CN106148361A - 海带甘露醇-2-脱氢酶基因及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种海带甘露醇-2-脱氢酶基因及应用。海带甘露醇-2-脱氢酶(M2DH)基因具有序列表SED IQ No.1中的碱基序列。M2DH基因的编码蛋白具有序列表SED IQ No.2中氨基酸序列。发明所涉及的M2DH蛋白，是催化海带重要经济性状甘露醇合成的关键反应酶。本发明通过海带M2DH基因序列的克隆与表达，分析其序列结构特征及酶活特性。结果表明M2DH为多元醇特异性长链脱氢酶/还原酶家族(PSLDRs)的新成员。M2DH原核表达产生的重组蛋白，可在辅酶NADH作用下，体外催化甘露醇的大量合成。本发明为解析海带中甘露醇积累的内在机制提供基础，也为高含量甘露醇海带的遗传改良提供借鉴。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种海带甘露醇-2-脱氢酶基因及应用。
背景技术
甘露醇(mannitol，C6H14O6)是目前唯一从植物中提取的具有工业价值的功能性糖醇。甘露醇化学性质稳定，被广泛用于医药、食品、化工等领域，对我国经济发展起重要作用。随着甘露醇应用领域的不断扩展，尤其是医药行业的大量需求，甘露醇产业面临供不应求的现状。
目前，国内外许多企业采用化学氢化法通过蔗糖、果葡糖浆等异构化、氢化进行甘露醇生产。高温、高压、金属催化、加氢等条件，使得该工艺依然存在能耗大、工序繁琐等问题。运用生物酶法合成甘露醇，具有糖完全转化成甘露醇，不会产生副产品，反应条件温和等优势，是工业化制备甘露醇的发展趋势(魏倩倩，2010)。然而，目前通过分子遗传操作实现功能基因与产物的报道较少。根据微生物中甘露醇代谢四步途径，国外学者利用甘露醇脱氢酶(MDH)和甘露醇-1-磷酸脱氢酶(M1PDH)，进行转基因和过表达研究，发现二者均可发酵糖类产生甘露醇。假肠膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)中的MDH基因，曾被转入大肠杆菌用于D型甘露醇的生产，但由于甲酸和二氧化碳存在，发酵循环体系缺乏长效性和稳定性(Kaup等，2004；2005)。国内有利用乳酸菌代谢己糖生产甘露醇的报道，如通过调节果糖浓度，利用发酵乳杆菌(Lactobacillusfementum)，可使51％的果糖转化为甘露醇，但仍存在菌株生长慢，得率差等问题(袁其朋，1999)。运用生物酶法制备甘露醇仅限于实验室阶段。
海带(Saccharina japonica)在其厚成期能够大量积累甘露醇，甘露醇含量占海带干重的20％。高含量甘露醇的合成，暗示海带体内存在高活力的甘露醇合成相关酶。通过克隆M2DH基因及构建高效重组表达体系，获得M2DH粗酶制剂，可为下游应用M2DH改进酶法制备甘露醇生产工艺提供基础。
发明内容
本发明目的在于提供一种海带甘露醇-2-脱氢酶基因克隆及应用。
为实现上述目的本发明采用的技术方案为：一种海带甘露醇-2-脱氢酶(M2DH)基因，海带甘露醇-2-脱氢酶(M2DH)为序列表SEDIQ No.1中的碱基序列。
M2DH基因的编码蛋白具有序列表SEDIQ No.2中氨基酸序列。
海带M2DH为多元醇特异性长链脱氢酶/还原酶家族(PSLDRs)的酶。
从海带幼孢子体中提取总RNA；利用反转录合成普通cDNA和RACE-cDNA；以M2DH基因部分序列合成其5’和3’端的-RACE引物，并以获得的RACE-cDNA为模板获得SEDIQ No.1中的所示的cDNA全长碱基序列。
所述海带M2DH重组编码蛋白可作为多元醇特异性长链脱氢酶/还原酶家族(PSLDRs)的酶。
所述海带M2DH重组编码蛋白作为粗酶制剂应用于果糖生成甘露醇中。
将SEDIQ No.1中所示M2DH碱基序列经pMAL体外表达产生的重组蛋白，在辅酶NADH作用下，体外催化合成甘露醇。
将SEDIQ No.1中所示M2DH碱基序列经pMAL体外表达产生的重组蛋白，在35-40℃、pH6.5，同时辅酶NADH作用下，体外催化合成甘露醇。
本发明优点如下：本发明所涉及的M2DH蛋白，是催化海带重要经济性状甘露醇合成的关键反应酶。本发明通过海带M2DH基因序列的克隆与表达，分析其序列结构特征及酶活特性。结果表明M2DH为多元醇特异性长链脱氢酶/还原酶家族(PSLDRs)的新成员。M2DH原核表达产生的重组蛋白，可在辅酶NADH作用下，体外催化甘露醇的大量合成。本发明为解析海带中甘露醇积累的内在机制提供基础，也为高含量甘露醇海带的遗传改良提供借鉴。
