CN116790792B - 一种用于水芹遗传多样性分析的ssr分子标记引物组及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于水芹遗传多样性分析的SSR分子标记引物组及应用。本发明经SSR位点寻找、设计引物、筛选引物获得SSR分子标记引物组，所述SSR引物组包括33对引物；利用SSR分子标记引物组可进行水芹遗传多样性分析及种质资源遗传系谱分析。本发明的引物特异性强，多态性高且分辨率好，能快速对水芹进行鉴定与分析，将其应用于水芹遗传多样性分析及种质资源遗传系谱分析中，能够更全面的揭示我国水芹遗传水平的多样性和遗传结构，为水芹种质资源库创建奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于水芹品种鉴定技术领域，具体涉及一种用于水芹遗传多样性分析的SSR分子标记引物组及应用。
背景技术
水芹(Oenanthe javanica(Blume)DC)，又名野芹菜，是一种生长在池沼边、河边和水田里的水生蔬菜，其味道鲜美，营养价值很高，含有多种微量元素和蛋白质，多吃有降血压、血脂，清热，利尿的功效，在我国，水芹是一种特色水生蔬菜，具有丰富的营养价值和独特的风味，深受广大群众喜爱，水芹原产亚洲东部，分布于中国长江流域、日本北海道、印度南部、等区域，尤其是在中国的江浙沪沿水一带，极易发现水芹的存在，但由于河流分布较广，地理位置的独特，导致水芹品种交杂，不断繁殖扩增，很难对水芹的品种进行鉴定，由于水芹分布较广，品种间差异较小，难以分辨，其遗传变异水平及其亲缘地理关系鲜有报道，因此，所存在的问题是：通过常规手段，即依靠形态对比和观察鉴定分辨是很难对水芹进行准确鉴定区分的，无法对水芹进行准确区分，在水芹育种种植过程中会给育种者带来了极大的困难。
随着分子生物学技术的飞速发展，分子标记技术不断成熟，SSR分子标记具有数量多、多态性好、使用成本低及操作简单等特点，已经在水稻、小麦、玉米等作物中得到广泛应用，也给蔬菜从品种基因组水平上的鉴定开辟了途径，水芹种植资源丰富，各地品种差异较大，目前有关水芹的遗传多样性研究较少，水芹资源大多以产地命名，使得水芹品种的命名比较混乱，因此，开发一种快速准确检测区分水芹的方法，用于水芹遗传多样性分析和种质资源遗传系谱分析，这对于水芹种植资源的鉴定保护、有效利用和创新具有十分重要意义。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种用于水芹遗传多样性分析的SS R分子标记引物组及应用，旨在解决现有技术中多是通过常规手段，即依靠形态对比和观察鉴定分辨，很难对水芹的品种进行准确鉴定区分，无法对水芹品种以及水芹品种的亲缘关系进行准确区分，在水芹育种种植过程中会给育种者带来了极大的困难。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
一种用于水芹遗传多样性分析的SSR分子标记引物组，包括以下33对引物：具有如序列表中SEQ ID No.1-2所示的核苷酸序列的引物Oj-005-F、Oj-005-R；具有如序列表中SEQ ID No.3-4所示的核苷酸序列的引物Oj-012-F、Oj-012-R；具有如序列表中SEQ IDNo.5-6所示的核苷酸序列的引物Oj-013-F、Oj-013-R；具有如序列表中SEQ ID No.7-8所示的核苷酸序列的引物Oj-031-F、Oj-031-R；具有如序列表中SEQ ID No.9-10所示的核苷酸序列的引物Oj-032-F、Oj-032-R；具有如序列表中SEQ ID No.11-12所示的核苷酸序列的引物Oj-039-F、Oj-039-R；具有如序列表中SEQ ID No.13-14所示的核苷酸序列的引物Oj-069-F、Oj-069-R；具有如序列表中SEQ ID No.15-16所示的核苷酸序列的引物Oj-071-F、Oj-071-R；具有如序列表中SEQ ID No.17-18所示的核苷酸序列的引物Oj-072-F、Oj-072-R；具有如序列表中SEQ ID No.19-20所示的核苷酸序列的引物Oj-077-F、Oj-077-R；具有如序列表中SEQ ID No.21-22所示的核苷酸序列的引物Oj-078-F、Oj-078-R；具有如序列表中SEQ ID No.23-24所示的核苷酸序列的引物Oj-079-F、Oj-079-R；具有如序列表中SEQ IDNo.25-26所示的核苷酸序列的引物Oj-080-F、Oj-080-R；具有如序列表中SEQ ID No.27-28所示的核苷酸序列的引物Oj-081-F、Oj-081-R；具有如序列表中SEQ ID No.29-30所示的核苷酸序列的引物Oj-084-F、Oj-084-R；具有如序列表中SEQ ID No.31-32所示的核苷酸序列的引物Oj-085-F、Oj-085-R；具有如序列表中SEQ ID No.33-34所示的核苷酸序列的引物Oj-091-F、Oj-091-R；具有如序列表中SEQ ID No.35-36所示的核苷酸序列的引物Oj-101-F、Oj-101-R；具有如序列表中SEQ ID No.37-38所示的核苷酸序列的引物Oj-108-F、Oj-108-R；具有如序列表中SEQ ID No.39-40所示的核苷酸序列的引物Oj-110-F、Oj-110-R；具有如序列表中SEQ ID No.41-42所示的核苷酸序列的引物Oj-112-F、Oj-112-R；具有如序列表中SEQ ID No.43-44所示的核苷酸序列的引物Oj-115-F、Oj-115-R；具有如序列表中SEQID No.45-46所示的核苷酸序列的引物Oj-119-F、Oj-119-R；具有如序列表中SEQ IDNo.47-48所示的核苷酸序列的引物Oj-120-F、Oj-120-R；具有如序列表中SEQ ID No.49-50所示的核苷酸序列的引物Oj-121-F、Oj-121-R；具有如序列表中SEQ ID No.51-52所示的核苷酸序列的引物Oj-125-F、Oj-125-R；具有如序列表中SEQ ID No.53-54所示的核苷酸序列的引物Oj-131-F、Oj-131-R；具有如序列表中SEQ ID No.55-56所示的核苷酸序列的引物Oj-140-F、Oj-140-R；
具有如序列表中SEQ ID No.57-58所示的核苷酸序列的引物Oj-142-F、Oj-142-R；
具有如序列表中SEQ ID No.59-60所示的核苷酸序列的引物Oj-146-F、Oj-146-R；
具有如序列表中SEQ ID No.61-62所示的核苷酸序列的引物Oj-150-F、Oj-150-R；
具有如序列表中SEQ ID No.63-64所示的核苷酸序列的引物Oj-156-F、Oj-156-R；
具有如序列表中SEQ ID No.65-66所示的核苷酸序列的引物Oj-159-F、Oj-159-R。
一种SSR分子标记引物组在水芹遗传多样性分析和种质资源遗传系谱分析中的应用。
作为本发明的进一步优化方案，所述水芹遗传多样性分析及种质资源遗传系谱分析的方法，包括以下步骤：
(1)提取待检测的水芹材料的DNA样品；
(2)以步骤(1)提取的DNA样品为模版，采用所述SSR分子标记引物组对DN A样品进行PCR扩增，获得PCR产物；
(3)将步骤(2)所获得的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，并统计条带检测结果；
(4)根据步骤(3)所统计的条带检测结果进行水芹遗传多样性分析和种质遗传系谱分析。
作为本发明的进一步优化方案，在步骤(2)中，PCR扩增采用的反应体系，包括10μl的2×PCR Mix，1μl的正向引物，1μl的反向引物，1μl的稀释好的DNA工作液，7μl的ddH20，总体积20μl。
作为本发明的进一步优化方案，在步骤(2)中，PCR反应程序如下：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸6s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
作为本发明的进一步优化方案，在步骤(4)中，水芹遗传多样性分析和种质遗传系谱分析方法具体为，使用Power Marker和GenAlEx软件分析SSR扩增数据，计算多态信息含量、次等位基因频率、等位基因数、有效等位基因数、遗传多样性、期望杂合度的数据，并采用NTsys-pc计算水芹材料之间的遗传距离和遗传相似系数，使用SAH N构建UPGMA聚类树。
本发明的有益效果在于：
1)本发明提供的SSR引物特异性强，多态性高且分辨率好，能够快速对水芹材料进行鉴定与分析。
2)本发明利用多态性引物对水芹材料鉴定技术具有取材方便、鉴定技术简便快速、结果高度准确稳定的特点，本发明可对幼苗或成年植株的叶、茎等组织或器官的基因组DNA进行检测，取样不受季节、地点限制，在取材方便上具有明显的优势；
3)本发明利用SSR分子标记多态性引物进行鉴定水芹具有周期短，耗力小，节约资源等特点，本发明利用琼脂糖凝胶电泳检测技术，该技术简便快捷，易于操作；
