CN116478256B - 一种发酵乳杆菌产生的细菌素及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种由发酵乳杆菌产生的细菌素以及在食品生产中的应用、在制备抗菌药物中的应用，所述发酵乳杆菌在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为CCTCCNO：M2020042。本发明筛选到的发酵乳杆菌SHY10产生的细菌素具有广谱的抗菌作用，对多种食源性致病菌和食品腐败菌具有较强的抑菌能力，但对益生菌却无抑制作用，尤其适合于食品、药品等生产中，控制其中的致病菌和腐败菌；同时该发酵乳杆菌还可以显著抑制发酵食品中白膜的生长。本发明还利用LC‑MS/MS系统对该菌株产生的细菌素进行了鉴定，共鉴定出3种细菌素，均为第一次发现的新型细菌素。

Description

一种发酵乳杆菌产生的细菌素及应用

技术领域

本发明涉及微生物及食品发酵技术领域，具体涉及一种发酵乳杆菌产生的细菌素及应用。

背景技术

随着社会经济的增长，人们对食品安全问题越来越关注。食源性致病菌和食品腐败菌是食品工业中常见的有害微生物，对人体健康具有严重威胁。目前，常常使用化学防腐剂抑制有害微生物的生长，但化学防腐剂具有一定毒性，会对人体造成慢性毒害。细菌素(bacteriocin)是细菌中的核糖体合成的低分子量肽或蛋白质。细菌素具有安全、无毒、耐高温、耐酸碱性及高效抑菌效果等优点，被认为是化学防腐剂的理想替代者。

乳酸菌是一类对宿主有益且能在碳水化合物中发酵产生大量乳酸的细菌的统称，广泛存在于各种发酵食品中，被认为是安全级别的微生物。研究表明，乳酸菌在其代谢过程中能产生细菌素，但乳酸菌发酵上清液中含有许多其它杂质，直接应用到食品工业中会有不利影响，因此需进一步纯化出细菌素。细菌素的提纯一般包括3个阶段：粗提阶段、层析柱纯化阶段、高度纯化阶段。传统的细菌素提取方法能够得到高纯度的细菌素，但是操作步骤复杂，耗时长，所需设备仪器多、价格高并且提取的量有限。因此，应用可以快速、简便的细菌素提取方法才能满足大量研究的需要。发展能够快速提取各种细菌素的方法，对于扩大细菌素在食品中的应用具有重大意义。

白膜，又称为生物膜，是一种有组织的且具有功能性的微生物群体，其存在形式是粘附于底板、交界面及细胞间互相粘结或由菌体外的大量胞外基质与细菌团块组成。传统发酵制品中经常会发生在发酵食品表面出现白膜，这对产品感官品质影响非常大。分离鉴定发酵食品中产生白膜菌以及筛选具有抑制发酵食品中白膜生长的菌种，对于提高发酵食品品质具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种细菌素，所述细菌素的氨基酸序列如SEQ ID No.2或SEQIDNo.3或SEQ ID No.4所示。

所述细菌素由发酵乳杆菌SHY10产生，所述发酵乳杆菌SHY10在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2020042。

本发明的再一目的是提供上述的细菌素的制备方法，包括如下步骤：

(1)细菌素粗提：发酵培养发酵乳杆菌SHY10，得到发酵液，发酵液离心得到上清液，采用硫酸铵盐析，沉淀用缓冲液溶解，稀释；

(2)阳离子交换层析：稀释过后的样品进行阳离子交换层析，收集洗脱液；

(3)疏水相互作用色谱：在洗脱液中加入硫酸铵，然后通过疏水柱进一步分离，收集洗脱液；

(4)凝胶柱层析：经疏水柱纯化后的样品冻干浓缩，使用凝胶柱进一步纯化，收集洗脱液；

(5)反相高效液相色谱纯化：将上一步纯化过后的具有抑菌活性的峰使用反相高效液相色谱进行最终纯化。

优选地，步骤(1)中发酵液是将培养至对数期的发酵乳杆菌SHY10菌液接入MRS肉汤中，在37℃下培养得到；采用80％硫酸铵盐析，所述缓冲液为柠檬酸-磷酸盐缓冲液，溶解后用纯水将溶液电导稀释至10mS/cm以下。

