CN117683675A - 一种产细菌素的植物乳杆菌w3-2、细菌素及其应用 - Google Patents

一种产细菌素的植物乳杆菌w3-2、细菌素及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种产细菌素的植物乳杆菌W3‑2、细菌素及其应用，属于细菌素制备技术领域。本发明提供的植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)W3‑2，于2022年08月29日保藏于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO：25611。本发明对植物乳杆菌W3‑2的发酵液依次进行有机溶剂提取、Sephadex凝胶层析、R‑HPLC分离纯化得到单一抑菌活性组分细菌素，经质谱分析该细菌素分子量为618.26KDa，氨基酸序列为AVEEE。本发明的细菌素具有抑菌能力强、抑菌谱宽、稳定性高等优点。

Description

一种产细菌素的植物乳杆菌W3-2、细菌素及其应用
技术领域
本发明涉及细菌素制备技术领域，尤其涉及一种产细菌素的植物乳杆菌W3-2、细菌素及其应用。
背景技术
随着经济与社会的发展，人民群众对食品安全的要求越来越高，特别是对食品生产过程中使用各种添加剂的安全性尤为关注。食品的腐败变质以及加工过程中食源性致病菌的控制是一个迫切需要解决的问题。目前我国大量使用的还是苯甲酸及其盐、山梨酸及其盐、对羟基苯甲酸酯类等化学合成防腐剂。研究发现，这一类防腐剂对人体有一定的毒性作用，长期食用会对健康造成不利影响。
目前，乳酸菌(lactic acidbacteria,LAB)是FDA认定的食品级安全微生物，在其发酵过程中会产生有机酸、过氧化氢、乳酸菌细菌素等抑菌物质，是目前细菌素研究的主要产生菌。而乳酸链球菌细菌素(Nisin)是唯一被FAO/WHO认定为安全的允许应用在食品中的天然防腐剂，广泛应用于肉制品、果蔬制品及乳制品的防腐保鲜。
细菌素是细菌在特定的代谢途径中，通过核糖体产生的蛋白质多肽或者蛋白类复合物，抑菌活性仅限于抑制亲缘关系较近的细菌，且其产生菌具有自身免疫性。细菌素进入人体消化道后可以被消化道内各种蛋白酶消化掉，具有作用范围广、无毒性、强抗菌性、无残留等特点。现有的细菌素通常只对一类致病菌(革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌)具有明显的抑菌效果，不能同时抑制两类病菌。且对pH要求较高，在酸性环境下抑菌效果高，碱性环境时不具有抑菌活性。
因此，发现新的对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有很好的抑制作用和抑菌活性pH范围广的细菌素已成为当务之急。
发明内容
本发明的目的在于提供一种产细菌素的乳酸菌W3-2，细菌素及其制备方法和应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一株植物乳杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)W3-2，该菌株保藏于北京的中国微物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2022年08月29日，保藏编号为：CGMCC NO：25611。
本发明还提供了所述植物乳杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)W3-2生产的细菌素。
优选的，所述细菌素的分子量为618.26KDa。
优选的，所述细菌素的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明还提供了一种细菌素的纯化方法，包括以下步骤：
(1)用有机溶剂对植物乳杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)W3-2的发酵液进行萃取，收集有机溶剂部分进行凝胶层析，取凝胶层析液中具有抑菌活性的部分，得细菌素粗提物；
(2)取细菌素粗提物，进行反向高效液相色谱纯化，得到纯化的具有抑菌活性的细菌素。
优选的，所述有机溶剂为乙醇、正丁醇或乙酸乙酯。
优选的，发酵液与有机溶剂的体积比为1:1～2。
