CN116731904A - 一株耐高渗的两歧双歧杆菌及其应用 - Google Patents

一株耐高渗的两歧双歧杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株耐高渗的两歧双歧杆菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明筛选出了一株两歧双歧杆菌CCFM1301，能够耐受1600mOsm/kg的渗透压，该菌株于5L罐中培养的发酵密度可达到(9.47±0.30)×109CFU/mL，冻干后菌粉活菌数可达到(4.02±0.13)×1011CFU/g，冻干存活率可达到(76.33±0.31)％，具有产业化应用前景。

Description

一株耐高渗的两歧双歧杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株耐高渗的两歧双歧杆菌及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)是乳酸菌中最重要的益生菌之一。在乳酸菌工业化生产或利用其生产酸、氨基酸等产品时，高密度培养是提高益生菌生物量、提高底物的转化率以满足其产业化的重要途径，然而，在高密度生产过程中，通常在恒pH培养条件下加入大量的碳、氮源，高浓度代谢产物和副产物的积累会造成发酵体系渗透压增加，最终会导致细胞停止生长，使得发酵液活菌数＜5×109CFU/mL。
由于乳酸菌自身的特点，在生产、运输、贮存和消耗过程菌体易失去活性，影响其产品的稳定性。真空冷冻干燥技术可以使乳酸菌菌剂在长期保存过程中保持较高的生物活性和稳定性，但是在该过程中，随着细胞的不断失水，未冷冻部分溶液的电解质浓度增加，造成细胞的结构和生理功能损伤，使其活性和某些功能丧失，影响复水后菌体的生长密度，最终导致细菌细胞裂解。此外，由于双歧杆菌发酵可以增加食品的风味，因此，双歧杆菌在发酵食品中得到了广泛应用，例如，将其制成酱油、泡菜、干酪等。为了抑制有害微生物的生长，延长保质期，通常加入大量的盐或糖，高浓度的糖或者盐在细胞外营造了高渗透压环境，致使细胞体积缩小甚至死亡。由于细胞能够平衡额外的乳糖和蔗糖浓度，所以糖施加的高渗胁迫只是瞬时渗透胁迫，而高盐浓度则会对菌体产生长期的渗透胁迫，是在食品发酵过程中遇到的一个主要环境应力。在含有益生菌的食品、药物或者化妆品中要求微生物在最终产品中保持较高的数量和活力，在这种情况下，需要降低水分活度(Aw)以帮助细菌存活和产品储存。水分减少造成的渗透压升高可能会影响益生菌的生理功能、生存能力和有益特性的表达。
双歧杆菌的高密度发酵、冻干保存以及使用过程中，渗透压胁迫会对菌体造成一定危害，但目前的研究局限于通过改进发酵方式、培养条件、冻存保护剂的种类与冻存条件来提高发酵与冻干过程中菌体抗渗透胁迫能力的研究，很少关注菌体自身的耐渗透压能力的提高。专利CN103266076A中报道了一株太空诱变的两歧双歧杆菌S7-T5，能耐受添加15％Nacl的培养基造成的高渗透压，但是，在上述高渗透压条件下，两歧双歧杆菌S7-T5只是处于可以生长的状态，并未披露此菌株的高密度发酵效果。张莹等对一株耐渗性高的两歧双歧杆菌菌株CCFM16进行逐级传代驯化得到耐渗性更高的菌株CCFM16-1300，所得菌株虽然耐渗性提高，但是生长受到抑制，无法满足工业生产中高密度发酵的要求。因此筛选耐渗透压能力较强，并且能够进行高密度发酵的菌株，是落实菌株产业化亟需解决的问题。
发明内容
本发明提供了一株两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1301，所述两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1301已于2023年2月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:63175，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
所述两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1301是从来源于上海市的婴儿粪便样本中分离得到的，该菌株经测序分析，将测序得到的16S rDNA序列在NCBI中进行核酸序列比对，结果显示菌株为两歧双歧杆菌，根据《伯杰氏系统细菌学手册》中双歧杆菌属的分类规定，两歧双歧杆菌属于放线菌门(Actinobacteria)、放线菌纲(Actinobacteria)、放线菌亚纲(Actinobacteridae)、双歧杆菌目(Bifidoacteriales)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)，两歧双歧杆菌种(Bifidobacterium bifidum)命名为两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1301。
所述两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1301在MRS固体培养基上的菌落呈小的、白色、不透明状。