附图说明
图1为本发明实施例提供的不同处理条件下海带幼孢子体M2DH表达量的变化图。
图2为本发明实施例提供的海带M2DH重组蛋白酶学特性分析图。
具体实施方式：
下面的实施例中将本发明作进一步阐述，但本发明不限于此。
实施例1
本发明所述海带M2DH基因的克隆方法，主要包括以下步骤：
1.海带幼孢子体总RNA的提取；
2.普通cDNA和RACE-cDNA的合成；
3.M2DH基因特异性引物的合成及PCR扩增产物测序；
4.M2DH基因的5’和3’端RACE引物的合成及cDNA全长序列测序
具体操作如下：
1.海带幼孢子体总RNA的提取：利用Qiagen公司的植物RNA提取试剂盒(RNeasy Plant Mini Kit)，提取海带样品的总RNA。洗脱获得的总RNA用琼脂糖凝胶电泳检测28S、18S等条带的完整性及亮度，鉴定所提RNA的质量。
2.普通cDNA和RACE-cDNA的合成：利用宝生物(大连)公司的TakaraPrimeScriptⅡ cDNA合成试剂盒，通过反转录合成普通cDNA，用于M2DH部分序列的扩增。利用Clontech公司的SMARTer RACE cDNA合成试剂盒，合成RACE-cDNA模板。详细操作参见各试剂盒说明书。
3.M2DH基因特异性引物的合成及PCR扩增产物测序：
利用Primer Premier 5软件，设计扩增M2DH基因部分序列的引物组合M2DH-F1和M2DH-R1(表1)。扩增体系为：1μl cDNA，0.25μl Ex TaqHS，2μl 10×PCR缓冲液，1.6μl dNTP(2.5mM)，13.15μl ddH2O和上下游引物各1μl。反应程序为：94℃预变性5min，然后进入30个循环：94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸2min，最后进行72°C延伸10min。PCR产物经DNA电泳检测、胶回收、连接与转化后，送上海生工进行测序。
4.M2DH基因的5’和3’端-RACE引物的合成及cDNA全长序列测序
设计RACE引物M2DH-3和M2DH-5(表1)，分别与SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒中的UPM引物组合，扩增M2DH基因上下游侧翼序列。扩增体系为：1μl RACE cDNA，10μl LA Taq Premix，7μl ddH2O和上下游引物(M2DH-3和M2DH-5)各1μl。反应程序为：94℃预变性5min，然后进入30个循环：94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸3min，最后进行72℃延伸10min。所得PCR产物送上海生工进行测序，然后将测序结果提交NCBI数据库进行Blast同源比对，以确定克隆得到的为海带M2DH基因(参见SEDIQ No.1)。
表1 本方案所用引物及其核苷酸序列
| 引物名称 | 引物序列 |
| M2DH-F1 | 5’-CGAGGCAGGACACTGAAGACC-3’ |
| M2DH-R1 | 5’-TGGAAGATGAAACCCGAAATG-3’ |
| M2DH-3 | 5’-GCCATGGCGAACCCTCTCATTTCGGGTTTC-3’ |
| M2DH-5 | 5’-CGGAAGTCGGCAGCCTTCTTACGGAGC-3’ |
| qM2DH-F | 5’-GCGAGGCAGGACACTGAAGACC-3’ |
| qM2DH-R | 5’-GGGACCACATCCAGCACCAAC-3’ |
| qActin-F | 5’-GACGGGTAAGGAAGAACGG-3’ |
| qActin-R | 5’-GGGACAACCAAAACAAGGGCAGGAT-3’ |
| M2DH-pM-F | 5’-CATATGATGTCGGACTTTATCGATGCGCT-3’ |
| M2DH-pM-R | 5’-GAATTCTTAATCGCTTTTCCCGGCAACTTCG-3’ |
SEDIQ No.1海带甘露醇脱氢酶(M2DH)基因碱基序列
cagtgacgcc accaccgagt actcatcgac tcacagcagt gccgactagc acagacatca
gcaacaaggg agggaggtat cttgataact gagcgcagag ccacagcgcg gagctctact
gctgctttcg tctggctcta gccgggagag cttgagagag agagagagat gtcggacttt