4)本发明可用于水芹品种和水芹品种的亲缘关系的鉴定，为水芹种质资源库创建奠定基础。
附图说明
图1是本发明的PCR扩增产物的部分琼脂糖电泳图；
图2是本发明的6种已知水芹品种UPGMA聚类图；
图3是本发明的55份水芹材料UPGMA聚类分析图。
具体实施方式
下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。
1、材料
本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
供试材料中(SQ008：玉祁红芹；SQ024：春晖；SQ026：秋芹1号；FQ1H：伏芹1号；YZCBQ：扬州长白芹；ESQ1H：鄂水芹1号)为已知品种，分别由江苏省水生作物资源圃和安徽省舒城县农业科学研究所提供；供试材料中(SQ009、SQ012、SQ014、S Q015、SQ019、SQ020、SQ021、SQ022)为江苏省水生作物资源圃提供；剩余材料为不同地区采集的自然材料，具体信息见表1。
表1 55份供试材料信息表
注：材料编号中带*标记的为具体品种(SQ008：玉祁红芹，编号为1；SQ024：春晖，编号为10；SQ026：秋芹1号，编号为11；FQ1H：伏芹1号，编号为12；YZCBQ：扬州长白芹，编号为13；ESQ1H：鄂水芹1号，编号为20；材料编号如表1所示)。
2、方法
2.1、水芹SSR分子标记多态性引物获得
2.1.1、SSR位点搜索
利用TBtools中SSRminer对水芹全基因组序列进行SSR位点搜索，SSR位点搜索标准为：两碱基重复10次以上，三碱基重复6次以上，且2个SSR位点之间的最小距离为100b p，所述水芹为溧阳白芹，溧阳白芹基因组序列由南京农业大学熊爱生教授课题组提供，基因组大小为1.23GB。
2.1.2、引物设计
利用水芹全基因组各SSR位点侧翼的保守序列，利用TBtools中插件Batch TargetRe gion Primer Design进行引物批量设计，再利用TBtools中插件Primer Check进行引物特异性检测，最后对特异性引物进筛选，筛选条件为：PCR产物在100～350bp；引物退火温度(Tm)在58℃～61℃，且前后引物相差1℃；引物长度在18～22bp，引物5’端最好是G/C，3’端最好避免出现A；引物序列中碱基重复数少于4，G/C的单碱基重复少于3；为了保证引物特异性，用于设计引物的保守侧翼序列与SSR位点至少间隔20～23碱基，对筛选过后的引物随机选取160对引物，由上海生物工程股份有限公司合成。
2.1.3、引物筛选
采用合成的160对引物，对来自不同地区的6份水芹品种(SQ008：玉祁红芹，编号为1；SQ024：春晖，编号为10；SQ026：秋芹1号，编号为11；FQ1H：伏芹1号，编号为12；YZCBQ：扬州长白芹，编号为13；ESQ1H：鄂水芹1号，编号为20；材料编号如表1所示)的基因组DNA进行扩增，根据扩增结果，筛选可稳定扩增、带型清晰且多态性高的引物Oj-005、Oj-012、Oj-013、Oj-031、Oj-032、Oj-039、Oj-069、Oj-071、Oj-072、Oj-077、Oj-078、Oj-079、Oj-080、Oj-081、Oj-084、Oj-085、Oj-091、Oj-101、Oj-108、Oj-110、Oj-112、Oj-115、Oj-119、Oj-120、Oj-121、Oj-125、Oj-131、Oj-140、Oj-142、Oj-146、Oj-150、Oj-156、Oj-159，共33对，这33对多态性高、扩增稳定的引物用于水芹鉴定，所述引物的序列信息如表2所示：
表2引物的序列信息
2.2、水芹DNA的提取与检测
步骤1、采用CTAB法提取55个水芹材料的DNA样品，步骤如下：
对于55份不同水芹材料，每种水芹材料均剪取两片直径为1cm的圆形新鲜水芹叶片(可以取幼苗或成年植株的叶片，也可取幼苗或成年植株茎等组织或器官)，加入液氮迅速研磨成粉状，将粉末转入2.0ml离心管中；加入0.5ml 65℃预热的2×CTAB提取液，65℃水浴30min(每隔10min摇晃一次)；加入与2×CTAB等体积的氯仿，轻轻颠倒混匀；室温下12000rpm离心10min；吸取上清液于2.0ml离心管并加入2倍于上清液的无水乙醇(4℃保存)，12000rpm离心5min，弃离心管内混合液，室温下晾干，加入80μl超纯水溶解；使用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，同时利用NanoDrop2000核酸蛋白测定仪检测其浓度及纯度；最后稀释到50ng/μl的工作液，-20℃冰箱保存；
