CN116437912A - 自噬激活剂 - Google Patents

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Abstract

含有抗坏血酸衍生物或其盐作为有效成分的自噬激活剂，以及含有该自噬激活剂和药学上可接受的载体的自噬激活用组合物。

Description

自噬激活剂
技术领域
本发明涉及自噬激活剂和自噬激活用组合物。
本申请基于2020年9月17日在日本提出了申请的日本特愿2020-156457号主张优先权，将其内容引用到本说明书中。
背景技术
自噬(autophagy)是应答饥饿、生长因子缺乏、和病原体感染等细胞外或细胞内的胁迫和信号，通过分解老化或受到损伤的细胞内物质和细胞器，从而进行能量的再生产和损伤物质的除去的机制，对于正常细胞的稳态维持是重要的。由过去的研究报告了，老化越进展则细胞内的自噬活性越急剧减少(非专利文献1)。另外，在抑制了自噬的情况下，老化线粒体、错误折叠的蛋白质等在细胞内过度蓄积，细胞内的氧化胁迫增加，从而细胞死亡被诱导，作为结果细胞衰老。
因此，通过激活分解细胞内的老化的物质和细胞器、再循环其分解产物的自噬，能够通过迅速除去细胞内的废弃物而提高细胞的稳态。
另一方面，作为老化对自噬的影响，已知在人脑中随着年龄增长而ATG5、ATG7、和Beclin 1基因的表达量降低。另外，认为在阿尔茨海默病等神经变性疾病中自噬的活性降低。因此，已知自噬的激活有助于阿尔茨海默病、以及亨廷顿病、帕金森病等神经变性疾病的治疗和预防(非专利文献2、3)。特别是在阿尔茨海默病中自噬的功能被阻碍，因而被称为β-淀粉样蛋白的凝集蛋白质在生物体内蓄积，据说这与发病相关(非专利文献4)。另外，据说自噬相关基因、参与选择性自噬的基因的突变对于作为伴随着脑的黑质和苍白球中的铁沉积和大脑萎缩的神经变性疾病的SENDA病(SENDA：static encephalopathy ofchildhood with neurodegeneration in adulthood(儿童期静态性脑病成年期神经变性))、作为在消化道引起严重的炎症或溃疡的炎症性肠疾病的克罗恩病、和癌也有影响(非专利文献5)。
自噬的过程被在酵母和哺乳类的双方中进行了研究，最大36种蛋白质被利用。其中从自噬体的形成到其内容物的分化被由自噬相关基因(ATG)编码的Atg蛋白质控制，可以分类为包含Atg12-Atg5结合系统、LC3-Phosphatidyl Ethanolamine(LC3-磷脂酰乙醇胺，PE)结合系统在内的6组，分别在各过程中阶段性地发挥作用。
作为自噬激活剂，报告了增加了作为自噬的活性状态的标志物的LC3相关的因子而激活自噬的化合物、和促进自噬通量(包括自噬体向溶酶体的融合)的化合物(专利文献1～4)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2018/173653号
专利文献2：日本特开2018-80204号公报
专利文献3：日本特表2018-510902号公报
专利文献4：日本特表2019-529514号公报
非专利文献
非专利文献1：Yogendra S.Rajawat et al.，Aging：Central role forautophagy and the lysosomal degradative system.Ageing Research Reviews 8(2009)199-213.
非专利文献2：Aaron Barnett et al.，Autophagy in Aging and Alzheimer′sDisease：Pathologic or Protective？.J Alzheimers Dis.2011；25(3)：385-394.
非专利文献3：Marta M.Lipinski et al.，Genome-wide analysis revealsmechanisms modulating autophagy in normal brain aging and in Alzheimer′sdisease.Proc Natl Acad Sci USA.2010，107，14164-14169.
非专利文献4：Xiangqing Li et al.，Cubeben induces autophagy via PI3K-AKT-mTOR pathway to protect primary neurons against amyloid beta inAlzheimer′s disease.Cytotechnology(2019)71：679-686.
非专利文献5：荫山等，“オ一トフアジ一と疾患(自噬与疾病)”、領域融合レビユ一(领域融合综述)，2014年，3，e006
发明内容
发明要解决的课题
如上所述，已知在阿尔茨海默病等各种疾病中自噬功能降低，要求能够有效地激活自噬的药剂。然而，可以说现有已知的药剂其效果尚不充分。
因此，本发明的目的是提供能够有效地激活自噬的自噬激活剂、和含有所述自噬激活剂的自噬激活用组合物。
用于解决课题的手段
