CN116568314A - 新型乳酸菌及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新型植物乳杆菌、两歧双歧杆菌、长双歧杆菌或它们的混合物以及它们的用途。本发明的菌株或它们的混合物抑制变形菌(Proteobacteria)的表达且抗炎症效果优秀，增加眼中的眼泪分泌量，抑制角膜和/或视网膜中的炎症，在角膜和/或视网膜中表现出优秀的抗氧化效果及炎症抑制效果，减少人体内疲劳物质的含量，呈现抑制神经炎症因子、增加脑源性神经营养因子(BDNF)的表达以及改善认知障碍、精神障碍等效果。因此，可以在眼部疾病、疲劳、炎症性疾病、认知功能障碍、精神障碍等的治疗、改善及预防中有效使用。

Description

新型乳酸菌及其用途
技术领域
本发明涉及作为新型乳酸菌的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)或它们的混合物。
背景技术
大部分与老化、疲劳等相关的眼部疾病都不是突发的，而具有随着人年龄的增长或疲劳等外部因素等逐渐发生的倾向。被认为可以在综合的眼部检查的情况下检出及治疗的疾病可以为如黄斑变性、白内障、青光眼及糖尿病性视网膜病症等。在老龄人口比例增加、被迫接受越来越多的可能给眼部带来的视觉刺激的情况下，上述眼部疾病的发病率和影响度也随之增加。
上述眼部疾病已知通常是氧化胁迫引起的过度的活性氧簇(reactive oxygenspecies，ROS)的生成导致视网膜色素上皮细胞的主要结构成分被氧化、线粒体功能降低以及与脱氧核糖核酸(DNA)损伤相关的内因性细胞凋亡(intrinsic apoptosis)途径的激活为主要问题的，因此，正进行着以与活性氧簇(ROS)相关的多种信号通路(signal pathway)上的靶标为目的来治疗疾病的多种研究开发。并且，由于抑制与新生血管相伴的炎症反应还可以通过稳定血管壁来改善血浆渗出、视网膜水肿并增强治疗效果，因此同时需要对其的改善。并且，近来通过大量文献确认到上述眼部疾病与肠内菌群不均衡的相关性，通过微生物来解决该问题的努力也部分得到了确认。
另一方面，与上述疾病相比，通常更为常见的可能是眼疲劳和眼球干燥症。眼疲劳或眼球干燥症为表现出眼的针刺感、眼的干涩、眼的异物感、眼的严重干燥、眼的灼热感、眼的凉感、眼的拉扯感、眼疼痛等症状的疾病。近来，由于污染的微尘、长时间收看电视(TV)、过度使用电脑或智能手机等外部因素，使眼部疾病患者激增。
除上述提及的包括黄斑变性、青光眼、眼疲劳、眼球干燥症等在内的大部分眼部疾病的发病机制以外，已知与炎症的相关性也应引起高度关注。有报告说在眼部疾病患者的眼泪中，与正常人相比，肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)等炎症相关细胞因子和白细胞介素8(IL-8)等炎症相关趋化因子过表达，已知在与眼部疾病同时伴有干燥综合征的NOD.B10.H2b小鼠中，白细胞介素10(IL-10)的表达低，粪便中的肠内菌群的状态与正常组相异。
通常用于治疗上述眼部疾病的或改善眼疲劳的方法为向眼部滴入与眼泪成分相似的人造泪液/眼药，在严重的情况下，利用通过泪点塞塞住泪点的泪点封闭术。并且，通常使用的治疗剂有已知为免疫抑制剂的环孢素A(Cyclosporin A)、氟米龙(Fluorometholone)等。如上所述的疾病的治疗方法虽然可以临时缓解疾病，但在根治疾病方面存在局限性，因此需要有关于此的新的治疗方法。
于是，本发明人确认了在对免疫调节、认知功能障碍、精神障碍、炎症性疾病的改善效果之上，还具有在眼部通过抗氧化调节、血管新生调节、炎症调节、眼泪量调节等功能来改善眼部疾病的效果的新型菌株，从而完成本发明。
发明内容
技术问题
本发明的目的在于，提供植物乳杆菌NK151(Lactobacillus plantarum NK151)KCCM12783P。
本发明的再一目的在于，提供两歧双歧杆菌NK175(Bifidobacterium bifidumNK175)KCCM12784P。
本发明的还有一目的在于，提供长双歧杆菌NK173(Bifidobacterium longumNK173)KCCM13046P。
本发明的另一目的在于，提供包含保藏编号为KCCM12783P的植物乳杆菌NK151、保藏编号为KCCM12784P的两歧双歧杆菌NK175、保藏编号为KCCM13046P的长双歧杆菌NK173或它们的任意混合物的用来预防、改善或治疗选自由眼部疾病、疲劳、认知功能障碍、精神障碍及炎症性疾病组成的组中的一种以上疾病的用途。
技术方案
作为用来实现上述目的的一实施方式，本发明提供植物乳杆菌NK151(保藏机构：韩国微生物保藏中心，保藏日期：2020年09月10日，保藏编号：KCCM12783P)。
本发明的保藏编号为KCCM12783P的植物乳杆菌NK151的特征在于，是从健康人的肠内菌群(从粪便中分离)中分离及鉴定的乳酸菌。
用于对本发明的植物乳杆菌NK151进行鉴定及分类的16S rDNA碱基序列如本说明书中随附的序列1所示。因此，本发明的植物乳杆菌NK151可以包含序列1的16S rDNA。
上述序列1的16S rDNA碱基序列的分析结果为，示出与公知的植物乳杆菌菌株具有99％的同源性，具有与植物乳杆菌最高的分子系统学亲缘关系。因此，将上述乳酸菌鉴定为植物乳杆菌，将其命名为植物乳杆菌NK151，于2020年09月10日保藏于韩国微生物保藏中心(KCCM12783P)。
本发明的植物乳杆菌NK151为革兰氏阳性菌，细胞形态为杆菌。植物乳杆菌NK151更为具体的生理学特性可以通过相关技术领域的通常方法来分析，结果如下述表4所示。具体地，植物乳杆菌NK151可以利用选自由甘油、L-阿拉伯糖、D-核糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、甘露醇、α-甲基-D-甘露糖苷、N-乙酰葡萄糖胺、苦杏仁苷、熊果苷、七叶苷、水杨苷、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、松三糖、棉子糖、龙胆二糖、D-松二糖及葡萄糖酸盐组成的组中的一种以上作为碳源。
作为用来实现上述目的的再一实施方式，提供两歧双歧杆菌NK175(保藏机构：韩国微生物保藏中心，保藏日期：2020年09月10日，保藏编号：KCCM12784P)。
本发明的保藏编号为KCCM12784P的两歧双歧杆菌NK175的特征在于，是从健康人的肠内菌群(从粪便中分离)中分离及鉴定的乳酸菌。
用于对本发明的保藏编号为KCCM12784P的两歧双歧杆菌NK175进行鉴定及分类的16S rDNA碱基序列如本说明书中随附的序列2所示。因此，本发明的两歧双歧杆菌NK175可以包含序列2的16SrDNA。
上述序列2的16S rDNA碱基序列的分析结果为，示出与公知的两歧双歧杆菌菌株具有99％的同源性，具有与两歧双歧杆菌最高的分子系统学亲缘关系。因此，将上述乳酸菌鉴定为两歧双歧杆菌，将其命名为两歧双歧杆菌NK175，于2020年09月10日保藏于韩国微生物保藏中心(KCCM12784P)。
上述两歧双歧杆菌NK175为革兰氏阳性菌，细胞的形态为杆菌。两歧双歧杆菌NK175更为具体的生理学特性可以通过相关技术领域的通常方法来分析，结果如下述表5所示。具体地，两歧双歧杆菌NK175可以利用选自由D-葡萄糖、D-乳糖、D-麦芽糖、D-木糖、七叶苷、D-纤维二糖、D-甘露糖及D-棉子糖组成的组中的一种以上作为碳源。
作为用来实现上述目的的还有一实施方式，涉及长双歧杆菌NK173(保藏机构：韩国微生物保藏中心，保藏日期：2021年09月06日，保藏编号：KCCM13046P)。
本发明的保藏编号为KCCM13046P的长双歧杆菌NK173的特征在于，是从健康人的肠内菌群(从粪便中分离)中分离及鉴定的乳酸菌。
用于对本发明的长双歧杆菌NK173进行鉴定及分类的16S rDNA碱基序列如本说明书中随附的序列3所示。因此，本发明的长双歧杆菌NK173可以包含序列3的16S rDNA。
上述序列3的16S rDNA碱基序列的分析结果为，示出与公知的长双歧杆菌菌株具有99％的同源性，具有与长双歧杆菌最高的分子系统学亲缘关系。因此，将上述乳酸菌鉴定为长双歧杆菌，将其命名为长双歧杆菌NK173。
本发明的长双歧杆菌NK173为革兰氏阳性菌，细胞的形态为杆菌。长双歧杆菌NK173更为具体的生理学特性可以通过相关技术领域的通常方法来分析，结果如下述表6所示。具体地，长双歧杆菌NK173可以利用选自由D-葡萄糖、D-甘露醇、D-麦芽糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、明胶、七叶苷及D-甘露糖组成的组中的一种以上作为碳源。
本发明所述保藏编号为KCCM12783P的植物乳杆菌NK151、保藏编号为KCCM12784P的两歧双歧杆菌NK175、保藏编号为KCCM13046P的长双歧杆菌NK173或它们的混合物的特征在于，变形菌(Proteobacteria)的表达抑制效果优秀，抑制炎性细胞因子的表达(例如，肿瘤坏死因子α等)并增进抗炎性细胞因子的表达(例如，白细胞介素10等)。并且，增加眼中的眼泪分泌量、抑制角膜和/或视网膜中的炎症，在角膜和/或视网膜中表现出优秀的抗氧化效果及炎症抑制效果，减少人体内疲劳物质(例如，血中的肌酐、乳酸)的含量，减少皮质酮的水平。即，改善眼中发生的炎症，有效抑制细胞内一氧化氮的水平，可以使角膜的损伤最小化，可以通过阻止视网膜的氧化损伤等来增进眼健康。并且，表现出对包括结肠炎在内的炎症性疾病的改善效果，呈现抑制神经炎症因子、增加脑源性神经营养因子(BDNF)的表达、改善认知功能障碍、精神障碍等效果。
作为实现上述目的的另一实施方式，本发明提供包含保藏编号为KCCM12783P的植物乳杆菌NK151、保藏编号为KCCM12784P的两歧双歧杆菌NK175、保藏编号为KCCM13046P的长双歧杆菌NK173或它们的任意混合物的药物组合物。在本发明中，上述药物组合物可以为包含上述任一种、两种或三种乳酸菌的药物组合物。
作为实现上述目的的又一实施方式，本发明提供包含保藏编号为KCCM12783P的植物乳杆菌NK151、保藏编号为KCCM12784P的两歧双歧杆菌NK175、保藏编号为KCCM13046P的长双歧杆菌NK173或它们的任意混合物以及药学上可接受的载体的药物组合物。
作为实现上述目的的又一实施方式，本发明提供包含保藏编号为KCCM12783P的植物乳杆菌NK151、保藏编号为KCCM12784P的两歧双歧杆菌NK175、保藏编号为KCCM13046P的长双歧杆菌NK173或它们的任意混合物的用于预防或治疗眼部疾病、炎症性疾病、认知功能障碍或精神障碍的药物组合物。
