CN117652583A - 使用优势真菌发酵剂强化雅安藏茶品质特性的液态发酵工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了使用优势真菌发酵剂强化雅安藏茶品质特性的液态发酵工艺，包括以下步骤：步骤1：藏茶渥堆发酵优势微生物的分离纯化、鉴定以及接种剂的制备；步骤2：原料预处理；步骤3：藏茶液态发酵；步骤4：发酵样品的采集、处理及保存；步骤5：藏茶样品中主要品质成分的测定。与现有技术相比，本发明建立了优势真菌发酵剂强化雅安藏茶液态发酵效果的技术，明确了黑曲霉在藏茶液态发酵体系中对品质成分的转化作用，并实现了缩短渥堆周期、提升藏茶品质的，促进藏茶的精深加工的目的。
Description
技术领域
本发明涉及茶叶发酵技术领域，更具体地说，涉及使用优势真菌发酵剂强化雅安藏茶品质特性的液态发酵工艺。
背景技术
雅安藏茶拥有独特的风味及丰富的功能性成分，富含多酚、茶色素和多糖类物质，具有抗氧化，降糖减脂和抗辐射作用，有益健康。近年来随着对藏茶相关研究的不断深入，雅安藏茶的品牌价值持续提升，发展前景广阔。
研究表明渥堆发酵环节是藏茶品质形成最为关键的工序，在此过程中茶叶内含成分在微生物胞外酶主导下的生化反应以及湿热主导下的理化反应作用下，发生一系列包括氧化、降解、缩合在内的复杂化学变化，从而直接影响着藏茶的综合品质。不过由于目前藏茶品质成分形成的机理并不清晰，针对雅安藏茶品质成分转化的系统性研究极为缺乏。另外渥堆发酵进程缺乏科学调控的理论支撑，微生物群在藏茶品质形成过程中的作用尚未明确，导致渥堆过程不易控制，可能存在有害微生物的滋生。并且藏茶生产的标准化程度较低，使其渥堆发酵时间普遍较长从而限制了藏茶的持续性发展和产品质量的可控化。因此藏茶加工过程中的这些潜在隐患，对藏茶产品的质量和安全性产生了消极的影响，制约着藏茶发展行业的进一步发展。因此，有必要提供一种使用优势真菌发酵剂强化雅安藏茶品质特性的液态发酵工艺，以解决上述背景技术中提出的问题。
发明内容
针对藏茶生产过程中的技术问题，本发明旨在明确相关微生物在藏茶品质形成的过程中具有关键的作用，并通过优势微生物的定向接种发酵推进藏茶渥堆进程，避免有害微生物滋生同时提升藏茶综合品质的高效途径。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种使用优势真菌发酵剂强化雅安藏茶液态发酵效果的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：从藏茶中期发酵堆(day 25)中分离、纯化、鉴定、培养优势真菌并制成优势真菌发酵剂；
步骤2：称取绿茶粉到锥形瓶中，加入超纯水进行高温高压灭菌，采集未发酵对照组的茶汤，并进行茶汤过滤、滤液浓缩冻干以及冻干样品保存；
步骤3：冷却后，实验组茶汤进行优势真菌发酵剂接种发酵；对照组茶汤接种灭菌的生理盐水作为对比；
步骤4：定期采集发酵茶汤样品，并进行茶汤过滤、滤液浓缩冻干以及冻干样品保存；
步骤5：测定接种发酵组，未接种发酵组以及未接种未发酵对照组茶叶样品的各项理化指标；明确该优势真菌发酵剂对液态发酵藏茶样品品质成分的影响，从而得到高品质的藏茶产品。
作为本发明的进一步优选，所述步骤1中需要从藏茶发酵样品中分离纯化并鉴定出可培养的发酵微生物：首先微生物的分离纯化需要在超净工作台中称取100g藏茶样品置于500mL无菌烧杯中，并添加300mL的无菌生理盐水，充分摇匀后得到藏茶发酵微生物菌悬液，吸取1mL稀释后菌悬液涂布到马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上，于霉菌培养箱37℃培养3天后，将分离得到的单菌落在无菌环境下进行扩大培养，培养结束后各菌种需采集一部分菌液保存在-80℃冰箱中，同时需要将各菌种的剩余部分菌液进行离心；其次需要将收集到的菌体进行液氮研、DNA抽提、PCR扩增以及电泳验证通过后进行测序并将测序结果进行BLAST比对，将所得序列与NCBI的Genbank数据库中已知序列进行比对，以确定分离得到的菌种类型。通过上述实验后，在藏茶样品中共鉴定出了13种真菌(NCBI登录号：OP020453-OP020465)和一种细菌(NCBI登录号：ON999200)。