本发明包含以下方案。
(1)自噬激活剂，含有抗坏血酸衍生物或其盐作为有效成分。
(2)根据(1)所述的自噬激活剂，所述抗坏血酸衍生物或其盐是选自抗坏血酸磷酸酯、抗坏血酸磷酸酯的脂肪酸酯、乙基抗坏血酸、和抗坏血酸葡糖苷中的至少1种抗坏血酸衍生物或其盐。
(3)根据(2)所述的自噬激活剂，所述抗坏血酸衍生物或其盐是抗坏血酸磷酸酯的脂肪酸酯或其盐。
(4)根据(3)所述的自噬激活剂，所述抗坏血酸磷酸酯的脂肪酸酯或其盐是抗坏血酸磷酸酯的棕榈酸酯或其盐。
(5)根据(1)～(4)的任一项所述的自噬激活剂，含有所述抗坏血酸衍生物的盐作为有效成分，所述抗坏血酸衍生物的盐是抗坏血酸衍生物的镁盐或钠盐。
(6)根据(1)～(5)的任一项所述的自噬激活剂，该自噬激活剂促进LC3基因的表达。
(7)根据(1)～(6)的任一项所述的自噬激活剂，该自噬激活剂促进LC3基因、ATG5基因、ATG7基因、和Beclin 1基因的表达。
(8)根据(1)～(7)的任一项所述的自噬激活剂，该自噬激活剂用于阿尔茨海默病的预防或治疗。
(9)自噬激活用组合物，含有(1)～(8)的任一项所述的自噬激活剂和药学上可接受的载体。
(10)根据(9)所述的自噬激活用组合物，所述抗坏血酸衍生物或其盐的合计含量相对于自噬激活用组合物总量为0.05～15质量％。
发明的效果
根据本发明，可以提供能够促进选自LC3基因、ATG5基因、ATG7基因、和Beclin 1基因中的至少1种基因的表达，有效地激活自噬的自噬激活剂，以及含有所述自噬激活剂的自噬激活用组合物。
具体实施方式
(自噬激活剂)
本实施方式的自噬激活剂含有抗坏血酸衍生物或其盐作为有效成分。
这里所谓“自噬(autophagy)”，是通过分解老化或受到损伤的细胞内物质和细胞器而进行能量的再生产和损伤物质的除去的机制。
本实施方式的自噬激活剂能够促进作为自噬标志物的LC3基因、以及自噬体所包含的ATG5基因、ATG7基因、和Beclin 1基因的表达，能够激活自噬。
<抗坏血酸衍生物或其盐>
作为本实施方式的自噬激活剂中的抗坏血酸衍生物，可列举将抗坏血酸的至少1个羟基衍生化了的抗坏血酸衍生物。
作为所述抗坏血酸衍生物，更具体地，可列举使抗坏血酸的任意羟基磷酸酯化而得的抗坏血酸磷酸(也称为抗坏血酸磷酸酯)；使抗坏血酸的任意羟基磷酸酯化、用脂肪酸使其他羟基酯化而得的抗坏血酸磷酸酯的脂肪酸酯；使抗坏血酸的任意羟基乙氧基化而得的乙基抗坏血酸；使抗坏血酸的任意羟基葡糖苷化而得的抗坏血酸葡糖苷；使抗坏血酸的任意羟基酰基化而得的酰基化抗坏血酸；使抗坏血酸的任意羟基酰基化、使其他羟基磷酸酯化而得的酰基化抗坏血酸磷酸酯；将抗坏血酸的任意羟基用甘油置换而得的抗坏血酸甘油酯；隔着磷酸分别通过酯键结合了抗坏血酸和生育酚的抗坏血酸与生育酚的磷酸二酯(具体为d1-α-生育酚2-L-抗坏血酸磷酸二酯等)等。
作为抗坏血酸衍生物的盐，可列举例如，抗坏血酸衍生物与无机碱的盐、抗坏血酸衍生物与有机碱的盐等。
作为与无机碱的盐，可列举例如，钠盐、钾盐等碱金属盐；钙盐、镁盐等碱土金属盐；铝盐；铵盐；锌盐等。
作为与有机碱的盐，可列举例如，烷基铵盐、与碱性氨基酸的盐等。
作为本实施方式的自噬激活剂中的抗坏血酸衍生物或其盐，在上述之中，优选(i)抗坏血酸磷酸酯或其盐、(ii)抗坏血酸磷酸酯的脂肪酸酯或其盐、(iii)乙基抗坏血酸或其盐、(iv)抗坏血酸葡糖苷或其盐。
《(i)抗坏血酸磷酸酯或其盐》
·抗坏血酸磷酸酯
抗坏血酸磷酸酯是在抗坏血酸的至少1个羟基上导入了磷酸基的化合物。
作为抗坏血酸磷酸酯，适合列举下述化学式(1)所示的化合物。
下述化学式(1)所示的化合物是将抗坏血酸的2位羟基用磷酸酯保护了的抗坏血酸-2-磷酸酯。
Figure BDA0004220787980000051
抗坏血酸磷酸酯中存在D型异构体和L型异构体的立体异构体、以及作为外消旋体的DL体。本实施方式中的抗坏血酸磷酸酯可以是这些立体异构体的任意种，从获得容易性的观点考虑，优选为L型异构体，具体优选为L-抗坏血酸-2-磷酸酯。
·抗坏血酸磷酸酯的盐
作为抗坏血酸磷酸酯的盐，可列举例如，抗坏血酸磷酸酯与无机碱的盐、抗坏血酸磷酸酯与有机碱的盐等。
作为与无机碱的盐，可列举例如，钠盐、钾盐等碱金属盐；钙盐、镁盐等碱土金属盐；铝盐；铵盐；锌盐等。
作为与有机碱的盐，可列举例如，烷基铵盐、与碱性氨基酸的盐等。
作为抗坏血酸磷酸酯的盐，上述之中，优选碱金属盐或碱土金属盐，更优选钠盐或镁盐，进一步优选镁盐。
抗坏血酸磷酸酯的镁盐从稳定性高、且不易着色这样的观点考虑是优选的。
作为本实施方式的自噬激活剂中的抗坏血酸磷酸酯或其盐，在上述之中，从稳定性提高的观点考虑，优选为抗坏血酸磷酸酯的盐，更优选上述化学式(1)所示的化合物的碱金属盐、或上述化学式(1)所示的化合物的碱土金属盐，进一步优选上述化学式(1)所示的化合物的钠盐、或上述化学式(1)所示的化合物的镁盐。
上述化学式(1)所示的化合物的镁盐具体地，特别优选L-抗坏血酸-2-磷酸酯的镁盐。
上述化学式(1)所示的化合物的钠盐具体地，特别优选L-抗坏血酸-2-磷酸酯的钠盐。
