CN115386502A - 一株烟曲霉菌株pjz-1及其应用、产品与方法 - Google Patents

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Abstract

本发明一株烟曲霉菌株PJZ‑1及其应用、产品与方法属于微生物技术领域。本发明提供一株烟曲霉（Aspergillus fumigatus）菌株PJZ‑1，其保藏编号为CGMCC No.40050。本发明还提供菌株PJZ‑1在降解四环素方面的用途，以及基于该菌株PJZ‑1的菌剂和四环素降解剂产品以及一种降解四环素的方法。本发明的PJZ‑1菌株在不同pH、不同温度、不同时间、不同金属离子存在、不同四环素浓度下均表现出不同程度的降解四环素的活性。

Description

一株烟曲霉菌株PJZ-1及其应用、产品与方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株烟曲霉菌株PJZ-1及其应用、产品与方法。
背景技术
烟曲霉（拉丁名为Aspergillus fumigatus）是一种重要的致病菌，也是引起食品腐败的一种真菌。烟曲霉的菌落生长迅速，绒状或作一定的絮状，暗烟绿色，老后色变得更深。此菌嗜高温，在45℃或更高的温度下生长茂盛。在粮食发热霉变的中期和后期常大量出现，促进粮温的升高和败坏。烟曲霉能寄生在人、鸟类及其它脊椎动物的肺部引起结核症。
四环素是一种抗生素，其在干燥状态下极为稳定，四环素的水溶液相当稳定。四环素还能溶于稀酸、稀碱等，略溶于水和低级醇，但不溶于醚及石油醚。由于在很长一段时期内人们对抗生素（包括抗生素）的滥用，环境中出现抗生素污染现象，其中四环素在水体和土壤中的污染情况也不容乐观。
为解决抗生素污染问题，目前已报道的方法有多种，例如，采用微生物降解、用光催化剂降解催化、使用吸附剂吸附等。
目前已报道可降解四环素的微生物有氨基杆菌、蜡状芽孢杆菌、不动杆菌、黄孢原毛平革菌、柠檬酸杆菌等。
然而，本领域尚未出现用烟曲霉降解四环素、或者具有四环素降解功能的烟曲霉的相关报道。
发明内容
为解决本领域存在的上述技术问题、填补本领域的空白，本发明提供一株具有抗生素降解性能的烟曲霉（Aspergillus fumigatus）菌株PJZ-1及其应用、产品与方法。
本发明的技术方案如下：
一株烟曲霉（Aspergillus fumigatus）菌株PJZ-1，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No. 40050。
保藏编号为CGMCC No. 40050的烟曲霉（Aspergillus fumigatus）菌株PJZ-1在降解四环素方面的用途。
降解的条件选自下述条件中的一种或一种以上：
降解时间为3-9天；
降解温度为20℃-40℃；
降解pH值为5-9；
降解的培养基中添加金属盐离子选自：铜离子、铁离子、锰离子、镁离子；
降解的底物浓度为25-200mg/l；
优选地，所述底物指四环素；
优选地，所述培养基为MSM培养基。
一种菌剂，其特征在于，包括：保藏编号为CGMCC No. 40050的烟曲霉（Aspergillus fumigatus）菌株PJZ-1。
所述的一种菌剂，其特征在于，还包括：菌剂辅料。
一种四环素降解剂，包括降解四环素的活性成分，其特征在于，所述降解四环素的活性成分包括：保藏编号为CGMCC No. 40050的烟曲霉（Aspergillus fumigatus）菌株PJZ-1。
所述降解四环素的活性成分还包括：催化降解四环素的光催化剂、吸附四环素的吸附剂、降解四环素的微生物菌株。
一种降解四环素的方法，其特征在于，采用保藏编号为CGMCC No. 40050的烟曲霉（Aspergillus fumigatus）菌株PJZ-1降解四环素。
所述降解的条件选自下述条件中的一种或一种以上：
降解的时间为3-9天；
降解的温度为20℃-40℃；
降解的pH值为5-9；
降解的培养基中添加金属盐离子选自：铜离子、铁离子、锰离子、镁离子；
降解的底物浓度为25-200mg/L。
