CN112094758A - 一种烟曲霉菌株及其在降解聚乙烯醇中的应用 - Google Patents

一种烟曲霉菌株及其在降解聚乙烯醇中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种烟曲霉菌株及其在降解聚乙烯醇中的应用，该烟曲霉菌株命名为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)GPVA1，保藏编号为CCTCC NO:M 2020213，保藏日期为2020年6月17日。本发明首次提供了能够降解聚乙烯醇(PVA)的烟曲霉菌株，该菌株能在以聚乙烯醇为唯一碳源的固体无机盐培养基或液体无机盐培养基中生长并降解PVA，在24小时内能将液体培养基中PVA的浓度减少2.72g/L，具有应用于环境中PVA污染微生物处理的潜力。本发明提供的烟曲霉菌株不仅具有聚乙烯醇降解能力，而且能够利用至少80种碳源，碳源利用能力强。

Description

一种烟曲霉菌株及其在降解聚乙烯醇中的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种烟曲霉菌株及其在降解聚乙烯醇中的应用。
背景技术
聚乙烯醇(PVA)是以石油裂解产物为原料制作的化工原料，具有良好的水溶性、黏附性、浆膜强韧性和耐磨性、强有机溶剂耐受性，被广泛应用于纺织、纸制品制造、食品包装和医疗器械等行业。PVA是生产量最大的水溶性聚合物，且其生产和消费量逐年递增，导致大量PVA排入环境，造成了环境污染，影响生态平衡。PVA具有较大的表面活性，能在水中形成大量泡沫，导致水体富氧，黏度增大，从而抑制甚至破坏水生生物的呼吸活动。因此，PVA的降解处理对保护环境具有重要的意义。
PVA在自然条件下不易被降解，需要通过物理化学或生物的方法处理。处理PVA 的物理化学方法包括超滤膜分离法、辐射法、盐析絮凝法、高级氧化法、单独臭氧氧化法等，其存在成本高和二次污染等问题。相比之下，生物降解PVA更加经济和高效。
PVA可生化性差，难以被普通微生物降解利用，但是可以被特定的功能微生物或酶降解。研究表明，PVA降解菌在自然界中的分布并不广泛，一般仅存在于被PVA污染的环境中，如PVA纺织废水和造纸废水。自1936年Nord首次报道了镰刀菌可以降解PVA以来，已有部分PVA降解菌得到分离纯化，如Pseudomonas O-3、Pseudomonas vesiculars PD、Pseudomonas putida、Bacillus magaterium、Acinetiobactor sp.、 Xanthamonas sp.等，但是，绝大部分菌株因为效率低等原因，仍无法满足实际应用的需要。筛选分离高效菌株是研发PVA微生物降解技术的关键。
因此，有必要筛选能满足实际应用要求的新微生物资源，为PVA污染微生物修复提供支撑。
发明内容
本发明提供了的目的在于提供一株降解聚乙烯醇的烟曲霉，该菌株能在以聚乙烯醇(PVA)为唯一碳源的固体和液体无机盐培养基生长并降解PVA，具有应用于环境中PVA污染微生物处理的潜力。
具体技术方案如下：
一种烟曲霉菌株，命名为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)GPVA1，保藏编号为CCTCC NO:M 2020213，保藏日期为2020年6月17日。
上述烟曲霉(Aspergillus fumigatus)GPVA1于2020年6月17日保藏于中国典型培养物菌种保藏管理中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020213，命名为烟曲霉 (Aspergillusfumigatus)GPVA1。
上述烟曲霉(Aspergillus fumigatus)GPVA1的28S rRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示，rDNA-ITS基因序列如SEQ ID NO:2所示，18S rRNA基因序列如SEQ ID NO:3 所示。
上述烟曲霉(Aspergillus fumigatus)GPVA1的生物学特征为：菌落向培养基表面隆起，疏松、干燥、呈绒毛状、边缘为白色，中间为烟绿色，有大量孢子产生，孢子为球型，顶囊为倒烧瓶状，无色素产生。
本发明提供了一种包含所述的烟曲霉菌株的菌剂。
本发明提供了所述的烟曲霉菌株在降解聚乙烯醇中的应用。
本发明提供了所述的菌剂在降解聚乙烯醇中的应用。
本发明将烟曲霉(Aspergillus fumigatus)GPVA1置于以聚乙烯醇(PVA1799)为唯一碳源的固体无机盐培养基和液体无机盐培养基进行生长和培养，发现该烟曲霉(Aspergillus fumigatus)GPVA1能够24小时内将液体培养基中PVA浓度减少2.72g/L。
其中，固体无机盐培养基的成分为K2HPO4 0.7g、KH2PO4 0.7g、MgSO4·7H2O 0.7g、NaCl 0.005g、FeSO4·7H2O 0.002g、ZnSO4·7H2O 0.002g、MnSO4·H2O 0.001g、PVA 10g、琼脂18g、蒸馏水1000m L，灭菌。
液体无机盐培养基的成分为K2HPO4 0.7g、KH2PO4 0.7g、MgSO4·7H2O 0.7g、NaCl0.005g、FeSO4·7H2O 0.002g、ZnSO4·7H2O 0.002g、MnSO4·H2O 0.001g、PVA 10g、蒸馏水1000mL，灭菌。
