CN116699018A - 一种同时检测吡啶-3-磺酰氯中多种结构类似物杂质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种同时检测吡啶‑3‑磺酰氯中多种结构类似物杂质的方法。该方法具有较好的分离度，能在一个条件下将吡啶‑3‑磺酰氯和其结构类似物完全分离开来，各结构类似物色谱峰的检测限和定量限均较低，灵敏度高，还具有较好的精密度、准确度和稳定性。该方法非常适于对吡啶‑3‑磺酰氯的杂质进行监控，能有效提高吡啶‑3‑磺酰氯的质量，并且操作简单，检测周期较短，能快速反馈吡啶‑3‑磺酰氯的产品质量。
Description
技术领域
本发明属于分析检测技术领域。更具体地，涉及一种同时检测吡啶-3-磺酰氯中多种结构类似物杂质的方法。
背景技术
吡啶-3-磺酰氯是一种白色晶体，易潮解，在水中能迅速水解，生成吡啶-3-磺酸。吡啶-3-磺酰氯作为酰氯类衍生物，可以进行多种多样的有机转化反应。例如吡啶-3-磺酰氯可以作为酰化试剂参与酰化反应，与醇、酚、胺等亲核试剂反应，生成相应的酯、醚、酰胺等化合物，广泛用于有机合成化学和医药分子结构修饰。
吡啶-3-磺酰氯常用的合成路线如下：
在合成过程中很容易引入杂质化合物吡啶-2-磺酰氯、吡啶-4-磺酰氯，这两者易与合成工艺中使用的醇类溶剂反应，生成潜在基因毒性杂质吡啶-2-磺酸酯和吡啶-4-磺酸酯。为更好地控制吡啶-3-磺酰氯质量，迫切需要建立检测吡啶-2-磺酰氯、吡啶-4-磺酰氯的分析检测方法。
常用的分析检测方法有气相色谱法和液相色谱法。虽然吡啶-2-磺酰氯、吡啶-4-磺酰氯、吡啶-3-磺酰氯在气相色谱中有较好的保留，但是其沸点均在280℃以上，超过绝大多数气相色谱柱的温度范围，容易损坏气相色谱柱。而吡啶-2-磺酰氯、吡啶-4-磺酰氯、吡啶-3-磺酰氯的结构、极性类似，仅取代基位点不一样，采用高效液相方法检测时，较难在一个条件下将三者完美分离。如中国专利申请CN113390983A公开了一种同时测定富马酸伏诺拉生中吡啶-3-磺酸、吡啶-3-磺酸甲酯和吡啶-3-磺酸乙酯的检测方法，但是该方法用于吡啶-3-磺酰氯检测时，杂质的分离度较差，无法较好的分离。并且，常见的磺酰氯类检测方法很多是采用衍生法，衍生法样品配制繁琐，耗时长，且转化率低，在样品配制过程中样品还易水解，不适用于实际操作。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有气相检测易损坏色谱柱，液相检测分离度差，衍生繁琐不适合实际操作的缺陷和不足，提供一种分离度、灵敏度、准确性、精密度、稳定性较高，能同时检测吡啶-3-磺酰氯中多种结构类似物杂质的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种同时检测吡啶-3-磺酰氯中多种结构类似物杂质的方法，采用高效液相色谱法进行检测，所述高效液相色谱法的条件为：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶，检测波长：260nm，柱温：40～50℃，流速0.7～0.9ml/min；流动相A：磷酸二氢钾水溶液-甲醇混合溶液，流动相B：甲醇或乙腈，在以下梯度洗脱条件下进行检测：
进一步地，所述色谱柱为Waters Symmetry C18，4.6mm×250mm，5μm色谱柱或Welch PFP 3.9mm×250mm，3μm色谱柱。
更进一步地，所述磷酸二氢钾水溶液的浓度为1.8～2.2g/L。
进一步地，所述磷酸二氢钾水溶液的pH值为2.3～2.7。
更进一步地，所述磷酸二氢钾水溶液和甲醇的体积比为(85～95):(5～15)。
进一步地，所述高效液相色谱法的条件中，进样量为(10～30)μl。
更进一步地，所述吡啶-3-磺酰氯检测前需要进行前处理，所述前处理为45～55℃水解完全。
进一步地，所述水解的时间为10～60min。
更进一步地，所述吡啶磺酸杂质为吡啶-4-磺酸、吡啶-2-磺酸。
进一步地，所述吡啶-4-磺酸或吡啶-2-磺酸的定量限为0.01％，所述吡啶-4-磺酸或吡啶-2-磺酸的检测限为0.005％。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一个能同时检测吡啶-3-磺酰氯中多种结构类似物杂质的方法，该方法具有较好的分离度，能在一个条件下将吡啶-3-磺酰氯和其结构类似物完全分离开来，各结构类似色谱峰的检测限和定量限均较低，灵敏度高，还具有较好的精密度、准确度和稳定性。该方法非常适于对吡啶-3-磺酰氯的杂质进行监控，能有效提高吡啶-3-磺酰氯的质量，并且操作简单，检测周期较短，能快速反馈吡啶-3-磺酰氯的产品质量。