atcgatgcgc tcaacctgat cacgagccat aaaatacacg agctgtacgc gaggcaggac
actgaagacc cgctcgtgct ccgtaagaag gctgccgact tccgtaaggg gtatggaaac
tggcgaagca agaagtccaa gggagctcgc ggagagacga actaccccac ggacaaggac
aagctccacg ccacggatgc caagcacgaa gagttggtgc tggatgtggt cccgttgacg
agggtgaact ctgtggagat gctcaaggcg ccggatacac ccggcagcag gggcgtcagc
cgccgaggga gtttgttccg ttgcaactcc atcatcgatg gcaacgatct agaggcgcac
caggagaagg aaaactggct gaagttctac gtgaaccctt actccggtat ggccgaggcg
gagctcaccg agcccgtggc gctcaaccag gccaacctcg agaaggtaat ccctgcgacc
gtggtgaagc cgcaatacgc tcgaccagga gacgggcggt tcatcgacca ctacatgtgc
cacatgggcg tgggtggctt ccacaggtct caccaagcgg tgtacacgga cgatctgctc
aacctcgcgg cgtctttgga ggccaaaaat ggctccccgt cggatgtgaa gaagtggggc
atcgtcggaa tcgggctgat gccgtgggat agcaagatgt acaacatctt gaaagcgcag
gaccacctgt acaccctgct gtcgaggggc cacacggggt cggaggcgag ggtggtcggc
tccatcgtgg acttcatgtt tgcgcctgag aaccaccagg ctgtcatcga caagctggcg
cacgtggaca cgcgcatcgt ttcgttgacg atgacggaga agggttactg ccaggacgtc
aacggcgact tggacagggc gaacgcgcta gtcaagagcg acttggacgg agacctggcg
aagccgtctt cggcgatcgg catgatcgta gcggctttga ggaagaggaa gcaggagggc
acgccttcct ttaccgttct ctcgtgcgac aacctccctg aaaacggcga caagatcaag
cacgtggtgt tgcagatggc gggctacgtg agcgccgagc tgagagagtg ggtggagtcg
aacacgacct tcccgaacac gatggttgac cgcatcaccc ccatgacgga ggtggagcac
atcgagctcg ttgccaggga ctacatggtg aaggacagct ggccagtgat cgcggaagac
ttttcccagt gggtggttga ggacaacttc tgcaacggga tgccggagtg ggacaaggtg
ggcgcgctgg tggtgaagga cgtgaagccg tacgagttca tgaagctccg gctgttgaac
ggcgggcaca gttgtctgtc ttacatctcg gtgctgtgcg gctacaacta tgttgacgac
gccatggcga accctctcat ttcgggtttc atcttccagt tcttcaatga gatgtccccg
accctgctgc ccgtgccggg ggtggacacg ctcacttacc agaagaagct cgtcgagcgt
ttcggtaacc cgtacatcaa ggacaagctt acgcgcctgg caaaggacgg ctcaaagaag
atggccaaca cactcaagga agctgtgatc gaactcagcg agaaggggct ctcgactaag
gttatcgcgc tcgccaacgc cgcgtggatc cgctacatgg tgggcaggat gcccgaaaca