在所以被鉴定出的14种藏茶发酵样品含有的微生物中，黑曲霉(NCBI登录号：OP020458)以被相关理论研究确认为藏茶发酵过程中的的优势真菌，因此我们选择黑曲霉作为藏茶发酵的优势真菌并制备黑曲霉接种剂。在发酵培养之前，需要将黑曲霉菌种(NCBI登录号：OP020458)从冰箱取出，并接种到马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上，并在37℃的培养箱中活化3-5天，待孢子在培养基上长满后，利用0.9％的无菌氯化钠溶液刮取孢子，置于三角瓶中，采用分光光度计测定菌种在不同生长期、不同稀释倍数下孢子悬液的OD600 nm值，对比血球板计数法得到的孢子悬液浓度，研究在对数期和稳定期OD600 nm值与孢子浓度之间的关系，并调节孢子浓度到1×107CFU/mL，活化后的菌株生长至对数生长期时用于接种茶样。
作为本发明的进一步优选，所述步骤2中，需称取24g绿茶粉(过40目筛)到500mL的锥形瓶中，并加入150mL超纯水在121℃下灭菌20min，同时采集灭菌后的茶汤样品(重复取3个平行)命名为W0(0天)，并进行茶汤过滤、滤液浓缩冻干、水浸出物含量测定以及冻干样品保存(-20℃冰箱)。
作为本发明的进一步优选，所述步骤3中，待冷却到37℃后，发酵实验组茶汤样品以1×107CFU/mL的浓度进行接种渥堆，菌悬液的接种量为8mL；对照发酵组茶汤样品，用8mL的无菌生理盐水代替接种剂进行液态发酵实验，整个实验在无菌处理后的超净工作台完成接种。此外，整个发酵实验共设置了8组发酵样品，包括接种发酵组J2(2d)、J4(4d)、J6(6d)、J8(8d)以及未接种发酵组W2(2d)、W4(4d)、W6(6d)、W8(8d)，每组设置3组发酵平行，所有发酵样品均在恒温摇床中以37℃、150r/min的条件进行发酵。
作为本发明的进一步优选，所述步骤4中，分别在发酵的第0、2、4、6、8天采集发酵茶汤样品，并进行茶汤过滤、滤液浓缩冻干以及冻干样品保存(-20℃冰箱)。
作为本发明的进一步优选，所述步骤5中，藏茶样品需要测定的主要品质成分含量：总多酚、总黄酮、茶褐素、茶红素、茶黄素、可溶性蛋白、可溶性糖、总游离氨基酸的含量。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明建立了优势真菌发酵剂强化雅安藏茶液态发酵效果的技术，明确了黑曲霉在藏茶液态发酵体系中对品质成分的转化作用，并实现了缩短渥堆周期、提升藏茶品质的，促进藏茶的精深加工的目的。
附图说明
图1为发酵接种组以及未接种发酵组雅安藏茶液态发酵流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及实施效益更加清楚明白，下面将结合附图及实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例一
本实施例重点对比了接种发酵组和未接种发酵组雅安藏茶液态发酵的过程及发酵效果，包括如下步骤：
1.藏茶渥堆发酵优势微生物的分离纯化、鉴定以及接种剂的制备
从藏茶发酵样品中分离纯化并鉴定出可培养的发酵微生物：首先微生物的分离纯化需要在超净工作台中称取100g藏茶样品置于500mL无菌烧杯中，并添加300mL的无菌生理盐水，充分摇匀后得到藏茶发酵微生物菌悬液，吸取1mL稀释后菌悬液涂布到马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上，于霉菌培养箱37℃培养3天后，将分离得到的单菌落在无菌环境下进行扩大培养，培养结束后各菌种需采集一部分菌液保存在-80℃冰箱中，同时需要将各菌种的剩余部分菌液进行离心；其次需要将收集到的菌体进行液氮研、DNA抽提、PCR扩增以及电泳验证通过后进行测序并将测序结果进行BLAST比对，将所得序列与NCBI的Genbank数据库中已知序列进行比对，以确定分离得到的菌种类型。通过上述实验后，在藏茶样品中共鉴定出了13种真菌(NCBI登录号：OP020453-OP020465)和一种细菌(NCBI登录号：ON999200)。