进一步地，所述的应用，包括：将烟曲霉菌株接种至含聚乙烯醇的废水中进行处理。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明首次提供了能够降解聚乙烯醇(PVA)的烟曲霉菌株，该菌株能在以聚乙烯醇为唯一碳源的固体无机盐培养基或液体无机盐培养基中生长并降解PVA，在 24小时内能将液体培养基中PVA的浓度减少2.72g/L，具有应用于环境中PVA污染微生物处理的潜力。
(2)本发明提供的烟曲霉菌株不仅具有聚乙烯醇降解能力，而且能够利用至少 80种碳源，碳源利用能力强。
附图说明
图1为实施例2中烟曲霉(Aspergillus fumigatus)GPVA1的平板菌落观察图片。
图2为实施例2中烟曲霉(Aspergillus fumigatus)GPVA1的光学显微镜镜检(200X) 图片。
图3为菌株烟曲霉(Aspergillus fumigatus)GPVA1在平板培养基中降解PVA的图片。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
实施例1一株PVA降解功能菌株的筛选
1.1制作含PVA为唯一碳源的无机盐培养基平板：
培养基包括以下成分：K2HPO4 0.7g、KH2PO4 0.7g、Mg SO4·7H2O 0.7g、NaCl0.005g、FeSO4·7H2O 0.002g、ZnSO4·7H2O 0.002g、MnSO4·H2O 0.001g、PVA 10g、琼脂18g、蒸馏水1000m L。将培养基在121℃灭菌20min，然后冷却至不烫手后于无菌操作台内倒平板。
1.2培养PVA降解功能菌：
将具有降解特征的塑料袋在无菌水中清洗，得到含有微生物的清洗液，并将其涂在以PVA为唯一碳源的无机盐培养基平板上，于30℃培养，获得PVA降解功能菌。
1.3分离PVA降解功能菌株单菌落：
用无菌水冲洗长有PVA降解功能菌的平板，配制含菌悬浮液。按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5稀释含菌悬浮液，各吸取0.1ml涂在以PVA为唯一碳源的无机盐培养基平板上，30℃培养箱中倒置培养，获得长势良好、可降解PVA功能菌株单菌落。
1.4纯化PVA降解功能菌：
在以PVA为唯一碳源的无机盐培养基平板上挑取长势良好的单菌落接种到新的平板上，在30℃培养箱中倒置培养，待其长出孢子，用无菌水冲洗平板，配制浓度约为106个/mL的孢子悬浮液，按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5稀释孢子液，各吸取0.1ml 涂在以PVA为唯一碳源的无机盐培养基平板上，30℃培养箱中倒置培养，确保得到纯净的PVA降解功能菌株，命名为GPVA1。
实施例2菌株GPVA1的形态、碳源利用、分子生物学鉴定
菌株GPVA1的检测鉴定委托中国典型培养物保藏中心实施，结果如下：
2.1形态学特征
菌株在PDA培养基上生长良好，28℃培养3天后，菌落向培养基表面隆起，疏松、干燥、呈绒毛状、边缘为白色，中间为烟绿色(图1)，有大量孢子产生，孢子为球型，顶囊为倒烧瓶状，无色素产生(图2)。
2.2碳源利用特征
用biolog FF板检测GPVA1对95种碳源的利用情况，结果表明其能利用其中的 80种。
表1 GPVA1菌株的碳源利用检测
Figure RE-GDA0002778825070000041
Figure RE-GDA0002778825070000051
+：阳性反应；-：阴性反应；
2.3分子生物学特征
提取GPVA1的总DNA，用PCR扩增目的基因rDNA-ITS(引物ITS1: 5‘-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；ITS4:5‘-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)、28S rRNA基因(引物NL1:5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’；NL4:5’-GGTCCGT GTTTCAAGACGG-3’)、18S rRNA基因(引物NS1:5‘-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’； NS8:5‘-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3’)。扩增产物序列如下：
1)28S rRNA的基因序列如SEQ ID NO:1所示；
2)rDNA-ITS的基因序列如SEQ ID NO:2所示；
3)18SrRNA的基因序列如SEQ ID NO:3所示。
将rDNA-ITS基因、28S rRNA基因、18S rRNA基因在NCBI数据库中作blast比对，结果显示该菌株与Aspergillus fumigatus某些菌株具有共同的起源，故将菌株鉴定为:烟曲霉(Aspergillus fumigatus)，命名为Aspergillus fumigatus GPVA1。
该菌株已于2020年6月17日保存于中国典型培养物菌种保藏管理中心，保存号为CCTCC M 2020213，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
实施例3菌株GPVA1在平板培养基中降解PVA