本实施方式的自噬激活剂中的抗坏血酸磷酸酯或其盐可以单独使用1种，也可以2种以上联合使用。
抗坏血酸磷酸酯或其盐可以通过公知的制造方法、例如日本特开平2-279690、日本特开平6-345786所记载的方法等来制造。
例如，作为抗坏血酸磷酸酯的具体制造方法，可以通过使抗坏血酸与三氯氧磷等反应而磷酰化而获得。
另外，作为抗坏血酸磷酸酯的盐的具体制造方法，可以通过将抗坏血酸磷酸酯溶液用氧化镁等金属氧化物、或氢氧化钠等金属氢氧化物等中和，从而获得抗坏血酸磷酸酯的盐。
作为本实施方式的自噬激活剂中的抗坏血酸磷酸酯的盐的市售例，可列举昭和电工社制的抗坏血酸PS(化合物名：L-抗坏血酸-2-磷酸酯的钠盐(也称为L-抗坏血酸-2-磷酸钠)、标示名称：抗坏血酸磷酸Na)、昭和电工社制的抗坏血酸PM(化合物名：L-抗坏血酸-2-磷酸酯的镁盐(也称为L-抗坏血酸-2-磷酸镁)、标示名称：抗坏血酸磷酸Mg)等。
《(ii)抗坏血酸磷酸酯的脂肪酸酯或其盐》
·抗坏血酸磷酸酯的脂肪酸酯
抗坏血酸磷酸酯的脂肪酸酯是在抗坏血酸磷酸酯的至少1个羟基上以酯键结合了脂肪酸的化合物。作为该脂肪酸，优选为碳原子数6～22的直链状或支链状的脂肪酸(即，结合于羧基的直链状或支链状的烷基的碳原子数为5～21的脂肪酸)，更优选为碳原子数10～20的直链状或支链状的脂肪酸，进一步优选为碳原子数12～18的直链状或支链状的脂肪酸。
作为抗坏血酸磷酸酯的脂肪酸酯，可列举下述通式(2)所示的化合物。下述通式(2)所示的化合物是在抗坏血酸的2位羟基上以酯键结合了磷酸、在6位羟基上以酯键结合了脂肪酸的抗坏血酸-2-磷酸-6-脂肪酸。
Figure BDA0004220787980000071
[式中，R1是碳原子数5～21的直链状或支链状的烷基。]
上述通式(2)中，R1是碳原子数5～21的直链状或支链状的烷基。具体可列举直链状或支链状的戊基、直链状或支链状的己基、直链状或支链状的庚基、直链状或支链状的辛基、直链状或支链状的壬基、直链状或支链状的癸基、直链状或支链状的十一烷基、直链状或支链状的十二烷基、直链状或支链状的十三烷基、直链状或支链状的十四烷基、直链状或支链状的十五烷基、直链状或支链状的十六烷基、直链状或支链状的十七烷基、直链状或支链状的十八烷基、直链状或支链状的十九烷基、直链状或支链状的二十烷基、直链状或支链状的二十一烷基。
上述通式(2)中，R1在上述之中，优选为碳原子数9～19的直链状或支链状的烷基，更优选为碳原子数11～17的直链状或支链状的烷基，进一步优选为碳原子数13～15的直链状或支链状的烷基，从原料获得性等观点考虑，特别优选为碳原子数15的直链状的烷基(直链状的十五烷基)。
即，作为上述通式(2)所示的化合物，特别优选为6-O-棕榈酰抗坏血酸-2-磷酸酯(也称为抗坏血酸-2-磷酸-6-棕榈酸)。
抗坏血酸磷酸酯的脂肪酸酯中存在D型异构体和L型异构体的立体异构体、以及作为外消旋体的DL体。本实施方式中的抗坏血酸磷酸酯的脂肪酸酯可以是这些立体异构体的任意种，但从获得容易性的观点考虑，优选为L型异构体，具体优选为L-抗坏血酸-2-磷酸酯的脂肪酸酯。
·抗坏血酸磷酸酯的脂肪酸酯的盐
作为抗坏血酸磷酸酯的脂肪酸酯的盐，可列举例如，抗坏血酸磷酸酯的脂肪酸酯与无机碱的盐、抗坏血酸磷酸酯的脂肪酸酯与有机碱的盐等。
作为与无机碱的盐，可列举例如，钠盐、钾盐等碱金属盐；钙盐、镁盐等碱土金属盐；铝盐；铵盐；锌盐等。
作为与有机碱的盐，可列举例如，烷基铵盐、与碱性氨基酸的盐等。
作为抗坏血酸磷酸酯的脂肪酸酯的盐，在上述之中，优选碱金属盐或碱土金属盐，更优选钠盐或镁盐，进一步优选为钠盐。
抗坏血酸磷酸酯的脂肪酸酯的钠盐从稳定性和向制剂的混配容易性的观点考虑是优选的。
作为本实施方式的自噬激活剂中的抗坏血酸磷酸酯的脂肪酸酯或其盐，在上述之中，从稳定性和向制剂的混配容易性的观点考虑，优选抗坏血酸磷酸酯的脂肪酸酯的盐，更优选上述通式(2)所示的化合物的碱金属盐、或上述通式(2)所示的化合物的碱土金属盐，进一步优选上述通式(2)所示的化合物的钠盐、或上述通式(2)所示的化合物的镁盐，特别优选上述通式(2)所示的化合物的钠盐、具体为L-抗坏血酸-2-磷酸-6-棕榈酸的钠盐。
本实施方式的自噬激活剂中的抗坏血酸磷酸酯的脂肪酸酯或其盐可以单独使用1种，也可以2种以上联合使用。
本实施方式的自噬激活剂中的抗坏血酸磷酸酯的脂肪酸酯或其盐可以通过公知的制造方法、例如日本专利6265550所记载的方法等制造。
例如，作为抗坏血酸磷酸酯的脂肪酸酯的具体的制造方法，可以在通过与上述的抗坏血酸磷酸酯的制造方法同样的方法制造抗坏血酸磷酸酯之后，使该抗坏血酸磷酸酯与脂肪酸或其酯进行缩合反应，从而获得。
另外，作为抗坏血酸磷酸酯的脂肪酸酯的盐的具体的制造方法，可以将抗坏血酸磷酸酯的脂肪酸酯溶液用氧化镁等金属氧化物、或氢氧化钠等金属氢氧化物等中和，从而获得抗坏血酸磷酸酯的脂肪酸酯的盐。
作为本实施方式的自噬激活剂中的抗坏血酸磷酸酯的脂肪酸酯的盐的市售例，可列举昭和电工社制的アプレシエ(注册商标)(APPS)(化合物名：L-抗坏血酸-2-磷酸-6-棕榈酸的钠盐(也称为L-6-O-棕榈酰抗坏血酸-2-磷酸酯的钠盐)、标示名称：棕榈酸抗坏血酸磷酸3Na)等。