步骤2、以提取DNA为模版，采用33对引物分别进行PCR扩增(如图1所示)
PCR扩增采用20μl的反应体系，包括10μl的2×PCR Mix，1μl的正向引物，1μl的反向引物，1μl的稀释好的DNA工作液，7μl的ddH20，总体积20μl；
PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸6s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；
2.3、33对引物扩增数据统计分析
使用Power Marker和GenAlEx软件分析SSR扩增数据，计算多态信息含量(polymorphism information content，PIC)、次等位基因频率(Minor allele frequency，MAF)、等位基因数(number of alleles，Na)、有效等位基因数(effective number of alleles，Ne)、遗传多样性(genetic diversity，GD)、期望杂合度(expected heterozygosity，H e)等数据，如表3所示，采用NTsys-pc计算供实验的55份水芹材料(表1中编号为1-55)以及6种已知品种的水芹材料(SQ008：玉祁红芹，编号为1；SQ024：春晖，编号为10；SQ026：秋芹1号，编号为11；FQ1H：伏芹1号，编号为12；YZCBQ：扬州长白芹，编号为13；ESQ1H：鄂水芹1号，编号为20；材料编号如表1所示)之间的遗传距离和遗传相似系数，并使用SAHN构建UPGMA聚类树，结果如图2-3所示。
表3三十三对引物扩增数据统计分析
2.4、实验结论
利用三十三对SSR引物，通过琼脂糖凝胶电泳对55份水芹材料进行检测，共检测出164个等位基因，平均每对引物扩增的等位基因数为5；有效等位基因总数为100.7262，数值变化范围为1.5568～5.4340，平均每个位点有效等位基因数目为3.0523；“Shannon's指数”数值范围为0.5954～2.0043，平均值1.2255；多态性信息含量(PIC)的数值范围为0.3233～0.7912，平均值0.5882；三十三对引物均具有较高的多态信息(PIC＞0.25)；根据三十三对引物的遗传信息数据，通过软件ntsys-pc计算遗传距离系数，构建了6份已知品种水芹材料的UPMGA聚类图(图2)，由此可知，这三十三对SSR引物可用于水芹品种鉴定；同时我们对55份水芹材料(已知品种和自然材料)构建了UPMGA聚类图(图3)进行分析，通过该三十三对引物可以将目前已知的不同水芹品种完全区分开，还可以对从不同地区进行取样的水芹材料完全区分开，根据UPMGA聚类图可获得不同地区的水芹材料与目前已知水芹品种的亲缘关系，并且可以发现水芹群体中存在较多的遗传变异。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种用于水芹遗传多样性分析的SSR分子标记引物组，其特征在于：包括以下33对引物：
如序列表中SEQ ID No.1-2所示的核苷酸序列的引物Oj-005-F、Oj-005-R；
如序列表中SEQ ID No.3-4所示的核苷酸序列的引物Oj-012-F、Oj-012-R；
如序列表中SEQ ID No.5-6所示的核苷酸序列的引物Oj-013-F、Oj-013-R；
如序列表中SEQ ID No.7-8所示的核苷酸序列的引物Oj-031-F、Oj-031-R；
如序列表中SEQ ID No.9-10所示的核苷酸序列的引物Oj-032-F、Oj-032-R；
如序列表中SEQ ID No.11-12所示的核苷酸序列的引物Oj-039-F、Oj-039-R；
如序列表中SEQ ID No.13-14所示的核苷酸序列的引物Oj-069-F、Oj-069-R；
如序列表中SEQ ID No.15-16所示的核苷酸序列的引物Oj-071-F、Oj-071-R；
如序列表中SEQ ID No.17-18所示的核苷酸序列的引物Oj-072-F、Oj-072-R；
如序列表中SEQ ID No.19-20所示的核苷酸序列的引物Oj-077-F、Oj-077-R；
如序列表中SEQ ID No.21-22所示的核苷酸序列的引物Oj-078-F、Oj-078-R；
