CN116511516A - 一种新型铜基纳米材料及其在抗氧化和抑菌方面的应用 - Google Patents
一种新型铜基纳米材料及其在抗氧化和抑菌方面的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116511516A CN116511516A CN202310753310.XA CN202310753310A CN116511516A CN 116511516 A CN116511516 A CN 116511516A CN 202310753310 A CN202310753310 A CN 202310753310A CN 116511516 A CN116511516 A CN 116511516A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- csia
- copper
- nanomaterial
- novel
- amplification
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000010949 copper Substances 0.000 title claims abstract description 109
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 title claims abstract description 69
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 31
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 30
- 230000003064 anti-oxidating effect Effects 0.000 title abstract description 3
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 18
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 claims abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 13
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims abstract description 4
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000004792 oxidative damage Effects 0.000 claims abstract description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 29
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 29
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 27
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 18
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 14
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 14
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 8
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 6
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 claims description 6
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 6
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 claims description 5
- 101710134784 Agnoprotein Proteins 0.000 claims description 4
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 3
- 241000219793 Trifolium Species 0.000 claims description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims description 3
- JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N Cu2+ Chemical compound [Cu+2] JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910001431 copper ion Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 108700020962 Peroxidase Proteins 0.000 claims 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 5
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 4
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000022 bacteriostatic agent Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000000956 alloy Substances 0.000 description 1
- 229910045601 alloy Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 238000000643 oven drying Methods 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001699 photocatalysis Effects 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000027756 respiratory electron transport chain Effects 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N59/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing elements or inorganic compounds
- A01N59/16—Heavy metals; Compounds thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N59/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing elements or inorganic compounds
- A01N59/16—Heavy metals; Compounds thereof
- A01N59/20—Copper
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
- A01P1/00—Disinfectants; Antimicrobial compounds or mixtures thereof
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J23/00—Catalysts comprising metals or metal oxides or hydroxides, not provided for in group B01J21/00
- B01J23/70—Catalysts comprising metals or metal oxides or hydroxides, not provided for in group B01J21/00 of the iron group metals or copper
- B01J23/89—Catalysts comprising metals or metal oxides or hydroxides, not provided for in group B01J21/00 of the iron group metals or copper combined with noble metals
- B01J23/8926—Copper and noble metals
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B22—CASTING; POWDER METALLURGY
- B22F—WORKING METALLIC POWDER; MANUFACTURE OF ARTICLES FROM METALLIC POWDER; MAKING METALLIC POWDER; APPARATUS OR DEVICES SPECIALLY ADAPTED FOR METALLIC POWDER
- B22F9/00—Making metallic powder or suspensions thereof
- B22F9/16—Making metallic powder or suspensions thereof using chemical processes
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y20/00—Nanooptics, e.g. quantum optics or photonic crystals
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y40/00—Manufacture or treatment of nanostructures