优选地，步骤(2)中阳离子交换层析，A液是20mM的pH＝3.5的柠檬酸-磷酸盐缓冲液，B液是A中加入NaCl，NaCl浓度为1mol/L；

步骤(3)中分离所用缓冲液为：A液是含1.3mol/LNH₂SO₄的20mM的柠檬酸-磷酸盐缓冲液，pH＝4，B液是A液中不加入NH₂SO₄；

步骤(4)中纯化条件：A液：超纯水+0.1％(v/v)三氟乙酸，B液：乙腈+0.1％三氟乙酸；梯度洗脱程序：0-4min，10％B；4-33min 10％-100％B；33-38min，100％B；38-43min，100％-0％B。

本发明的最后的目的是提供上述的细菌素在食品生产中或制备抗菌药物中的应用。

优选地，所述食品为发酵食品。

进一步优选地，所述在食品生产中的应用为抑制发酵食品白膜生长上的应用。

本发明的有益效果是：筛选到的发酵乳杆菌SHY10能产生具有广谱抗菌活性的细菌素，细菌素的抑菌活性测定试验结果显示，SHY10产生的细菌素不仅对单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌等革兰氏阳性菌有较强的抑制作用，同时对革兰氏阴性菌如大肠杆菌、沙门氏菌也具有较强的抑制作用。但该细菌素对植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、消化乳杆菌等乳酸菌无抑制作用。表明该细菌素具有广谱的抗菌作用，对多种食源性致病菌和食品腐败菌具有较强的抑菌能力，但对益生菌却无抑制作用，尤其适合于食品、药品等生产中，控制其中的致病菌和腐败菌；同时该发酵乳杆菌还可以抑制发酵食品中白膜的生长。本发明还利用LC-MS/MS系统对该菌株产生的细菌素进行了鉴定，共鉴定出3种细菌素，均为第一次发现的新型细菌素。

附图说明

图1为发酵乳杆菌SHY10的菌落形态图(图a)及革兰氏染结果(图b)。

图2为金黄色葡萄球菌ATCC25923的生长曲线。

图3为发酵乳杆菌SHY10对金黄色葡萄球菌的抑菌效果。

图4为发酵乳杆菌SHY10的生长及其细菌素产生曲线。

图5为细菌素的分离色谱图，其中，A：SP-Sepharose Fast Flow阳离子柱；B：Octyl疏水柱；C：凝胶柱；D：C18柱。

图6为细菌素的二级质谱图，其中，图A、B、C分别为细菌素A、B、C的二级质谱图。

图7为25℃时发酵乳杆菌SHY10对近平滑假丝酵母白膜影响情况。

图8为37℃时发酵乳杆菌SHY10对近平滑假丝酵母白膜影响情况。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

主要试剂来源或成分：

MRS固体培养基、LB肉汤、LB半固体培养基、MRS肉汤均为本领域常规培养基/液。金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠杆菌ATCC25922、枯草芽胞杆菌CCTCCAB 90008、沙门氏菌CMCC50071、蜡样芽胞杆菌、单核细胞增生李斯特菌ATCC19115、屎肠球菌、植物乳杆菌、消化乳杆菌、保加利亚乳杆菌，以上菌的标准菌株均可通过商购获得。

其余试剂如未表明，均为本领域常规试剂，可商购获得。

实施例1、产细菌素乳酸菌的筛选与鉴定

1实验材料

8份从重庆市区市民家中采集的传统泡菜水。

2实验方法

2.1乳酸菌的分离纯化

取1mL泡菜水采用10倍稀释法进行梯度稀释，依次稀释至10^-4。每个稀释度取100μL涂布于MRS固体培养基上，置于37℃生化培养箱中培养48h后，挑取不同形态特征的单菌落进行平板划线法分离菌株，反复划线直至得到单一菌落，记录其菌落形态并进行革兰氏染色镜检，并将纯化的菌株冻干保藏。

2.2指示菌的活化及生长曲线

在超净工作台中打开保藏金黄色葡萄球菌ATCC25923的安瓿管，将冻干粉接入灭过菌的LB肉汤中，在37℃恒温培养箱中培养24h。活化后取1％(v/v)菌液接入无菌LB肉汤中37℃静置培养，在0、2、4、6、8、10、12、14h取菌液测OD_600nm值。