《(iii)乙基抗坏血酸或其盐》
·乙基抗坏血酸
乙基抗坏血酸是在抗坏血酸的至少1个羟基上导入了乙基的化合物。
作为乙基抗坏血酸，适合列举下述化学式(3)所示的化合物。
下述化学式(3)所示的化合物是将抗坏血酸的3位羟基的氢原子用乙基置换了的3-O-乙基抗坏血酸。
Figure BDA0004220787980000101
乙基抗坏血酸中存在D型异构体和L型异构体的立体异构体、以及作为外消旋体的DL体。乙基抗坏血酸可以是这些立体异构体的任意种，但从获得容易性的观点考虑，优选为L型异构体，具体优选为L-3-O-乙基抗坏血酸(也称为3-O-乙基-L-抗坏血酸)。
·乙基抗坏血酸的盐
作为乙基抗坏血酸的盐，可列举例如，乙基抗坏血酸与无机碱的盐、乙基抗坏血酸与有机碱的盐等。
作为与无机碱的盐，可列举例如，钠盐、钾盐等碱金属盐；钙盐、镁盐等碱土金属盐；铝盐；铵盐；锌盐等。
作为与有机碱的盐，可列举例如，烷基铵盐、与碱性氨基酸的盐等。
作为本实施方式的自噬激活剂中的乙基抗坏血酸或其盐，在上述之中，从获得容易性的观点考虑，优选为乙基抗坏血酸，更优选为L-3-O-乙基抗坏血酸。
本实施方式的自噬激活剂中的乙基抗坏血酸或其盐可以单独使用1种，也可以2种以上联合使用。
乙基抗坏血酸或其盐可以通过公知的制造方法制造。
例如，作为乙基抗坏血酸的制造方法，可以通过：将抗坏血酸在二甲基亚砜(DMSO)中在甲醇钠存在下用卤代烷进行烷基化的方法；日本特开平8-134055、日本特开平1-228977所记载的方法等制造。
另外，作为乙基抗坏血酸的盐的具体的制造方法，可以通过将乙基抗坏血酸溶液用氧化镁等金属氧化物、或氢氧化钠等金属氢氧化物等中和，从而获得乙基抗坏血酸的盐。
作为本实施方式的自噬激活剂中的乙基抗坏血酸的市售例，可列举富士フイルム和光純薬社制的3-O-乙基-L-抗坏血酸(标示名称：3-O-乙基抗坏血酸)等。
《(iv)抗坏血酸葡糖苷或其盐》
·抗坏血酸葡糖苷
抗坏血酸葡糖苷是抗坏血酸的至少1个羟基被葡糖苷化了的化合物。葡糖苷键优选为α-葡糖苷键。
作为抗坏血酸葡糖苷，适合列举下述化学式(4)所示的化合物。
下述化学式(4)所示的化合物是在抗坏血酸的2位羟基上结合了葡萄糖的抗坏血酸2-葡糖苷。
Figure BDA0004220787980000111
抗坏血酸中存在D型异构体和L型异构体的立体异构体、以及作为外消旋体的DL体。抗坏血酸葡糖苷中的抗坏血酸可以是这些立体异构体的任意种，但从获得容易性的观点考虑，优选为L型异构体，抗坏血酸葡糖苷具体优选为L-抗坏血酸2-葡糖苷。抗坏血酸葡糖苷中的葡萄糖既可以是D型异构体也可以是L型异构体，但从获得容易性的观点考虑，优选为D型异构体。
·抗坏血酸葡糖苷的盐
作为抗坏血酸葡糖苷的盐，可列举例如，抗坏血酸葡糖苷与无机碱的盐、抗坏血酸葡糖苷与有机碱的盐等。
作为与无机碱的盐，可列举例如，钠盐、钾盐等碱金属盐；钙盐、镁盐等碱土金属盐；铝盐；铵盐；锌盐等。
作为与有机碱的盐，可列举例如，烷基铵盐、与碱性氨基酸的盐等。
作为本实施方式的自噬激活剂中的抗坏血酸葡糖苷或其盐，在上述之中，从获得容易性的观点考虑，优选抗坏血酸葡糖苷，更优选L-抗坏血酸2-葡糖苷。
本实施方式的自噬激活剂中的抗坏血酸葡糖苷或其盐可以单独使用1种，也可以2种以上联合使用。
抗坏血酸葡糖苷或其盐例如可以通过日本特开平03-139288所记载的方法等来制造。
例如，作为抗坏血酸葡糖苷的具体的制造方法，可以通过在抗坏血酸的2位羟基通过酶反应以α-葡糖苷键结合1分子葡萄糖来制造。
另外，作为抗坏血酸葡糖苷的盐的具体的制造方法，可以将抗坏血酸葡糖苷溶液用氧化镁等金属氧化物、或氢氧化钠等金属氢氧化物等中和，从而获得抗坏血酸葡糖苷的盐。
作为本实施方式的自噬激活剂中的抗坏血酸葡糖苷的市售例，可列举林原社制的抗坏血酸2-葡糖苷(化合物名：L-抗坏血酸2-葡糖苷，标示名称：抗坏血酸葡糖苷)等。
本实施方式的自噬激活剂中的抗坏血酸衍生物或其盐可以单独使用1种，也可以2种以上联合使用。
作为本实施方式的自噬激活剂中的抗坏血酸衍生物或其盐，在上述之中，从能够进一步激活自噬的观点考虑，优选(i)抗坏血酸磷酸酯或其盐或(ii)抗坏血酸磷酸酯的脂肪酸酯或其盐，更优选(ii)抗坏血酸磷酸酯的脂肪酸酯或其盐。
本实施方式的自噬激活剂可以以阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病等神经变性疾病的治疗为目的，将其自身对患者施与而使用。另外，本实施方式的自噬激活剂也可以以激活自噬为目的混配到药品、化妆品中而使用。另外，可以混配到后述的自噬激活用组合物中而使用。
本实施方式的自噬激活剂能够通过促进LC3基因的表达而有效地激活自噬。
本实施方式的自噬激活剂能够通过促进ATG5基因的表达而有效地激活自噬。
本实施方式的自噬激活剂能够通过促进ATG7基因的表达而有效地激活自噬。
本实施方式的自噬激活剂能够通过促进Beclin 1基因的表达而有效地激活自噬。
因为本实施方式的自噬激活剂能够有效地激活自噬，所以能够在阿尔茨海默病的预防或治疗中使用。