具体地，本发明的植物乳杆菌NK151可以对选自由眼部疾病、炎症性疾病、认知功能障碍及精神障碍组成的组中的一种以上疾病具有预防、治疗或改善效果。并且，具体地，本发明的两歧双歧杆菌NK175可以对选自由眼部疾病、炎症性疾病、认知功能障碍及精神障碍组成的组中的一种以上疾病具有预防、治疗或改善效果。并且，具体地，本发明的长双歧杆菌NK173可以对选自由眼部疾病、炎症性疾病、认知功能障碍及精神障碍组成的组中的一种以上疾病具有预防、治疗或改善效果。并且，上述提及的菌株的任意混合形态的混合物可以对选自由眼部疾病、炎症性疾病、认知功能障碍及精神障碍组成的组中的一种以上疾病具有预防、治疗或改善效果。
作为用来实现上述目的的具体实施方式，本发明提供包含保藏编号为KCCM12783P的植物乳杆菌NK151、保藏编号为KCCM12784P的两歧双歧杆菌NK175、保藏编号为KCCM13046P的长双歧杆菌NK173或它们的任意混合物的用于预防或治疗眼部疾病的药物组合物。
作为用来实现上述目的的具体实施方式，本发明提供包含保藏编号为KCCM12783P的植物乳杆菌NK151、保藏编号为KCCM12784P的两歧双歧杆菌NK175、保藏编号为KCCM13046P的长双歧杆菌NK173或它们的任意混合物的用于预防或治疗炎症性疾病的药物组合物。
作为用来实现上述目的的具体实施方式，本发明提供包含保藏编号为KCCM12783P的植物乳杆菌NK151、保藏编号为KCCM12784P的两歧双歧杆菌NK175、保藏编号为KCCM13046P的长双歧杆菌NK173或它们的任意混合物的用于预防或治疗认知功能障碍的药物组合物。
作为用来实现上述目的的具体实施方式，本发明提供包含保藏编号为KCCM12783P的植物乳杆菌NK151、保藏编号为KCCM12784P的两歧双歧杆菌NK175、保藏编号为KCCM13046P的长双歧杆菌NK173或它们的任意混合物的用于预防或治疗精神障碍的药物组合物。
在本发明中，“眼部疾病”是指发生在眼部的疾病，包括作为覆盖眼前侧的结构物的结膜和角膜的异常、眼球前方及包括虹膜或玻璃体在内的前方的结构物中发生的异常，包括眼的结构物中发生的疾病。
上述眼部疾病的例包括例如眼疲劳、视网膜症、角膜炎、黄斑变性(包括干性和/或湿性)、眼球干燥症、色素性视网膜症、糖尿病性视网膜症、早产儿视网膜症、增生性视网膜症、缺血性视网膜症、脉络膜血管新生、新生血管青光眼、缺血性视神经病变、糖尿病性黄斑变性、红肿、近视、干燥综合征(Sjogren)，但不限定于此。优选地，眼部疾病可以为选自由眼疲劳、黄斑变性、眼球干燥症、视网膜症及角膜炎组成的组中的一种以上。
“眼疲劳”是指因近距离作业时花眼引起的调节力下降导致睫状体肌肉负荷过度的情况、由干燥的环境引起的眼球干燥的情况、暴露在过度的光线下的情况等发生的眼中的疲劳感。表现为模糊、流泪、充血、炫目、干涩、异物感等症状，严重的情况下还发生疼痛及头痛。上述眼疲劳可以由例如无法维持泪膜而使眼球表面干燥，由此在角膜及结膜出现伤口而诱发疲劳感，可以因过度的光刺激在视网膜上皮细胞中产生自由基(free radical)而在眼球内的视网膜细胞及玻璃体中发生直接的损伤引起。
“黄斑变性”是指位于视网膜的中心部附近的负责详细视觉的黄斑的进行性损伤。有在视网膜出现玻璃膜疣(代谢物在黄斑部逐渐堆积的状态)或发生视网膜色素上皮的萎缩等病变的情况等的干性黄斑变性，还有在视网膜下出现脉络膜新生血管而产生的湿性黄斑变性。
“眼球干燥症”包括因盐类不足或盐类过度蒸发引起眼球干燥导致的眼的针刺感、眼的干涩感、眼的异物感、眼疲劳、眼的严重干燥、眼的灼热感、眼的凉感、眼的拉扯感、眼的疼痛、眼的充血及眼球干燥引起的头痛、角膜神经的感觉下降以及各种炎症等。
“视网膜症”是指眼的视网膜中发生持续性或急性损伤的情况，包括因视网膜的外周血管中发生循环障碍或在其上堆积沉淀物等引起的疾病。包括糖尿病性视网膜病变、高血压视网膜症、早产儿视网膜病变、放射线视网膜症等。
“结膜炎”是指因结膜的炎症引起结膜充血导致的眼屎堆积、眼睑内侧出现滤泡、感觉到瘙痒和异物感的眼部疾病。
在本发明中，炎症性疾病为以炎症为主要病变的疾病的总称，可以为选自包括炎症性肠病、关节炎、痛风、肝炎、肥胖、胃炎、肾炎、糖尿病、结核、支气管炎、胸膜炎、腹膜炎、脊柱炎、胰腺炎、尿道炎、膀胱炎、阴道炎、动脉硬化症、败血症及牙周炎在内的组中的一种以上。
术语“炎症性肠病(IBD)”是指结肠及胃肠道的炎症状态的一个类别。炎症性肠病的主要类型为为溃疡性结肠炎(UC)及克罗恩病。结肠炎与克罗恩病的主要不同点在于炎症变化的位置和特性。克罗恩病可以影响从口至肛门的胃肠道的任何部分，与之相反，结肠炎局限于结肠和直肠。若因表现(presentation)的特质性而无法实现克罗恩病或结肠炎的最终诊断，则这种情况可以诊断为未确定型结肠炎。其它形态的炎症性肠病包括胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、转化性结肠炎、白塞氏病及未确定型结肠炎，但不限定于此。
即，本发明的炎症性肠病可以为选自由溃疡性结肠炎、克罗恩病、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、转化性结肠炎、白塞氏病及未确定型结肠炎组成的组中的一种以上。
在本发明中，认知功能障碍为表现出认知损伤及行为变化的障碍，是指因记忆力、空间知觉、判断力、执行功能、语言能力等功能下降发生疾病。上述认知功能障碍可以为例如选自由阿尔茨海默病、亨廷顿病、血管性痴呆症、皮克(pick)病、帕金森病、克雅氏病及痴呆组成的组中的一种以上，但不限定于此。并且，认知功能障碍包括由上述症状发生的记忆力损伤、痴呆症状等。
在本发明中，“精神障碍”也称为精神疾病或精神病，是指在个人、社会功能方面出现问题的行为-精神异常，还可以包括由此引起的身体症状。病因可以为具有先天性的大脑问题，还可以有严重的压力因素等。精神障碍的种类可以为选自由抑郁不安障碍、情绪障碍、失眠症、妄想障碍、强迫障碍、偏头痛、精神压力、记忆障碍、自闭症、注意缺陷与多动障碍(ADHD)、注意力障碍综合征(ADD)、惊恐发作及注意力障碍组成的组中的一种以上，但不限定于此。
本发明中的“神经炎症(neuroinflammation)”是指脑中发生的炎症，是引起认知功能障碍、精神障碍相关疾病的重要因素。已知若炎性细胞在脑中过度激活，则炎症诱发细胞因子的分泌增多，通过这样的炎症反应的过度激活引起脑细胞损伤，从而诱发认知功能障碍或精神障碍。
根据本发明的一实施方式，确认到植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175和/或长双歧杆菌NK173表现出抑制巨噬细胞的肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β(IL-1β)的表达，而诱导白细胞介素10的表达的优秀的抗炎效果。
并且，根据本发明的一实施方式，确认到植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175和/或长双歧杆菌NK173表现出通过抑制变形菌增殖活性来实现肠内微生物群的正常化的效果。
并且，根据本发明的一实施方式，在眼部疾病动物模型中确认到植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175和/或长双歧杆菌NK173恢复眼泪分泌量、抑制角膜的炎症、调节炎性细胞因子及抗炎性细胞因子的表达水平、视网膜的丙二醛(MDA)、调节谷胱甘肽(GSH)及NO(一氧化氮)水平、减少血液中作为疲劳物质(尤其是与眼疲劳的关联性高的)的乳酸、乳酸脱氢酶、肌酐以及皮质酮的水平的结果。
并且，根据本发明的一实施方式，在结肠炎动物模型中确认到植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175和/或长双歧杆菌NK173抑制大肠长度的减少、减少髓过氧化物酶(MPO)活性、减少炎性细胞因子在大肠中的表达并增加抗炎性细胞因子的表达水平的结果。
并且，根据本发明的一实施方式，在患有痴呆、不安以及抑郁症的动物模型中确认到植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175和/或长双歧杆菌NK173改善由上述疾病诱发的行动学问题(交叉行动量改善)、通过减少炎性细胞因子的表达来调节神经炎症、增加脑源性神经营养因子的表达、通过改善不安/抑郁症状(挂尾状态时的静止状态时间减少)来呈现出对疾病的改善及治疗效果。
上述结果示出植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175和/或长双歧杆菌NK173在炎症性疾病、眼部疾病、认知功能障碍和/或精神障碍的预防、治疗或改善中具有卓越的功效。
并且，上述药物组合物在使变化的肠内微生物正常化的同时通过使免疫力正常化来在眼部疾病、认知功能障碍、精神障碍、炎症性疾病及由此引起的并发症的调节、预防、改善及治疗中呈现出优秀的效果。
本发明菌株的形态能够以活菌体、死菌体、培养物、破碎物或提取物的形态等来使用。本发明的菌株在包含菌株的条件下，无论具有何种形态，在上述提及的效果层面都呈现出同等水平以上(尤其在以活菌为中心考虑时)的结果。
活菌体是指正常存活的菌，死菌体是指在规定条件下培养活菌等后通过热条件、加压、药物处理等方法分离提取的有效成分。
培养物是指在公知的液体培养基或固体培养基中培养乳酸菌来获得的产物，是包括本发明的菌株的概念。上述产物可以包含乳酸菌。上述培养基可以在公知的液体培养基或固体培养基中选择，例如，可以为MRS液体培养基、GAM液体培养基、MRS琼脂培养基、GAM琼脂培养基、BL琼脂培养基，但不限定于此。
破碎物是指通过机械、化学方法分离加工的活菌体、死菌体或其培养物的破碎形态。例如，可以通过珠磨机(bead mills)、挤压(Presses)、超声波仪(Sonicator)或微射流机(Microfluidizer)、酶处理等来制备为破碎形态。
提取物是指通过通常已知的提取方式(公知的提取溶剂(例如使用水、C1至C4的醇类(甲醇、乙醇等))提取来获得)提取活菌体、死菌体和/或破碎物来获得的提取物。
在本发明中，确认到混合菌株的混合物表现出协同效果，因此包括利用它们的任意混合物的形态。