附图说明
图1为实施例1中加标供试品溶液的高效液相色谱图。
图2为实施例8中吡啶-4-磺酸标准曲线图。
图3为实施例8中吡啶-2-磺酸标准曲线图。
图4为对比例1检测得到的高效液相色谱图。
图5为对比例2检测得到的高效液相色谱图。
图6为对比例3检测得到的高效液相色谱图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1一种同时检测吡啶-3-磺酰氯中多种结构类似物杂质的方法
1、溶液制备：
(1)对照品单个储备液：分别取吡啶-2-磺酸对照品、吡啶-4-磺酸对照品各约25mg，精密称定，分别置50ml量瓶中，加入适量50％乙腈溶液使溶解，用50％乙腈溶液定量稀释至刻度，摇匀，作为吡啶-2-磺酸对照品、吡啶-4-磺酸对照品单个储备液。
(2)混合对照品储备液：精密量取吡啶-2-磺酸对照品、吡啶-4-磺酸对照品单个储备液各5ml置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品储备液。
(3)混合对照品溶液：精密量取混合对照品储备液2ml置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。
(4)供试品溶液：取吡啶-3-磺酰氯约50mg，精密称定，置50ml量瓶中，加入适量水，50℃振荡20min使溶解并水解，加水定量稀释至刻度，摇匀，即得。
(5)加标供试品溶液：取吡啶-3-磺酰氯约50mg，精密称定，置50ml量瓶中，加入适量水，50℃振荡20min使溶解，精密量取混合对照品储备液2ml置上述量瓶中，加水定量稀释至刻度，摇匀，即得。
2、液相色谱条件
色谱柱：Waters Symmetry C18，4.6mm×250mm，5μm；柱温为45℃，流速为每分钟0.8ml，检测波长为260nm，进样体积为10μl；
流动相：以2g/L磷酸二氢钾水溶液(用磷酸调节pH值至2.5)-甲醇(95：5)为流动相A，甲醇为流动相B，按表1进行线性梯度洗脱；
表1梯度洗脱提条件
| 时间/min | 流动相A/％ | 流动相B/％ |
| 0 | 100 | 0 |
| 10 | 100 | 0 |
| 15 | 50 | 50 |
| 25 | 50 | 50 |
| 26 | 100 | 0 |
| 35 | 100 | 0 |
3、检测结果
将配样溶剂(水)、加标供试品溶液和对照品溶液进样检测，检测结果参见表2和图1。
表2实施例1加标供试品溶液吡啶磺酸的分离度
结果表明，空白溶剂不干扰吡啶-2-磺酸、吡啶-4-磺酸的测定，加标供试品中，吡啶-3-磺酸与吡啶-2-磺酸、吡啶-4-磺酸分离度均符合中国药典要求(分离度大于1.5)。
实施例2一种同时检测吡啶-3-磺酰氯中多种结构类似物杂质的方法
与实施例1不同之处在于，本实施例的流动相B为乙腈，其余参数及操作参考实施例1。结果参见表3。
表3实施例2加标供试品溶液吡啶磺酸的分离度
| 名称 | 保留时间/min | 分离度 |
| 吡啶-4-磺酸 | 3.666 | / |
| 吡啶-3-磺酸 | 4.018 | 2.42 |
| 吡啶-2-磺酸 | 5.133 | 7.07 |
结果表明，加标供试品中，吡啶-3-磺酸与吡啶-2-磺酸、吡啶-4-磺酸分离度均符合中国药典要求(分离度大于1.5)。
实施例3一种同时检测吡啶-3-磺酰氯中多种结构类似物杂质的方法
与实施例1不同之处在于，本实施例的流速为0.7ml/min、0.9ml/min，其余参数及操作参考实施例1。结果参见表4。
表4实施例3加标供试品溶液吡啶磺酸的分离度
结果表明，加标供试品中，吡啶-3-磺酸与吡啶-2-磺酸、吡啶-4-磺酸分离度均符合中国药典要求(分离度大于1.5)。
实施例4一种同时检测吡啶-3-磺酰氯中多种结构类似物杂质的方法
与实施例1不同之处在于，本实施例的柱温为40℃、50℃，其余参数及操作参考实施例1。结果参见表5。
表5实施例4加标供试品溶液吡啶磺酸的分离度
结果表明，加标供试品中，吡啶-3-磺酸与吡啶-2-磺酸、吡啶-4-磺酸分离度均符合中国药典要求(分离度大于1.5)。
实施例5一种同时检测吡啶-3-磺酰氯中多种结构类似物杂质的方法
与实施例1不同之处在于，本实施例的供试品溶液在制备过程中，分别50℃振荡10min、20min、60min，其余参数及操作参考实施例1。结果参见表6。
表6实施例5供试品溶液水解时间的影响
| 提取时间/min | 峰面积S | 称样量M/mg | S/M |