已知β-淀粉样蛋白引起神经细胞中的自噬的降低。另外，已知β-淀粉样蛋白引导自噬的降低并由此引导神经细胞的被称为细胞凋亡的细胞死亡。
本实施方式的自噬激活剂能够促进β-淀粉样蛋白存在下的LC3基因表达。
本实施方式的自噬激活剂能够促进β-淀粉样蛋白存在下的ATG5基因表达。
本实施方式的自噬激活剂能够促进β-淀粉样蛋白存在下的ATG7基因表达。
本实施方式的自噬激活剂能够促进β-淀粉样蛋白存在下的Beclin 1基因表达。
本实施方式的自噬激活剂能够抑制β-淀粉样蛋白存在下的细胞凋亡。
本实施方式的自噬激活剂特别是能够在神经细胞中促进β-淀粉样蛋白存在下的选自LC3基因、ATG5基因、ATG7基因、和Beclin 1基因中的至少1种基因的表达。另外，本实施方式的自噬激活剂特别是能够在神经细胞中抑制β-淀粉样蛋白存在下的细胞凋亡。
所谓在β-淀粉样蛋白存在下促进LC3基因表达，是指在β-淀粉样蛋白存在下，通过施与本实施方式的自噬激活剂，从而与不施与所述自噬激活剂的情况相比，LC3基因的表达量上升。对于ATG5基因、ATG7基因和Beclin 1基因也是同样的。
所谓在β-淀粉样蛋白存在下抑制细胞凋亡，是指在β-淀粉样蛋白存在下，通过施与本实施方式的自噬激活剂，从而与不施与所述自噬激活剂的情况相比，细胞凋亡被抑制。
LC3(microtubule associated protein 1light chain 3alpha(微管关联蛋白1轻链3α)：NCBI Gene ID：84557)在自噬的信号传导上游被添加磷脂酰乙醇胺，被转换为能被自噬体膜引诱的LC3-II，与自噬体膜结合。LC3被作为自噬体的标志物使用。作为人LC3基因的碱基序列，可列举例如，NCBI Reference Sequence数据库中登记的NM_032514.4、和NM_181509.3等。
ATG5(autophagy related 5(自噬相关蛋白5)：NCBI Gene ID：9474)与ATG12结合，在泛素样共轭系统中作为E1样激活酶发挥功能。作为人ATG5基因的碱基序列，可列举例如，NCBI Reference Sequence数据库中登记的NM_001286106.1、NM_001286107.1、NM_001286108.1、NM_001286111.1、和NM_004849.4等。
ATG7(autophagy related 7(自噬相关蛋白7)：NCBI Gene ID：10533)作为ATP依赖地激活LC3和ATG12的E1样激活酶发挥功能。作为人ATG7基因的碱基序列，可列举例如，NCBI Reference Sequence数据库中登记的NM_001136031.3、NM_001144912.2、NM_001349232.2、NM_001349233.2、NM_001349234.2等。
Beclin 1(NCBI Gene ID：8678)与ATG14L、Vps34mp150一起形成Class III PI3K复合物，作为自噬体形成的正调控因子发挥功能。作为人Beclin 1基因的碱基序列，可列举例如，NCBI Reference Sequence数据库中登记的NM_001313998.2、NM_001313999.1、NM_001314000.1、和NM_003766.4等。
本实施方式的自噬激活剂可以施与阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病等神经变性疾病的发病风险高的患者，为了预防阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病等神经变性疾病而使用。另外，本实施方式的自噬激活剂可以施与发病了阿尔茨海默病、亨延顿病、帕金森病等神经变性疾病的患者，为了抑制神经变性疾病的进展、恶化而使用。
本实施方式的自噬激活剂可以通过与后述的自噬激活用组合物同样的方法施与患者，既可以经口地施与，也可以非经口地施与，也可以施与静脉内、动脉内、肌肉内、皮内、皮下、腹腔内等，也可以制成栓剂进行直肠内施与，也可以制成皮肤外用剂施与皮肤。
(自噬激活用组合物)
本实施方式的自噬激活用组合物含有：上述的含有抗坏血酸衍生物或其盐的自噬激活剂、和药学上可接受的载体。
本实施方式的自噬激活用组合物可以按照常规方法(例如，日本药局方记载的方法)，通过将上述的自噬激活剂、药学上可接受的载体、和根据情况的其他成分混合而制剂化，从而制造。
本说明书中，所谓“药学上可接受的载体”，是指不阻碍有效成分的生理活性、且对其施与对象不显示实质的毒性的载体。
其中，所谓“不显示实质的毒性”是指该成分在通常使用的施与量下，对施与对象不显示毒性。
作为药学上可接受的载体，不特别限制，可以列举赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、稳定剂、稀释剂、注射剂用溶剂、保湿剂、触感提高剂、表面活性剂、高分子/增稠/胶凝剂、溶剂、喷射剂、抗氧化剂、还原剂、氧化剂、螯合剂、酸、碱、粉体、无机盐、水、含金属化合物、不饱和单体、多元醇、高分子添加剂、湿润剂、增稠剂、胶黏物质、油性原料、液态基质、脂溶性物质、高分子羧酸盐等。