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
- C09K11/08—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing inorganic luminescent materials
- C09K11/58—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing inorganic luminescent materials containing copper, silver or gold
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K15/00—Anti-oxidant compositions; Compositions inhibiting chemical change
- C09K15/02—Anti-oxidant compositions; Compositions inhibiting chemical change containing inorganic compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
本发明公开了一种新型铜基纳米材料及其在抗氧化和抑菌方面的应用。首次以CSIA恒温扩增产物为模板，通过化学还原法合成了两种铜基纳米材料CSIA‑Cu@Pt和CSIA‑Cu@Ag。并且发现CSIA‑Cu@Pt具有类过氧化物酶活性，对TMB和H2O2的KM分别为0.01 mM和0.05 mM，Vmax分别是1.674×10‑7 M‑1 s和97.29×10‑7 M‑1 s；CSIA‑Cu@Ag具有抑菌活性，抑菌机制主要是由于纳米材料的加入引起了细菌内部的氧化应激，进而导致DNA的氧化损伤，引起细菌破裂。
Description
技术领域
本发明属于材料合成领域，具体涉及一种铜基核酸纳米材料的制备及应用。
背景技术
纳米材料因其特殊的理化性质，被广泛应用于食品安全检测、生物抑菌、纳米酶等领域的创新研究。目前已有数百种纳米材料被生产，特别是合金纳米材料，由于其独特的电子、光学、催化或光催化性能，通常会提供单一成份所不具备的性质，因此受到更广泛的关注。由于铜在地壳中的总量丰富，在储量和价格上具有天然优势；核酸作为纳米材料的模板不仅可以赋予靶向性，还可以提高生物相容性、低毒性，但是以恒温扩增产物为模板的合成纳米材料至今没有报道，因此本发明在CSIA扩增产物的基础上，尝试合成新的铜基核酸纳米材料，以拓展其生物学功能，实现新型纳米材料的应用推广。
发明内容
本发明的目的是开发一种新型的铜基纳米材料合成方法，拓展其生物学功能。首次以恒温扩增的双链核酸产物为模板，既能够为纳米材料合成提供充足的原料，又能够为前体金属离子提供结合位点，且能够提高纳米材料的生物相容性。本发明成功合成了两种CSIA-Cu@Pt和CSIA-Cu@Ag纳米材料。
本发明采用的技术方案是：
本发明的第一方面，一种新型铜基纳米材料的合成方法，以CSIA恒温扩增产物为模板，在铜离子和其他前体金属离子存在下，通过化学还原方法合成含有铜元素的纳米材料。
其中CSIA恒温扩增产物是指通过CSIA扩增技术获得的双链核酸产物。
其中CSIA扩增技术是以一条三叶草结构的核酸序列为模板，在恒温条件下，无需引物，通过聚合酶作用即可发生指数扩增的反应；
具体的，三叶草结构的核酸序列是指5’端和3’端均能形成发卡结构，且中间通过连接区域连接；5’端发卡序列的GC含量在0%~20%；3’端发卡序列的GC含量在0%~50%；连接区域为富AT序列或富T序列或富A序列；其中聚合酶是指具有5’→3’聚合酶活性，且能够催化dNTP加入核苷酸链的3'-OH末端并形成新的核酸链；
具体的，CSIA恒温扩增是以SEQ ID NO.1为模板序列，在Bst 2.0 DNA聚合酶作用下，扩增条件为70℃ 30 min。
其中双链核酸产物是高AT含量的核酸序列，可以与前体金属离子结合提供位点，并用于纳米材料的合成。
同时该合成方法在铜基纳米材料合成中的应用。
本发明的第二方面，一种新型抗氧化铜基纳米材料，利用第一方面合成方法，在前体金属离子为K2PtCl4和CuSO4时，合成具有过氧化物酶活性的CSIA-Cu@Pt纳米材料，可以发挥其抗氧化活性，在抗氧化和纳米酶领域进行应用。
本发明的第三方面，一种新型抑菌铜基纳米材料，利用第一方面合成方法，在前体金属离子为AgNO3和CuSO4时，合成具有抑菌活性的CSIA-Cu@Ag纳米材料。其抑菌机制是由于纳米材料的加入引起了细菌内部的氧化应激，进而导致DNA的氧化损伤，引起细菌破裂。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
首次以CSIA恒温扩增的双链核酸产物为模板，合成新型的铜基纳米材料；该扩增技术无需引物，在恒温条件下即可完成指数扩增，合成产物为富AT含量的双链核酸，且可以作为金属离子的结合位点。
研究发现CSIA-Cu@Pt具有优异的类过氧化物酶活性，其酶活可以与天然HRP具有更优的酶活；而CSIA-Cu@Ag具有良好的抑菌功能，拓展了铜基纳米材料的生物学功能。
附图说明
图1 CSIA恒温扩增原理图。
图2纳米材料的紫外吸收光谱图。
图3不同组成的CSIA-Cu@Pt和CSIA-Cu@Ag吸收光谱。
图4不同组成的CSIA-Cu@Pt和CSIA-Cu@Ag荧光光谱。