优选的，所述凝胶层析为依次进行葡聚糖G-25柱层析和羟丙基葡聚糖凝胶LH-20层析。
本发明还提供了所述植物乳杆菌W3-2发酵液中纯化提取的细菌素作为食品防腐剂的应用。
本发明对植物乳杆菌W3-2的发酵液依次进行有机溶剂提取、Sephadex凝胶层析、R-HPLC分离纯化得到单一抑菌活性组分细菌素，经质谱分析该细菌素分子量为618.26KDa，氨基酸序列为AVEEE。目前为止，在其他研究中还未有相同分子量及氨基酸序列的报道。本发明提供的细菌素具有较好的热稳定性，在121℃热处理20min之后仍然具有抑菌能力；所产细菌素具有较好抑菌活性的pH范围为2～11；抑菌能力强、抑菌谱宽，对食品中多种革兰氏阴性及革兰氏阳性致病菌均有抑制作用，具有开发新型食品防腐剂及应用的潜力。
附图说明
图1为实施例1中菌株W3-2菌落形态和镜检图，A为W3-2菌株在MRS固体培养基上培养的菌落形态，B为菌体经革兰氏染色后菌体形态；
图2为实施例1中菌株W3-2的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；
图3为实施例1中菌株W3-2的系统发育树；
图4为实施例2中W3-2无细胞发酵上清液消除有机酸和过氧化氢前后对指示菌的抑制作用；(a)为CFS对金黄色葡萄球菌的抑菌图；(b)为消除有机酸和过氧化氢后CFS对金黄色葡萄球菌的抑菌图；(c)为CFS对大肠杆菌的抑菌图；(d)为消除有机酸和过氧化氢之后CFS对大肠杆菌的抑菌图；
图5为实施例3中Sephadex凝胶层析中Sephadex G-25凝胶图谱；
图6为实施例3中Sephadex凝胶层析中Sephadex G-25层析后对应的收集管；
图7为中Sephadex凝胶层析中Sephadex LH-20凝胶图谱；
图8为中Sephadex凝胶层析中Sephadex LH-20的层析后对应的收集管；
图9为实施例3中R-HPLC纯化图谱；
图10为实施例3中plantaricinW3-2的一级质谱图；
图11为实施例3中plantaricinW3-2的二级质谱图；
图12为实施例4中温度对细菌素抑菌作用的影响曲线图；
图13为实施例4中温度对细菌素抑菌作用的平板结果；
图14为实施例6中PlantaricinW3-2处理前后大肠杆菌(a)和金黄色葡萄球菌(b)生长结果；
图15为实施例6中PlantaricinW3-2处理前后大肠杆菌扫描电镜，A：PlantaricinW3-2处理前大肠杆菌扫描电镜；B：PlantaricinW3-2处理后大肠杆菌扫描电镜；
图16为实施例6中PlantaricinW3-2处理前后金黄色葡萄球菌扫描电镜，A：PlantaricinW3-2处理前金黄色葡萄球菌扫描电镜；B、C：PlantaricinW3-2处理后金黄色葡萄球菌扫描电镜。
保藏说明
植物乳杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)W3-2，该菌株保藏于北京的中国微物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2022年08月29日，保藏编号为：CGMCC NO：25611。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
菌株W3-2的鉴定
1.1菌落形态观察
将菌株W3-2以2％(v/v)的接种量接入到新鲜MRS液体培养基中，37℃恒温静置培养24h，传代活化三次，使用无菌生理盐水进行梯度稀释后涂布于MRS固体平板中，37℃静置培养24h，观察菌落形态。W3-2菌株在MRS固体培养基上培养的菌落形态如图1(A)所示，由图1(A)可知：W3-2菌落中等大小，凸起，乳白色，边缘整齐，菌落呈圆形。
1.2革兰氏染色
(1)制片，取少量无菌水于载玻片上，接种环挑取单个菌落与载玻片上的无菌水混合均匀，酒精灯加热固定。
(2)涂片固定后滴加结晶紫染色液，染色1min，流动水小心冲洗，避免水流直接冲洗菌落。
(3)滴加革兰氏碘液，作用1min，流动水小心冲洗。
(4)滴加脱色酒精，30s左右，即当在整个涂片上涂满脱色酒精后，立即冲洗，再次在涂片上滴加脱色酒精，脱色10s左右，流动水小心冲洗。
(5)滴加沙黄复染液，复染1min，流动水冲洗，晾干。
(6)油镜观察。
菌体经革兰氏染色后菌体形态如图1(B)所示。由图1(B)可知：W3-2革兰氏染色呈阳性，单个或成链排列，杆状，无芽孢。