并用形态或混合物的利用形态可以包括：例如1)植物乳杆菌NK151及两歧双歧杆菌NK175；2)植物乳杆菌NK151及长双歧杆菌NK173；或3)植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175及长双歧杆菌NK173的形态。
即，对于有本发明的植物乳杆菌NK151来说，可以通过混合双歧杆菌属菌株来呈现优秀的协同效果。
基于菌的数量(CFU)，植物乳杆菌NK151与两歧双歧杆菌NK175的比例可以为例如10∶1、9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9或1∶10。优选地，可以为9∶1至1∶1，更优选地，可以为4∶1至1∶1，更具体地，可以为4∶1。
基于菌的数量(CFU)，植物乳杆菌NK151与长双歧杆菌NK173的比例可以为例如10∶1、9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9或1∶10。优选地，基于菌的数量(CFU)，可以为9∶1至1∶1，更优选地，可以为4∶1至1∶1，更具体地，可以为4∶1。
植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175及长双歧杆菌NK173可以相对于植物乳杆菌NK151并基于2种双歧杆菌属菌株的和来考虑菌的数量。例如，基于菌的数量(CFU)，可以为10(植物乳杆菌NK151)∶1(两歧双歧杆菌NK175及长双歧杆菌NK173)、9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9或1∶10。优选地，可以为9∶1至1∶1，更优选地，可以为4∶1至1∶1，更具体地，可以为4∶1。
根据本发明的一实施方式，上述菌株的混合物，即，并用形态在眼部疾病动物模型中表现出增加眼泪分泌量、改善角膜损伤、调节炎性细胞因子和趋化因子的表达的优秀的协同效果，并且，在视网膜的抗氧化调节及眼疲劳调节中也表现出优秀的效果。
根据本发明的一实施方式，对于炎症性疾病(尤其是炎症性肠病)、认知功能障碍及精神障碍，上述菌株的混合物也通过菌株混合的优秀的协同效果在疾病的治疗剂改善中表现出优秀的效果。
尤其，与单独菌株相比，上述菌株的混合在肠内微生物群的正常化及保持肠内健康方面可以表现出更为优秀的效果。
本发明的药物组合物可以使用本发明所属技术领域中已知的方法制备为药物剂型来在向哺乳动物给药后提供活性成分的迅速、持续或延迟的释放。在剂型的制备中，在不妨碍本发明化合物的活性的范围内，本发明的药物组合物还可以追加包含药剂学上可接受的载体。
上述药剂学上可接受的载体为通常所使用的载体，包括例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但不限定于此。并且，本发明的药物组合物还可以包含填充剂、增量剂、结合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂等稀释剂或赋形剂、其他药剂学上可接受的添加剂。
本发明的药物组合物能够以药学上有效的量来给药。“药学上有效的量”是指可以应用于医学治疗中的以合理的收益/风险比例来预防或治疗疾病的充分的量。有效剂量水平可以通过相关从业者根据配制方法、患者的状态及体重、患者的性别、年龄、疾病的程度、药物形态、给药途径及期间、代谢速度、反应敏感性等因素来多种多样地选择。如相关从业者所认可地，有效量可以根据处理的途径、赋形剂的使用及与其他药剂联合使用的可能性来变化。但为了优选的效果，在口服制剂的情况下，成人通常可以一天给药0.0001mg/kg至100mg/kg，优选地，给药0.001mg/kg至100mg/kg，但无论从任何方面来讲，上述给药量都不是在限制本发明的范围。
可以通过多种途径向小鼠、家畜、人类等哺乳动物给药本发明的药物组合物。具体地，本发明的药物组合物可以口服或胃肠外给药(例如，涂敷或静脉内、皮下、腹腔内注射)，单一口服给药为佳。用于口服给药的固体剂型包括散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、软胶囊剂、丸剂等。用于口服的液体制剂有悬混剂、内溶液剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等，除常用的作为单纯稀释剂的水、液体石蜡以外，还可以包含多种赋形剂，例如湿润剂、甜味剂、芳香剂、保存剂等。用于胃肠外给药的制剂可以根据各种通常的方法配置为灭菌的水溶液、液剂、非水性溶剂、悬混剂、乳剂、滴眼剂、眼软膏剂、浆剂、栓剂、喷剂等外用剂及灭菌注射制剂的形态来使用，优选地，制备为霜剂、凝胶、面膜、喷雾剂、软膏剂、硬膏剂、洗剂、擦剂、眼软膏剂、滴眼剂、贴剂或巴布剂等药物组合物来使用，但不限定于此。用于局部给药的制剂可以根据临床处方为无水型或水性型。非水性溶剂、助悬剂可以使用丙二醇(propylene glycol)、聚乙二醇、橄榄油等植物油、油酸乙酯等可注射的酯类。栓剂的基剂可以使用witepsol、聚乙二醇、吐温(tween)61、可可脂、肉实树酯、甘油明胶等。
根据用于实现上述目的本发明的又一实施方式，涉及包含植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175、长双歧杆菌NK173或它们的任意混合物的预防或治疗选自由眼部疾病、认知功能障碍、精神障碍及炎症性疾病组成的组中的一种以上疾病的方法。
上述“植物乳杆菌NK151”、“两歧双歧杆菌NK175”、“长双歧杆菌NK173”、“眼部疾病”、“认知功能障碍”、“精神障碍”及“炎症性疾病”的内容如前所述。
本发明的药物组合物可以作为单独治疗剂来给药，也可以与其他治疗剂联合给药，可以与现有的治疗剂依次或同时给药。并且，本发明的药物组合物可以单次或多次给药。重点在于，在考虑上述所有因素后以能够以无副作用的最小的量来获得最大效果的量来给药，这可以通过相关从业者轻易地确定。
本发明的术语“对象”包括可以通过给药本发明的药物组合物来使症状好转的动物或人类。可以通过向个体给药本发明的治疗组合物来有效预防及治疗眼部疾病、认知功能障碍、精神障碍或炎症性疾病。
本发明的术语“给药”是指通过任意适合的方法向人类或动物导入规定的物质的行为，本发明的治疗用组合物的给药可以通过能够到达目标组织的任何通常的途径来口服或胃肠外给药。并且，本发明的治疗用组合物可以通过能够使有效成分向目标细胞移动的任意装置来给药。
本发明的药物组合物的优选给药量可以根据患者的状态及体重、疾病的程度、药物形态、给药途径及期间的不同而不同，可以通过相关从业者适当地选择。
本发明提供用于在选自由眼部疾病、认知功能障碍、精神障碍及炎症性疾病组成的组中的一种以上疾病的预防或治疗中使用的植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175、长双歧杆菌NK173或它们的任意混合物。
本发明提供用于在炎症性疾病的预防或治疗中使用的植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175、长双歧杆菌NK173或它们的任意混合物。
本发明提供用于在眼部疾病的预防或治疗中使用的植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175、长双歧杆菌NK173或它们的任意混合物。
本发明提供用于在认知功能障碍的预防或治疗中使用的植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175、长双歧杆菌NK173或它们的任意混合物。
本发明提供用于在精神障碍的预防或治疗中使用的植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175、长双歧杆菌NK173或它们的任意混合物。
本发明提供植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175、长双歧杆菌NK173或它们的任意混合物在用于治疗选自由眼部疾病、认知功能障碍、精神障碍及炎症性疾病组成的组中的一种以上疾病的药剂的制备中的用途。
本发明提供植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175、长双歧杆菌NK173或它们的任意混合物在用于治疗炎症性疾病的药剂的制备中的用途。
本发明提供植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175、长双歧杆菌NK173或它们的任意混合物在用于治疗眼部疾病的药剂的制备中的用途。
本发明提供植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175、长双歧杆菌NK173或它们的任意混合物在用于治疗认知功能障碍的药剂的制备中的用途。
本发明提供植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175、长双歧杆菌NK173或它们的任意混合物在用于治疗精神障碍的药剂的制备中的用途。
本发明的又一实施方式涉及包含植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175、长双歧杆菌NK173及它们的任意混合物的用于预防或改善选自由眼部疾病、认知功能障碍、精神障碍及炎症性疾病组成的组中的一种以上疾病的食品组合物。
本发明的又一实施方式涉及包含植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175、长双歧杆菌NK173及它们的任意混合物的用于改善疲劳的食品组合物。
本发明的食品组合物通过减少人体内的胁迫或疲劳物质的水平来在疲劳改善中表现出优秀的效果。具体地，通过减少乳酸、乳酸脱氢酶、肌酐的水平和皮质酮的水平并增进看氧化效果来在疲劳的改善中表现出优秀的效果。
上述“植物乳杆菌NK151”、“两歧双歧杆菌NK175”、“长双歧杆菌NK173”、“眼部疾病”、“认知功能障碍”、“精神障碍”及“炎症性疾病”的内容如前所述。
具体地，本发明的食品组合物中包含的乳酸菌可以为其活菌体、其死菌体、其培养物、其破碎物或其提取物，只要是能够实现预防或改善认知功能障碍、眼部疾病、精神障碍或炎症性疾病的效果的乳酸菌的形态，就可以不受限制地使用。