图5CSIA-Cu@Pt和CSIA-Cu@Ag的酶活测定。
图6CSIA-Cu@Pt催化条件优化。
图7CSIA-Cu@Pt的动力学分析。
图8 CSIA-Cu@Pt和CSIA-Cu@Ag的抑菌效果。
图9 CISA-Cu@Ag对E.coil和S.aureus的MIC测定。
图10 CISA-Cu@Ag对E.coil和S.aureus的生长曲线。
图11 CSIA-Cu@Ag处理E.coil和S.aureus的ROS变化和DNA损伤注：A为胞内ROS产量；B为实验组和对照组在524 nm处荧光差值；C为DNA损伤情况，M是Marker 2000，1是CSIA-Cu@Ag处理的E.coil，2是CSIA-Cu@Ag处理的S.aureus，3是E.coil，4是S.aureus。
图12 CSIA-Cu@Ag对E.coil和S.aureus细胞形态的影响。注：A为E.coil对照组，B为CSIA-Cu@Ag对E.coil处组理，C为S.aureus对照组，D为CSIA-Cu@Ag对S.aureus对处组理。
图13 CSIA-Cu@Ag组分对于抑菌的必要性。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 CSIA扩增以及扩增产物的纯化
CSIA恒温扩增方法是以一条三叶草结构的核酸序列为模板，在恒温条件下，无需引物，通过聚合酶作用即可发生指数扩增的反应（图1）。模板是由三个发卡结构组成的，其中发卡1和发卡3是为了维持该特殊结构所设计，发卡2是为了提高产物的AT含量，并连接发卡1和发卡3。基于上述扩增即可实现核酸序列的体外人工指数放大。该扩增方法的扩增产物是模板的N个重复单元，富含大量的富AT序列，可以为金属离子提供结合位点，进而生成新型纳米材料。相较于其他恒温扩增检测方法CSIA扩增仅需要一个三叶草结构的模板就可以在Bst 2.0 DNA聚合酶存在的条件下进行恒温扩增，整个反应体系简单、反应条件要求低、扩增效率高。相较于LAMP恒温扩增，本方法不需要设计复杂的内外引物，也不需要考虑引物之间的相互影响，同时本方法不存在假阳性的问题，因此基于CSIA恒温扩增检测方法的传感器准确性更高、可操作性更强。相较于RCA恒温扩增，本方法的扩增时间仅需要30min，大大缩短了恒温反应时间，确保CSIA扩增技术在现场快速检测中的应用前景。相较于无酶恒温扩增技术HCR、CHA，本方法仅需要一条核酸模板，不需要设计复杂的发卡序列，且无需考虑背景值的问题。
具体的扩增机制研究表明CSIA扩增模板的设计基本遵从以下原则：发卡2连接区域优选富AT序列和富A序列，且连接区域越长越有利于CSIA的扩增；对模板5’端的发卡序列GC%含量要维持在10%~20%为优（发卡1），3’端的发卡序列GC%含量在10%~50%范围（发卡3）。结合CuNCs荧光信号，连接区域最好选择其富AT序列，且序列长度越长越有利于CuNCs的合成，同时葡萄糖的稳定剂同样能提升恒温扩增产物-CuNCs荧光，另外富AT区域弱相互作用和丰富的二级结构也有利于CuNCs的有序排列。简而言之，可以通过上述原则体外人工调控CSIA扩增产物，促使合成更有利于CuNCs合成的模板。另外人们还可以通过理性的人工设计，生成更多特异性的核酸模板，为核酸纳米技术的发展提供原料。本发明首次采用CSIA恒温扩增产物为模板合成新型纳米材料。
本发明中具体CSIA的反应体系如表1所示，实验条件为70 ℃ 30 min。其中Self-T-20AT模板的核酸序列为：TTGTTAACAATTGTTAACAATATATATATATATATATATAGTTACTCCTTTTGGAGTAAC（SEQ ID NO.1）。
表1 恒温扩增的反应体系
扩增反应结束后，利用醇沉的方法纯化CSIA扩增产物，V(DNA):V(无水乙醇):V(NaAC, 3M pH 5.2)=10:20:1，混匀置于-20℃ 3h，12000 rmp 10 min 倒去上清，加入1mL70%乙醇，上下颠倒几次，12000 rmp 10 min 倒去上清，55℃烘干，10 min，最后加入原来1/10体积的ddH2O。用Nanodrop进行浓度测定，并调整浓度为100 ng/μL，4℃储存备用。
实施例2 铜基核酸纳米材料的合成与表征
以CSIA扩增产物为模板，通过化学还原法合成CSIA-Cu@Pt、CSIA-Cu@Ag纳米材料，具体合成体系如表2所示，其中AgNO3/K2PtCl4的浓度根据实际情况进行优化。
表 2 纳米材料合成体系
将上述合成的纳米材料在室温下合成12 h，12000 rmp 10 min离心，用H2O清洗两次，4℃ 备用。后文中利用AgNO3/K2PtCl4的浓度表示纳米材料的浓度。由图2的紫外吸收光谱图可知，CSIA-CuNCs在340 nm处有明显吸收峰，这代表CuNCs的成功合成；而CSIA-Cu@Pt和CSIA-Cu@Ag在400 nm处有肩峰出现，表明不同于CSIA-CuNCs的新纳米材料合成，且在12h后仍表现出稳定的吸收峰，表明新纳米材料具有良好的稳定性。