2.3产细菌素乳酸菌的筛选

采用双层平板抑菌法进行产细菌素乳酸菌的筛选，用接种环取对数期的乳酸菌菌液在MRS平板中间划两条2cm左右的平行线。配置LB半固体培养基(含0.75％琼脂)，灭菌后冷却至45℃左右，加入培养6h的金黄色葡萄球菌，终浓度为10⁶CFU/mL，摇匀后倾倒在MRS培养基上。在37℃下培养过夜后，观察抑菌情况，并测量抑菌宽度。挑选对金黄色葡萄球菌具有最强抑菌效果的乳酸菌进行下一步实验。

2.4菌株鉴定

将上一步筛选到的菌株接种到MRS肉汤中培养18h，取菌液1.5mL于2mL离心管中，12000rpm离心2min得菌体。然后，采用天根生化科技(北京)有限公司的细菌DNA试剂盒提取DNA(操作按照产品使用说明书进行)。使用细菌通用引物27F和1492R、采用25μL反应体系对其16S rDNA进行PCR扩增，反应结束后利用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，合格后将样品委托华大基因科技有限公司对PCR扩增产物进行双向测序。测序结果通过NCBI中的BLAST程序进行同源性比对分析。将该菌株命名为SHY10。

2.5统计分析

每个试验做3次平行试验，试验数据以“平均值±标准方差”表示。

3结果与分析

3.1分离菌株的菌落形态和细胞形态

从8份泡菜水中共分离到30株乳酸菌。菌株纯化后在MRS固体培养基上形成单菌落，菌落形态几乎一致，大多数呈圆形，乳白色，表面光滑。革兰氏染色后在显微镜下观察到蓝紫色细胞形态，为革兰氏阳性菌(G⁺)，短杆状。其中，SHY10的菌株的菌落形态和革兰氏染色结果见图1。

3.2金黄色葡萄球菌的生长曲线

由图2可知，金黄色葡萄球菌ATCC25923在0-2h缓慢生长处于延滞期；2-8h快速生长，处于指数期；8h之后处于平稳期。选择处于指数期的金黄色葡萄球菌进行后续实验。

3.3产细菌素乳酸菌的筛选

结果如图3所示，SHY10菌株对金黄色葡萄球菌展现出强抑制圈(抑菌的宽度大于25mm)，说明SHY10菌株对金黄色葡萄球菌具有很强的抑菌活性。

3.4菌株鉴定

菌株SHY10的16S rDNAPCR扩增成功后，由华大基因科技有限公司完成测序。SHY10的16S rDNA基因扩增产物的序列如SEQ ID No.1所示，经过BLAST比对，鉴定为发酵乳杆菌，发现与发酵乳杆菌Lactobacillusfermentum(Accession：MT641196.1)的16S rDNA序列相似性为100％。

实施例2、细菌素的分离纯化鉴定及抑菌活性

1实验材料

实验菌株为发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)SHY10。

2实验方法

2.1发酵乳杆菌SHY10生长及其抑菌物质的生长曲线

将实施例1得到的冻干发酵乳杆菌SHY10活化后，取1％(v/v)培养至对数期的菌液接种于100mLMRS肉汤中，在37℃下培养48h，每隔2h取样，分别测试其OD_600nm、pH和上清液的抑菌活性。在4000rpm、4℃离心10min取上清液。上清液的抑菌活性采用琼脂扩散法进行测定。

2.2细菌素的粗提

(1)将发酵乳杆菌SHY10进行活化，活化后取1％(v/v)培养至对数期的菌液接入100mL MRS肉汤中，在37℃下静置培养22h；发酵液在4000rpm、4℃离心10min，取上清液；将上清液置于4℃层析柜中并磁力搅拌，在上清液中缓慢加入硫酸铵至饱和度为40％，并搅拌过夜；搅拌过夜后将样品液体分装到100mL离心管中，在11000rpm、4℃下离心10min，得到的沉淀用pH＝6的柠檬酸-磷酸盐缓冲液溶解。

(2)沉淀用柠檬酸-磷酸盐缓冲液溶解后得到的液体则继续加入硫酸铵至饱和度为60％，并搅拌过夜，将样品液体分装到100mL离心管中，在11000rpm、4℃下离心10min，得到的沉淀用pH＝6的柠檬酸-磷酸盐缓冲液溶解，得到60％饱和度沉淀溶解液。重复该步骤，直至硫酸铵饱和度为100％。