上述食品的种类不受特别限制。可以添加上述乳酸菌的食品有香肠、肉类、面包、巧克力类、小食品类、糖类、饼干类、拉面、披萨、其他面类、口香糖类、包括冰淇淋在内的乳制品、各种汤、饮料、茶、饮剂、酒精饮料及维生素复合剂等。在配制为饮料的情况下，除乳酸菌以外，添加的液体成分可以与通常的饮料一样包含多种香味剂或天然碳水化合物等追加成分，但不限定于此。上述天然碳水化合物可以为单糖(例如葡萄糖、果糖等)、二糖(例如麦芽糖、蔗糖等)、多糖(例如糊精、环糊精等通常的糖)以及木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等糖醇。
上述食品的种类具体可以为保健功能食品。上述保健功能食品可以含有多种营养剂、维生素、矿物质(电解质)、合成风味剂及天然风味剂等风味剂、着色剂及增稠剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、有机酸、保护性胶体增粘剂、pH调节剂、稳定剂、保存剂、甘油、酒精、碳酸饮料中使用的碳酸化剂等。可以单独或组合来使用上述成分，相对于组合物的总重量，上述添加剂的比例通常可以在0.001重量份至50重量份的范围内选择。
上述保健功能食品为强调食品的生物体调节功能的食品，为利用生物化学、生物工程学方法赋予附加价值来在特定目标中起作用及表达的食品。上述保健功能食品的成分以在生物体内充分发挥生物体防御及生物体节律的调节、与疾病的预防及恢复相关的身体调节功能的方式设计加工，可以含有可接受为食品的食品辅助添加剂、甜味料或功能性原料。
在将本发明的植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175和/或长双歧杆菌NK173用作保健功能食品(或者保健功能饮料添加物)的情况下，可以直接添加上述植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175和/或长双歧杆菌NK173，或者与其他食品或食品成分一同使用，可以根据通常的方法适当地使用。上述植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175和/或长双歧杆菌NK173的混合量可以根据其使用目的(预防、保健或改善、治疗处置)来适当地决定。
发明的效果
本发明的新型乳酸菌及它们的任意混合物的特征在于，抑制变形菌表达的效果优秀，抑制炎性细胞因子的表达(例如，肿瘤坏死因子α(等)并增进抗炎性细胞因子的表达(例如，白细胞介素10等)。并且，在眼中增加盐类的分泌量并抑制角膜和/或视网膜中的炎症，在角膜和/或视网膜中表现出优秀的抗氧化效果及炎症抑制效果，减少人体内疲劳物质(例如，血中的肌酐、乳酸等)的含量，减少皮质酮的水平。并且，表现出对包括结肠炎在内的炎症性疾病的改善效果，表现出抑制神经炎症因子、增加脑源性神经营养因子的表达以及改善认知障碍、精神障碍等的效果。因此，可以在眼部疾病、炎症性疾病、认知功能障碍、精神障碍等的治疗、改善及预防中有效地使用。
应该理解的是，本发明的效果不限于上述效果，还应包括能够通过本发明的详细说明或发明要求保护范围中记载的结构推导出的所有效果。
具体实施方式
以下，通过实施例详细说明本发明。但下述实施例仅用于例示本发明，本发明不限定于下述实施例。
实施例1.分离及鉴定植物乳杆菌NK151、长双歧杆菌NK173及两歧双歧杆菌NK175乳酸菌
1-1.从人粪便中分离乳酸菌
为了从健康人的肠内菌群中获得新型菌株，将人粪便放入GAM液体培养基(GAMbroth；日水制药(Nissui Pharmaceutical)，日本(Japan))并悬浮。然后，采集上清液移植到GAM琼脂培养基(general anaerobic medium；日水制药，日本)及BL琼脂培养基(BL agarmedium；日水制药，日本)并在37℃的温度下培养约48小时后，分离形成菌落(colony)的乳酸杆菌属菌株(Lactobacillus sp.)、双歧杆菌属(Bifidobacterium sp.)菌株。
1-2.鉴定分离的乳酸菌
为了确认从人粪便中分离的菌株的生理学特性以及筛选的菌株的系统分类学位置，通过分析16S rDNA的碱基序列来确定菌株的种，赋予菌株名称。
通过上述过程分离的菌株如下述表1所示。
表1
实施例2.分析菌株的特性
2-1.测定巨噬细胞的白细胞介素10及肿瘤坏死因子α的表达量
向6周龄的雄性C57BL/6小鼠(20g-23g)的腹腔内给药2ml的灭菌的4％的巯基乙酸，经过96小时后，麻醉小鼠，向小鼠腹腔中给药8ml的RPMI 1640培养基，5分钟～10分钟后抽出小鼠腹腔内的RPMI培养基(巨噬细胞)，在1000g的条件下离心分离10分钟后，再用RPMI1640培养基洗涤两次。以0.5×106的数量在24孔培养板的每孔中铺上巨噬细胞后，只处理上述实施例1中鉴定的乳酸菌，或者与乳酸菌一同处理作为炎症诱导物质的脂多糖(LPS)24小时后，使用酶联免疫吸附测定试剂盒(ELISA kit)(皮尔斯生物科技(PierceBiotechnology,Inc.)，罗克福德(Rockford)，伊利诺伊州(IL)，美国(USA))在上清液中测量肿瘤坏死因子α、白细胞介素10细胞因子的表达量。
首先，向分别涂敷有肿瘤坏死因子α抗体、白细胞介素10抗体的96孔培养板中放入50μl的上清液并在常温下反应2小时后，使用磷酸盐缓冲溶液-吐温(phosphate bufferedsaline-Tween，PBS-Tween)洗涤，放入发色剂发色20分钟后，在450nm的波长中测量吸光度来计算。
2-2.变形菌增殖抑制活性
测定了变形菌增殖抑制活性。分别将0.1ml的1×106CFU/mL的人的分辨稀释液和1×106CFU/mL的上述实施例1中分离的乳酸菌培养稀释液移植到10ml的GAM培养基中，在厌氧条件下培养24小时，采集菌，使用QIAamp脱氧核糖核酸粪便微型试剂盒(DNA stool minikit)(凯杰(Qiagen)，德国(Germany))提取脱氧核糖核酸(DNA)后进行定量聚合酶链式反应(qPCR)。聚合酶链式反应(PCR)首先是在是在95℃的温度下处理30秒钟后，接着重复42次在95℃的温度下处理5秒钟，在72℃的温度下处理30秒钟的过程。
定量聚合酶链式反应的引物如下述表2所示。
表2
2-3.确认特性分析结果
如表3所示，确认了变形菌增殖抑制效果和在巨噬细胞中的炎性细胞因子及抗炎性细胞因子的表达变化。
表3
*乳酸菌的组中处理浓度：1×105CFU/ml。*+++：>80％；++：＞40％-80％；+：＞1％-40％；-：＜0％--40％；--：＜-40％。
如上述表3所示，植物乳杆菌NK151及两歧双歧杆菌NK175表现出相对于肿瘤坏死因子α表达优秀的的白细胞介素10表达诱导活性。并且，长双歧杆菌NK173也确认到相对于肿瘤坏死因子α表达优秀的的白细胞介素10表达诱导活性。通过上述结果可以确认上述菌株可以示出优秀的抗炎活性。
并且，在用来考虑肠内微生物群的正常功能的变形菌增殖抑制活性的确认结果中，上述提及的菌株也表现出优秀的变形菌增殖抑制活性。
实施例3.菌株保藏及生理学特性确认
3-1.新型菌株确认及16s rDNA确认
确认到植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175及长双歧杆菌NK173分离菌株均为革兰氏阳性菌且均为杆菌。
确认16S rDNA的结果示出植物乳杆菌NK151的16S rDNA具有序列1的碱基序列。使用基因银行的BLAST程序分析植物乳杆菌NK151的16S rDNA的同源性的结果，未检索到公知的植物乳杆菌菌株，示出与公知的植物乳杆菌菌株的16S rDNA序列具有99％的同源性。将上述新型菌株命名为植物乳杆菌NK151，于2020年9月10保藏于公认的保藏机构韩国微生物保藏中心(地址：韩国首尔市西大门区弘济内2甲路45号榆林大厦)并赋予KCCM12783P的保藏编号。
两歧双歧杆菌NK175的16S rDNA示出具有序列2的碱基序列。利用基因银行的BLAST程序分析两歧双歧杆菌NK175的16S rDNA的同源性的结果，未检索到公知的两歧双歧杆菌菌株，示出与公知的两歧双歧杆菌菌株的16S rDNA序列具有99％的同源性。将上述新型菌株命名为两歧双歧杆菌NK175，于2020年9月10保藏于公认的保藏机构韩国微生物保藏中心(地址：韩国首尔市西大门区弘济内2甲路45号榆林大厦)并赋予KCCM12784P的保藏编号。
并且，长双歧杆菌NK173的16S rDNA示出具有序列3的碱基序列。利用基因银行的BLAST程序分析长双歧杆菌NK173的16S rDNA的同源性的结果，未检索到公知的长双歧杆菌菌株，示出与公知的长双歧杆菌菌株的16S rDNA序列具有99％的同源性。将上述新型菌株命名为两歧双歧杆菌NK175，于2021年9月6保藏于公认的保藏机构韩国微生物保藏中心(地址：韩国首尔市西大门区弘济内2甲路45号榆林大厦)并赋予KCCM13046P的保藏编号。
3-2.利用API试剂盒的生物化学鉴定
在植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175及长双歧杆菌NK173的生理学特性中利用碳源，分别通过API 50CH Kit及API 20A Kit(生产商：生物梅里埃(BioMerieux's)，美国)以糖发酵试验进行分析，结果分别如下述表4至表6所示。
表4
表5
表6
碳源 NK173 碳源 NK173
L-色氨酸 - 七叶苷 +
尿素 - 甘油 -
D-葡萄糖 + D-纤维二糖 -
D-甘露醇 + D-甘露糖 +
D-乳糖 - D-松三糖 -
D-蔗糖 - D-棉子糖 -
D-麦芽糖 + D-山梨糖醇 -
水杨苷 - D-鼠李糖 -
D-木糖 + D-海藻糖 -
L-阿拉伯糖 + CAT -
明胶 + Spor -
Gram + Cocc -
在上述表4至表6中，“+”表示碳源利用性阳性的情况，“-”表示碳源利用性阴性的情况。如上述表4至表6所示，确认到各菌株的生物化学特性不同。
实施例4：制备死菌体、破碎物
实施例4-1.制备死菌体
在热处理的条件下以90℃的温度对植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175及长双歧杆菌NK173进行10分钟的热处理共3次来制备死菌体。
实施例4-2.制备破碎物(可溶物及不溶物)
将离心分离植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175及长双歧杆菌NK173获得的活菌以1×106CFU/mL的浓度在灭菌蒸馏水中悬浮，在4℃的温度下进行超声波处理(处理1分钟，休息1分钟，重复5次)，离心分离(10000g，4℃，15分钟)来获得上清液(可溶物)和沉淀物(不溶物)。将其冷冻干燥来使用。