所述降解的条件选自：降解的时间为9天、或，降解的温度为40℃、或，降解的pH值为5、或，降解的培养基中添加铜离子、或，降解的底物浓度为25mg/L；
优选地，所述底物指四环素；
优选地，所述培养基为MSM培养基。
本发明首次提供一株具有四环素降解性能的烟曲霉（Aspergillus fumigatus）菌株PJZ-1，并通过多因素实验反复验证其在不同条件下的四环素降解功能。本发明通过在培养基中添加四环素的方式从土壤样品中筛选得到一株新菌株，经分子生物学鉴定为烟曲霉（Aspergillus fumigatus）菌株，将其命名为菌株PJZ-1。该菌株在不同pH、不同温度、不同时间、不同金属离子存在、不同四环素浓度下均表现出不同程度的降解四环素的活性。本发明的烟曲霉（Aspergillus fumigatus）菌株PJZ-1可广泛应用于四环素降解、环境保护、土壤修复、水体修复等领域。
本发明烟曲霉（Aspergillus fumigatus）菌株PJZ-1的保藏信息如下：
菌种保藏名称：PJZ-1
保藏编号：CGMCC No. 40050
分类命名：烟曲霉 Aspergillus fumigatus
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2022年1月21日。
附图说明
图1为本发明实验例1.3部分的PJZ-1菌株平板培养的形态图和电镜下的形态他。
图2为本发明实验例1.3部分的PJZ-1菌株的系统发育树。
图3为本发明实验例2.2部分的PJZ-1菌株对四环素降解率虽天数变化的柱形图。
图4为本发明实验例2.2部分的PJZ-1菌株在不同温度下对四环素的降解率的柱形图。
图5为本发明实验例2.2部分PJZ-1菌株在不同pH条件下四环素降解率的柱形图。
图6为本发明实验例2.2部分PJZ-1菌株在添加不同离子条件下的四环素降解率的柱形图。
图7为本发明实验例2.2部分PJZ-1菌株在不同底物浓度下的四环素降解率的柱形图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和实验例对本发明的具体内容和技术效果做进一步的详细描述，但并不以此限制本发明的保护范围。
第1组实施例、本发明的烟曲霉菌株PJZ-1
本组实施例提供一株烟曲霉（Aspergillus fumigatus）菌株PJZ-1，其保藏编号为CGMCC No. 40050。
本领域技术人员根据本发明的教导和启发，可将保藏号为CGMCC No. 40050的烟曲霉（Aspergillus fumigatus）菌株LRa05用于制备降解四环素功能的任何制品或用于降解四环素。任何使用、培养、扩繁、接种、制备、生产、发酵保藏号为CGMCC No. 40050的烟曲霉（Aspergillus fumigatus）菌株LRa05并将其用于制备四环素降解功能或用途的任何形式的产品或直接用于降解四环素的行为，均落入本发明的保护范围。
第2组实施例、本发明的烟曲霉菌株PJZ-1的用途
本组实施例提供保藏编号为CGMCC No. 40050的烟曲霉（Aspergillus fumigatus）菌株PJZ-1在降解四环素方面的用途。
在具体的实施例中，降解的条件选自下述条件中的一种或一种以上：
降解时间为3-9天；
降解温度为20℃-40℃；
降解pH值为5-9；
降解的培养基中添加金属盐离子选自：铜离子、铁离子、锰离子、镁离子；
降解的底物浓度为25-200mg/l；
优选地，所述底物指四环素；
优选地，所述培养基为MSM培养基。
第3组实施例、本发明的菌剂
本组实施例提供一种菌剂。本组所有实施例都具备如下共同特征：所述菌剂包括：保藏编号为CGMCC No. 40050的烟曲霉（Aspergillus fumigatus）菌株PJZ-1。
在进一步的实施例中，所述一种菌剂还包括：菌剂辅料。
在具体的实施例中，所述菌剂辅料包括但不限于：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。
本领域技术人员根据实际生产中药物的剂型与规格，可对上述药用辅料进行选择和调整，以获得合适的适于本发明的以烟曲霉（Aspergillus fumigatus）菌株LRa05为活性成分的降解四环素产品的制备、生产、存放、运输、使用、崩解、释放的菌剂产品。