均用琼脂扩散法检测各饱和度沉淀液的抑菌活性。

2.3细菌素粗提物的抑菌活性测定

在无菌培养皿中倒入一层1.5％的灭菌琼脂，待其凝固后，用镊子夹取牛津杯放置在琼脂上。配置LB半固体(含0.75％琼脂)培养基，灭菌后冷却至45℃；再将对数期的金黄色葡萄球菌ATCC25923添加LB半固体培养基中(终菌浓度为10⁶CFU/mL)，摇匀后倒入放有牛津杯的琼脂平板上，含指示菌的培养基没过牛津杯四分之一位置。待半固体培养基凝固后，取出牛津杯，半打开平板盖子，放置于无菌操作台中0.5h，使水分挥发。用移液器吸取细菌素粗提物100μL到平板的牛津杯孔中，在37℃下静置培养过夜，并观察抑菌效果，并测量抑菌圈直径。

2.4细菌素的分离纯化

(1)硫酸铵粗提

将1LMRS肉汤，灭菌、冷却后，接入1％(v/v)的培养至对数期的发酵乳杆菌SHY10菌液，在37℃下培养20h后离心取上清液，加入80％硫酸铵盐析，离心得到的沉淀溶解在20mM的pH＝3.5的柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，充分溶解后用纯水将溶液电导稀释至10mS/cm以下。

(2)阳离子交换层析

稀释过后的样品，使用SP-琼脂糖凝胶FF(SP-Sepharose Fsat Flow)离子交换层析柱介质填料预装柱分离。缓冲液为：A液是20mM的pH＝3.5的柠檬酸-磷酸盐缓冲液，B液是A中加入NaCl，NaCl浓度为1mol/L。SP Sepharose Fsat Flow填料装入层析柱(2.1×13.5cm)中，接入AKTA蛋白纯化仪后用纯水平衡100mL，接着用B液冲洗50mL，最后用A液冲洗至电导、pH稳定。待柱子平衡好后，采用系统泵上样，上样体积400mL，流速10mL/min。上样完毕后用A液将杂质冲洗干净，之后再用1mol/LNaCl的B液洗脱。收集洗脱液，进行下一步分离。

(3)疏水相互作用色谱

上一步中收集的洗脱液需加入硫酸铵至电导为180mS/cm，然后通过疏水柱OctylSepharose 4Fast Flow(辛基琼脂糖凝胶4FF)进一步分离。分离所用缓冲液为：A液是含1.3mol/LNH₂SO₄的20mM的柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH＝4)，B液是A液中不加入NH₂SO₄。将柱子接入AKTA蛋白纯化仪后，用10倍柱体积的B液清洗疏水柱，再用A液清洗柱子直至基线、电导和pH稳定。通过系统泵上样，上样体积为40mL，流速为3mL/min，上样完成后，先使用A液将杂质冲洗干净，再使用B液进行洗脱。并收集洗脱液，用于下一步纯化。

(4)凝胶柱层析

经疏水柱纯化后的样品冻干浓缩，使用Superdex-20010/300GL凝胶柱(GE凝胶过滤预装柱)进一步纯化，洗脱液为pH＝4的20mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液。使用样品环上样，一次上样体积为0.5mL。上样完成后，流速设置为0.4mL/min进行洗脱。在280nm处紫外检测，并收集各个洗脱峰进行抑菌试验。

(5)反相高效液相色谱纯化

将上一步分子筛纯化过后的具有抑菌活性的峰使用反相高效液相色谱进行最终纯化，纯化条件：安捷伦Shim-packArata C18(5μm，250L×4.6)，A液：超纯水+0.1％(v/v)三氟乙酸，B液：乙腈+0.1％三氟乙酸。梯度洗脱程序：0-4min，10％B；4-33min 10％-100％B；33-38min，100％B；38-43min，100％-0％B。进样量：100uL，检测波长：220nm，流速：0.6mL/min。手动收集各个峰，并检测各峰的抑菌活性。

2.5细菌素的鉴定

经过反相高效液相色谱纯化的细菌素，使用LC-MS/MS系统测定其分子质量，并利用从头测序技术分析氨基酸序列。样品首先需要还原烷基化，即：在样品中加入DTT溶液使其终浓度为10mmol/L，37℃水浴中还原4h；再加入IAA溶液使其终浓度为50mmol/L，避光反应40min；最后使用脱盐柱脱盐，并在真空离心浓缩仪中使溶剂挥发。烷基化完成后，将肽溶解在0.1％甲酸中上液质检测。毛细管液相色谱条件，预装柱：Acclaim PepMap RPLC C18(300μm×5mm，5μm，)；分析柱：Acclaim PepMap RPLC C18(150μm×150mm，1.9μm，/>)；流动相A：超纯水+0.1％(v/v)甲酸；流动相B：乙腈+0.1％甲酸；流速：600nL/min；时间程序如表1。一级质谱条件，喷涂电压：2.2kV；毛细管温度：270℃；MS分辨率：在400m/z下60000；扫描范围：350-1800m/z。结束后使用Peaks Studio 10.0对质谱原始文件进行多肽序列解析。