实施例5.确认死菌体及破碎物的活性
利用上述实施例4中制备的死菌体及破碎物，以与实施例2相同的方式确认在巨噬细胞中的抗炎活性。
结果，确认到通过热处理(90℃，10分钟，3次)制备的死菌体及通过超声波处理(1分钟，10次)破碎的破碎物相对于肿瘤坏死因子α表达的白细胞介素10的诱导活性示出与处理活菌时相似的结果。
实施例6.确认在眼部疾病模型中的治疗及改善效果
6-1.眼部疾病实验动物的制备
购入8周龄的BALB/c小鼠(桑塔科(Samtako)，韩国)，经一周的驯化后，为了去除泪腺，使用2％的异氟醚(isoflurane)麻醉后，在保持1％的异氟醚的情况下去除小鼠的眼球与耳部之间正中央部位的毛，消毒手术部位后，切开约1cm的皮肤。在切开的部位摘除眼球外泪腺(exorbital lacrimal gland)后缝合皮肤，在5天内向角膜处理硫酸阿托品(atropine sulfate)。翌日，使用酚红线(thread)眼泪量测量试纸(FCI Opthalmics ZoneQuick，日本(Japan))接触眼睑外侧端部眼球表面，30秒钟后测量试纸的颜色因眼泪变化的长度，将与正常对照组(sham)相比眼泪量显著减少的小鼠用于实验。每组的小鼠为8只。
分为如下组：1)正常组(NC)；2)仅手术但未摘除泪腺的sham组(sham)；3)摘除泪腺并给药生理盐水的组(DE)；4)摘除泪腺并给药植物乳杆菌NK151的组(LP)；5)摘除泪腺并给药两歧双歧杆菌NK175的组(BB)；6)摘除泪腺并给药长双歧杆菌NK173的组(BL)；7)摘取泪腺并以1∶1的比例混合植物乳杆菌NK151与两歧双歧杆菌NK175来给药的组(LB1)；8)摘除泪腺并以4∶1的比例混合植物乳杆菌NK151与两歧双歧杆菌NK175来给药的组(LB2)以及9)以4∶1的比例混合植物乳杆菌NK151及长双歧杆菌NK173来给药的组(LB3)。
6-2.测定眼泪分泌量
眼泪分泌量的测定，向正常组、sham组、DE组给药溶剂(1％的麦芽糖液)，LP组、BB组、BL组、LB1组、LB2组及LB3组分别按照各自的实验组给药5×108CFU/小鼠(mouse)/天(day)的乳酸菌，共给药10天(在混合给药的情况下，以基于CFU的比例混合后按照上述给药量给药)。
通过使用酚红线眼泪量测量试纸(日本)接触眼睑外侧端部眼球表面，30秒钟后测量试纸的颜色因眼泪变化的长度来测量眼泪分泌量。
结果如表7所示。
下述表7示出以5×108CFU/小鼠/天的量给药10天的结果。
表7
实验组 眼泪量(mm)
正常组 4.8
SH组 4.9
DE组 1.2
LP组 2.1
BB组 1.8
BL组 1.6
LB1组 2.0
LB2组 2.1
LB3组 1.9
通过表7可以确认，给药溶剂的正常组、sham组、DE组的眼泪分泌量分别为4.8mm、4.9mm、1.2mm，诱发眼部疾病的小鼠在10天后相对于正常组的眼泪分泌量显著减少。给药植物乳杆菌NK151的LP组、给药两歧双歧杆菌NK175的BB组、给药1∶1的混合菌的LB1组、给药4∶1的混合菌的LB2组及LB3组中都因乳酸菌的给药而使眼泪分泌量显著增加。
结果还显示以1×108CFU/小鼠/天的量给药的小鼠的眼泪分泌量也增加了。
确认到并用菌株时眼泪增加的程度更高，尤其是在两歧双歧杆菌NK175及长双歧杆菌NK173的情况下，在与植物乳杆菌NK151混合的LB1组至LB3组中确认到眼泪的分泌量比单独给药时显著增加。
上述结果显示植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175及长双歧杆菌NK173或它们的任意混合物通过增加眼泪分泌量来在眼部疾病的改善中具有效果。
6-3.角膜荧光素染色(Corneal fluorescein staining)确认
将上述6-1的小鼠麻醉后，使用荧光染料(荧光素钠(Flurescein sodium salt))观察角膜的损伤程度。具体地，向实验动物的眼球中滴入2.5％的荧光素溶液后，在钴蓝光下使用活组织显微镜(biomicroscope)拍摄，将角膜分为上、中、下，将各区域中角膜炎最严重的情况评估为3分。
表8
实验组 角膜荧光素染色分数
正常组 0.4
SH组 0.5
DE组 4.8
LP组 1.4
BB组 1.9
BL组 1.9
LB1组 1.5
LB2组 1.4
LB3组 1.9
如上述表8所示，与正常组相比，摘除泪腺并处理阿托品(atropine)的DE组中的角膜损伤显著，但在处理植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175和/或长双歧杆菌NK173的LP组、BB组、BL组、LB1组、LB2组及LB3组中，角膜损伤显著改善。
6-4.测定角膜的细胞因子表达量
向50mg的角膜加入含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒(protease inhibitor cocktail)的150μl的RIPA缓冲液来均质化。然后在4℃及10000g的条件下离心分离15分钟来获得上清液，向96孔培养板中放入50μl的钙上清液后利用酶联免疫吸附测定酶标板试剂盒(ELISAplate kits)(皮尔斯生物科技，罗克福德，伊利诺伊州，美国)测量肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素10的表达量。
首先，向分别涂敷有肿瘤坏死因子α抗体、白细胞介素10抗体的96孔培养板中放入50μl的上清液并在常温下反应2小时后，使用磷酸盐缓冲溶液-吐温洗涤，放入发色剂发色20分钟后，在450nm的波长中测量吸光度来计算。
表9
如上述表9所所示，与正常组相比，摘除泪腺并处理阿托品的DE组中作为炎性细胞因子的肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β的表达量显著增加，而作为抗炎性细胞因子的白细胞介素10的表达量减少。另一发面，在处理了植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175和/或长双歧杆菌NK173的LP组、BB组、BL组、LB1组、LB2组及LB3组中，不仅角膜损伤都显著降低，而且白细胞介素10的表达量增加，炎症诱发细胞因子肿瘤坏死因子α及白细胞介素1β的表达量减少。尤其确认到LP组、LB2组及LB3组中炎性及抗炎性细胞因子的表达调节效果突出，上述结果表示植物乳杆菌NK151或与其混合两歧双歧杆菌NK175或长双歧杆菌NK173的菌株为改善眼部疾病，尤其是改善眼中的炎症的有效乳酸菌。
6-5.测定视网膜的丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)及一氧化氮(nitric oxide，NO)的量。
为了测量在眼部疾病中可以着重考虑的抗氧化相关因子和NO以及在视网膜中确认炎症水平变化，进行了如下实验。
从使用微型剪刀摘除的眼球中分离视网膜。将摘除的视网膜(1mg)放入0.2ml的凉磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，使用均质机均质化。
测量丙二醛：向50μl的视网膜均质液中放入0.6ml的1％的磷酸(phosphoricacid)和0.2ml的0.6％的硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid)后，在95℃的温度下沸腾45分钟后冷却后，放入0.8ml的正丁醇(n-butanol)后在3000g的条件下离心分离20分钟。离心分离后取上清液在535nm的波长中测量吸光度。使用1,1,3,3-四乙氧基丙烷(1,1,3,3-tetraethoxypropane)(丙二醛)测量535nm的吸光度来用作丙二醛标准曲线(MDA Standardcurve)。
测量NO：在50μl的视网膜均质液中使用硝酸盐/亚硝酸盐比色测定试剂盒(Nitrate/Nitrite Colormetric Assay Kit)(开曼化学(Caymanchem)，780001)进行测量。
测量谷胱甘肽：在50μl的视网膜均质液中依次混合谷胱甘肽测定试剂盒(GSHdetermination kit)中的试剂600μl的溶液(solution)R3、50μl的溶液(solution)R1、50μl的溶液(solution)R2，进行涡流后，在25℃的暗处反应10分钟后，在405nm的波长中测量吸光度。
测量肿瘤坏死因子α：利用酶联免疫吸附测定酶标板试剂盒(皮尔斯生物科技，罗克福德，伊利诺伊州，美国)进行测量。
表10
*将正常组表示为100％。
如上述表10所示，与正常组相比，摘除泪腺并处理阿托品的DE组中视网膜的丙二醛、谷胱甘肽及一氧化氮及肿瘤坏死因子α的浓度增加。
另一方面，在处理植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175和/或长双歧杆菌NK173的LP组、BB组、BL组、LB1组、LB2组及LB3组中，视网膜中的丙二醛、谷胱甘肽及一氧化氮及肿瘤坏死因子α的浓度都降低。尤其在LP组、LB2组及LB3组中确认到作为诱发黄斑变性的自由基生成指标的丙二醛、谷胱甘肽及一氧化氮的生成抑制效果突出。
上述结果表示植物乳杆菌NK151或与其混合两歧双歧杆菌NK175或长双歧杆菌NK173的菌株为在黄斑变性发病的抑制剂改善中有效的乳酸菌。
6-6.测定血液中皮质酮(corticosterone)、肌酐(creatinine)、乳酸(lactate)浓度及乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase)的活性
包括眼疲劳在内，当人体积聚疲劳时，积聚很多疲劳相关物质(例如，乳酸、肌酐等)，也积聚与压力相关性高的激素(例如皮质酮等)。因此，通过确认上述因子的表达变化来确认对疲劳现象的改善效果。
将从上述6-1的小鼠模型中采取的血液与乙二胺四乙酸(EDTA)一同放入试验管中，在3000rpm、4℃的条件下处理乙二胺四乙酸15分钟来分离血浆。利用艾博抗(Abcam)公司(剑桥(Cambrige)、马萨诸塞(MA)，美国)的乳酸、肌酐、乳酸脱氢酶测定试剂盒(assaykits)测定乳酸、肌酐的浓度及乳酸脱氢酶的活性。而且，使用武汉伊莱瑞特(Elabscience)生物科技股份有限公司(湖北，中国)的酶联免疫吸附测定试剂盒(ELISA assay kit)测定血浆中皮质酮的浓度。
表11