本发明还提供了含有两歧双歧杆菌CCFM1301的微生物制剂。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物制剂为含有两歧双歧杆菌CCFM1301的液体或固体制剂。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物制剂中含有两歧双歧杆菌CCFM1301活菌数≥1.21×1011CFU/mL或者≥4.02×1011CFU/g。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物制剂还含有山梨糖醇和甘氨酸。
本发明还提供了制备所述微生物制剂的方法，将两歧双歧杆菌CCFM1301接种到高密度培养基进行发酵。
在本发明的一种实施方式中，所述高密度培养基的成分包含胰酪蛋白胨、葡萄糖、半胱氨酸、MgSO4·7H2O、吐温80。
优选地，所述高密度培养的培养基的成分包含胰酪蛋白胨37g/L、葡萄糖55g/L、半胱氨酸1g/L、MgSO4·7H2O 1.25g/L、吐温80 1mL/L。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵是高密度发酵，所述高密度发酵的接种量为3～5％(v/v)，发酵温度30～40℃，pH 5.5～6.5，发酵16～18h。
本发明还提供了两歧双歧杆菌CCFM1301，或其微生物制剂，或制备含两歧双歧杆菌CCFM1301的微生物制剂的方法在高密度发酵制备两歧双歧杆菌或含两歧双歧杆菌的产品中的应用，所述产品包括食品、药品、化妆品。
有益效果
(1)本发明筛选出了一株两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1301，此菌株可耐高渗，能够耐受1600mOsm/kg的渗透压，即添加3.6％的NaCl溶液的培养基造成的高渗透压。
(2)将本发明筛选出的两歧双歧杆菌CCFM1301接种至高密度发酵培养基中发酵18h，即可使两歧双歧杆菌CCFM1301的发酵密度达到(9.47±0.30)×109CFU/mL。
(3)本发明筛选出的两歧双歧杆菌CCFM1301在冷冻干燥过程中体现出良好的抗渗透胁迫能力，冻干存活率达到(76.33±0.31)％，可高效产业化。
生物材料保藏
一株两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1301，分类学命名为Bifidobacterium bifidum，已于2023年2月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO:63175，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
附图说明
图1：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1301的菌落特征。
图2：两歧双歧杆菌CCFM1301在不同渗透压下的生长曲线及生长代时。
图3：两歧双歧杆菌CCFM16在不同渗透压下的生长曲线及生长代时。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸氢二铵、琼脂粉、胰酪蛋白胨、七水硫酸镁、一水硫酸锰、吐温80、半胱氨酸氨酸盐购自上海创赛科技有限公司。
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS固体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO40.05 g/L、吐温80 1mL/L、琼脂20g/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。
MRS液体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO40.05 g/L、吐温80 1mL/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。
调节渗透压的MRS培养基：在MRS液体培养基中添加NaCl调节渗透压，1L MRS液体培养基中添加3g NaCl渗透压平均增长100mOsm/kg。(MRS液体培养基渗透压为300mOsm/kg)
高密度发酵培养基：胰酪蛋白胨37g/L、葡萄糖55g/L、半胱氨酸1g/L、MgSO4·7H2O1.25g/L、吐温80 1mL/L。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
乳酸菌活菌数的测定：
采用国标《GB 4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》。
乳酸菌冻干存活率的测定：
按照以下公式计算双歧杆菌的冻干存活率：
葡萄糖含量检测：使用葡萄糖测定试剂盒测定(产品编号：碧云天S0201M)
渗透压检测：使用型冰点渗透压测定仪测定。
复水条件：冻干结束后取出对应样品用常温生理盐水复水至冻干前体积。