| 10 | 16975919 | 52.1 | 325833 |
| 20 | 16691283 | 51.6 | 323474 |
| 60 | 16213026 | 49.4 | 328199 |
结果表明，吡啶-3-磺酸峰面积与称取量的比值基本一致。
实施例6一种同时检测吡啶-3-磺酰氯中多种结构类似物杂质的方法
与实施例1不同之处在于，本实施例的色谱柱为Welch，PFP 3.9mm×250mm，3μm，其余参数及操作参考实施例1。结果参见表7。
表7实施例6加标供试品溶液吡啶磺酸的分离度
| 名称 | 保留时间/min | 分离度 |
| 吡啶-4-磺酸 | 3.666 | / |
| 吡啶-3-磺酸 | 4.018 | 2.42 |
| 吡啶-2-磺酸 | 5.133 | 7.07 |
结果表明，加标供试品中，吡啶-3-磺酸与吡啶-2-磺酸、吡啶-4-磺酸分离度均符合中国药典要求(分离度大于1.5)。
实施例7一种同时检测吡啶-3-磺酰氯中多种结构类似物杂质的方法
与实施例1不同之处在于，本实施例的洗脱梯度参见表8，其余参数及操作参考实施例1。结果参见表9。
表8实施例7洗脱梯度条件
| 时间/min | 流动相A/％ | 流动相B/％ |
| 0 | 90 | 10 |
| 10 | 90 | 10 |
| 15 | 50 | 50 |
| 25 | 50 | 50 |
| 26 | 90 | 10 |
| 35 | 90 | 10 |
表9实施例7加标供试品溶液吡啶磺酸的分离度
| 名称 | 保留时间/min | 分离度 |
| 吡啶-4-磺酸 | 3.052 | / |
| 吡啶-3-磺酸 | 3.317 | 1.72 |
| 吡啶-2-磺酸 | 3.946 | 4.29 |
结果表明，加标供试品中，吡啶-3-磺酸与吡啶-2-磺酸、吡啶-4-磺酸分离度均符合中国药典要求(分离度大于1.5)。
实施例8方法学考察
1、检测限与定量限测定
取对照品溶液逐级稀释，参考实施例1的方法，考察吡啶磺酸的检测限(LOD)和定量限(LOQ)，结果参见表10。
表10吡啶磺酸的检测限与定量限
结果表明，本发明检测方法对吡啶-2-磺酸与吡啶-4-磺酸具有较低的检测限和定量限。
2、线性和范围试验
分别精密量取实施例1中混合对照品储备液适量，分别制备吡啶-2-磺酸、吡啶-4-磺酸浓度为0.1～5μg/ml的对照品溶液，参考实施例1液相色谱条件，进样检测。以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性回归处理，计算回归方程及相关系数。结果参见表11～12，图2～3。
表11吡啶-4-磺酸线性结果
表12吡啶-2-磺酸线性结果
结果表明，吡啶-4-磺酸在0.09834μg/ml～4.917μg/ml之间，峰面积与浓度呈良好线性关系，其中r为0.9999，Y轴截距在100％浓度响值之比为1.1％；吡啶-2-磺酸在0.1003μg/ml～5.017μg/ml之间，峰面积与浓度呈良好线性关系，其中r为1.0000，Y轴截距在100％浓度响值之比为1.0％。
3、精密度试验
参考实施例1的条件，取对照品溶液连续进样5次，结果参见表13。
表13精密度试验结果
| 序号 | 吡啶-4-磺酸峰面积 | 吡啶-2-磺酸峰面积 |
| 1 | 19548 | 13506 |
| 2 | 19899 | 13890 |
| 3 | 20236 | 13908 |
| 4 | 20352 | 14013 |
| 5 | 20503 | 14138 |
| 平均值 | 20108 | 13891 |
| RSD/％ | 2.0 | 1.8 |
结果表明对照品溶液吡啶-4-磺酸或吡啶-2-磺酸的峰面积RSD均小于5.0％，精密度良好。
4、准确度试验
取吡啶-3-磺酰氯约50mg，精密称定，置50ml量瓶中，加入适量水，50℃振荡20min使溶解，分别加入1.0ml、2.0ml、4.0ml混合对照品储备液，加水稀释至刻度，摇匀，配制成50％、100％、200％加标供试品溶液。每个浓度平行配制3份，参照实施例1条件进样检测。按外标法以峰面积计算吡啶-2-磺酸、吡啶-4-磺酸回收率，结果参见表14～15。
表14吡啶-4-磺酸的准确度测定结果
表15吡啶-2-磺酸的准确度测定结果
结果表明吡啶-4-磺酸平均回收率为103％，单个回收率在101.2％～105.7％之间，RSD为1.6％；吡啶-2磺酸平均回收率为96％，单个回收率在91.4％～98.8％之间，RSD为3.1％。可见，吡啶-4-磺酸和吡啶-2磺酸的RSD均小于10.0％，准确度高。
5、溶液稳定性试验