1.3生理生化鉴定
筛选到的菌株参考《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》和《伯杰氏系统细菌学手册》进行以下几方面的生理生化鉴定。
(1)产硫化氢能力检测将菌株活化完全后继续培养至对数生长期，2％的接种量接种于装有硫化氢培养基的试管，试管中悬挂有经过乙酸铅浸泡后且灭菌烘干的滤纸条，滤纸条下端靠近培养基液面但不接触，37℃培养24h，滤纸条变为黑色为阳性反应，无黑色则为阴性反应。
(2)运动能力检测将培养至对数生长期的菌种穿刺接种于PYG半固体培养基，37℃培养24h，观察穿刺线菌株生长情况，只有穿刺接种线上有菌株生长为无运动性，穿刺线周围有片状菌株生长或向穿刺线外扩散则为有运动性。
(3)葡萄糖产气检测将培养至对数生长期的菌种接种到葡萄糖产气培养基中，在试管中倒置放入一根小倒管，确保导管内无气泡，37℃培养24h，小倒管有气泡为产气，小倒管无气泡则为不产气。
(4)葡萄糖酸盐产酸检测使用生化鉴定管检测，将菌株接种到生化鉴定管中，37℃培养36h，培养后加班氏试剂4滴，隔水煮沸数分钟后观察结果，黄色或橙色为阳性反应，不变色为阴性反应。
(5)明胶水解试验使用生化鉴定管检测，挑取新鲜菌苔穿刺接种到生化鉴定管中，竖立培养，培养后置于4℃冰箱30min后观察结果。如果培养24h不液化，则继续培养到48h再观察，4℃液化为阳性反应，4℃不液化则为阴性反应。
(6)碳水化合物发酵试验使用生化鉴定管检测，将培养至对数生长期的菌种接种于葡萄糖生化鉴定管、果糖鉴定管、半乳糖生化鉴定管、麦芽糖生化鉴定管、乳糖生化鉴定管、山梨糖生化鉴定管、蔗糖生化鉴定管、阿拉伯糖生化鉴定管、蜜二糖生化鉴定管、纤维二糖生化鉴定管、鼠李糖生化鉴定管、甘露醇生化鉴定管、山梨醇生化鉴定管、七叶苷生化管、甘露糖生化鉴定管的15管中，37℃培养24h，西林瓶内变为黄色为阳性反应，出现紫色则为阴性反应。
结果如表1所示。
表1菌株W3-2理生化鉴定结果
注：“+”表示阳性；“-”表示阴性。
由表1可知，菌株W3-2硫化氢、运动能力、葡萄糖产气、明胶水解试验中结果呈阴性，说明菌株W3-2在发酵过程中没有代谢产生明胶酶、硫化氢的能力，也没有运动性，能够发酵葡萄糖产酸但是不能产气；能发酵葡萄糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、乳糖、山梨糖、蔗糖、阿拉伯糖、蜜二糖、纤维素二糖、鼠李糖、甘露醇、七叶苷，但是不能发酵利用山梨醇。根据形态学特征以及生理生化鉴定试验，可以初步判定菌株W3-2为乳杆菌属。
1.416S rRNA基因序列分析
(1)细菌基因组DNA提取
将菌株W3-2活化后以2％(v/v)接种比例接种于新鲜MRS液体培养基，37℃静置培养12h；在4℃条件下10000r/min离心15min，弃去发酵上清液取菌泥，使用无菌水洗涤后相同条件下再次离心，重复三次后用细菌基因组DNA提取试剂盒对乳酸菌的基因组DNA进行提取，操作流程按照试剂盒说明进行。
(2)细菌基因组PCR扩增
PCR扩增引物采用乳酸菌基因组DNA通用引物，由上海派森诺有限公司合成。27F：5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇；1492R：5＇-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3＇；PCR扩增反应体系如下：
表2PCR扩增反应体系和PCR扩增反应程序
PCR扩增反应体系如下：
PCR扩增反应程序：
共进行35个循环，反应完成后，取3μL PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图2，PCR扩增产物条带清晰明亮，16S rRNA基因序列长度为1500bp左右。
为了确认PCR扩增片段，将扩增的PCR产物用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收，具体操作按试剂盒说明书进行。取纯化后的PCR产物，使用测序仪ABI3730-XL进行DNA测序。结果显示菌株W3-2的16S rRNA基因序列长度为1466bp，如SEQ ID NO：1所示。
(3)系统发育树的构建