HPLC检测脯氨酸的条件：流动相A(pH＝7.2):27.6mmo/L醋酸钠-三乙胺-四氢呋喃(体积比为500:0.11:2.5)；流动相B(pH＝7.2):80.9mmol/L醋酸钠-甲醇-乙腈(体积比为1:2:2)。Agilent Hypersil ODS柱(5μm,4.0mm x 250mm)；采用梯度洗脱，洗脱程序为:0min，8％B；17min,50％B；20.lmin,100％B；24.0min,0％B；流动相流速为1.0mL/min；柱温为40C；紫外检测器(VWD)检测波长为262nm。
ICPMS检测K+的条件：使用1μg/L的调谐液对仪器条件进行最优化,最优化参数为：射频功率：1320W；载气流速：1.15L/min；采样深度:7mm；S/C温度：2℃；蠕动泵转速：0.1r/min；采样锥与截取锥类型：镍锥；样品提升速度：0.50r/min；重复取样次数：3次。
实施例1：两歧双歧杆菌CCFM1301的筛选及菌种鉴定
1、筛选
以来源于上海市的婴儿粪便为样本，用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释至10-6，然后分别取100μL稀释倍数为10-4、10-5、10-6的稀释液于MRS固体培养基上进行平板涂布，37℃倒置培养48h，观察并记录菌落形态；挑取MRS固体培养基上不同形态的菌落进行划线分离，经37℃培养48h后，再次挑取MRS固体培养基上不同形态的单菌落进行划线分离，直至得到形态一致的纯的单菌落；挑取MRS固体培养基上的单菌落接种于5mLMRS液体培养基中，37℃培养18h；再按5％的接种量分别接种至渗透压为700、1000、1300、1600mOsm/kg的MRS液体培养基中，筛选出耐渗能力较高的菌株，得到菌株CCFM1301。
2、鉴定
提取菌株CCFM1301的基因组，将菌株CCFM1301的16S rDNA进行扩增和测序(由英潍捷基贸易有限公司进行)，将该序列在NCBI中进行核酸序列比对，结果显示菌株为两歧双歧杆菌，命名为两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1301。
3、保存
挑取两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1301的单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃培养18h，得到菌液；取1mL菌液于无菌离心管中，8000r/min离心3min后弃去上层培养基，菌泥重悬于30％甘油溶液中置于-80℃中保藏。
实施例2：两歧双歧杆菌CCFM1301的耐渗能力、培养与冻干
具体步骤如下：
(1)双歧杆菌种子液的制备：取实施例1获得的两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)CCFM1301在MRS固体培养基上划线，于37℃恒温培养36h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃恒温培养24h，得到种子液；
(2)将制备得到的种子液以5％(v/v)的接种量接种至装有MRS液体培养基的三角瓶中，在37℃厌氧培养24h，得到培养液；
(3)将步骤(2)制备得到的培养液按5％(v/v)的接种量分别接种至渗透压为300、700、1000、1300、1600mOsm/kg的5mLMRS液体培养基中，在37℃厌氧培养24h，每隔2h取样测定OD600，至稳定期，计算代时。结果如表1所示。
(4)配制高密度发酵培养基，将3L发酵培养基置于5L三联原位发酵罐，115℃15min高温灭菌，充氮气保压0.1Mpa冷却。
(5)将步骤(2)制备得到的培养液按5％(v/v)的接种量接种至步骤(4)的高密度发酵培养基中，在pH 6.5、37℃恒温培养，每隔2h取样测定OD600，至稳定期，发酵结束，得到发酵液；检测发酵终点的葡萄糖含量、发酵终点渗透压值和发酵液活菌数。结果如表2所示。
(6)将步骤(5)所得发酵液离心，收集菌体并与山梨糖醇和甘氨酸按质量比1：1配制的冻干保护剂溶液(溶液浓度40％)，震荡至充分均匀，将重悬液冻干，冻干工艺：预冻，控制层板温度在10min内从室温降温至-4℃维持1h，在1h降至-50℃，保持1h；一次干燥阶段降低真空度并调节层板1h内升温至-30℃，以200μbar的真空度下保持18h以除去自由水；二次干燥，控制层板温度1h升温至25℃，在真空度为20μbar的条件下保持16h；制备得到菌粉；分别检测菌粉复水后的活菌数与冻干前重悬液中的活菌数，计算得到冻干存活率。结果如表2所示。
表1两歧双歧杆菌CCFM1301的耐渗能力结果
结果表明，两歧双歧杆菌CCFM1301的初始抑制渗透压(生长速率开始被抑制时的渗透压)为1000mOsm/kg，完全抑制渗透压(生长速率完全被抑制时的渗透压)为1600mOsm/kg。
表2两歧双歧杆菌CCFM1301利用本实施例发酵冻干结果