如上述表示11所示，与正常组相比，摘除泪腺并处理阿托品的DE组的血浆中乳酸、肌酐、皮质酮的浓度及乳酸脱氢酶的活性增加。另一方面，在处理植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175和/或两歧双歧杆菌NK173的LP组、BB组、BL组、LB1组、LB2组及LB3组中，乳酸、肌酐、皮质酮的浓度及乳酸脱氢酶活性都降低。尤其，在LP组、LB2组及LB3组中确认到作为因疲劳产生的指标的乳酸、肌酐、皮质酮的浓度及乳酸脱氢酶的活性抑制调节效果突触，上述结果表示植物乳杆菌NK151或与其混合两歧双歧杆菌NK175或长双歧杆菌NK173的菌株为在因眼球干燥、手术、压力产生的疲劳的抑制剂改善中有效的乳酸菌。
实施例7.抑郁、不安、疲劳、结肠炎疾病模型制备及治疗功效确认
7-1.制备拘束胁迫动物模型
为了诱导抑郁症及压力等精神障碍，制备了拘束胁迫动物模型。首先，将C57BL/6雄性小鼠(5周龄，19g-21g)以每组8只的方式分组后适应实验室1周时间。以一组为正常组，其余组为实验组。实验组为将小鼠以不能动的方式固定在3cm×10cm的圆筒形状的拘束胁迫器具上。具体地，以每2天一次使头部向上的方式站立2小时的方法重复拘束胁迫(IS)5次，从最后拘束胁迫24小时后开始每天一次给药乳酸菌及其复合物(以5×108CFU/小鼠/天的量给药，使用与前述相同的菌株比例相同的比例)共5天。正常组(NC)给药生理盐水。
用于确认分离的乳酸菌的抑郁/不安及疲劳改善功效的行动实验进行了高架十字迷宫实验、悬尾实验、强迫游泳实验，使用酶联免疫吸附测定试剂盒(ELISA kit)测定海马体中的白细胞介素6(IL-6)、脑源性神经营养因子，使用酶联免疫吸附测定试剂盒或分析试剂盒(kit)测定血液中的皮质酮、白细胞介素6，使用酶联免疫吸附测定试剂盒测定大肠中的白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素10、髓过氧化物酶。
7-2.制备抑郁/认知障碍/肠炎疾病模型
为了诱导由抑郁/认知障碍/肠炎诱发的精神障碍，制备了粪便移植动物模型。首先，将C57BL/6雄性小鼠(5周龄，19g-21g)以每组8只的方式分组后适应实验室1周时间。以一组为正常组，其余组为实验组。实验组为将患有抑郁/认知障碍/肠炎的患者(60多岁的女性)的粪便(2克)在生理盐水(18ml)中悬浮后，以500g的条件离心分离5分钟来分离上清液。将该上清液(0.1ml)每天向小鼠粪便移植一次共5天。从最后一次粪便移植(FMT)24小时后开始每天一次给药乳酸菌及其复合物(以5×108CFU/小鼠/天的量给药，使用与前述相同的菌株比例相同的比例)共5天。正常组(NC)给药生理盐水。
用于确认分离的乳酸菌的抑郁/不安及疲劳改善功效的行动实验进行了高架十字迷宫实验、悬尾实验、强迫游泳实验，使用酶联免疫吸附测定试剂盒测定海马体中的白细胞介素6、脑源性神经营养因子，使用酶联免疫吸附测定试剂盒或分析试剂盒测定血液中的皮质酮、白细胞介素6、肌酐、乳酸的浓度，使用酶联免疫吸附测定试剂盒测定大肠中的白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素10、髓过氧化物酶。
7-3.确认结肠炎及由其引起的痴呆、不安及抑郁的改善效果
购入6周龄的雄性C57BL/6小鼠(桑塔科，韩国)在动物实验室(湿度50±10％，温度25±2℃，照明间隔12小时，使用高效空气过滤器(HEPA)过滤空气)中驯化一周来使用。饲料使用标准实验用饲料(三养(Samyang)，韩国)，自由摄取饮用水。使用乙醚轻微麻醉实验动物后，使用针尖呈圆形的1ml的注射器通过肛门向大肠内给药0.1ml的三硝基苯磺酸(TNBS)2.5mg/5％的乙醇(EtOH)后保持倒立垂直的状态30秒钟。相反，正常组口服给药0.1ml的生理盐水。一组为6只小鼠。
从翌日开始，将试样(以5×108CFU/小鼠/天的量给药，使用与前述相同的菌株比例相同的比例)溶在生理盐水中以预先设定的剂量以一天一次的方式口服给药三天，在给药试样结束后的次日，使用二氧化碳使实验动物窒息安乐死后，摘除从盲肠至肛门之前部位的大肠。另一方面，获得测定大肠长度、髓过氧化物酶活性、大肠的细胞因子表达量、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor)表达量以及进行Y字型迷宫实验、悬尾实验等来获得结果。
7-4.Y字型迷宫实验(Y-maze task)
对于上述动物模型，通过Y字型迷宫实验来确认记忆力改善效果。
具体地，Y字型迷宫检测装置为伸出三个通路(arm)的具有“Y”字形状的装置，每个通路长度为25cm，高度为14cm，宽度为5cm，各通路间具有相同的角度。使实验动物的头部朝向Y字型迷宫的一个通路的端部后，使其自由地在通路中移动8分钟。记录动物的移动，将动物的后腿进入通路的情况视作通过(arm entry)。动物的移动以交替次数(alternation)来表示，所谓交替次数，就是将动物连续通过3个通路时定义为一次交替。自发性交替行动量以实际交替次数与可能的交替次数(即，从总交替次数中减去2的值)的百分比来表示。
7-5.高架十字迷宫(elevated plus maze，EPM)试验
对于上述动物模型进行实验。在20勒克斯照度的上方设置有摄像机的房间里，在高架十字迷宫实验装置(在距离地面50cm的高度架设两个开放通路(Open arm，30cm×7cm)和两个具有20cm高的壁的封闭通路(Enclosed arm，30cm×7cm)，从中央平台伸出7cm的有机玻璃装置)中使小鼠在正中央头朝向开放通路，测定5分钟内在开放通路和封闭通路中经过的时间和次数。在全部实验实践中，在开放通路中经过的时间(Time spent in openarms，OT)以[在开放通路中经过的时间/(在开放通路中经过的时间+在封闭通路中经过的时间)]×100来计算。
7-6.悬尾实验(Tail Suspension Test，TST)
对上述动物模型进行实验。使用固定装置将小鼠尾部端部1cm左右固定在直径35cm及高50cm的圆筒中后，使小鼠悬在距离地面50cm的位置。在6分种类测量实验动物处于不动状态(immobility)的时间。
7-7.强迫游泳实验(Forced Swimming Test，FST)
对上述动物模型进行实验。在高40cm、直径20cm的水槽中装温度为25±1℃的水至30cm的高度。将上述实验例5中制备的疾病模型小鼠一只一只地放入水槽中，在6分钟内，前两分钟作为适应时间不测量，测量最后4分钟内实验动物的不动状态(immobility)的时间(以百分比表示)。不动状态是指除为将头部露出水面的最小动作以外，保持站立不动的漂浮状态。
7-8.测量大肠长度
解剖腹部分离大肠来测量肠的长度。
7-9.测定髓过氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)活性
向100mg的大肠组织放入200μl的含有0.5％十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyltrimethyl ammonium bromide)的10mM的磷酸钙缓冲液(potassium phosphate buffer，pH7.0)后均质化。然后，在4℃及10000g的条件下离心分离来获得上清液。将其用作粗酶溶液。将50μl的粗酶溶液放入0.95μl的反应液(含有1.6mM的四甲基联苯胺(tetramethylbenzidin)与0.1mM的H2O2)后在37℃的温度下一边反应一边在650nm的波长中测量经时吸光度。上述髓过氧化物酶的活性以作为反应物产生的1μmol/ml的H2O2为1单位(unit)计算。
7-10.测定大肠的细胞因子表达量
向100mg的大肠组织加入250μl的含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒的RIPA缓冲液来均质化。然后在4℃及10000g的条件下离心分离15分钟来获得上清液，向96孔培养板中放入50μl的该上清液后，利用酶联免疫吸附测定酶标板试剂盒(皮尔斯生物科技，罗克福德，伊利诺伊州，美国)测量肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6的表达量。
首先，向分别涂敷有肿瘤坏死因子α抗体、白细胞介素1β抗体及白细胞介素10抗体的96孔培养板中放入50μl的上清液并在常温下反应2小时后，使用磷酸盐缓冲溶液-吐温洗涤，放入发色剂发色20分钟后，在450nm的波长中测量吸光度来计算。
7-11.确认拘束胁迫模型中的效果
表12
在处理拘束胁迫的组中，与正常组相比，确认到在高架十字迷宫实验、悬尾实验、强迫游泳实验中的不安及抑郁行动显著增加，但在LP组、BB组、BL组、LB1组、LB2组及LB3组中，因拘束胁迫增加的不安、抑郁行动得到显著抑制。即，确认到因拘束胁迫出现的不安、抑郁行动在植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175及长双歧杆菌NK173的给药组中都得到优异的改善，在联合给药的情况下，也确认到改善效果。
表13
在处理拘束胁迫的组中，与正常组相比，海马体中的白细胞介素6、血液中的皮质酮和白细胞介素6、大肠中的髓过氧化物酶、白细胞介素1β显著增加，但海马体的脑源性神经营养因子和大肠的白细胞介素10减少。然而，植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175及长双歧杆菌NK173都使因胁迫等增加的海马体中的白细胞介素6、血液中的皮质酮和白细胞介素6、大肠中的髓过氧化物酶、白细胞介素1β减少，相反，使海马体中减少的脑源性神经营养因子和大肠的白细胞介素10增加。而且，在联合给药的情况下也表现出优秀的改善效果。
7-12.确认粪便移植小鼠中的效果
表14
在进行粪便移植的组中，与正常组相比，确认到高架十字迷宫实验、悬尾实验、强迫游泳实验中的不安及抑郁行动显著增加，Y字型迷宫实验中示出认知功能受损的行动，但在LP组、BB组、BL组、LB1组、LB2组及LB3组中，因粪便移植增加的不安抑郁行动得到显著抑制，受损的认知功能得到显著改善。即，因粪便移植出现的不安、抑郁行动在植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175及长双歧杆菌NK173的给药组中都得到优异的改善，在联合给药的情况下，也确认到改善效果。
表15