将所测16S rRNA基因序列(SEQ ID NO：1)提交到NCBI数据库，用BLAST工具进行序列的同源性分析，并通过MEGA6软件构建系统发育树。(见图3)，与大多数已公布的植物乳杆菌的同源性为99％以上，结合形态学特征与16S rRNA基因序列分析可知：菌株W3-2为植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)。
实施例2
1、消除有机酸的抑菌作用之后W3-2发酵液对指示菌的抑制作用
乳酸菌在发酵过程中会产生有机酸、过氧化氢、细菌素等物质，从而抑制其他菌株的生长。其中，有机酸通过中和其电化学电位并增加其渗透性作用于细胞质膜，从而导致抑菌作用并最终导致易感细菌死亡。因此，需要消除发酵液中的有机酸的影响。
W3-2发酵液的制备：将菌株W3-2接种在MRS培养基中，37℃恒温培养24h，传代活化三次，4℃、10000r/min条件下离心18min，去除沉淀，收集上清液，0.22μm滤菌膜过滤上清液，除去残留菌体和杂质，将所得无细胞发酵上清液(CFS)4℃保存备用。
前期乳酸实验已经表明当pH为6时没有抑菌作用，因此，加入2mol/L的NaOH，直至CFS的pH为6，中和发酵液中的有机酸(乳酸)。以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为指示菌，采用双层琼脂扩散法进行抑菌试验。并设pH＝6的乳酸溶液作为对照，以排除发酵液中有机酸的抑菌作用。
具体为采用双层琼脂扩散法，在无菌培养平皿上倒入20mL已灭菌的2％(v/v)素琼脂，待其充分冷却凝固后放入灭菌后的牛津杯数个，摆放均匀，将指示菌稀释到10-9CFU/mL浓度，取其菌悬液与冷却到50℃左右的营养肉汤培养基混匀，使其指示菌最终浓度为10- 7CFU/mL，取20mL加入到放有牛津杯的平板上，完全凝固之后用无菌镊子取出牛津杯，在形成的孔洞中加入200μL CFS或pH＝6的乳酸溶液，置于4℃冰箱扩散5h之后37℃静置培养12h，用游标卡尺采用十字交叉法测量抑菌圈直径。
结果如表3所示。由表3可知，对照组pH＝6的乳酸溶液对指示菌的生长没有抑制作用，W3-2的无细胞发酵上清液(CFS)调pH＝6后对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌直径分别为17.54±0.06mm和16.68±0.04mm，表明在菌株W3-2的CFS中，还存在其它抑菌物质(过氧化氢或细菌素)。
表3消除有机酸抑菌作用之后对指示菌具有抑菌作用的菌株
注：表中结果均进行三次平行取平均值±标准差，“-”表示无抑菌作用；一列内的不同字母表示平均值之间的差异有统计学意义(p<0.05)。
2、消除有机酸和过氧化氢的抑菌作用之后W3-2发酵液对指示菌的抑制作用
过氧化氢抑菌作用效果的排除：采用实施例2的方法，将CFS的pH值调至6(中和了有机酸)，使用PBS配制2mg/mL的过氧化氢酶溶液，将酶液与pH＝6的CFS按照1:1的体积例混合均匀，37℃水浴3h，以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为指示菌，采用双层琼脂扩散法检测处理后发酵液的抑菌活性。
结果如图4所示，图4中(a)为CFS对金黄色葡萄球菌的抑菌图；(b)为消除有机酸和过氧化氢后CFS对金黄色葡萄球菌的抑菌图；(c)为CFS对大肠杆菌的抑菌图；(d)为消除有机酸和过氧化氢之后CFS对大肠杆菌的抑菌图。由图4可知，消除有机酸和过氧化氢的CFS，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌直径仍在16mm以上，由此可知，W3-2的CFS中的主要抑菌物质也不是过氧化氢。
3、在上一步中制备的消除了有机酸、过氧化氢的W3-2无细胞发酵上清液的基础上进一步分别添加胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K处理后，按照三种酶的最适酶解pH分别将消除了有机酸、过氧化氢的W3-2无细胞发酵上清液调节为pH＝7(胰蛋白酶)、pH＝7(蛋白酶K)和pH＝2.5(胃蛋白酶)(调解pH所用试剂为6mol/L的HCL)。然后等体积比例混合，使各酶的终浓度为1.0mg/mL，37℃恒温水浴4h，沸水中5min使各酶活性丧失。将上述酶解处理后的CFS按照实施例2的操作以金黄色葡萄球菌对实验对象进行抑菌实验，结果见表4。