结果表明，培养结束时发酵液葡萄糖含量≥3.00g/L，说明本发明的发酵培养基中的葡萄糖含量充足；发酵结束发酵液渗透压均接近完全抑制渗透压；发酵液活菌数为(9.47±0.30)×109CFU/mL，冻干复水后活菌数为(1.21±0.12)×1011CFU/ml，冻干后菌粉活菌数为(4.02±0.13)×1011CFU/g，冻干存活率为(76.33±0.31)％。
实施例3：两歧双歧杆菌CCFM1301在渗透压胁迫下的K+含量变化
(1)双歧杆菌种子液的制备：取实施例1获得的两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)CCFM1301在MRS固体培养基上划线，于37℃恒温培养36h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃恒温培养24h，得到种子液；
(2)将种子液按5％的接种量分别接种至普通MRS(渗透压为300mOsm/kg)，渗透压为1000mOsm/kg的MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h，在0h及对数期初期分别收菌后调整菌体浓度使OD600达0.45，10000g离心10min，收集菌体。
(3)将1mL菌泥与5mL硝酸加入酸缸泡过的50mL离心管，于石墨消解仪上160℃消解40min，再加入1mL双氧水，继续消解30min。最后定容到50mL，取10mL过膜，通过等离子体质谱仪ICPMS测定K+含量。结果如表3所示。
表3两歧双歧杆菌CCFM1301在不同渗透压胁迫下K+含量(mg/g)结果
结果表示，在1000mOsm/kg渗透压下，两歧双歧杆菌CCFM1301从发酵0h至对数期初期K+含量的增加量较渗透压为300mOsm/kg时升高了25倍，说明K+在一定程度上调节了细菌渗透压平衡。
实施例4：两歧双歧杆菌CCFM1301在渗透压胁迫下的脯氨酸含量
(1)双歧杆菌种子液的制备：
取实施例1获得的两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1301在MRS固体培养基上划线，于37℃恒温培养36h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃恒温培养24h，得到种子液；
(2)将两歧双歧杆菌分别接种于加盐至1000mOsm/kg与不加盐(渗透压为300mOsm/kg)的体积为100mL的MRS培养基中37℃培养24h，并用灭好菌的MRS液体培养基调整菌体浓度使OD600达0.45。
(4)取等量的培养基进行样品处理：4℃，5000r/min下离心20min，收集菌体然后用PBS洗涤，以上过程重复3次。收集菌体，在超声细胞破碎仪中按以下流程进行破碎：7.6min，工作/间歇＝5S/5S。然后于-80℃反复冻融5～6次，反复超声5～6次，进行离心(4000r/min，20min)取上清，用10g/100mL三氯乙酸(TCA)等体积稀释，记录稀释倍数，放置1h，保证溶液体系中TCA终浓度为5％。双层滤纸过滤后，取1mL澄清滤液于1.5mL离心管内，编号，15000rpm离心30min。用0.22μm水膜再次过滤后，取400μL上清液于液相样品瓶。通过高效液相色谱仪HPLC测定两歧双歧杆菌CCFM1301在渗透压胁迫下的脯氨酸含量变化。结果如表4所示。
表4两歧双歧杆菌CCFM1301在渗透压胁迫下的脯氨酸含量
结果表示，两歧双歧杆菌CCFM1301在渗透压为1000mOsm/kg时，胞内脯氨酸浓度提高，是渗透压为300mOsm/kg时的2.2倍，说明脯氨酸在一定程度上调节了细菌渗透压平衡。
对照例1：两歧双歧杆菌CCFM16的耐渗能力、培养与冻干
具体实施方式与实施例2相同，区别在于，用两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)CCFM16替换两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1301，两歧双歧杆菌CCFM16已公开于专利号为CN106834187A的专利中。测定两歧双歧杆菌CCFM16的稳定期OD600，并计算代时，结果如表5所示。检测发酵终点的葡萄糖含量、发酵终点渗透压值和发酵液活菌数，结果如表6所示。将菌体冻干，分别检测菌粉复水后的活菌数与冻干前重悬液中的活菌数，计算得到冻干存活率，结果如表6所示。
表5两歧双歧杆菌CCFM16的耐渗能力结果
结果表明，两歧双歧杆菌CCFM16的初始抑制渗透压为700mOsm/kg，完全抑制渗透压为900mOsm/kg，远小于两歧双歧杆菌CCFM1301。
表6两歧双歧杆菌CCFM16利用本实施例发酵冻干结果
结果表明，培养结束时发酵液葡萄糖含量为29.20g/L，说明本发明的发酵培养基中的葡萄糖含量充足；发酵结束发酵液渗透压未达到完全抑制渗透压，可能是受初始培养基渗透压过高影响；发酵液活菌数为(5.42±0.4)×108CFU/mL，冻干存活率为(34.42±0.26)％，均明显低于两歧双歧杆菌CCFM1301。
对照例2：两歧双歧杆菌CCFM16在渗透压胁迫下的K+含量变化