在所以被鉴定出的14种藏茶发酵样品含有的微生物中，黑曲霉(NCBI登录号：OP020458)以被相关理论研究确认为藏茶发酵过程中的的优势真菌，因此我们选择黑曲霉作为藏茶发酵的优势真菌并制备黑曲霉接种剂。在发酵培养之前，需要将黑曲霉菌种(NCBI登录号：OP020458)从冰箱取出，并接种到马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上，并在37℃的培养箱中活化3-5天，待孢子在培养基上长满后，利用0.9％的无菌氯化钠溶液刮取孢子，置于三角瓶中，采用分光光度计测定菌种在不同生长期、不同稀释倍数下孢子悬液的OD600 nm值，对比血球板计数法得到的孢子悬液浓度，研究在对数期和稳定期OD600 nm值与孢子浓度之间的关系，并调节孢子浓度到1×107CFU/mL，活化后的菌株生长至对数生长期时用于接种茶样。
2.原料预处理
称取24g绿茶粉(过40目筛)到500mL的锥形瓶中，并加入150mL超纯水在121℃下灭菌20min，同时采集灭菌后的茶汤样品(重复取3个平行)命名为W0(0天)，并进行茶汤过滤、滤液浓缩冻干以及冻干样品保存(-20℃冰箱)。
3.藏茶液态发酵
(1)接种发酵组：待灭菌后的茶汤冷却到37℃后，发酵实验组茶汤样品以1×107CFU/mL的浓度进行接种渥堆，菌悬液的接种量为8mL。整个接种实验在无菌处理后的超净工作台完成接种。此外，接种发酵实验共设置了4组发酵样品，包括接种发酵组J2(2d)、J4(4d)、J6(6d)、J8(8d)，每组设置3组发酵平行，所有发酵样品均在恒温摇床中以37℃、150r/min的条件进行发酵。
未接种发酵组：待灭菌后的茶汤冷却到37℃后，用8mL的无菌生理盐水代替接种剂进行液态发酵实验，整个实验在无菌处理后的超净工作台完成接种。此外，未接种发酵实验共设置了4组发酵样品，包括未接种发酵组W2(2d)、W4(4d)、W6(6d)、W8(8d)，每组设置3组发酵平行，所有发酵样品均在恒温摇床中以37℃、150r/min的条件进行发酵。
4.发酵样品的采集、处理及保存
分别在发酵的第0、2、4、6、8天采集发酵茶汤样品，并进行茶汤过滤(三层纱布)、滤液浓缩(70℃真空旋蒸2h)、浓缩液冻干(真空冻干48h)、水浸出物含量测定以及冻干样品保存(-20℃冰箱)。
表1各组藏茶样品的水浸出物含量
| 分组 | 水浸出物含量(％) |
| W0 | 39.42±0.52 |
| W2 | 41.83±0.14 |
| W4 | 44.29±0.51 |
| W6 | 46.33±0.38 |
| W8 | 47.38±0.13 |
| J2 | 42.17±0.17 |
| J4 | 46.01±0.21 |
| J6 | 46.98±0.29 |
| J8 | 48.99±0.98 |
结果显示，未发酵对照组(W0)的水浸出物含量最低，同时随着发酵的进行未接种发酵组(W2、W4、W6、W8)与接种发酵组(J2、J4、J6、J8)的水浸出物含量都呈现持续增加的趋势；其中在同样的发酵时间下，接种发酵组的水浸出物含量均高于未接种发酵组，说明接种黑曲霉进行发酵有助于藏茶样品水浸出物含量的提升。
5.藏茶样品中主要品质成分的测定
采用福林酚比色法(GBT8313-2018)对总多酚进行定量分析；采用三氯化铝-亚硝酸钠比色法测定总黄酮含量；采用黄意欢《茶学实验技术》中的方法测定了茶色素的含量，包括茶褐素、茶红素和茶黄素；根据考马斯亮蓝蛋白检测试剂盒测定可溶性蛋白含量；采用苯酚-硫酸法对藏茶样品中的可溶性糖进行定量；总游离氨基酸含量测定参照国家标准GB/T 3814-2013。所有测定出的品质成分含量均换算为mg/g茶粉。
表2藏茶样品中总多酚以及总黄酮的含量
| 分组 | 总多酚含量(mg/g) | 总黄酮含量(mg/g) |
| W0 | 83.41±2.26 | 71.93±1.44 |
| W2 | 81.39±2.29 | 69.93±0.63 |
| W4 | 78.41±2.14 | 62.64±0.33 |
| W6 | 86.50±3.59 | 64.46±0.75 |
| W8 | 97.19±4.66 | 75.83±2.47 |
| J2 | 112.33±5.95 | 79.00±2.69 |
| J4 | 130.32±4.10 | 96.75±2.53 |