表1毛细管液相时间程序

2.6细菌素的抑菌活性

在无菌培养皿中倒入一层1.5％的灭菌琼脂，待其凝固后，用镊子夹取牛津杯放置在琼脂上。配置LB半固体(含0.75％琼脂)培养基，灭菌后冷却至45℃；再将对数期的指示菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、沙门氏菌、蜡样芽胞杆菌、单核细胞增生李斯特菌、屎肠球菌、植物乳杆菌、消化乳杆菌、保加利亚乳杆菌)添加LB半固体培养基中(终菌浓度为10⁶CFU/mL)，摇匀后倒入放有牛津杯的琼脂平板上，含指示菌的培养基没过牛津杯四分之一位置。待半固体培养基凝固后，取出牛津杯，半打开平板盖子，放置于无菌操作台中0.5h，使水分挥发。用移液器吸取纯化后的细菌素100μL到平板的牛津杯孔中，在37℃下静置培养过夜，并观察抑菌效果，并测量抑菌圈直径。

2.7统计分析

每个试验做3次平行试验，试验数据以“平均值±标准方差”表示。

3结果与分析

3.1发酵乳杆菌SHY10生长及其抑菌物质的生长曲线

由图4可知，发酵乳杆菌SHY10在0-4h，处于延滞期，生长缓慢；6-24h为指数期，生长快速；24h后发酵乳杆菌SHY10不再生长，趋于稳定状态。0-8h发酵乳杆菌SHY10没有细菌素产生，12-20h这段时间发酵乳杆菌SHY10产的细菌素逐渐增多，在20h达到峰值。3.2细菌素粗提物的抑菌效果

由表2可知，80％饱和度硫酸铵的沉淀溶液的抑菌活性最强，并远高于另外3个饱和度硫酸铵沉淀，故取80％饱和度硫酸铵的沉淀溶液进行后续的分离纯化。

表2不同饱和度硫酸铵沉淀的抑菌直径

3.3发酵乳杆菌SHY10产细菌素的纯化

发酵乳杆菌SHY10的发酵上清液经80％饱和度硫酸铵沉淀，经适当稀释，过SP阳离子柱分离曲线如图5A所示。收集1mol/LNaCl洗脱峰，向其中加入硫酸铵后上Octyl疏水柱分离，分离曲线如图5B，出现一个洗脱峰。收集该峰冻干浓缩后上凝胶柱分离，出现三个峰，其中箭头所指的峰具有抑菌活性，如图5C所示。收集该抑菌峰，使用R-HPLC进一步分离分析，分离图谱如图5D所示，在5.876min出现的一个峰具有较强抑菌活性，而在该峰前面的两个小峰无抑菌活性。因此该峰对应的物质就是发酵乳杆菌SHY10产的细菌素。

3.4细菌素的结构鉴定

经过反相高效液相色谱纯化的细菌素样品，通过LC-MS/MS系统进行分析，共鉴定出3种细菌素(见图6)，其分子量分别为737.4384Da、1106.5782Da、1333.6572Da。根据肽质谱图中序列离子的通用命名法，通过Peaks Studio 10.0推断出L.fermentum SHY10细菌素A由6个氨基酸组成，其氨基酸序列为KKLYAN(如SEQ ID No.2所示)；L.fermentum SHY10细菌素B由10个氨基酸组成，其氨基酸序列为NQGPLGNAHR(如SEQ ID No.3所示)；L.fermentumSHY10细菌素C由14个氨基酸组成，其氨基酸序列为GPSGPKGPSGPMYT(如SEQ ID No.4所示)。将所得的三个序列提交到APD数据库比对，发现L.fermentum SHY10细菌素A最相似的抗菌肽是PGLa-H，相似性只有40％；与L.fermentum SHY10细菌素B最相似的抗菌肽是Peptide-2，相似性只有46.15％；与L.fermentum SHY10细菌素C最相似的细菌素是PlantaricinGZ1-27，相似性只有46.66％。结果表明，发酵乳杆菌SHY10产生的细菌素是3种新型细菌素。