具体实施方式与实施例3相同，区别在于，用两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)CCFM16替换两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1301，测定两歧双歧杆菌CCFM16在初始抑制渗透压胁迫下的K+含量。结果如表7所示。
表7两歧双歧杆菌CCFM16在不同渗透压胁迫下K+含量(mg/g)结果
结果表示，在初始抑制渗透压700mOsm/kg下，两歧双歧杆菌CCFM1301从发酵0h至对数期初期K+含量的增加量较渗透压为300mOsm/kg时时升高了5.8倍，但升高的量明显低于两歧双歧杆菌CCFM1301，说明两歧双歧杆菌CCFM16受到渗透压胁迫时，维持离子平衡方面的能力弱于两歧双歧杆菌CCFM1301。
对照例3：两歧双歧杆菌CCFM16在渗透压胁迫下的脯氨酸含量
具体实施方式与实施例4相同，区别在于，用两歧双歧杆菌CCFM16替换两歧双歧杆菌CCFM1301，测定两歧双歧杆菌CCFM16在初始抑制渗透压胁迫下的脯氨酸含量变化。结果如表8所示。
表8两歧双歧杆菌CCFM16在渗透压胁迫下的脯氨酸含量
结果表示，两歧双歧杆菌CCFM16在渗透压为700mOsm/kg时，稳定期胞内脯氨酸浓度为10.19mg/g，比两歧双歧杆菌CCFM1301低1.6倍，说明两歧双歧杆菌CCFM16受到渗透压胁迫时，脯氨酸作为兼容性溶质的调控能力弱于两歧双歧杆菌CCFM1301。
对照例4：两歧双歧杆菌CCFM1301、CCFM16、CCFM16-1300发酵密度
具体步骤如下：
(1)双歧杆菌种子液的制备：取实施例1获得的两歧双歧杆菌CCFM1301以及对照株CCFM16、CCFM16-1300在MRS固体培养基上划线，于37℃恒温培养36h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃恒温培养24h，得到种子液；
(2)配制两组不同渗透压的发酵培养基，A组：葡萄糖：30g/L、胰酪蛋白胨26g/L、MgSO4·7H2O 1.25g/L、半胱氨酸1g/L(渗透压为360mOsm/kg)；B组：葡萄糖55g/L、胰酪蛋白胨37g/L、MgSO4·7H2O 1.25g/L、半胱氨酸1g/L(渗透压为590mOsm/kg)。将配置好的3L发酵培养基置于5L三联原位发酵罐，115℃15min高温灭菌，充氮气保压0.1Mpa冷却。
(3)将步骤(1)制备得到的培养液按5％(v/v)的接种量接种至步骤(2)的高密度发酵培养基中，在pH 6.5、37℃恒温培养，每隔2h取样测定OD600，至稳定期，发酵结束，得到发酵液；检测发酵终点的葡萄糖含量、发酵终点渗透压值和发酵液活菌数。结果如表9所示。
表9不同渗透压下两歧双歧杆菌发酵密度
结果表示，CCFM1301的发酵密度显著高于CCFM16与CCFM16-1300。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一株耐高渗的两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)CCFM1301，其特征在于，所述两歧双歧杆菌CCFM1301已于2023年2月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo:63175。
2.含权利要求1所述两歧双歧杆菌CCFM1301的微生物制剂。
3.如权利要求2所述微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂为含有两歧双歧杆菌CCFM1301的液体或固体制剂。
4.如权利要求3所述微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂中含有两歧双歧杆菌CCFM1301活菌数≥1.21×1011CFU/mL或者≥4.02×1011CFU/g。
5.如权利要求4所述微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂还含有山梨糖醇和甘氨酸。
6.一种制备权利要求2-5任一所述微生物制剂的方法，其特征在于，将权利要求1所述两歧双歧杆菌CCFM1301在培养基中发酵。
7.如权利要求6所述方法，其特征在于，所述培养基为高密度培养基；所述高密度培养基含有：胰酪蛋白胨20～30g/L、葡萄糖60～70g/L、半胱氨酸0.1～1.0g/L、MgSO4·7H2O0.1～1.0g/L、吐温80 1～2mL/L。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵是高密度发酵，接种量以体积百分比计，为3～5％，发酵温度30～40℃，pH5.5～6.5，发酵16～18h。
9.权利要求1所述两歧双歧杆菌CCFM1301，或权利要求2-5任一所述微生物制剂，或权利要求6-8任一所述方法在高密度发酵制备两歧双歧杆菌或含两歧双歧杆菌的产品中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述产品包括食品、药品或化妆品。
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