ggcgaggcca tccttgggat caaggacccc gcagcagacg aactgcgaga cttggcggta
gaagccctgg acggagtgga ctatggcgag gagccgaagc cggagaggta catcgagttt
gtcttcgggg ctgagattgt cgagctcaag ggtttcgtgg gcgagatcaa ggacctgctt
cgatctatcg tgacacacgg tgccttgact acgctagagg atgtcatggc cgaagttgcc
gggaaaagcg attaaacgat gagggctgtt gctgttgtgt ttgtggcctt cgggtggatt
gtcttgtctg gtcgtgccac cgatctgcct tctttctggt ctggaagcga aaagtaatgg
cttttcttga tgtgacattt tttggtgtga cattcattgc cttctttgtg gaagcgaacg
taataggtca tgggggattg gggtataaca tgggtggtca tatttttgtg tttcgactgc
ggaagaggag ggcggggaag agggaaaaag aggagactgg ttagagccca gcgacgtgga
gttggaatat ggaggtcaag atagggagcg tgcccaccag ccgtctaccg catcacaagt
gtgctaagat gacacttaag ataacactta agataacact taggataaca cttgagtcag
cacttaagat aacacctaag ataacactta ggataacact taagtcagca cttaagataa
cacttaagac aacacttgag ataacacttg agtcaacact tgagccaaca cttaaggtaa
cacttaagac gacacttagg ataacactta agatagcact taagtcagca cttagggtaa
cacttaagac aacacttaag ataacactta aggtaacact attacaaaga taacacacac
cctgggatgg gatttccgag ccaattttgt ccagaacaag ggaggagctc acaaccacaa
tgctgggtat ggaaatatct cgcctagaaa tttccgagat atttccatca acgcacgcat
ctctcggcgt ttgcacccta ctcatgaccg ttgtaaccgt tttgggaaaa taaaatcagc
taaaaaaa
SEDIQ No.2海带甘露醇脱氢酶(M2DH)基因编码蛋白氨碱基序列
MSDFIDALNLITSHKIHELYARQDTEDPLVLRKKAADFRKGYGNWRSKKSKGARGETNYPTDKDKLHATDAKHEELVLDVVPLTRVNSVEMLKAPDTPGSRGVSRRGSLFRCNSIIDGNDLEAHQEKENWLKFYVNPYSGMAEAELTEPVALNQANLEKVIPATVVKPQYARPGDGRFIDHYMCHMGVGGFHRSHQAVYTDDLLNLAASLEAKNGSPSDVKKWGIVGIGLMPWDSKMYNILKAQDHLYTLLSRGHTGSEARVVGSIVDFMFAPENHQAVIDKLAHVDTRIVSLTMTEKGYCQDVNGDLDRANALVKSDLDGDLAKPSSAIGMIVAALRKRKQEGTPSFTVLSCDNLPENGDKIKHVVLQMAGYVSAELREWVESNTTFPNTMVDRITPMTEVEHIELVARDYMVKDSWPVIAEDFSQWVVEDNFCNGMPEWDKVGALVVKDVKPYEFMKLRLLNGGHSCLSYISVLCGYNYVDDAMANPLISGFIFQFFNEMSPTLLPVPGVDTLTYQKKLVERFGNPYIKDKLTRLAKDGSKKMANTLKEAVIELSEKGLSTKVIALANAAWIRYMVGRMPETGEAILGIKDPAADELRDLAVEALDGVDYGEEPKPERYIEFVFGAEIVELKGFVGEIKDLLRSIVTHGALTTLEDVMAEVAGKSD