表4蛋白酶处理对发酵液抑菌作用的影响
由表4可知，W3-2的CFS调pH＝6和经过氧化氢酶处理后，再经胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K处理后，CFS抑菌活性下降，初步确定W3-2的CFS中的抑菌物质为蛋白类物质，即细菌素。
实施例3
1、细菌素粗提
将乙醇、正丁醇、乙酸乙酯分别与CFS按照体积比1:1、2:1的比例混合均匀(具体参见表5)，置于摇床37℃，100r/min反应3h，取出室温下静置12h出现明显的分界线后收集上层有机相。将有机相于55℃条件下蒸干，5ml的pH＝5.5的PBS复溶，以pH＝5.5的PBS为对照，以金黄色葡萄球菌为指示菌，实施例2中的双层琼脂扩散法检测各有机溶剂萃取后的抑菌活性，以选取最优的萃取方法。
比较三种有机溶剂不同的比例萃取细菌素结果，如表5所示，pH＝5.5的PBS对指示菌的生长没有抑制作用；相同比例的乙醇、正丁醇、乙酸乙酯中，乙酸乙酯的抑菌直径优于其他有机溶剂，且在乙酸乙酯:CFS为2:1时的抑菌直径最大。因此，采用乙酸乙酯作为细菌素的提取溶剂。
表5不同有机溶剂提取细菌素的抑菌活性
2、Sephadex凝胶层析
乙酸乙酯与植物乳杆菌W3-2的CFS按2:1的体积比混合均匀，置于摇床37℃，100r/min反应3h，取出室温下静置12h使有机相与CFS出现明显的分界线。收集上层有机相于55℃条件下蒸干，5ml的pH＝5.5的PBS复溶，得到粗样品，粗样品经0.22μm滤菌膜过滤，上样于Sephadex G-25凝胶层析柱中(1.5cm×80cm)，以pH＝5.5超纯水为流动相，0.5mL/min流速进行洗脱，使用自动收集装置收集各馏分。
结果如图5、6所示。Sephadex G-25纯化过程中共出现四个洗脱峰，经验证只有第二个是抑菌活性洗脱峰(图5)，对应于收集管中的第59至70管(图6)，其他三个杂峰对金黄色葡萄球菌的生长没有抑制作用。将活性洗脱峰对应的第59至70管活性成分合并浓缩15倍，取2mL上样于Sephadex LH-20凝胶层析柱中(1.5cm×80cm)，以80％甲醇溶液为流动相，0.25mL/min流速进行洗脱，使用自动收集装置收集各馏分。
结果如图7、8所示。由图可知，Sephadex LH-20纯化之后只有一个洗脱峰(图7)，且在第44至52管洗脱出单个抑菌活性峰(图8)，说明此时的细菌素样品中已无明显杂质。合并活性峰(第44至52管洗脱成分)进行全波长扫描，在220nm处有最大吸收峰，故选取此波长作为下一步纯化的检测波长。
3、RP-HPLC纯化
将Sephadex LH-20层析出的活性馏分经0.22μm滤菌膜过滤，使用反向高效液相色谱继续纯化，纯化条件：C18柱(4.6mm×250mm)，流动相A：85％水，15％乙腈(含有0.07％的三氟乙酸)，梯度：35min内100％A，流速：1ml/min。
结果如图9所示，由图9可知反向高效液相色谱(RP-HPLC)纯化后共出现五个吸收峰，除了5.578min处是抑菌活性洗脱峰外，其他洗脱峰均无抑菌效果，故收集此活性峰进行下一步分析。
4、细菌素结构鉴定
将经过RP-HPLC纯化保留时间为5.578min的抑菌活性洗脱峰收集浓缩15倍，使用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)进行质谱分析，在LC-MS/MS分析前，使用5ml的0.1％甲酸重悬多肽并注入C18柱(150μm×15cm,1.9μm)。流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：20％0.1％甲酸水溶液-80％乙腈，流速：600nL/min。在m/z 300-1800的全扫描正离子模式下获得一级质谱光谱，见图10。由一级质谱图可知该活性组分分子量为618.26Da，并将其细菌素命名为plantaricinW3-2。
将618.26Da的质谱峰继续进行Denovo分析，最后得到二级质谱图，如图11，在二级谱中，母离子与惰性气体碰撞，使得肽链中的肽键断裂，形成一系列子离子，即N端碎片离子(B系列)和C端碎片离子(Y系列)，最后推导出整个氨基酸序列为AVEEE(如SEQ ID NO.2所示)。由此可知，plantaricinW3-2是由五个氨基酸组成的活性多肽。目前为止，在其他研究中还未有相同分子量及氨基酸序列的细菌素的报道，属于新型细菌素。