作为这些成分的具体例，可列举例如，国际公开公报第2016/076310号所记载的成分等。进而，作为高分子/增稠/胶凝剂的具体例，可列举甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、甲基丙烯酸丁酯或它们的聚合物等。
本实施方式的自噬激活用组合物中的药学上可接受的载体可以单独使用1种，也可以2种以上联合使用。
另外，作为其他成分，不特别限制，可列举防腐剂、抗菌剂、紫外线吸收剂、美白剂、抗坏血酸衍生物或其盐以外的维生素类及其衍生物类、消炎剂、抗炎症剂、育发用药剂、血液循环促进剂、刺激剂、激素类、抗皱剂、抗老化剂、绷紧剂、冷感剂、温感剂、创伤治愈促进剂、刺激缓和剂、镇痛剂、细胞赋活剂、植物/动物/微生物提取物、种子油、镇痒剂、角质剥离/溶解剂、止汗剂、清凉剂、收敛剂、酶、核酸、香料、色素、着色剂、染料、颜料、消炎镇痛剂、抗真菌剂、抗组胺剂、催眠镇静剂、精神稳定剂、抗高血压剂、降压利尿剂、抗生素、麻醉剂、抗菌性物质、抗癫痫剂、冠状动脉扩张剂、生药、止瘁剂、角质软化剥离剂、紫外线阻挡剂、杀菌剂、抗氧化物质、pH调节剂、添加剂、金属皂等。作为这些成分的具体例，可列举例如，国际公开公报第2016/076310号所记载的成分等。进而，作为植物/动物/微生物提取物的具体例，可列举多肋稻槎菜花/叶/茎、茶叶等。作为种子油的具体例，可列举辣木种子油。作为香料的具体例，可列举紫苏醛。
其他成分可以单独使用1种，也可以2种以上联合使用。
本实施方式的自噬激活用组合物可以含有治疗有效量的所述自噬激活剂。所谓“治疗有效量”是指为了患者的疾病的治疗或预防而有效的药剂的量。治疗有效量可以根据施与对象的疾病的状态、年龄、性别、和体重等而变动。
在本实施方式的自噬激活用组合物中，上述的自噬激活剂的治疗有效量剂的治疗有效量可以是抗坏血酸衍生物或其盐能够激活自噬的量。另外，上述的自噬激活剂的治疗有效量可以是抗坏血酸衍生物或其盐能够有效地促进选自LC3基因、ATG5基因、ATG7基因、和Beclin 1基因中的至少1种基因的表达的量。另外，上述自噬激活剂的治疗有效量可以是抗坏血酸衍生物或其盐能够在β-淀粉样蛋白存在下抑制细胞凋亡的量。
本实施方式的自噬激活用组合物中的所述自噬激活剂的治疗有效量(抗坏血酸衍生物或其盐的合计含量)相对于自噬激活用组合物总量可以为例如0.05～15质量％，也可以为例如0.1～10质量％，也可以为例如0.5～5质量％。
此外，所谓抗坏血酸衍生物或其盐的合计含量，在单独使用1种抗坏血酸衍生物或其盐的情况下是指该化合物的含量，在组合使用2种以上抗坏血酸衍生物或其盐的情况下是指这些化合物的合计含量。
本实施方式的自噬激活用组合物既可以是药物组合物，也可以是化妆料。
(药物组合物)
在一个实施方式中，本发明提供含有上述的自噬激活剂和药学上可接受的载体的自噬激活用药物组合物。
在本实施方式的药物组合物中，作为药学上可接受的载体，没有特别限制，除了上述举出的以外还可以使用一般使用于药品的载体。例如，可以使用日本药局方、日本药局方外医药品规格、医药品添加物规格2013(药事日报社，2013年)、医药品添加物辞典2016(日本医药品添加剂协会编，药事日报社，2016年)、Handbook of Pharmaceutical Excipients第7版(Pharmaceutical Press，2012年)等所记载的一般原料。
药学上可接受的载体可以单独使用1种，也可以2种以上联合使用。
本实施方式的药物组合物除了所述自噬激活剂和药学上可接受的载体以外，还可以含有其他成分。作为其他成分，没有特别限制，可以使用一般的药品添加物。另外，作为其他成分，也可以使用除上述的自噬激活剂以外的活性成分。作为其他成分即药品添加物和活性成分，除了上述举出的成分以外，还可以使用例如，日本药局方、日本药局方外医药品规格、医药品添加物规格2013(药事日报社，2013年)、医药品添加物辞典2016(日本医药品添加剂协会编，药事日报社，2016年)、Handbook of Pharmaceutical Excipients第7版(Pharmaceutical Press，2012年)等所记载的一般原料。其他成分可以单独使用1种，也可以2种以上联合使用。
作为本实施方式的药物组合物的剂型，没有特别限制，可以为作为药品制剂而一般使用的剂型。可举出例如，片剂、包衣片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、水溶剂、悬浮剂、乳剂等经口施与的剂型；和注射剂、栓剂、皮肤外用剂等非经口施与的剂型等。这些剂型的药物组合物可以按照通用方法(例如，日本药局方记载的方法)进行制剂化。
本实施方式的药物组合物的施与方法没有特别限制，可以通过作为药品的施与方法而一般使用的方法施与。例如，可以作为片剂、包衣片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、水溶剂、悬浮剂、乳剂等而经口施与，也可以作为注射剂、输液制剂等单独或与葡萄糖液、林格液等一般的输液混合向静脉内、动脉内、肌肉内、皮内、皮下、腹腔内等施与，可以作为栓剂进行直肠内施与，也可以作为皮肤外用剂向皮肤施与。