第4组实施例、本发明的四环素降解剂
本组实施例提供一种四环素降解剂。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述四环素降解剂包括降解四环素的活性成分，所述降解四环素的活性成分包括：保藏编号为CGMCC No. 40050的烟曲霉（Aspergillus fumigatus）菌株PJZ-1。
在进一步的实施例中，所述降解四环素的活性成分还包括：催化降解四环素的光催化剂、吸附四环素的吸附剂、降解四环素的微生物菌株。
第5组实施例、本发明的降解四环素的方法
本组实施例提供一种降解四环素的方法。本组所有的实施例都具备如下共同特征：采用保藏编号为CGMCC No. 40050的烟曲霉（Aspergillus fumigatus）菌株PJZ-1降解四环素。
在具体的实施例中，所述降解的条件选自下述条件中的一种或一种以上：
降解的时间为3-9天；
降解的温度为20℃-40℃；
降解的pH值为5-9；
降解的培养基中添加金属盐离子选自：铜离子、铁离子、锰离子、镁离子；
降解的底物浓度为25-200mg/L。
在优选的实施例中，所述降解的条件选自：降解的时间为9天、或，降解的温度为40℃、或，降解的pH值为5、或，降解的培养基中添加铜离子、或，降解的底物浓度为25mg/L；
优选地，所述底物指四环素；
优选地，所述培养基为MSM培养基。
实验例、
1四环素降解菌筛选及鉴定
1.1土壤样品及主要培养基
土壤样品：试验所用土壤均取自北京农学院林下土壤，取回后-20˚C保存待用。
无机盐培养基（MSM）：CaCl2 0.02 g，(NH4)2SO4 1.00 g，NaCl 0.50 g，K2HPO4 1.00g，KH2PO4 1.00 g，NH4NO3 1.00 g，FeCl3 0.05 g；H2O 1000 ml。
筛选培养基（MSM-T）：在经过灭菌处理的MSM中加入四环素，配制成不同浓度的培养基。
PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g；H2O 1000 ml。
活化培养基（PDA-T）：在经过灭菌处理的PDA培养基中加入四环素，配制成不同浓度。如需配置成琼脂平板时，加入琼脂18 g·L-1。
1.2试验方法
四环素降解菌筛选：取5 g土壤样品于灭菌三角瓶中，加入45 mL到MSM中，200rpm，振荡悬浮14天，经过1 h自然沉淀后取5 mL上清液加入含45 mL的MSM-T中，以20 mg·L-1的TC为碳源，在30℃、150 rpm的黑暗中培养。7 d后将5 mL菌悬浮液转移到含有40 mg·L-1 TC的新鲜增菌培养基中，并在相同条件下培养。对于每种新鲜的增菌培养基，TC的浓度都增加一倍。直至TC浓度达到100 mg·L-1。将富集后的菌液接种于含100 mg·L-1 PDA-T琼脂平板上，在30 ℃黑暗中培养7天，然后在PDA-T琼脂平板上反复划线分离菌落并纯化。
形态鉴定：取培养好的PJZ-1菌液5 mL，8000 rpm，离心5 min，并弃去上清液，收集菌体。向菌丝沉淀中加入磷酸缓冲液（0.02 mol·L-1；pH=7.2）经过悬浮漂洗10 min后离心弃上清（条件同上），重复进行一次。2.5%戊二醛振荡混匀后4˚C固定过夜。用磷酸缓冲液（0.02 mol·L-1；pH=7.2）进行清洗，重复3次，每次10 min。用1%锇酸处理至样品变色，加入磷酸缓冲液（0.02 mol·L-1；pH=7.2）重复清洗3次，每次10 min。依次使用30%、50%、70%、80%、85%、90%、95%、100%、100%乙醇进行梯度脱水3次，每次20 min。最后使用叔丁醇置换处理2次，每次10 min；将脱水后的菌体加入少量叔丁醇置于-20˚C冰箱中冷冻后，利用临界点干燥仪完成冷冻干燥处理。最后将碳导电胶带一面粘在平皿上，另一面粘上干燥后的菌体，进行离子溅射金。当离子溅射金完成后，进行扫描电镜观察。