由于不同的金属离子组成会直接影响纳米材料的理化性质，因此本发明分别选择了1:1-1:10的Cu:Pt和Cu:Ag进行铜基纳米材料的合成，其吸收光谱和荧光光谱分别如图3和图4所示。由吸收光谱可知CSIA-Cu@Pt和CSIA-Cu@Ag随着Pt2+和Ag+的含量增加，CSIA-Cu@Pt和CSIA-Cu@Ag的产量也逐渐增加。由荧光光谱可知CSIA-Cu@Pt不具有荧光特性，这可能是由于金属离子之间的电子转移所致；而CSIA-Cu@Ag具有荧光特性，但与CSIA-CuNCs相比其发射峰发生了大约10 nm的红移，且在Cu:Ag=1:1和1:2时的荧光强度比CSIA-CuNCs荧光更高；而继续提高Ag+浓度时，CSIA-Cu@Ag的荧光会降低。根据Vazquez-Vazquez等人的研究成果，大尺寸铜纳米粒子的荧光性质会消失，因此推测Ag+浓度增加可能是CSIA-Cu@Ag的尺寸发生了变化。在12 h后CSIA-Cu@Ag的荧光虽然消失，但实验过程中CSIA-Cu@Ag的荧光衰减效率比CSIA-CuNCs更慢，因此可以考虑通过杂化其他金属离子提高CuNCs的荧光稳定性。
实施例3核酸纳米材料的酶活特性
以TMB为底物，验证上述合成纳米材料是否具有类过氧化物酶酶活。具体操作为取上述纳米材料5 μL，加入到95 μL显色体系中混匀，室温孵育10 min，测量OD652nm。显色体系包括75 μL pH 5.0的0.2 mM NaAC缓冲液，40 μL的10 mM H2O2以及10 μL 10 mM TMB。由图5可知，CSIA-Cu@Pt具有较高的类过氧化物酶酶活，且呈现出明显的时间依赖性，Cu:Pt=1:9时CSIA-Cu@Pt的酶活最高；而CSIA-Cu@Ag催化底物TMB的能力极低，几乎不具备类过氧化物酶活性。
为了获得更好的CSIA-Cu@Pt类过氧化物酶酶活，进一步优化CSIA-Cu@Pt的催化条件，由图6可知当H2O2为4 mM，TMB为1 mM，在pH=5的0.2 mM NaAC条件下可以获得最大催化活性。
为了进一步了解CSIA-Cu@Pt的催化性能，在最优条件下对5 μL 1:9的CSIA-Cu@Pt进行稳态动力学分析，首先固定H2O2的浓度为10 mM，然后变化TMB浓度（分别为0.05，0.1，0.5，1，2.5，5，10，20，30 mM），测定CSIA-Cu@Pt在pH 5.0 NaAC条件下反应10 min后的OD652nm吸光度。另外，固定10 mM TMB，变化H2O2浓度（分别为0.005，0.01，0.05，0.1，0.25，0.5，0.75，1，2.5，5，10 mM），测定CSIA-Cu@Pt在pH 5.0 NaAC条件下反应10 min后的OD652nm吸光度。然后根据Michaelis-Menten方程V0=(Vmax·[S])/(KM+[S])和Lineweaver-Burk双倒数1/V0=KM/Vmax(1/[S]+1/[KM])作图，为对CSIA-Cu@Pt纳米材料的Vmax和KM进行计算，其中Vmax代表最大反应速率，KM是米氏常数，[S]是底物浓度。TMB ε652nm为 3.9× 104 M-1 cm-1，所有的测量都至少重复三次，并取平均值以保证准确性。结果如图7所示，由图可知CSIA-Cu@Pt对TMB和H2O2的KM分别为0.01 mM和0.05 mM。KM代表CSIA-Cu@Pt对底物的亲和性，数值越小亲和性越高。与已知的HRP进行比较（TMB KM= 0.32 mM，H2O2 KM= 0.05 mM）可知，新合成的CSIA-Cu@Pt对TMB的亲和性提升了32倍，对H2O2的亲和性保持不变。另外，Vmax表示反应速率，数值越大反应速率越快。CSIA-Cu@Pt对TMB和H2O2的Vmax分别是1.674×10-7 M-1 s和97.29×10-7 M-1 s，相较于HRP的Vmax，新合成的CSIA-Cu@Pt具有更快的反应速率。上述结果表明CSIA-Cu@Pt纳米材料具有与天然酶相当的亲和性和反应速率，因此可以考虑将CSIA-Cu@Pt纳米材料作为HRP的有效替代。
实施例4 核酸纳米材料的酶活特性
选择E.coil和S.aureus作为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的典型菌进行抑菌效果验证。图8结果表明CSIA-Cu@Ag对于E.coil和S.aureus都具有抑菌效果，且Cu:Ag=1:1时对E.coil的抑菌效果最好，随着Cu:Ag的增加CSIA-Cu@Ag对于E.coil的抑菌效果并没有明显增加；当Cu:Ag=1:6~1:8时都能够完全抑制S.aureus的生长，但当Cu:Ag=1:9和1:10时其抑菌效果则消失了，该现象还有待进一步研究。而CSIA-Cu@Pt对于E.coil和S.aureus几乎没有抑菌效果，虽然很多文献有报道具有类过氧化物酶活性的纳米酶可以催化H2O2产生大量ROS进而抑菌细菌生长，但在本发明中具有类过氧化物酶活性的CSIA-Cu@Pt并没有表现出抑菌效果，甚至出现了促细菌生长的现象。这可能是由于CSIA-Cu@Pt除了具有类过氧化物酶活性外，该纳米材料可能在整个过程被降解释放Cu2+，而该微量元素作为细菌生长的必需微量元素可以促进细菌生长，提高耐受性，进而免受ROS影响。综上所述，CSIA-Cu@Pt不适合作为抑菌剂，而CSIA-Cu@Ag可以做为抑菌剂进一步研究。