制作含PVA为唯一碳源的无机盐培养基平板。培养基包括以下成分：K2HPO4 0.7g、KH2PO4 0.7g、Mg SO4·7H2O 0.7g、NaCl 0.005g、FeSO4·7H2O 0.002g、ZnSO4·7H2O 0.002g、MnSO4·H2O 0.001g、PVA 10g、琼脂18g、蒸馏水1000m L。将培养基在121℃灭菌20min，然后冷却至不烫手后于无菌操作台内倒平板。在平板上接种GPVA1后让其在30℃培养。菌落铺满平板后取小块有菌丝的培养基小块，转接到新的培养基平板上，于30℃培养2天。用喷壶往培养基中喷硼酸和碘化钾-碘溶液，让其与培养基中的PVA生成蓝绿色络合物，以证实其中PVA的存在。
结果显示(图3)，在GPVA1菌斑的周围形成了一个透明圈，与周围的蓝绿色(图中体现为灰色)形成鲜明的对比，表明菌株GPVA1降解了平板培养基中的PVA。
实施例4 GPVA1对PVA的降解
制作含PVA为唯一碳源的液体无机盐培养基。培养基包括以下成分：K2HPO4 0.7g、KH2PO4 0.7g、MgSO4·7H2O 0.7g、NaCl 0.005g、FeSO4·7H2O 0.002g、ZnSO4·7H2O 0.002g、MnSO4·H2O 0.001g、PVA 10g、蒸馏水1000m L。将培养基在121℃灭菌20 min，冷却后接种GPVA1，1天后用硼酸-碘分光光度法在645nm波长检测培养基中的 PVA。
结果显示，GPVA1在24小时降解了PVA2.72g/L。
序列表
<110> 广东省科学院生物工程研究所
<120> 一种烟曲霉菌株及其在降解聚乙烯醇中的应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 590
<212> DNA
<213> 烟曲霉(Aspergillus fumigatus)
<400> 1
cccgggcttg cctcgtacgg cgagtgaagc ggcaagagct caaatttgaa agctggcccc 60
ttcggggtcc gcgttgtaat ttgcagagga tgcttcgggt gcagcccccg tctaagtgcc 120
ctggaacggg ccgtcataga gggtgagaat cccgtctggg acggggtgtc tgcgtccgtg 180
tgaagctcct tcgacgagtc gagttgtttg ggaatgcagc tctaaatggg tggtaaattt 240
catctaaagc taaatactgg ccggagaccg atagcgcaca agtagagtga tcgaaagatg 300
aaaagcactt tgaaaagaga gttaaacagc acgtgaaatt gttgaaaggg aagcgtttgc 360
gaccagactc gcccgcgggg ttcagccggc attcgtgccg gtgtacttcc ccgtgggcgg 420
gccagcgtcg gtttgggcgg ccggtcaaag gccctcggaa tgtatcacct ctcggggtgt 480
cttatagccg agggtgcaat gcggcctgcc tggaccgagg aacgcgcttc ggctcggacg 540
ctggcgtaat ggtcgtaaat gacccgtcta aaaacccccc cgccccaaat 590
<210> 2
<211> 578
<212> DNA
<213> 烟曲霉(Aspergillus fumigatus)
<400> 2
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cgggggccgc cgtttctacg gccgccgggg aggtcttgcg cccccgggcc cgcgcccgcc 120
gaagacccca acatgaacgc tgttctgaaa gtatgcaatc tgagttgatt atcgtaatca 180
gttaaaactt tcaacaacgg atctcttggt accggcatca atgaagaacg caacgaaatg 240
cgataaataa tgtgaattgc acaattcatt gaatcatcga ggctttgaac gcacattgcg 300
ccccctggta ttccgggggg catgcctgtc cgagcgtcat tgctgccctc aagcacggat 360
tgtgtgatgg gcccccgtcc ccctctcccg ggggacgggc ccgaaaggca gcggcggcac 420
cgcgtccggt cctcgagcgt atggggcttt gtcacctgct ctgtaggccc ggccggcgcc 480
agccgacacc caactttatt tttctaaggt tgacctcgga tcaagcacgg atacccgctg 540
aacttaagca tatcaaggcc taaggaaccc tgaggacc 578
<210> 3
<211> 1699
<212> DNA
<213> 烟曲霉(Aspergillus fumigatus)
<400> 3
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tttgatagta ccttactaca tggatacctg gggtaattct agagctaata catgctaaaa 120
acctcgactt cggaaggggt gtatttatta gataaaaaac caatgccctt cggggctcct 180
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ggcagcaggc gcgcaaatta cccaatcccg acacggggag gtagtgacaa taaatactga 420