本发明从海带中克隆获得M2DH基因的cDNA全长为3008bp，其中开放阅读框(ORF)为2007bp，编码688个氨基酸。该基因的5’非编码区长168bp，包含干旱响应元件(TAACTG)，光应答元件(GGAGGG)及甲基茉莉酸应答元件(TGACG)等一系列顺式作用元件。3’非编码区长833bp，含PolyA加尾信号(AATAAA)和7个腺嘌呤的PolyA尾巴。M2DH蛋白预测分子量为74.3kDa，等电点为5.37。M2DH不存在跨膜结构域和信号肽序列，表明该酶在细胞质溶胶中发挥作用。
同时经上述所得氨基酸序列中可见，海带M2DH存在KLRLLNGGH区段，该特征与多元醇特异性长链脱氢酶/还原酶家族(PSLDRs)一致，即PSLDRs成员均含有一段高度保守的KxxxxNxxH基序。
实施例2
本发明所述海带M2DH基因转录谱检测方法，主要包括以下步骤：
1.海带幼孢子体处理及总RNA的提取；
2.mRNA反转录及定量引物合成；
3.M2DH基因定量PCR检测及统计学分析。
具体操作如下：
1.海带幼孢子体处理及总RNA提取：选取生长状况一致的健康海带幼孢子体，分别进行不同盐度(0,8,16,24,32‰)、NaCl浓度(0.4,0.6,0.8,1.0,1.2M)、H2O2浓度(0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mM)和干露时间(0,1,2,3,4h)等非生物胁迫处理。处理结束后，用0.1％DEPC处理水冲洗海带，擦干表面水分后取约0.1g(鲜重)进行总RNA提取，操作步骤如实施实例1。
2.mRNA反转录及定量引物合成：反转录操作参见实施实例1中普通cDNA的合成过程。利用Primer Premier 5软件设计M2DH基因定量引物组合qM2DH-F/qM2DH-R(表1)，扩增片段长度为185bp；设计β-actin基因引物组合qAct in-F/qAct in-R(表1)作为定量PCR反应内参。
3.M2DH基因定量PCR检测及统计学分析：定量PCR反应采用Takara公司的SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒，反应体系为：10μl SYBR Mix，1μl cDNA，上下游引物各0.8μl，7.4μl ddH2O。反应程序为：95℃预变性30s，然后进入40个循环：95℃变性5s，58℃退火+延伸30s，而后进行融解反应：95℃，15s；60℃，30s；95℃，15s。每个样品采用3个生物学重复，相对定量采用双△Ct法进行计算，产生的数据采用One-Way ANOVA进行统计分析(参见图1)。
随着NaCl浓度的升高，M2DH表达量下降，推测M2DH通过降低甘露醇氧化反应的效率来应答高盐胁迫。随着海水盐度的降低，M2DH转录水平显著上升，可能与M2DH发挥了催化果糖合成甘露醇的作用相关。此外，1-2h干露处理与0.2-0.8mM H2O2处理均上调M2DH表达量，表明M2DH通过调节甘露醇代谢应答外界非生物胁迫。
通过荧光定量PCR检测表明，M2DH在海带应答高盐、低盐、高氧及干旱等非生物胁迫过程中发挥重要作用。
实施例3
本发明所述海带M2DH重组蛋白表达及酶活检测方法，主要包括以下步骤：
1.M2DH重组质粒构建；
2.M2DH重组质粒转化表达菌株；
3.M2DH重组蛋白诱导表达；
4.M2DH重组蛋白催化甘露醇合成。
具体操作如下：
1.M2DH重组质粒构建：利用NEB公司的pMAL蛋白融合与纯化系统(E8200S)进行M2DH蛋白的原核表达。根据M2DH基因开放阅读框全长序列，设计带Nde Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切位点的引物组合：M2DH-pM-F和M2DH-pM-R(表1)，PCR扩增条件为：94℃预变性5min，然后进入35个循环：94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2.5min，最后进行72℃延伸10min。PCR产物亚克隆至pMD19-T载体，将阳性克隆过夜培养后，利用ZYMO质粒小提试剂盒提取质粒。利用NdeI和EcoRI分别对该质粒和pMAL载体(C5X)进行37℃，1.5h的双酶切反应。回收目的片段后，利用T4DNA连接酶，进行16℃，3h的连接反应，获得重组质粒。连接体系为：1μl T4连接酶，2μl T4缓冲液，酶切后的质粒及载体各1μl，15μl ddH2O。