| J6 | 119.18±3.86 | 75.74±2.58 |
| J8 | 137.98±2.71 | 101.63±4.42 |
结果显示，与未发酵对照组相比，未接种发酵组的总多酚和总黄酮的含量呈现先降低后增加的趋势；而接种发酵组的总多酚和总黄酮含量则呈现先增加后减少的趋势。总体相比，在各发酵时间段中接种发酵组的总多酚和总黄酮含量都显著高于未接种发酵组，说明接种黑曲霉进行藏茶的液态发酵有助于水浸出物中总多酚和总黄酮含量的提升。
表3藏茶样品中茶色素的含量
| 分组 | 茶褐素(mg/g) | 茶红素(mg/g) | 茶黄素(mg/g) |
| W0 | 37.73±3.03 | 35.03±2.44 | 4.73±0.22 |
| W2 | 46.13±1.92 | 28.70±1.92 | 4.67±0.35 |
| W4 | 48.06±0.98 | 27.74±1.36 | 3.65±0.16 |
| W6 | 51.42±2.34 | 30.96±2.34 | 4.73±0.15 |
| W8 | 47.19±2.00 | 29.55±2.00 | 3.74±0.13 |
| J2 | 32.50±1.01 | 34.18±1.01 | 4.79±0.23 |
| J4 | 32.37±2.14 | 33.55±2.14 | 4.88±1.09 |
| J6 | 35.64±3.31 | 31.03±3.31 | 5.77±0.21 |
| J8 | 30.75±4.36 | 35.57±3.18 | 5.86±1.43 |
结果显示，与未发酵对照组(W0)相比，未接种发酵组的茶褐素含量均高于未发酵；而接种发酵组的茶褐素含量则均低于为发酵组。另一方面对照组未接种发酵组与接种发酵组的茶褐素含量均呈现先减少后增加的趋势，且均在发酵的第六天达到最大值。此外发酵的各个时间段中，接种发酵组的茶红素以及茶黄素含量均高于未接种发酵组。综上结果表明接种黑曲霉会促进茶褐素、茶红素和茶黄素之间的转化。
表4藏茶样品中可溶性蛋白、可溶性糖以及总游离氨基酸的含量
| 分组 | 可溶性蛋白(mg/g) | 可溶性糖(mg/g) | 总游离氨基酸(mg/g) |
| W0 | 9.64±0.10 | 118.95±1.57 | 33.14±0.44 |
| W2 | 14.09±3.53 | 130.51±4.21 | 37.00±0.61 |
| W4 | 24.87±1.27 | 163.80±2.39 | 45.89±2.76 |
| W6 | 22.78±0.87 | 183.80±3.07 | 38.81±0.34 |
| W8 | 30.04±3.23 | 166.80±5.78 | 37.65±1.68 |
| J2 | 15.22±1.21 | 154.30±7.80 | 28.60±1.10 |
| J4 | 13.34±1.32 | 134.89±6.40 | 32.77±1.49 |
| J6 | 9.66±1.63 | 102.20±4.83 | 25.31±0.61 |
| J8 | 10.48±1.75 | 124.56±3.20 | 28.32±1.31 |
结果显示，与未发酵组相比，未接种发酵组和接种发酵组的可溶性蛋白含量通过发酵之后都会增加，其中未接种发酵组的增加趋势更为明显。另一方面为接种发酵组的可溶性糖含量明显高于接种发酵组以及未发酵组，随着发酵的进行，未接种发酵组的可溶性糖含量呈现先增加后减少的趋势，并在发酵的第六天达到最大值。此外，与未发酵组相比，未接种发酵组的总游离氨基酸含量明显增加，而接种发酵组的总游离氨基酸含量则明显降低，综上结果说明接种黑曲霉进行发酵会显著影响藏茶样品水浸出物可溶性蛋白、可溶性糖以及游离氨基酸的含量。
以上的具体实施方式，对本申请的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.使用优势真菌发酵剂强化雅安藏茶品质特性的液态发酵工艺，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1：从藏茶中期发酵堆中分离、纯化、鉴定、培养优势真菌并制成优势真菌发酵剂；