分子鉴定：纯化的菌株PJZ-1经液氮研磨后，按照试剂盒说明进行菌株PJZ-1 DNA提取。使用真菌通用引物ITS1和ITS4进行菌株PJZ-1PJZ-1的ITS序列的PCR扩增。所述真菌通用引物ITS1和ITS4 为“利用ITS1和ITS4通用引物扩增香蕉枯萎病菌核酸片段鉴定其生理小种”一文中记载的公知公用的引物。
1.3试验结果
本试验通过逐步增加筛选培养基中TC浓度，以对降解菌株进行分离与筛选。当四环素浓度达到100 mg·L-1时，菌株PJZ-1能正常生长，通过平板划线，分离纯化菌株PJZ-1，对其形态进行初步观察。结果如图1所示，PJZ-1在PDA培养基上的菌落呈圆扇形、暗烟绿色、不透明、边缘整齐。菌落背面有黄色分泌物。电子显微镜下，分生孢子梗光滑，顶囊呈烧瓶状；分生孢子球形。
以PJZ-1的总DNA为模版，进行PCR扩增ITS序列，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。经过菌株PJZ-1的ITS序列在NCBI上进行BLAST比对后，下载与PJZ-1相关种属的ITS序列构建系统发育树，由图2可知PJZ-1的ITS序列与Aspergillus 属归属同一簇群，且菌株与Aspergillus fumigatus 聚在一起，结合形态特征和ITS遗传发育分析结果，将菌株PJZ-1命名为Aspergillus fumigatus PJZ-1，并送保藏，其保藏信息如下：
菌种保藏名称：PJZ-1
保藏号：CGMCC No. 40050
分类命名：烟曲霉 Aspergillus fumigatus
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院3 号
保藏日期：2022年1月21日。
2菌株PJZ-1生长特性及四环素降解效率
2.1试验方法
（1）Na2EDTA-McIlvaine 缓冲溶液：称取一定量的柠檬酸和 Na2HPO4 分别配制成0.2 mol·L-1 的溶液。将柠檬酸溶液和Na2HPO4 溶液按照 8:5（v/v）混合，配制成McIlvaine 溶液。称取37.2 g Na2EDTA 于1 L McIlvaine溶液中，配得0.1 mol ·L-1 的EDTA-McIlvaine 提取液，其pH=4.0。
（2）四环素含量的检测采用高效液相色谱检测法，将经由PJZ-1降解的培养液以8000 r min-1，4˚C，离心10 min。弃去沉淀物，收集上清液。按1:1（v/v）加入NA2EDTA-McIlvaine 缓冲液（pH=4.0），漩涡震荡20 s混均后，室温超声20 min。经0.22 µm 微孔滤膜过滤，密封于液相样品瓶中，-20˚C 冻藏待测。
（3）四环素检测采用waters高效液相色谱仪，C18反相色谱柱（2.7µm, 100×4.6mm）；流动相为0.01 mol·L-1 草酸/乙腈/甲醇70/25/5（v/v/v）。流速：1 mL·min-1；柱温：30 ˚C；紫外检测器，波长360 nm；进样量：20 µL。
（4）配置四环素浓度为100 mg·L-1、pH值为7.0的MSM-T，其中温度分别设定为20、30、40˚C。将活化后的试验菌PJZ-1（OD600=1）以10%的接种量接种至培养液中，150 rpm黑暗培养7 d后取样。
（5）配置四环素浓度为100 mg·L-1的MSM-T，其pH值分别设定为5、6、7、8、9。将活化后的试验菌（OD600=1）以10%的接种量接种至培养液中，30˚C，150 rpm黑暗培养7 d后取样。
（6）配置四环素浓度为100 mg·L-1、pH值为7.0的MSM-T，将其培养液中分别加入MnSO4·H2O、MgSO4、CuSO4、FeCl3和Free（不添加金属盐）。将活化后的试验菌（OD600=1）以10%接种量接种至培养液中，30˚C，150 rpm黑暗培养7 d后取样。以上每个处理进行3次重复。
2.2试验结果
（1）在MSM-T培养基中菌株PJZ-1的生长曲线，在第3天干重达到顶峰，达到了1.73mg，接近第一天菌干重的两倍。从第3天到第7天，PJZ-1的干重稍有下降的趋势，到第9天菌重开始降到了0.87mg，第9~13天干重趋于平稳。随着时间的推移，MSM-T中的营养物质逐渐被消耗掉，而有毒物质在不断积累，逐渐死亡。如图3所示，PJZ-1培养初期四环素降解率较低，随着培养时间延长，降解率开始大幅度提升，到第5天，降解率升高了三倍多为41%，在第9天时的降解率达67.65%。