本实施方式的药物组合物的施与量可以为治疗有效量。治疗有效量只要根据患者的症状、体重、年龄、和性别等、以及药物组合物的剂型、和施与方法等而适当决定即可。
例如，关于本实施方式的药物组合物的施与量，在经口施与的情况下，可以列举作为抗坏血酸衍生物或其盐的合计含量每施与单位形态为0.01～500mg，在注射剂的情况下，可以列举作为抗坏血酸衍生物或其盐的合计含量每施与单位形态为0.02～250mg，在栓剂的情况下，可以列举作为抗坏血酸衍生物或其盐的合计含量每施与单位形态为0.01～500mg，在皮肤外用剂的情况下，可以列举作为抗坏血酸衍生物或其盐的合计含量每施与单位形态为0.01～500mg等。
本实施方式的药物组合物的施与间隔只要根据患者的症状、体重、年龄、和性别等、以及药物组合物的剂型、和施与方法等而适当决定即可。例如，可以为1天1次或2～3次左右等。
本实施方式的药物组合物可以用于由自噬活性的降低引起的疾病的治疗或预防。作为这样的疾病，可列举例如，阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、SENDA病等神经变性疾病；克罗恩病等炎症性肠疾病；癌等。
本实施方式的药物组合物例如，可以对阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、SENDA病等神经变性疾病；克罗恩病等炎症性肠疾病；或癌的患者施与，用于抑制神经变性疾病、炎症性肠疾病、或癌的进展。另外，本实施方式的药物组合物可以对阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、SENDA病等神经变性疾病；克罗恩病等炎症性肠疾病；或癌的患者施与，用于治疗神经变性疾病、炎症性肠疾病、或癌。另外，本实施方式的药物组合物可以用于治疗由β-淀粉样蛋白引起的疾病。另外，本实施方式的药物组合物可以用于治疗由LC3基因、ATG5基因、ATG7基因、或Beclin1基因的表达量降低引起的疾病。另外，本实施方式的药物组合物可以用于治疗由mTOR的表达量上升引起的疾病。
本实施方式的药物组合物在上述之中，特别适合用于治疗阿尔茨海默病。
本实施方式的药物组合物可以对阿尔茨海默病、以及亨廷顿病、帕金森病、SENDA病等神经变性疾病的发病风险高的患者施与，用于预防神经变性疾病。另外，本实施方式的药物组合物也可以对克罗恩病等炎症性肠疾病的发病风险高的患者施与，用于预防炎症性肠疾病。另外，本实施方式的药物组合物也可以对癌的发病风险高的患者施与，用于预防癌。
(化妆料)
在一个实施方式中，本发明提供含有上述的自噬激活剂和药学上可接受的载体的用于自噬激活的化妆料。
在本实施方式的化妆料中，作为药学上可接受的载体，没有特别限制，除了上述举出的以外，还可以使用一般使用于化妆料的载体。可以使用例如，化妆品原料基准第二版注解(日本公定书协会编，药事日报社，1984年)、化妆品原料基准外成分规格(厚生省药务局审查课监修，药事日报社，1993年)、化妆品原料基准外成分规格追补(厚生省药务局审查课监修，药事日报社，1993年)、化妆品种别许可基准(厚生省药务局审查课监修，药事日报社，1993年)、化妆品原料辞典(日光クミカルズ社，平成3年)、CTFA的International CosmeticIngredient Dictionary and Handbook 2002第9版Vol.1～4等所记载的一般原料。
药学上可接受的载体可以单独使用1种，也可以2种以上联合使用。
本实施方式的化妆料除了自噬激活剂和药学上可接受的载体以外，还可以含有其他成分。作为其他成分，没有特别限制，可以使用一般的化妆品添加物。另外，作为其他成分，也可以使用除上述的自噬激活剂以外的活性成分。作为其他成分即化妆品添加物和活性成分，除了上述举出的以外，还可以使用例如，化妆品原料基准第二版注解(日本公定书协会编，药事日报社，1984年)、化妆品原料基准外成分规格(厚生省药务局审查课监修，药事日报社，1993年)、化妆品原料基准外成分规格追补(厚生省药务局审查课监修，药事日报社，1993年)、化妆品种别许可基准(厚生省药务局审查课监修，药事日报社，1993年)、化妆品原料辞典(日光クミカルズ社，平成3年)、CTFA的International Cosmetic IngredientDictionary andHandbook 2002第9版Vol.1～4等所记载的一般原料。其他成分可以单独使用1种，也可以2种以上联合使用。
作为本实施方式的化妆料的形态，没有特别限制，可以为作为化妆料而一般使用的形态。可举出例如，香波、护发素、整发剂等毛发用化妆料；洗面奶、清洁剂、化妆水、乳液、洗剂、霜、凝胶、防晒剂、面膜(pack)、面膜(mask)、美容液等基础化妆料；粉底类、隔离霜、口红类、唇蜜、腮红类等彩妆化妆料；身体洗涤料、爽身粉、防臭化妆料等身体化妆料等。这些化妆料可以按照通用方法制造。