在进行粪便移植的组中，与正常组相比，确认到海马体中的白细胞介素6、血液中的皮质酮、白细胞介素6、肌酐和乳酸、大肠中的髓过氧化物酶、白细胞介素1β显著增加，但海马体的脑源性神经营养因子和大肠的白细胞介素10减少。然而，在给药植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175及长双歧杆菌NK17的组中，这些疾病相关因子的表达水平得到调节。尤其，在联合给药的情况下也表现出优秀的改善效果。
7-13.确认三硝基苯磺酸(TNBS)诱导抑郁及认知功能损伤的小鼠模型中的治疗效果
首先，在LP组、BB组、BL组、LB1组、LB2组及LB3组中都确认到因三硝基苯磺酸处理而变短的大肠长度得到显著恢复。并且，确认到髓过氧化物酶活性得到显著改善，肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6的表达量得到显著抑制，另一方面，因三硝基苯磺酸而减少的白细胞介素10的表达量也得到了诱导。
追加地，通过Y字型迷宫实验确认了记忆力改善效果，通过悬尾实验确认了不安/抑郁症改善效果。
表16
实验组 变化(Alteration)(％)
正常组 68.2
三硝基苯磺酸给药组 54.5
LP(NK151)组 65.4
BB(NK175)组 63.2
BL(NK173)组 66.5
LB1组 65.3
LB2组 66.2
LB3组 67.2
如上述表16所示，在处理三硝基苯磺酸的组中，与正常组相比，交替次数减少，但在LP组、BB组、BL组、LB1组、LB2组及LP3组中，因三硝基苯磺酸而减少的交替次数增加，其中，LP组、BL组、LB2组及LB3组中的交替次数增加率尤为优秀。这样的结果表示植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175和/或长双歧杆菌NK173在认知功能改善、不安及抑郁症状改善中具有优秀的效果。并且，测定海马体的肿瘤坏死因子α及脑源性神经营养因子表达量的结果如表17所示。
表17
如上述表17所示，在处理三硝基苯磺酸的组中，与正常组相比，确认到肿瘤坏死因子α的表达量显著增加，但在LP组、BB组、BL组、LB1组、LB2组及LB3组中，因三硝基苯磺酸而增加的肿瘤坏死因子α得到显著抑制。另一方面，因三硝基苯磺酸而减少的脑源性神经营养因子的表达量得到诱导，其中，LP组、LB2组及LB3组表现出优秀的肿瘤坏死因子α表达抑制及脑源性神经营养因子表达诱导效果。并且，悬尾实验测定结果如表18所示。
表18
实验组 不动(Immobility)(％)
正常组 23.5
三硝基苯磺酸给药组 48.4
LP(NK151)组 27.2
BB(NK175)组 29.1
BL(NK173)组 27.8
LB1组 27.9
LB2组 27.0
LB3组 26.9
如上述表18所示，在处理三硝基苯磺酸的组中，与正常组相比，确认到不动状态显著增加，但在LP组、BB组、BL组、LB1组、LB2组及LB3组中，因三硝基苯磺酸而增加的不动行动得到显著抑制。上述结果表示本发明的植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175和/或长双歧杆菌NK173通过调节炎性细胞因子及抗炎性细胞因子的表达来示出对炎症性疾病的治疗效果。并且，确认到通过能够在眼部疾病中表现出治疗效果的抗氧化作用、NO生成抑制作用、在认知功能中的改善效果、神经炎症的改善等效果来在炎症性疾病、眼部疾病、疲劳、认知功能障碍、精神障碍的预防、改善及治疗中也具有卓越的效果。因此，确认本发明的菌株不仅是益生菌制品，还可以多种多样地用作食品、药品等。
前述本发明的说明仅用于例示，本发明所属技术领域的普通技术人员可以理解的是，在不变更本发明的技术思想或必要特征的情况下还可以轻易变更为其他具体形态。因此应该理解的是，无论从哪方面来说，以上记述的实施例仅为例示，而非出于限定的目的。例如，以单一型来说明的个结构要素还可以分散来实施，同样，以分散的方式说明的结构要素能够以结合的形态来实施。
本发明的范围通过随附的发明要求保护范围来示出，发明要求保护范围的含义、范围以及由其同等概念导出的所有变更或变形的形态都应解释为包括在本发明的范围内。
保藏机构名称：韩国微生物保藏中心(国外)
保藏编号：KCCM12783P
保藏日期：2020年09月10日
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保藏编号：KCCM12784P
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保藏编号：KCCM13046P
保藏日期：2021年09月06日
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caaacaggat tagataccct ggtagtccat accgtaaacg atgaatgcta agtgttggag 840
ggtttccgcc cttcagtgct gcagctaacg cattaagcat tccgcctggg gagtacggcc 900
gcaaggctga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt 960
aattcgaagc tacgcgaaga accttaccag gtcttgacat actatgcaaa tctaagagat 1020
tagacgttcc cttcggggac atggatacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg 1080
tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta ttatcagttg ccagcattaa 1140
gttgggcact ctggtgagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa 1200
tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggatggta caacgagttg 1260
cgaactcgcg agagtaagct aatctcttaa agccattctc agttcggatt gtaggctgca 1320
actcgcctac atgaagtcgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac 1380
gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatgaga gtttgtaaca cccaaagtcg 1440
gtggggtaac cttttaggaa ccagccgcct aaggtgggac agatgatta 1489
<210> 2
<211> 1462
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 两歧双歧杆菌NK175_16SrDNA
<400> 2
ctcaggatga acgctggcgg cgtgcttaac acatgcaagt cgaacgggat ccatcaagct 60
tgcttggtgg tgagagtggc gaacgggtga gtaatgcgtg accgacctgc cccatgctcc 120
ggaatagctc ctggaaacgg gtggtaatgc cggatgttcc acatgatcgc atgtgattgt 180
gggaaagatt ctatcggcgt gggatggggt cgcgtcctat cagcttgttg gtgaggtaac 240
ggctcaccaa ggcttcgacg ggtagccggc ctgagagggc gaccggccac attgggactg 300
agatacggcc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattgcacaa tgggcgcaag 360
cctgatgcag cgacgccgcg tgagggatgg aggccttcgg gttgtaaacc tcttttgttt 420
gggagcaagc cttcgggtga gtgtaccttt cgaataagcg ccggctaact acgtgccagc 480
agccgcggta atacgtaggg cgcaagcgtt atccggattt attgggcgta aagggctcgt 540
aggcggctcg tcgcgtccgg tgtgaaagtc catcgcttaa cggtggatct gcgccgggta 600
cgggcgggct ggagtgcggt aggggagact ggaattcccg gtgtaacggt ggaatgtgta 660
gatatcggga agaacaccga tggcgaaggc aggtctctgg gccgtcactg acgctgagga 720
gcgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacggtgg 780
acgctggatg tggggcacgt tccacgtgtt ccgtgtcgga gctaacgcgt taagcgtccc 840
gcctggggag tacggccgca aggctaaaac tcaaagaaat tgacgggggc ccgcacaagc 900
ggcggagcat gcggattaat tcgatgcaac gcgaagaacc ttacctgggc ttgacatgtt 960
cccgacgacg ccagagatgg cgtttccctt cggggcgggt tcacaggtgg tgcatggtcg 1020
tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa ccctcgcccc 1080
gtgttgccag cacatgatgg tgggaactca cgggggaccg ccggggttaa ctcggaggaa 1140
ggtggggatg acgtcagatc atcatgcccc ttacgtccag ggcttcacgc atgctacaat 1200
ggccggtaca gcgggatgcg acatggcgac atggagcgga tccctgaaaa ccggtctcag 1260