3.5细菌素的抑菌活性

由表3可知，纯化后的细菌素对常见的食源性致病菌和食品腐败菌都具有抑制作用。细菌素对革兰氏阳性菌单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌、沙门氏菌均具有较强活性(抑菌直径≥12mm)。但对植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、消化乳杆菌等乳酸菌无抑制作用。

表3纯化后的细菌素对不同指示菌的抑菌活性

将菌株SHY10于2020年1月送中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)进行保藏，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏日期为2020年1月13日，保藏编号为CCTCC NO：M 2020042，分类名为发酵乳杆菌SHY10 Lactobacillusfermentum SHY10。

实施例3、发酵乳杆菌SHY10在抑制发酵食品中白膜生长的应用

1实验材料

实验菌株为发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)SHY10。

近平滑假丝酵母，分离自产白膜的泡菜水中。

2实验方法

2.1发酵乳杆菌SHY10对白膜形成量的测定

近平滑假丝酵母于YPD液体培养基中25℃培养18h，发酵乳杆菌SHY10于MRS肉汤中37℃培养12h，备用。取上述1mL近平滑假丝酵母菌液于48孔细胞板培养(对照组)；取0.5mL发酵乳杆菌SHY10和0.5mL近平滑假丝酵母菌液于细胞板中(实验组)。37℃和25℃下培养，于24、48、72h采用结晶紫染色法测定其白膜形成量。做3次平行试验，试验数据以“平均值±标准方差”表示。

3结果与分析

3.1发酵乳杆菌SHY10对白膜形成量的影响

传统发酵食品中经常会发生在食品表面出现白膜，这对发酵食品的感官品质影响非常大。图7为25℃时发酵乳杆菌SHY10对近平滑假丝酵母白膜影响情况，图8为37℃时发酵乳杆菌SHY10对近平滑假丝酵母白膜影响情况，由图7和图8可知，发酵乳杆菌SHY10对近平滑假丝酵母白膜的形成量具有非常显著的抑制作用。

Claims (6)

1.一种细菌素，其特征在于：所述细菌素由氨基酸序列如SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4所示的多肽组成。

2.如权利要求1所述的细菌素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)细菌素粗提：发酵培养发酵乳杆菌SHY10，得到发酵液，发酵液离心得到上清液，采用硫酸铵盐析，沉淀用缓冲液溶解，稀释；所述发酵乳杆菌SHY10在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2020042；

(2)阳离子交换层析：稀释过后的样品进行阳离子交换层析，收集洗脱液；

(3)疏水相互作用色谱：在洗脱液中加入硫酸铵，然后通过疏水柱进一步分离，收集洗脱液；

(4)凝胶柱层析：经疏水柱纯化后的样品冻干浓缩，使用凝胶柱进一步纯化，收集洗脱液；

(5)反相高效液相色谱纯化：将上一步纯化过后的具有抑菌活性的峰使用反相高效液相色谱进行最终纯化。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中发酵液是将培养至对数期的发酵乳杆菌SHY10菌液接入MRS肉汤中，在37℃下培养得到；采用80％硫酸铵盐析，所述缓冲液为柠檬酸-磷酸盐缓冲液，溶解后用纯水将溶液电导稀释至10mS/cm以下。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：

步骤(2)中阳离子交换层析，A液是20mM的pH＝3.5的柠檬酸-磷酸盐缓冲液，B液是A中加入NaCl，NaCl浓度为1mol/L；

步骤(3)中分离所用缓冲液为：A液是含1.3mol/LNH₂SO₄的20mM的柠檬酸-磷酸盐缓冲液，pH＝4，B液是A液中不加入NH₂SO₄；

步骤(4)中纯化条件：A液：超纯水+0.1％(v/v)三氟乙酸，B液：乙腈+0.1％三氟乙酸；梯度洗脱程序：0-4min，10％B；4-33min 10％-100％B；33-38min，100％B；38-43min，100％-0％B。

5.权利要求1所述的细菌素在食品生产中抑菌或制备抗菌药物中的应用，其特征在于：所述菌为单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌和/或沙门氏菌，其中，所述细菌素在食品生产中抑制食品中的致病菌和食品腐败菌。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述食品为发酵食品。