由于CISA-Cu@Ag对E.coil和S.aureus具有抑菌功能，因此通过抑制90%细菌生长的MIC来确定新纳米材料的抑菌能力。其中Cu:Ag=1:1的CSIA-Cu@Ag被用在E.coil抑菌实验，Cu:Ag=1:6的CSIA-Cu@Ag被用在S.aureus的抑菌实验。结果如图9所示，CISA-Cu@Ag对E.coil的MIC值为12.8 mM，对S.aureus的MIC值为9.6 mM，表明CISA-Cu@Ag对S.aureus具有更高的抑菌能力。而图中在高浓度下细菌浓度出现了负增长这可能是由于纳米材料自身具有一定的淡黄色，因此影响了OD600的测量结果。进一步利用不同浓度的CSIA-Cu@Ag对E.coil和S.aureus生长情况进行观察，结果如图10所示，E.coil和S.aureus在CSIA-Cu@Ag的处理下生长曲线出现明显延迟，并且随着用量的增加抑制效果越明显。
进一步从三个方面对CSIA-Cu@Ag的抑菌机制进行探究，包括胞内ROS的变化、DNA损伤和细菌形态变化。利用试剂盒对CSIA-Cu@Ag处理的E.coil和S.aureus进行ROS含量测定，结果如图11A、B所示，CSIA-Cu@Ag处理组的ROS明显高于对照组的ROS含量，这表明CSIA-Cu@Ag会引起细菌内部的氧化应激，进而可能破坏胞内的氧化平衡，引起氧化损伤。而CSIA-Cu@Ag处理组和对照组的菌体进行热裂解提取DNA，跑胶结果显示CSIA-Cu@Ag处理组出现明显的弥散条带，且出现更短的DNA片段（图11C），这证明CSIA-Cu@Ag造成了DNA损伤。而由图12可知CSIA-Cu@Ag处理能够影响细菌的形态，其中E.coil受CSIA-Cu@Ag影响呈短杆状，部分菌落出现皱缩、破裂；而S.aureus则表现出大面积的皱缩、坍塌状态，有些菌落出现细胞质外泄。由此可知CSIA-Cu@Ag对于E.coil和S.aureus的抑制主要是由于纳米材料的加入引起了细菌内部的氧化应激，进而导致DNA的氧化损伤，引起细菌破裂。
此外，为了证明CSIA-Cu@Ag组分在纳米材料抑菌过程中发挥的作用，分别合成了CuNCs、CSIA-CuNCs、AgNCs、CSIA-AgNCs、Cu@Ag、CSIA-Cu@Ag六种材料进行实验。结果如图13所示，只有CSIA-Cu@Ag纳米材料表现出良好的抑菌效果，这也证明了纳米材料中的核酸模板、前体金属离子Cu2+/Ag+都是必不可少的组分。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种新型铜基纳米材料的合成方法，其特征在于，以CSIA恒温扩增产物为模板，在铜离子和其他前体金属离子存在下，通过化学还原方法合成含有铜元素的纳米材料；
所述CSIA恒温扩增产物是指通过CSIA扩增技术获得的双链核酸产物；
所述CSIA扩增技术是以一条三叶草结构的核酸序列为模板，在恒温条件下，无需引物，通过聚合酶作用即可发生指数扩增的反应；
所述双链核酸产物是高AT含量的核酸序列，可以与前体金属离子结合提供位点，并用于纳米材料的合成。
2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，CSIA恒温扩增是以SEQ ID NO.1为模板序列，在Bst 2.0 DNA聚合酶作用下，扩增条件为70℃ 30 min。
3.一种新型抗氧化铜基纳米材料，其特征在于，利用权利要求1所述的合成方法，前体金属离子为K2PtCl4和CuSO4，合成具有过氧化物酶活性的CSIA-Cu@Pt纳米材料。
4.一种新型抑菌铜基纳米材料，其特征在于，利用权利要求1所述的合成方法，前体金属离子为AgNO3和CuSO4，合成具有抑菌活性的CSIA-Cu@Ag纳米材料。
5.根据权利要求4所述的新型抑菌铜基纳米材料，其特征在于，抑菌机制是由于CSIA-Cu@Ag纳米材料的加入引起了细菌内部的氧化应激，进而导致DNA的氧化损伤，引起细菌破裂。
6.根据权利要求1所述的合成方法在铜基纳米材料合成中的应用。
7.根据权利要求3所述的新型抗氧化铜基纳米材料在抗氧化领域的应用。
8.根据权利要求3所述的新型抗氧化铜基纳米材料在类过氧化物酶中的应用。
9.根据权利要求4所述的新型抑菌铜基纳米材料在抑菌领域的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310753310.XA CN116511516B (zh) | 2023-06-26 | 2023-06-26 | 一种新型铜基纳米材料及其在抗氧化和抑菌方面的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310753310.XA CN116511516B (zh) | 2023-06-26 | 2023-06-26 | 一种新型铜基纳米材料及其在抗氧化和抑菌方面的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116511516A true CN116511516A (zh) | 2023-08-01 |
| CN116511516B CN116511516B (zh) | 2023-09-19 |
Family
ID=87406661
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310753310.XA Active CN116511516B (zh) | 2023-06-26 | 2023-06-26 | 一种新型铜基纳米材料及其在抗氧化和抑菌方面的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116511516B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116970677A (zh) * | 2023-08-03 | 2023-10-31 | 西北大学 | 一种基于框架核酸的铜簇纳米材料在制备检测致病菌产品中的应用 |