ttcggatcgg agcctgcaac ccggctccgt gaaggcggag tcgctagtaa tcgcggatca 1320
gcaacgccgc ggtgaatgcg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcaa gtcatgaaag 1380
tgggcagcac ccgaagccgg tggcctaacc ccttgtggga tggagccgtc taaggtgagg 1440
ctcgtgattg ggactaagtc ta 1462
<210> 3
<211> 1460
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 长双歧杆菌NK173_16SrDNA
<400> 3
ctcaggatga acgctggcgg cgtgcttaac acatgcaagt cgaacgggat ccatcaagct 60
tgcttggtgg tgagagtggc gaacgggtga gtaatgcgtg accgacctgc cccatacacc 120
ggaatagctc ctggaaacgg gtggtaatgc cggatgctcc agttgatcgc atggtcttct 180
gggaaagctt tcgcggtatg ggatggggtc gcgtcctatc agcttgacgg cggggtaacg 240
gcccaccgtg gcttcgacgg gtagccggcc tgagagggcg accggccaca ttgggactga 300
gatacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggcgcaagc 360
ctgatgcagc gacgccgcgt gagggatgga ggccttcggg ttgtaaacct cttttatcgg 420
ggagcaagcg agagtgagtt tacccgttga ataagcaccg gctaactacg tgccagcagc 480
cgcggtaata cgtagggtgc aagcgttatc cggaattatt gggcgtaaag ggctcgtagg 540
cggttcgtcg cgtccggtgt gaaagtccat cgcttaacgg tggatccgcg ccgggtacgg 600
gcgggcttga gtgcggtagg ggagactgga attcccggtg taacggtgga atgtgtagat 660
atcgggaaga acaccaatgg cgaaggcagg tctctgggcc gttactgacg ctgaggagcg 720
aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acggtggatg 780
ctggatgtgg ggcccgttcc acgggttccg tgtcggagct aacgcgttaa gcatcccgcc 840
tggggagtac ggccgcaagg ctaaaactca aagaaattga cgggggcccg cacaagcggc 900
ggagcatgcg gattaattcg atgcaacgcg aagaacctta cctgggcttg acatgttccc 960
gacggtcgta gagatacggc ttcccttcgg ggcgggttca caggtggtgc atggtcgtcg 1020
tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc tcgccccgtg 1080
ttgccagcgg attatgccgg gaactcacgg gggaccgccg gggttaactc ggaggaaggt 1140
ggggatgacg tcagatcatc atgcccctta cgtccagggc ttcacgcatg ctacaatggc 1200
cggtacaacg ggatgcgacg cggcgacgcg gagcggatcc ctgaaaaccg gtctcagttc 1260
ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa ggcggagtcg ctagtaatcg cgaatcagca 1320
acgtcgcggt gaatgcgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcaagtc atgaaagtgg 1380
gcagcacccg aagccggtgg cctaacccct tgtgggatgg agccgtctaa ggtgaggctc 1440
gtgattggga ctaagtcgta 1460
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 变形菌_正向引物
<400> 4
gctaacgcat taagtryccc g 21
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 变形菌_反向引物
<400> 5
gccatgcrgc acctgtct 18
<210> 6
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌_正向引物
<400> 6
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga caggtgccag cmgccgcggt aa 52
<210> 7
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌_反向引物
<400> 7
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagggacta chvgggtwtc taat 54

Claims (17)

1.一种保藏编号为KCCM12783P的植物乳杆菌NK151。
2.根据权利要求1所述的保藏编号为KCCM12783P的植物乳杆菌NK151，其特征在于，上述植物乳杆菌NK151包含序列1的16S rDNA碱基序列。
3.一种保藏编号为KCCM12784P的两歧双歧杆菌NK175。
4.根据权利要求2所述的保藏编号为KCCM12784P的两歧双歧杆菌NK175，其特征在于，上述两歧双歧杆菌NK175包含序列2的16SrDNA碱基序列。
5.一种保藏编号为KCCM13046P的长双歧杆菌NK173。
6.根据权利要求5所述的保藏编号为KCCM13046P的长双歧杆菌NK173，其特征在于，上述长双歧杆菌NK173包含序列3的16S rDNA碱基序列。
7.一种用于预防或治疗眼部疾病、炎症性疾病、认知功能障碍或精神障碍的药物组合物，其特征在于，包含保藏编号为KCCM12783P的植物乳杆菌NK151、保藏编号为KCCM12784P的两歧双歧杆菌NK175、保藏编号为KCCM13046P的长双歧杆菌NK173或它们的任意混合物。
8.根据权利要求7所述的用于预防或治疗眼部疾病、炎症性疾病、认知功能障碍或精神障碍的药物组合物，其特征在于，眼部疾病为选自由眼疲劳、视网膜症、角膜炎、黄斑变性、眼球干燥症、色素性视网膜症、糖尿病性视网膜症、早产儿视网膜症、增生性视网膜症、缺血性视网膜症、脉络膜血管新生、新生血管青光眼、缺血性视神经病变、糖尿病性黄斑变性、红肿、近视及干燥综合征组成的组中的任一种。
9.根据权利要求7所述的用于预防或治疗眼部疾病、炎症性疾病、认知功能障碍或精神障碍的药物组合物，其特征在于，炎症性疾病为选自由炎症性肠病、关节炎、痛风、肝炎、肥胖、胃炎、肾炎、糖尿病、结核、支气管炎、胸膜炎、腹膜炎、脊柱炎、胰腺炎、尿道炎、膀胱炎、阴道炎、动脉硬化症、败血症及牙周炎组成的组中的一种以上。
10.根据权利要求9所述的用于预防或治疗眼部疾病、炎症性疾病、认知功能障碍或精神障碍的药物组合物，其特征在于，炎症性肠病为选自由溃疡性结肠炎、克罗恩病、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、转化性结肠炎、白塞氏病及未确定型结肠炎组成的组中的一种以上。
11.根据权利要求7所述的用于预防或治疗眼部疾病、炎症性疾病、认知功能障碍或精神障碍的药物组合物，其特征在于，认知功能障碍为选自由阿尔茨海默病、亨廷顿病、血管性痴呆症、皮克病、帕金森病、克雅氏病及痴呆组成的组中的一种以上。
12.根据权利要求7所述的用于预防或治疗眼部疾病、炎症性疾病、认知功能障碍或精神障碍的药物组合物，其特征在于，精神障碍为选自由抑郁不安障碍、情绪障碍、失眠症、妄想障碍、强迫障碍、偏头痛、精神压力、记忆障碍、自闭症、注意缺陷与多动障碍、注意力障碍综合征、惊恐发作及注意力障碍组成的组中的一种以上。
13.一种用于预防或改善眼部疾病、炎症性疾病、认知功能障碍或精神障碍的食品组合物，其特征在于，包含保藏编号为KCCM12783P的植物乳杆菌NK151、保藏编号为KCCM12784P的两歧双歧杆菌NK175、保藏编号为KCCM13046P的长双歧杆菌NK173或它们的任意混合物。
14.一种用于改善疲劳的食品组合物，其特征在于，包含植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175、长双歧杆菌NK173或它们的任意混合物。
15.一种预防或治疗选自由眼部疾病、认知功能障碍、精神障碍及炎症性疾病组成的组中的一种以上疾病的方法，其特征在于，包含植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175、长双歧杆菌NK173或它们的任意混合物。
16.用于预防或治疗选自由眼部疾病、认知功能障碍、精神障碍及炎症性疾病组成的组中的一种以上疾病的植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175、长双歧杆菌NK173或它们的任意混合物。
17.一种植物乳杆菌NK151、两歧双歧杆菌NK175、长双歧杆菌NK173或它们的任意混合物在用于治疗选自由眼部疾病、认知功能障碍、精神障碍及炎症性疾病组成的组中的一种以上疾病的药剂的制备中的用途。
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