如序列表中SEQ ID No.23-24所示的核苷酸序列的引物Oj-079-F、Oj-079-R；
如序列表中SEQ ID No.25-26所示的核苷酸序列的引物Oj-080-F、Oj-080-R；
如序列表中SEQ ID No.27-28所示的核苷酸序列的引物Oj-081-F、Oj-081-R；
如序列表中SEQ ID No.29-30所示的核苷酸序列的引物Oj-084-F、Oj-084-R；
如序列表中SEQ ID No.31-32所示的核苷酸序列的引物Oj-085-F、Oj-085-R；
如序列表中SEQ ID No.33-34所示的核苷酸序列的引物Oj-091-F、Oj-091-R；
如序列表中SEQ ID No.35-36所示的核苷酸序列的引物Oj-101-F、Oj-101-R；
如序列表中SEQ ID No.37-38所示的核苷酸序列的引物Oj-108-F、Oj-108-R；
如序列表中SEQ ID No.39-40所示的核苷酸序列的引物Oj-110-F、Oj-110-R；
如序列表中SEQ ID No.41-42所示的核苷酸序列的引物Oj-112-F、Oj-112-R；
如序列表中SEQ ID No.43-44所示的核苷酸序列的引物Oj-115-F、Oj-115-R；
如序列表中SEQ ID No.45-46所示的核苷酸序列的引物Oj-119-F、Oj-119-R；
如序列表中SEQ ID No.47-48所示的核苷酸序列的引物Oj-120-F、Oj-120-R；
如序列表中SEQ ID No.49-50所示的核苷酸序列的引物Oj-121-F、Oj-121-R；
如序列表中SEQ ID No.51-52所示的核苷酸序列的引物Oj-125-F、Oj-125-R；
如序列表中SEQ ID No.53-54所示的核苷酸序列的引物Oj-131-F、Oj-131-R；
如序列表中SEQ ID No.55-56所示的核苷酸序列的引物Oj-140-F、Oj-140-R；
如序列表中SEQ ID No.57-58所示的核苷酸序列的引物Oj-142-F、Oj-142-R；
如序列表中SEQ ID No.59-60所示的核苷酸序列的引物Oj-146-F、Oj-146-R；
如序列表中SEQ ID No.61-62所示的核苷酸序列的引物Oj-150-F、Oj-150-R；
如序列表中SEQ ID No.63-64所示的核苷酸序列的引物Oj-156-F、Oj-156-R；
如序列表中SEQ ID No.65-66所示的核苷酸序列的引物Oj-159-F、Oj-159-R。
2.一种如权利要求1所述的SSR分子标记引物组在水芹遗传多样性分析和种质资源遗传系谱分析中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述水芹遗传多样性分析及种质资源遗传系谱分析的方法，包括以下步骤：
（1）提取待检测的水芹材料的DNA样品；
（2）以步骤（1）提取的DNA样品为模版，采用所述SSR分子标记引物组对DNA样品进行PCR扩增，获得PCR产物；
（3）将步骤（2）所获得的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，并统计条带检测结果；
（4）根据步骤（3）所统计的条带检测结果进行水芹遗传多样性分析和种质遗传系谱分析。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：在步骤（2）中，PCR扩增采用的反应体系，包括10μl 的2×PCR Mix，1μl的正向引物，1μl的反向引物，1μl的稀释好的DNA模板，7μl 的ddH2O，总体积20μl。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：在步骤（2）中，PCR反应程序如下：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸6 s，30个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：在步骤（4）中，水芹遗传多样性分析和种质遗传系谱分析方法具体为，使用Power Marker和GenAlEx软件分析SSR扩增数据，计算多态信息含量、次等位基因频率、等位基因数、有效等位基因数、遗传多样性、期望杂合度的数据，并采用NTsys-pc计算水芹材料之间的遗传距离和遗传相似系数，使用SAHN构建UPGMA聚类树。
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