| CN116970677B (zh) * | 2023-08-03 | 2024-04-30 | 西北大学 | 一种基于框架核酸的铜簇纳米材料在制备检测致病菌产品中的应用 |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102666879A (zh) * | 2009-10-30 | 2012-09-12 | 西北大学 | 模板化的纳米缀合物 |
| CN104278088A (zh) * | 2014-09-23 | 2015-01-14 | 深圳先进技术研究院 | 一种基于恒温指数扩增反应与表面增强拉曼光谱检测的miRNA检测方法及其应用 |
| CN106282175A (zh) * | 2015-06-07 | 2017-01-04 | 复旦大学 | 荧光纳米铜簇的发卡式dna模板及其应用 |
| CN108383147A (zh) * | 2017-12-28 | 2018-08-10 | 兰州大学 | 一种以重组胶原蛋白为生物矿化模板制备CuO纳米粒子的方法 |
| CN109576147A (zh) * | 2018-12-12 | 2019-04-05 | 中国人民解放军陆军军医大学第附属医院 | 基于磁流变液技术的恒温扩增型太赫兹多通道微流控芯片及其用于病原菌检测的方法 |
| CN110982846A (zh) * | 2018-10-02 | 2020-04-10 | 纳米细菌公司 | 纯氧化铁纳米颗粒的细胞生产 |
| CN111790450A (zh) * | 2020-08-04 | 2020-10-20 | 济南大学 | 一种铜基金属有机框架复合化学发光催化剂的制备及应用 |
| WO2021217722A1 (zh) * | 2020-04-27 | 2021-11-04 | 生态环境部华南环境科学研究所 | 一种中低温负载型纳米氧化铜颗粒催化剂及其制备方法和应用 |
-
2023
- 2023-06-26 CN CN202310753310.XA patent/CN116511516B/zh active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102666879A (zh) * | 2009-10-30 | 2012-09-12 | 西北大学 | 模板化的纳米缀合物 |
| CN104278088A (zh) * | 2014-09-23 | 2015-01-14 | 深圳先进技术研究院 | 一种基于恒温指数扩增反应与表面增强拉曼光谱检测的miRNA检测方法及其应用 |
| CN106282175A (zh) * | 2015-06-07 | 2017-01-04 | 复旦大学 | 荧光纳米铜簇的发卡式dna模板及其应用 |
| CN108383147A (zh) * | 2017-12-28 | 2018-08-10 | 兰州大学 | 一种以重组胶原蛋白为生物矿化模板制备CuO纳米粒子的方法 |
| CN110982846A (zh) * | 2018-10-02 | 2020-04-10 | 纳米细菌公司 | 纯氧化铁纳米颗粒的细胞生产 |
| CN109576147A (zh) * | 2018-12-12 | 2019-04-05 | 中国人民解放军陆军军医大学第附属医院 | 基于磁流变液技术的恒温扩增型太赫兹多通道微流控芯片及其用于病原菌检测的方法 |
| WO2021217722A1 (zh) * | 2020-04-27 | 2021-11-04 | 生态环境部华南环境科学研究所 | 一种中低温负载型纳米氧化铜颗粒催化剂及其制备方法和应用 |
| CN111790450A (zh) * | 2020-08-04 | 2020-10-20 | 济南大学 | 一种铜基金属有机框架复合化学发光催化剂的制备及应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 陈清玉: "《金基光热复合纳米材料可控制备及其光热抗菌研究》", 《CNKI优秀硕士学位论文全文库 工程科技Ⅰ辑》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116970677A (zh) * | 2023-08-03 | 2023-10-31 | 西北大学 | 一种基于框架核酸的铜簇纳米材料在制备检测致病菌产品中的应用 |
| CN116970677B (zh) * | 2023-08-03 | 2024-04-30 | 西北大学 | 一种基于框架核酸的铜簇纳米材料在制备检测致病菌产品中的应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116511516B (zh) | 2023-09-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9644193B2 (en) | B-1,3-glucanase, polynucleotide, recombinant vector, transformant, production method for B-1,3- glucanase, enzyme preparation, and production method for paramylon having reduced molecular weight | |
