6：反向引物：CGAGGGTATAATTGCTCCTGC。
一种SSR引物组在水芹育种中的应用，所述水芹育种包括水芹品种的鉴定和水芹种质资源的分类。
作为本发明的进一步优化方案，所述水芹品种包括玉祁红芹、春晖、秋芹1号、扬州长白芹、伏芹1号和鄂水芹1号。
一种利用SSR引物组进行鉴定水芹品种的方法，包括以下步骤：
(1)提取待鉴定的水芹品种的DNA样品；
(2)以步骤(1)提取的DNA样品为模版，采用所述SSR引物组分别对DNA样品进行PCR扩增，获得PCR产物；
(3)将步骤(2)所获得的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测条带，读取琼脂糖凝胶数据，统计获得各水芹品种的带型，通过比较带型将水芹品种区分开。
作为本发明的进一步优化方案，在步骤(2)中，PCR扩增采用20μL的反应体系，总体积20μL，包括10μL的2×PCR Mix，1μL的正向引物，1μL的反向引物，1μL的稀释好的DNA工作液，7μL的ddH2O。
作为本发明的进一步优化方案，在步骤(2)中，PCR反应条件如下：94℃，3min；94℃，30s；55℃，30s；72℃，6s；30个循环；72℃，10min；4℃保存。
本发明的有益效果在于：
1)本发明提供的SSR引物组特异性强，多态性高且分辨率好，能够快速对水芹品种进行鉴定与分析，可用三对引物将目前不同已知水芹品种完全区分开，还可以对从不同地区取样的水芹材料完全区分开，经分析计算可获得该不同地区的水芹材料与目前已知水芹品种的亲缘关系；
2)本发明利用引物组对品种鉴定技术具有取材方便、鉴定技术简便快速、结果高度准确稳定的特点，本发明可对幼苗或成年植株的叶、茎等组织或器官的基因组DNA进行检测，取样不受季节、地点限制，在取材方便上具有明显的优势；
3)本发明利用SSR引物组进行鉴定水芹品种具有周期短，耗力小，节约资源等特点，本发明利用琼脂糖凝胶电泳检测技术，该技术简便快捷，易于操作；
4)本发明可用于水芹品种的鉴定，为水芹种质资源库创建奠定基础。
附图说明
图1是本发明的PCR扩增产物的琼脂糖电泳图。
图2是本发明的24个水芹材料聚类分析图。
具体实施方式
下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。
1、材料
本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
2、方法
2.1、鉴定水芹品种的SSR引物组的获得
2.1.1、SSR位点搜索
利用TBtools中SSRminer对水芹全基因组序列进行SSR位点搜索；SSR位点搜索标准为：1(18)、2(10)、3(6)、4(5)、5(5)、6(5)，且2个SSR位点之间的最小距离为100bp，所述水芹为溧阳白芹，溧阳白芹基因组序列由南京农业大学熊爱生教授课题组提供，基因组大小为1.23GB。
2.1.2、引物设计
提取溧阳白芹全基因组各SSR位点侧翼的保守序列，利用TBtools软件中插件Batch Target Region Primer Design进行引物批量设计，再利用TBtools中插件PrimerCheck进行引物特异性检测，最后对引物进行筛选；筛选条件为：PCR产物在100～350bp；引物退火温度(Tm)在58℃～61℃，且前后引物相差1℃；引物长度在18～22bp，引物5’端最好是G/C，3’端最好避免出现A；引物序列中碱基重复数少于4，G/C的单碱基重复少于3；为了保证引物特异性，用于设计引物的保守侧翼序列与SSR位点至少间隔20～23碱基，共获得669对引物，随机选取100对引物，由上海生物工程股份有限公司合成。
2.1.3、引物筛选
采用合成的100对引物，对来自不同地区的水芹品种的基因组DNA进行扩增，根据扩增结果，筛选可稳定扩增、带型清晰且多态性高的引物，共28对，利用该28对引物对24个水芹材料进行复筛，筛选出Oj-084、Oj-112、Oj-156，这三对多态性高、扩增稳定的引物用于水芹鉴定。
所述Oj-084的序列为：
SEQ ID NO.1：正向引物：GCCTGGAGAGGTGTGCTC；
SEQ ID NO.2：反向引物：GGCAAACTGGCCGAATGC；
所述Oj-112的序列为：
SEQ ID NO.3：正向引物：TGTGTCTGGGTGTGAGAGTG；
SEQ ID NO.4：反向引物：AGTGGAAGCTGATACGCGG；