参照实施例1中配制方法配制对照品溶液，分别于室温放置0h、4h、8h、12h、24h，精密量取对照品溶液，注入液相色谱仪，参照实施例1的检测条件进行检测，记录色谱图，测定并计算各时间点各杂质峰面积与0小时峰面积相比的相对变化率。结果参见表16。
表16对照品溶液稳定性测定结果
结果表明与0h相比，对照品溶液放置24小时后，吡啶-4-磺酸、吡啶-2-磺酸峰面积变化率均小于10％，对照品溶液室温放置24小时内稳定。
通过上述方法学考察实验证明，本发明能够准确有效地检测吡啶-3-磺酰氯中吡啶-2-磺酰氯、吡啶-4-磺酰氯的含量，并且方法专属性强、灵敏度高、稳定可靠。
对比例1
精密量取实施例1中混合对照品储备液2ml、供试品溶液50μl，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，参考中国专利申请CN113390983A中的实施例1条件进行测定，结果参见图4。
由图可见，吡啶-3-磺酸、吡啶-2-磺酸与吡啶-4-磺酸分离度均无法有效分离。
对比例2
与实施例1不同之处在于，本对比例的洗脱梯度参见表17，其余参数及操作参考实施例1，结果参见图5。
表17对比例2洗脱梯度
| 时间/min | 流动相A/％ | 流动相B/％ |
| 0 | 98 | 2 |
| 10 | 98 | 2 |
| 16 | 40 | 60 |
| 26 | 40 | 60 |
| 26.1 | 98 | 2 |
| 30 | 98 | 2 |
由图可见，吡啶-3-磺酸、吡啶-2-磺酸与吡啶-4-磺酸分离度均无法有效分离。
对比例3
与实施例1不同之处在于，本对比例的洗脱梯度参见表18，其余参数及操作参考实施例1，结果参见图6。
表18对比例3洗脱梯度
| 时间/min | 流动相A/％ | 流动相B/％ |
| 0 | 80 | 20 |
| 10 | 80 | 20 |
| 15 | 50 | 50 |
| 25 | 50 | 50 |
| 26 | 80 | 20 |
| 35 | 80 | 20 |
由图可见，吡啶-3-磺酸、吡啶-2-磺酸与吡啶-4-磺酸分离度均无法有效分离。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种同时检测吡啶-3-磺酰氯中多种结构类似物杂质的方法，其特征在于，采用高效液相色谱法进行检测，所述高效液相色谱法的条件为：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶，检测波长：260nm，柱温：40～50℃，流速0.7～0.9ml/min；流动相A：磷酸二氢钾水溶液-甲醇混合溶液，流动相B：甲醇或乙腈，在以下梯度洗脱条件下进行检测：
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述色谱柱为Waters Symmetry C18，4.6mm×250mm，5μm色谱柱或Welch PFP 3.9mm×250mm，3μm色谱柱。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述磷酸二氢钾水溶液的浓度为1.8～2.2g/L。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述磷酸二氢钾水溶液的pH值为2.3～2.7。
5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述磷酸二氢钾水溶液和甲醇的体积比为(85～95):(15～5)。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的条件中，进样量为10～30μl。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述吡啶-3-磺酰氯检测前需要进行前处理，所述前处理为45～55℃水解完全。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述水解的时间为10～60min。
9.根据权利要求1～8任一所述方法，其特征在于，所述吡啶磺酸杂质为吡啶-4-磺酸、吡啶-2-磺酸。
10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述吡啶-4-磺酸或吡啶-2-磺酸的定量限为0.01％，所述吡啶-4-磺酸或吡啶-2-磺酸的检测限为0.005％。
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