2.M2DH重组质粒转化表达菌株：将2μl重组质粒与50μl大肠杆菌NEB Express感受态细胞混合，冰浴15min；42℃热激45s，置于冰上冷却1-2min；加入500μl LB培养基(不含Amp)，37℃，350rpm，孵育50min；将菌液离心，涂布LB平板(含100μg/ml Amp)，37℃，过夜培养。根据pMAL-C5X载体设计引物对：malE-F和malE-R(表1)，进行菌落PCR并送测鉴定阳性克隆。
3.M2DH重组蛋白诱导表达：将2μl阳性克隆菌液，加入至2ml LB培养基(Amp+)中，37℃，160rpm，培养12h，然后在pMAL培养基中扩大培养，至OD600达到0.5-0.7；向培养基中加入0.3mM IPTG诱导表达，2h后4℃，4000rpm离心20min收集菌体。将菌体重悬于100mM Tris-HCl(pH 8.8)缓冲液中，在冰水浴中超声破碎约1h，每次5s，间隔10s。11,400g，4℃，离心40min，上清液即为M2DH重组蛋白的细菌粗提物。
4.M2DH重组蛋白催化甘露醇合成：配制不同pH值的缓冲液：柠檬酸(4.5-6.5)，Tris-HCl(7.5-8.5)和甘油-NaOH(9.5-10.5)，将含约30μg蛋白质的M2DH重组蛋白粗提物分别加至200μl含有上述不同pH值的缓冲液反应体系中，反应体系为1mM NAD(P)H，100mM果糖/甘露醇和100mM不同pH的缓冲液。设置20-55℃不同反应温度，检测OD340。实验以ddH2O和空载体C5X诱导所得细菌粗提物为阴性对照(参见图2)。
结果如图2所示：利用pMAL C5X表达载体在大肠杆菌NEB Express菌株中实现了该重组蛋白的表达。海带M2DH重组蛋白以NADH为辅酶，催化果糖转化为甘露醇。反应最适pH为6.5，在pH7.5和8.5时，反应速率为最大反应速率的85％以上。最适反应温度在35-40℃之间，低于25℃时，酶活降至最大酶活的50％以下，高于50℃几乎检测不到酶活。
前人研究发现，真菌与红藻中的M2DHs以NADP(H)为辅酶，而细菌M2DHs(属于PSLDRs家族)以NAD(H)为辅酶。上述结果表明，海带M2DH仅在NAD(H)存在时具有活力，这与PSLDRs蛋白家族一致。
综上，M2DH重组蛋白在NADH为辅酶时，催化果糖还原为甘露醇，最适反应时间为10min内，最适pH为6.5，最优反应温度为35-40℃。M2DH酶活被ZnCl2抑制，但不受MgCl2，CaCl2和MnCl2的影响。
Claims (8)
1.一种海带甘露醇-2-脱氢酶(M2DH)基因，其特征在于：海带甘露醇-2-脱氢酶(M2DH)为序列表SEDIQ No.1中的碱基序列。
2.按权利要求1所述的海带甘露醇-2-脱氢酶(M2DH)的编码蛋白，其特征在于：M2DH基因的编码蛋白具有序列表SEDIQ No.2中氨基酸序列。
3.按权利要求2所述的海带甘露醇-2-脱氢酶(M2DH)的编码蛋白，其特征在于：海带M2DH为多元醇特异性长链脱氢酶/还原酶家族(PSLDRs)的酶。
4.一种海带甘露醇-2-脱氢酶(M2DH)基因的构建方法，其特征在于：从海带幼孢子体中提取总RNA；利用反转录合成普通cDNA和RACE-cDNA；以M2DH基因部分序列合成其5’和3’端的-RACE引物，并以获得的RACE-cDNA为模板获得SEDIQ No.1中的所示的cDNA全长碱基序列。
5.一种海带甘露醇-2-脱氢酶(M2DH)基因的应用，其特征在于：所述海带M2DH重组编码蛋白可作为多元醇特异性长链脱氢酶/还原酶家族(PSLDRs)的酶。
6.一种海带甘露醇-2-脱氢酶(M2DH)基因的应用，其特征在于：所述海带M2DH重组编码蛋白作为粗酶制剂应用于果糖生成甘露醇中。
7.按权利要求6所述海带甘露醇-2-脱氢酶(M2DH)基因的应用，其特征在于：将SEDIQ No.1中所示M2DH碱基序列经pMAL体外表达产生的重组蛋白，在辅酶NADH作用下，体外催化合成甘露醇。
8.按权利要求6所述海带甘露醇-2-脱氢酶(M2DH)基因的应用，其特征在于：将SEDIQ No.1中所示M2DH碱基序列经pMAL体外表达产生的重组蛋白，在35-40℃、pH6.5，同时辅酶NADH作用下，体外催化合成甘露醇。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109161556A (zh) * | 2018-09-30 | 2019-01-08 | 中国海洋大学 | 一种海带中的m1pdh基因、其蛋白质及用途 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
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