推导完成之后对所推导的序列进行了反推合成，并对氨基酸序列为AVEEE的五肽进行抑菌试验，指示菌为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，利用双层琼脂扩散法进行抑菌验证，其中当五肽浓度为1mg/ml时，对指示菌浓度为10-7CFU/ml的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌直径分别为14.84±0.12mm，14.68±0.18mm；然而蛋白浓度为1mg/ml的CFS对指示菌浓度为10-7CFU/ml的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌直径分别为13.21±0.10mm，12.95±0.11mm。由此证明本发明提供的氨基酸序列为AVEEE的新型细菌素具有抑菌作用。
实施例4
PlantaricinW3-2热稳定性研究结果
将实施例3中经过Sephadex LH-20纯化后的样品分别置于60℃、70℃、80℃、90℃、100℃的温度下分别处理10min和30min，121℃处理20min，冷却至室温，采用双层琼脂扩散法检测抑菌活性，以未处理的纯化后样品作为对照，对指示菌的抑菌结果如图12、13所示。
Sephadex LH-20纯化后的活性组分经60℃、70℃、80℃分别处理10min和30min后，对金黄色葡萄球菌的抑菌效果与对照组相比无明显差异；经过100℃分别处理10min和30min后，对金黄色葡萄球菌仍保留82.2％和79.7％的抑菌活性；121℃处理20min后，对金黄色葡萄球菌的抑菌活性与未处理的纯化后样品相比仅降低了26.6％，表明植物乳杆菌W3-2所产的细菌素具有较好的热稳定性。
实施例5
比较Plantaricin W3-2、Plantarum C010、plantaricin JY22三种细菌素的pH稳定性
本研究中plantaricin W3-2分子量为618.26Da，属于小分子量的细菌素(收集自实施例3中经过RP-HPLC纯化的保留时间为5.578min的抑菌活性洗脱峰对应的成分)，相似的，分离自金鲤鱼肠的植物乳杆菌JY22产生的plantaricin JY22分子量为4.1KDa(参见Purification,characterization and action mechanism of plantaricin JY22,anovel bacteriocin against Bacillus cereus producedby Lactobacillus plantarumJY22 from golden carp intestine)，分离自牛粪中的植物乳杆菌C010产生的细菌素Plantarum C010分子量为260.1161Da。(张漫敏.Lactobacillus plantarum C010产细菌素的分离纯化、抑菌特性及保鲜应用初探[D].江西农业大学,2022.DOI:10.27177/d.cnki.gjxnu.2022.000556.)。
将经过Sephadex LH-20纯化后的样品分别用1mol/L HCL和1mol/LNaOH分别将样品pH调至3、4、5、6、7、8、9、10、11，37℃水浴2h，再将pH调回6，采用琼脂扩散法检测抑菌活性，以未处理的CFS作为对照。
结果如表6所示。
表6PlantaricinW3-2、Plantarum C010、plantaricin JY22 pH稳定性
注：“-”表示没有测定数据。
根据表6可知，Plantarum C010、plantaricin JY22在pH大于6时抑菌活性为0，plantaricinW3-2在pH＝11时仍然保留64.3％抑菌活性，说明植物乳杆菌W3-2所产细菌素不但在酸性环境中抑菌效果较好，而且能在碱性环境中发挥作用。与现有的细菌素相比，植物乳杆菌W3-2所产的细菌素具有更好的pH稳定性，在pH范围为2～11时均具有抑菌活性。
实施例6
PlantaricinW3-2最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的测定