步骤2：称取绿茶粉到锥形瓶中，加入超纯水进行高温高压灭菌，采集未发酵对照组的茶汤，并进行茶汤过滤、滤液浓缩冻干以及冻干样品保存；
步骤3：冷却后，实验组茶汤进行优势真菌发酵剂接种发酵；对照组茶汤接种灭菌的生理盐水作为对比；
步骤4：定期采集发酵茶汤样品，并进行茶汤过滤、滤液浓缩冻干以及冻干样品保存；
步骤5：测定接种发酵组，未接种发酵组以及未接种未发酵对照组茶叶样品的各项理化指标；明确该优势真菌发酵剂对液态发酵藏茶样品品质成分的影响，从而得到高品质的藏茶产品。
2.根据权利要求1所述的使用优势真菌发酵剂强化雅安藏茶品质特性的液态发酵工艺，其特征在于：所述步骤1中需要从藏茶发酵样品中分离纯化并鉴定出可培养的发酵微生物：首先微生物的分离纯化需要在超净工作台中称取100g藏茶样品置于500mL无菌烧杯中，并添加300mL的无菌生理盐水，充分摇匀后得到藏茶发酵微生物菌悬液，吸取1mL稀释后菌悬液涂布到马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，于霉菌培养箱37℃培养3天后，将分离得到的单菌落在无菌环境下进行扩大培养，培养结束后各菌种需采集部分菌液保存在-80℃冰箱中，同时需要将各菌种的剩余部分菌液进行离心；其次需要将收集到的菌体进行液氮研、DNA抽提、PCR扩增以及电泳验证通过后进行测序并将测序结果进行BLAST比对，将所得序列与NCBI的Genbank数据库中已知序列进行比对，以确定分离得到的菌种类型，通过上述实验后，在藏茶样品中共鉴定出了13种真菌——NCBI登录号：OP020453-OP020465和一种细菌——NCBI登录号：ON999200，在所有被鉴定出的14种藏茶发酵样品含有的微生物中，黑曲霉——NCBI登录号：
OP020458以被相关理论研究确认为藏茶发酵过程中的优势真菌吗，因此我们选择黑曲霉作为藏茶发酵的优势真菌并制备黑曲霉接种剂，在发酵培养之前，需要将黑曲霉菌种——NCBI登录号：OP020458从冰箱取出，并接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，并在37℃的培养箱中活化3-5天，待孢子在培养基上长满后，利用0.9％的无菌氯化钠溶液刮取孢子，置于三角瓶中，采用分光光度计测定菌种在不同生长期、不同稀释倍数下孢子悬液的OD600nm值，对比血球板计数法得到的孢子悬液浓度，研究在对数期和稳定期OD600 nm值与孢子浓度之间的关系，并调节孢子浓度到1×107CFU/mL，活化后的菌株生长至对数生长期时用于接种茶样。
3.根据权利要求1所述的使用优势真菌发酵剂强化雅安藏茶品质特性的液态发酵工艺，其特征在于：所述步骤2中需称取24g绿茶粉使用40目筛过到500mL的锥形瓶中，并加入150mL超纯水在121℃下灭菌20min，同时采集灭菌后的茶汤样品命名为W0，即第0天，且茶汤样品重复取3个平行，并进行茶汤过滤、滤液浓缩冻干以及冻干样品保存，冻干样品保存条件为-20℃冰箱。
4.根据权利要求1所述的使用优势真菌发酵剂强化雅安藏茶品质特性的液态发酵工艺，其特征在于：所述步骤3中，待冷却到37℃后，发酵实验组茶汤样品以1×107CFU/mL的浓度进行接种渥堆，菌悬液的接种量为8mL；对照发酵组茶汤样品，用8mL的无菌生理盐水代替接种剂进行液态发酵实验，此外，整个发酵实验共设置了8组发酵样品，包括接种发酵组J2、J4、J6、J8以及未接种发酵组W2、W4、W6、W8，依次对应第2、4、6、8天，每组设置3组发酵平行，所有发酵样品均在恒温摇床中以37℃、150r/min的条件进行发酵。
5.根据权利要求1所述的使用优势真菌发酵剂强化雅安藏茶品质特性的液态发酵工艺，其特征在于：所述步骤4中，分别在发酵的第0、2、4、6、8天采集发酵茶汤样品，并进行茶汤过滤、滤液浓缩冻干、水浸出物含量测定以及冻干样品保存，冻干样品保存条件为-20℃冰箱。
6.根据权利要求1所述的使用优势真菌发酵剂强化雅安藏茶品质特性的液态发酵工艺，其特征在于：所述步骤5中藏茶样品需要测定的主要品质成分含量：总多酚、总黄酮、茶褐素、茶红素、茶黄素、可溶性蛋白、可溶性糖、总游离氨基酸的含量。
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