| SG165394A1 (en) | Modulation of immunostimulatory properties of short interfering ribonucleic acid (sirna) by nucleotide modification | |
| CN102978201A (zh) | 石墨烯作为增强剂在聚合酶链式反应中的应用 | |
| JP2008512105A (ja) | Ｋ５多糖の製造方法 | |
| Du et al. | Coordination‐Driven One‐Step Rapid Self‐Assembly Synthesis of Dual‐Functional Ag@ Pt Nanozyme | |
| CN116511516B (zh) | 一种新型铜基纳米材料及其在抗氧化和抑菌方面的应用 | |
| Grimalt-Alemany et al. | Cryopreservation and fast recovery of enriched syngas-converting microbial communities | |
| Chang et al. | Enhancement of nitrite-dependent anaerobic methane oxidation via Geobacter sulfurreducens | |
| Chen et al. | A cancer cell membrane vesicle-packaged DNA nanomachine for intracellular microRNA imaging | |
| CN112439370B (zh) | 氧化石墨烯荧光增强型功能核酸水凝胶的制备方法 | |
| Xiang et al. | Expanding DNAzyme functionality through enzyme cascades with applications in single nucleotide repair and tunable DNA-directed assembly of nanomaterials | |
| CN105586293B (zh) | 一种新的乳酸利用梭菌及其用途 | |
| CN101134973A (zh) | 基于纳米金属颗粒的长片段核酸聚合酶链式反应扩增的优化方法 | |
| CN109942080B (zh) | 一种促进厌氧氨氧化菌脱氮的组合物及其应用 | |
| CN114807146B (zh) | 一种核酸纳米酶的制备方法及传感应用 | |
| CN116555334A (zh) | 一种猕猴桃果实抗坏血酸含量的调控机制及其应用 | |
| Kuzina et al. | Genes involved in carotene synthesis and mating in Blakeslea trispora | |
| CN116926051B (zh) | 一种查耳酮异构酶突变体及其制备方法和应用 | |
| CN113308424B (zh) | 一种产阿魏酸酯酶的短小芽孢杆菌及其应用 | |
| CN103509768B (zh) | 一种耐酸性真菌α-淀粉酶TaAMY及其基因和应用 | |
| CN106191017B (zh) | 一种来源于虎眼万年青的尿苷-5’-二磷酸芹菜糖/木糖合成酶，其核苷酸序列及应用 | |
| CN109721117B (zh) | 一种紫丁香醛功能化改性的方法及其获得的产物和应用 | |
| CN106148361A (zh) | 海带甘露醇-2-脱氢酶基因及应用 | |
| KR101461222B1 (ko) | 탄소화 폴리도파민이 도포된 실리카 나노입자를 포함하는 pcr 조성물 및 이를 이용한 pcr 방법 | |
| Schmitt et al. | BIOGENESIS OF MITOCHONDRIA FROM AETETHA SALINA CYSTS AND THE TRANSCRIPTION IN VITRO OF THE DNA |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20240108 Address after: 462300 intersection of Wenming road and national highway 107, Yicheng District, Luohe City, Henan Province Patentee after: Zhongyuan Food Laboratory Address before: 100193 No. 2 Old Summer Palace West Road, Beijing, Haidian District Patentee before: CHINA AGRICULTURAL University |
|
| TR01 | Transfer of patent right |