将plantaricinW3-2使用无菌PBS缓冲液进行二倍梯度稀释。将培养至对数生长期的金黄色葡萄球菌及大肠杆菌分别与不同浓度(参见表7)的细菌素样品按照1:1的体积比例混合均匀，37℃静置培养24h后。在OD600处检测大肠杆菌和金黄色葡萄球菌与各浓度细菌素混合前后的吸光度，以检测plantaricinW3-2对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度。
将指示菌与不同浓度(参见表7)细菌素按照体积比1:1混合培养(37℃静置培养24h后)后，每个浓度取100μL涂布于营养肉汤固体培养基，37℃分别静置培养24h和48h。观察指示菌生长情况，以检测plantaricin W3-2对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小杀菌浓度。
结果如图14、15和表7所示。
表7不同浓度PlantaricinW3-2对指示菌抑制作用
由图14(a)可知，在plantaricin W3-2稀释倍数在1～5倍时，培养前OD值均大于培养后OD值，菌体数量没有增加，说明大肠杆菌在此时的细菌素浓度下生长被抑制，当plantaricinW3-2稀释倍数为6时，培养后的OD值远高于培养前，菌体数量迅速增加，OD值急剧上升，说明大肠杆菌在此细菌素浓度下生长没有被限制。由表7可知，取大肠杆菌与不同浓度细菌素混合培养后的样品进行涂布培养，当培养24h后，细菌素稀释倍数为6，浓度为0.053mg/mL时涂布有大肠杆菌的培养皿中才有菌体长出，继续将大肠杆菌与不同浓度细菌素混合后涂布的培养皿培养至48h，结果发现细菌素浓度小于0.213mg/mL的培养皿均有大肠杆菌长出，说明小于此浓度的细菌素只是暂时抑制了大肠杆菌的生长，并没有将大肠杆菌杀死，而浓度在0.425mg/mL以上的细菌素处理过的大肠杆菌培养48h后均未有菌落长出，说明此浓度的细菌素可能导致大肠杆菌死亡。
金黄色葡萄球菌与不同浓度细菌素混匀之后生长结果如图14(b)，与大肠杆菌结果相似，金黄色葡萄球菌在plantaricinW3-2稀释倍数在1～5倍时，菌体数量并没有增加，此时金黄色葡萄球菌的生长被抑制，而当细菌素进行了6倍稀释与金黄色葡萄球菌混合培养后的OD值明显高于培养前，说明在混合培养时金黄色葡萄球菌菌体数量快速增加，菌株的生长没有受到细菌素的影响。由表7金黄色葡萄球菌生长情况可得，细菌素浓度为0.053mg/mL时与金黄色葡萄球菌混合培养后再涂布培养24h后，培养皿中有菌体长出，在细菌素浓度大于0.106mg/mL的混合培养液中，涂布后菌没有菌落长出，说明金黄色葡萄球菌的生长被此浓度下的细菌素所抑制。将各浓度细菌素混合培养液涂布后的培养皿继续培养至48h时，细菌素浓度大于0.425mg/mL的培养皿中仍然没有菌落长出，而下一梯度培养皿中金黄色葡萄球菌的生长没有受到细菌素的限制，说明在细菌素浓度为0.425mg/mL处理后的金黄色葡萄球菌已失去活性。
综上所述，结合plantaricinW3-2处理前后指示菌生长结果与不同浓度plantaricinW3-2对指示菌的抑制作用可得，plantaricinW3-2对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度均为106μg/mL，最低杀菌浓度为425μg/mL。
PlantaricinW3-2的抑菌方式
将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌培养至对数生长期，加入plantaricin W3-2，使其浓度达到各自的最小杀菌浓度，以未处理的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为对照，37℃静置培养过夜，4℃、10000r/min，离心15min，取菌沉淀，使用无菌水清洗后再次离心取沉淀，重复清洗三次后，加入含有2.5％戊二醛，100mM磷酸盐的电镜固定液，4℃固定过夜，送样于武汉赛维尔生物科技有限公司进行扫描电镜观察培养后指示菌细胞表面的变化。
plantaricinW3-2处理前后的大肠杆菌扫描电镜如图15，由图15(A)可知，未经plantaricinW3-2处理的大肠杆菌具有典型的杆状及具有完整且光滑的表面，相比之下，经最低杀菌浓度的细菌素处理后的大肠杆菌细胞表面变形、凹陷、皱缩、结构塌陷，有的细胞表面还有小的凸起(图15(B))。表明plantaricinW3-2可能是破坏了大肠杆菌细胞膜完整性，并能够溶解部分细胞，从而抑制了大肠杆菌的正常生长。