tacggggctc ttttgggtct cgtaattgga atgagtacaa tctaaatccc ttaacgagga 480
acaattggag ggcaagtctg gtgccagcag ccgcggtaat tccagctcca atagcgtata 540
ttaaagttgt tgcagttaaa aagctcgtag ttgaaccttg ggtctggctg gccggtccgc 600
ctcaccgcga gtactggtcc ggctggacct ttccttctgg ggaacctcat ggccttcact 660
ggctgtgggg ggaaccagga cttttactgt gaaaaaatta gagtgttcaa agcaggcctt 720
tgctcgaata cattagcatg gaataataga ataggacgtg cggttctatt ttgttggttt 780
ctaggaccgc cgtaatgatt aatagggata gtcgggggcg tcagtattca gctgtcagag 840
gtgaaattct tggatttgct gaagactaac tactgcgaaa gcattcgcca aggatgtttt 900
cattaatcag ggaacgaaag ttaggggatc gaagacgatc agataccgtc gtagtcttaa 960
ccataaacta tgccgactag ggatcgggcg gtgtttctat gatgacccgc tcggcacctt 1020
acgagaaatc aaagtttttg ggttctgggg ggagtatggt cgcaaggctg aaacttaaag 1080
aaattgacgg aagggcacca caaggcgtgg agcctgcggc ttaatttgac tcaacacggg 1140
gaaactcacc aggtccagac aaaataagga ttgacagatt gagagctctt tcttgatctt 1200
ttggatggtg gtgcatggcc gttcttagtt ggtggagtga tttgtctgct taattgcgat 1260
aacgaacgag acctcggccc ttaaatagcc cggtccgcat ttgcgggccg ctggcttctt 1320
agggggacta tcggctcaag ccgatggaag tgcgcggcaa taacaggtct gtgatgccct 1380
tagatgttct gggccgcacg cgcgctacac tgacagggcc agcgagtaca tcaccttggc 1440
cgagaggtct gggtaatctt gttaaaccct gtcgtgctgg ggatagagca ttgcaattat 1500
tgctcttcaa cgaggaatgc ctagtaggca cgagtcatca gctcgtgccg attacgtccc 1560
tgccctttgt acacaccgcc cgtcgctact accgattgaa tggctcggtg aggccttcgg 1620
actggctcag gggagttggc aacgactccc cagagccgga aagttggtca aacccggtca 1680
ttagagaaga attagtcgt 1699
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
gcatatcaat aagcggagga aaag 24
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
ggtccgtgtt tcaagacgg 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
gtagtcatat gcttgtctc 19
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
tccgcaggtt cacctacgga 20

Claims (6)

1.一种烟曲霉菌株，其特征在于，命名为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)GPVA1，保藏编号为CCTCC NO:M 2020213，保藏日期为2020年6月17日。
2.如权利要求1所述的烟曲霉菌株，其特征在于，所述烟曲霉(Aspergillusfumigatus)GPVA1的28S rRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示，rDNA-ITS基因序列如SEQ IDNO:2所示，18S rRNA基因序列如SEQ ID NO:3所示。
3.一种包含权利要求1所述的烟曲霉菌株的菌剂。
4.如权利要求1所述的烟曲霉菌株在降解聚乙烯醇中的应用。
5.如权利要求3所述的菌剂在降解聚乙烯醇中的应用。
6.如权利要求4或5任一项所述的应用，其他特征在于，将烟曲霉菌株接种至含聚乙烯醇的废水中进行处理。
CN202011043866.2A 2020-09-28 2020-09-28 一种烟曲霉菌株及其在降解聚乙烯醇中的应用 Active CN112094758B (zh)

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