所述Oj-156的序列为：
SEQ ID NO.5：正向引物：TGCCGGTGACTTTCGAGG；
SEQ ID NO.6：反向引物：CGAGGGTATAATTGCTCCTGC。
2.2、利用SSR引物组(Oj-084、Oj-112、Oj-156)进行水芹鉴定
2.2.1、利用SSR引物组对已知的水芹品种进行鉴定
步骤1、采用CTAB法提取待鉴定的6个不同水芹材料(SQ008：玉祁红芹，编号为1；SQ024：春晖，编号为10；SQ026：秋芹1号，编号为11；YZCBQ：扬州长白芹，编号为12；FQ1H：伏芹1号，编号为13；EQ1H：鄂水芹1号，编号为20；材料编号如表1所示)的DNA样品，步骤如下：
对于6个不同品种的水芹品种材料，每种品种的水芹材料均剪取两片直径为1cm的圆形新鲜水芹叶片(可以取幼苗或成年植株的叶片，也可取幼苗或成年植株茎等组织或器官)，加入液氮迅速研磨成粉状，将粉末转入2.0mL离心管中；加入0.5mL65℃预热的2×CTAB提取液，65℃水浴30min(每隔10min摇晃一次)；加入0.5mL氯仿，轻轻颠倒混匀；室温下12000rpm离心10min；取上清液到1.5mL的离心管中并加入2倍于上清液的无水乙醇，12000rpm离心5min，弃离心管内混合液，DNA留在离心管中；室温下晾干，加入80μL超纯水溶解，并稀释到50ng/μL的工作液，在-20℃冰箱保存备用；
步骤2、以提取DNA为模版，采用三对引物分别进行PCR扩增
PCR扩增采用20μL的反应体系，总体积20μl，包括10μl的2×PCR Mix，1μl的正向引物，1μl的反向引物，1μl的稀释好的DNA工作液，7μl的ddH2O；
PCR扩增反应条件为：94℃，3min；94℃，30s；55℃，30s；72℃，6s；30个循环；72℃，10min；4℃保存；
步骤3、PCR产物用琼脂糖电泳检测条带
称量2.5g的琼脂糖溶于100mL的1×TBE缓冲液中加热溶解，将胶倒入胶槽等待凝固；吸取5μLPCR产物加入胶孔，放入电泳槽中进行电泳；琼脂糖电泳图如图1所示。
2.2.2、利用SSR引物组对未知的水芹品种进行鉴别和种质资源分析
步骤1、采用CTAB法提取24份水芹材料DNA，其中6份水芹材料(SQ008：玉祁红芹，编号为1；SQ024：春晖，编号为10；SQ026：秋芹1号，编号为11；YZCBQ：扬州长白芹，编号为12；FQ1H：伏芹1号，编号为13；EQ1H：鄂水芹1号，编号为20)，另从不同区域采集18份材料(SQ009(编号2)、SQ012(编号3)、SQ014(编号4)、SQ015(编号5)、SQ019(编号6)、SQ020(编号7)、SQ021(编号8)、SQ022(编号9)、TC-FG(编号14)、SC2H(编号15)、JZ-XHD(编号16)、JZ-GWXP(编号17)、HF-DQ(编号18)、SC1H(编号19)、TC-WC(编号21)、CZ-LCC(编号22)、CZ-JC(编号23)、SC-LJLZ(编号24)；材料编号如表1所示)，并对该18份材料进行种质资源分析，上述24种材料的品种编号和来源如表1所示。DNA提取步骤同2.2.1；
步骤2、以提取DNA为模版，采用三对引物分别进行PCR扩增
PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件均与步骤2.2.1一致；
步骤3、PCR产物用琼脂糖电泳检测条带
称量2.5g的琼脂糖溶于100mL的1×TBE缓冲液中加热溶解，将胶倒入胶槽等待凝固；吸取5μLPCR产物加入胶孔，放入电泳槽中进行电泳；琼脂糖电泳图如图1所示。
上述涉及的6个已知水芹品种和18个未知水芹品种的材料编号和来源地见表1。
表1二十四份水芹材料明细
2.2.3、引物有效性验证
采用凝胶成像系统测读上述步骤2.2.1-2.2.2所获得的琼脂糖凝胶数据，具体为，采用0/1数据辩读条带，即从条带最高往最低读，统计带型，有条带记为1，无条带记为0，检测结果如表2所示。
表2三对引物扩增条带0/1数据表
2.2.4、三对引物扩增数据统计分析