（2）经培养7天后，不同温度的四环素降解效率是不同的，如图4所示，在20˚C时四环素残留量最高，降解率为68.66%。在30˚C的条件下，四环素的降解效率达到3.58%。在40˚C时，四环素降解率为84.38%。温度升高加速了四环素降解，但具体是非生物降解导致的还是PJZ-1作用加强还有待于进一步研究。
（3）在不同pH条件下菌株PJZ-1培养7天后，四环素降解效率与pH值呈反比。如图5所示，在pH值为5时，四环素残留量仅剩5.32 mg·L-1，降解率高达78.01%。在pH值为6-9时，降解效率分别为65.83%、66.67%、55.75%和53.59%。
（4）在MSM中添加CuSO4、FeCl3、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O等4种不同金属盐，培养7天后，结果如图6所示，以铜离子和锰离子的金属盐离子的水体环境中的降解率较高，分别为86.67%和76.67%，显著高于其它两种金属盐离子环境的降解率。
(5)PJZ-1在不同的四环素浓度中明显有着显著差异，如图7所示，在25mg/L和50mg/L的降解率显著高于其它浓度降解结果。其中，加入25mg/L四环素的降解率又显著高于加入50mg/L四环素的降解率，前者的降解率达72.30%，后者的降解率达61.95%，这说明在水体环境中，偏低的四环素浓度更易被PJZ-1降解。

Claims (10)

1.一株烟曲霉（Aspergillus fumigatus）菌株PJZ-1，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNo. 40050。
2.保藏编号为CGMCC No. 40050的烟曲霉（Aspergillus fumigatus）菌株PJZ-1在降解四环素方面的用途。
3.根据权利要求2所述的保藏编号为CGMCC No. 40050的烟曲霉（Aspergillus fumigatus）菌株PJZ-1在降解四环素方面的用途，其特征在于，降解的条件选自下述条件中的一种或一种以上：
降解时间为3-9天；
降解温度为20℃-40℃；
降解pH值为5-9；
降解的培养基中添加金属盐离子选自：铜离子、铁离子、锰离子、镁离子；
降解的底物浓度为25-200mg/l；
和/或，所述底物指四环素；
和/或，所述培养基为MSM培养基。
4.一种菌剂，其特征在于，包括：保藏编号为CGMCC No. 40050的烟曲霉（Aspergillus fumigatus）菌株PJZ-1。
5.根据权利要求4所述的一种菌剂，其特征在于，还包括：菌剂辅料。
6.一种四环素降解剂，包括降解四环素的活性成分，其特征在于，所述降解四环素的活性成分包括：保藏编号为CGMCC No. 40050的烟曲霉（Aspergillus fumigatus）菌株PJZ-1。
7.根据权利要求6所述的一种四环素降解剂，其特征在于，所述降解四环素的活性成分还包括：催化降解四环素的光催化剂、吸附四环素的吸附剂、降解四环素的微生物菌株。
8.一种降解四环素的方法，其特征在于，采用保藏编号为CGMCC No. 40050的烟曲霉（Aspergillus fumigatus）菌株PJZ-1降解四环素。
9.根据权利要求8所述的一种降解四环素的方法，其特征在于，所述降解的条件选自下述条件中的一种或一种以上：
降解的时间为3-9天；
降解的温度为20℃-40℃；
降解的pH值为5-9；
降解的培养基中添加金属盐离子选自：铜离子、铁离子、锰离子、镁离子；
降解的底物浓度为25-200mg/L。
10.根据权利要求8或9所述的一种降解四环素的方法，其特征在于，所述降解的条件选自：降解的时间为9天、或，降解的温度为40℃、或，降解的pH值为5、或，降解的培养基中添加铜离子、或，降解的底物浓度为25mg/L；
和/或，所述底物指四环素；
和/或，所述培养基为MSM培养基。
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