PlantaricinW3-2处理前后的金黄色葡萄球菌扫描电镜如图16，由图16(A)可知，未经plantaricinW3-2处理的金黄色葡萄球菌细胞饱满、表面光滑、具有完整的细胞膜。由图16(B)可知，经过plantaricinW3-2处理后的金黄色葡萄球菌细胞表面出现不规则性状，有些出现凹陷、粘连，由图16(C)可知，细菌素导致金黄色葡萄球菌细胞表面出现破裂，破坏了其细胞膜的完整性，说明细菌素plantaricinW3-2可能会导致金黄色葡萄球菌细胞破裂导致细胞内容物泄漏从而导致菌体死亡。
细菌素结构的不同导致其功能和作用有很大差异，然而，目前研究表明，细胞膜通透性对细菌素的作用模式起着非常重要的作用。在本发明中，plantaricinW3-2导致指示菌细胞表面凹陷、粘连、细胞膜被破坏及细胞表面出现孔洞或裂痕，最终导致细胞死亡。
plantaricinW3-2抑菌谱
将食品中常见的致病菌(革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、藤黄微球菌，革兰氏阴性菌：铜绿假单胞菌、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、变形杆菌)作为指示菌，检测植物乳杆菌W3-2细菌素(plantaricinW3-2)的抑菌性能，结果见表8。由表8可知，plantaricinW3-2对金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、蜡样芽胞杆菌的抑菌直径均大于28mm，对于其他革兰氏阳性菌的抑菌直径也都大于21mm；对沙门氏菌、志贺氏菌、变形杆菌等革兰氏阴性菌的抑制直径基本在20～23mm之间，可见植物乳杆菌W3-2所产的细菌素plantaricinW3-2具有广谱的抑菌活性，对兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有抑菌效果。
表8细菌素对各种指示菌的抑菌活性
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一株植物乳杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)W3-2，该菌株保藏于北京的中国微物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2022年08月29日，保藏编号为：CGMCCNO：25611。
2.一种利用权利要求1所述植物乳杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)W3-2生产的细菌素。
3.如权利要求2所述的细菌素，其特征在于，所述细菌素的分子量为618.26KDa。
4.如权利要求2或3所述的细菌素，其特征在于，所述细菌素的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。
5.一种权利要求2～4任一项所述的细菌素的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)用有机溶剂对植物乳杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)W3-2的发酵液进行萃取，收集有机溶剂部分进行凝胶层析，取凝胶层析液中具有抑菌活性的部分，得细菌素粗提物；
(2)取细菌素粗提物，进行反向高效液相色谱纯化，得到纯化的具有抑菌活性的细菌素。
6.如权利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙醇、正丁醇或乙酸乙酯。
7.如权利要求6所述的提取方法，其特征在于，所述发酵液与有机溶剂的体积比为1～2:1。
8.如权利要求7所述的提取方法，其特征在于，所述凝胶层析为依次进行葡聚糖G-25柱层析和羟丙基葡聚糖凝胶LH-20层析。
9.权利要求2～4任一项所述的细菌素或权利要求5～8任一项所述的提取方法纯化的细菌素作为食品防腐剂的应用。
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