使用Power Marker和GenAlEx软件分析SSR扩增数据，计算多态信息含量(polymorphism information content，PIC)、次等位基因频率(Minor allele frequency，MAF)、等位基因数(number of alleles，Na)、有效等位基因数(effective number ofalleles，Ne)、遗传多样性(genetic diversity，GD)、期望杂合度(expectedheterozygosity，He)等数据，如表3所示，采用NTsys-pc计算遗传距离，并使用SAHN构建UPGMA聚类树，结果如图2所示。
表3三对引物扩增数据统计分析
SSR-Marker Oj-084 Oj-112 Oj-156
次等位基因频率MAF 0.5000 0.3333 0.2708
等位基因数Na 4 12 7
有效等位基因数Ne 2.7234 5.1659 5.4340
Shannon's指数I 1.1433 2.0043 1.7977
观察杂合度Ho 0.4580 0.6670 0.8160
期望杂合度He 0.6330 0.8060 0.8330
遗传多样性GD 0.6328 0.8064 0.8160
多态性信息含量PIC 0.5703 0.7853 0.7912
2.3、实验结论
利用三对SSR引物，通过琼脂糖凝胶电泳对24个水芹材料进行了检测，共检测出23个等位基因，平均每对引物扩增的等位基因数为7.6；有效等位基因总数为13.323，数值变化范围为2.7234～5.4340，平均每个位点有效等位基因数目为4.44；“Shannon's指数”数值范围为1.1433～2.0043，平均值1.6484；多态性信息含量(PIC)的数值范围为0.5703～0.7912，平均值0.7156；三对引物均具有较高的多态信息(PIC＞0.25)；根据三对引物的遗传信息数据，通过软件ntsys-pc计算遗传距离系数，构建UPMGA聚类图(图2)，表明这三对高多态SSR引物可用于水芹品种鉴定，且通过该三对引物可以将目前不同已知水芹品种完全区分开，还可以对从不同地区取样的水芹材料完全区分开，根据UPMGA聚类图可获得不同地区的水芹材料与目前已知水芹品种的亲缘关系。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种鉴定水芹品种的SSR引物组，其特征在于：所述SSR引物组由Oj-084、Oj-112、Oj-156三对引物构成；
所述Oj-084的序列为：
SEQ ID NO.1：正向引物：GCCTGGAGAGGTGTGCTC；
SEQ ID NO.2：反向引物：GGCAAACTGGCCGAATGC；
所述Oj-112的序列为：
SEQ ID NO.3：正向引物：TGTGTCTGGGTGTGAGAGTG；
SEQ ID NO.4：反向引物：AGTGGAAGCTGATACGCGG；
所述Oj-156的序列为：
SEQ ID NO.5：正向引物：TGCCGGTGACTTTCGAGG；
SEQ ID NO.6：反向引物：CGAGGGTATAATTGCTCCTGC。
2.一种如权利要求1所述的SSR引物组在水芹育种中的应用，其特征在于：所述水芹育种包括水芹品种的鉴定和水芹种质资源的分类。
3.根据权利要求2所述的SSR引物组在水芹育种中的应用，其特征在于：所述水芹品种包括玉祁红芹、春晖、秋芹1号、扬州长白芹、伏芹1号和鄂水芹1号。
4.一种利用权利要求1所述的SSR引物组进行鉴定水芹品种的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)提取待鉴定的水芹品种的DNA样品；
(2)以步骤(1)提取的DNA样品为模版，采用所述SSR引物组分别对DNA样品进行PCR扩增，获得PCR产物；
(3)将步骤(2)所获得的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测条带，读取琼脂糖凝胶数据，统计获得各水芹品种的带型，通过比较带型将水芹品种区分开。
5.根据权利要求4所述的一种鉴定水芹品种的方法，其特征在于：在步骤(2)中，PCR扩增采用20μL的反应体系，总体积20μL，包括10μL的2×PCR Mix，1μL的正向引物，1μL的反向引物，1μL的稀释好的DNA工作液，7μL的ddH2O。
6.根据权利要求4所述的一种鉴定水芹品种的方法，其特征在于：在步骤(2)中，PCR反应条件如下：94℃，3min；94℃，30s；55℃，30s；72℃，6s；30个循环；72℃，10min；4℃保存。
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