另外，作为本实施方式的化妆料的剂型，没有特别限制，可举出例如，水包油(O/W)型、油包水(W/O)型、W/O/W型、O/W/O型等乳化型、乳化高分子型、油性、固体、液状、膏状、棒状、挥发性油型、粉状、冻状、凝胶状、糊状、乳霜状、片状、膜状、雾状、喷射型、气溶胶状、多层状、泡状、薄片(flake)状等。
本实施方式的化妆料的使用量不特别限制，可以为为了激活自噬而有效的量。
例如，本实施方式的化妆料的使用量作为抗坏血酸衍生物或其盐的合计含量每1次使用为0.01～500mg，例如可以为0.15～300mg，例如可以为0.15～200mg，例如可以为0.2～100mg。
本实施方式的化妆料的使用间隔不特别限制，例如可以为1天1次或2～3次左右等。
本实施方式的化妆料可以用于缓和由自噬活性的降低引起的症状。或者，可以为了预防由自噬活性的降低引起的症状的发病，而对这些症状的发病风险高的受检者在更加日常的护肤、化妆中使用。
(其他实施方式)
在一个实施方式中，本发明提供激活自噬的方法，包括将抗坏血酸衍生物或其盐施与对象的工序。
在一个实施方式中，本发明提供促进LC3基因、ATG5基因、ATG7基因、或Beclin 1基因的表达的方法，包括将抗坏血酸衍生物或其盐施与对象的工序。
在一个实施方式中，本发明提供抑制β-淀粉样蛋白存在下的细胞凋亡的方法，包括将抗坏血酸衍生物或其盐施与对象的工序。
在一个实施方式中，本发明提供用于激活自噬的抗坏血酸衍生物或其盐。
在一个实施方式中，本发明提供用于促进LC3基因、ATG5基因、ATG7基因、或Beclin1基因的表达的抗坏血酸衍生物或其盐。
在一个实施方式中，本发明提供用于抑制β-淀粉样蛋白存在下的细胞凋亡的抗坏血酸衍生物或其盐。
在一个实施方式中，本发明提供用于预防或治疗阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、SENDA病、克罗恩病、或癌的抗坏血酸衍生物或其盐。
在一个实施方式中，本发明提供抗坏血酸衍生物或其盐用于制造自噬激活剂的用途。
在一个实施方式中，本发明提供抗坏血酸衍生物或其盐用于制造LC3基因、ATG5基因、ATG7基因、或Beclin 1基因表达的促进剂的用途。
在一个实施方式中，本发明提供抗坏血酸衍生物或其盐用于制造β-淀粉样蛋白存在下的LC3基因、ATG5基因、ATG7基因、或Beclin 1基因表达的促进剂的用途。
在一个实施方式中，本发明提供抗坏血酸衍生物或其盐用于制造β-淀粉样蛋白存在下的细胞凋亡的抑制剂的用途。
在一个实施方式中，本发明提供抗坏血酸衍生物或其盐用于制造自噬激活用组合物的用途。
在一个实施方式中，本发明提供抗坏血酸衍生物或其盐用于制造LC3基因、ATG5基因、ATG7基因、或Beclin 1基因表达的促进用组合物的用途。
在一个实施方式中，本发明提供抗坏血酸衍生物或其盐用于制造β-淀粉样蛋白存在下的LC3基因、ATG5基因、ATG7基因、或Beclin 1基因表达的促进用组合物的用途。
在一个实施方式中，本发明提供抗坏血酸衍生物或其盐用于制造β-淀粉样蛋白存在下的细胞凋亡的抑制用组合物的用途。
实施例
以下，通过实施例更详细地说明本发明，但本发明不受这些例子限定。
[抗坏血酸衍生物或其盐]
在以下的实施例和处方例中，使用下述的抗坏血酸衍生物或其盐。
APM：L-抗坏血酸-2-磷酸酯的镁盐(标示名称：抗坏血酸磷酸Mg、制品名：抗坏血酸PM、昭和电工社制)
APPS：L-抗坏血酸-2-磷酸-6-棕榈酸的钠盐(标示名称：棕榈酸抗坏血酸磷酸3Na、制品名：アプレシエ(APPS)、昭和电工社制)
AG：L-抗坏血酸2-葡糖苷(标示名称：抗坏血酸葡糖苷、制品名：抗坏血酸2-葡糖苷、林原社制)
AE：3-O-乙基-L-抗坏血酸(标示名称：3-O-乙基抗坏血酸、制品名：3-O-乙基-L-抗坏血酸、富士フイルム和光純薬社制)
<人老化成纤维细胞中的LC3基因、ATG5基因、ATG7基因、和Beclin 1基因的表达促进效果的评价>
为了制作人工地诱发了老化的细胞，使用成纤维细胞进行了试验。老化成纤维细胞通过以下的步骤制作。
《老化成纤维细胞的制作》
在添加了10％胎牛血清(MP Biomedicals社制)的D-MEM培养基(Sigma-Aldrich社制)中，将人正常成纤维细胞(NB1RGB；RIKEN BRCセルバシケ制)培养至汇合。然后，用250μM过氧化氢水处理2小时，用添加了新的10％胎牛血清的D-MEM培养基培养24小时。将该利用过氧化氢水的处理和细胞培养的操作重复3次，将所得的成纤维细胞作为老化成纤维细胞。
《基因的表达促进效果的评价试验》
将所制作的老化成纤维细胞以10000个/cm2的接种密度准备，用添加了10％胎牛血清(MP Biomedicals社制)的D-MEM培养基(Sigma-Aldrich社制)培养24小时。接着，在实施例1中，以APM的终浓度为10μM的方式，在培养基中添加溶解在了纯化水中的APM。在实施例2中，以APPS的终浓度为1μM的方式，在培养基中添加溶解在了纯化水中的APPS。在实施例3中，以APPS的终浓度为10μM的方式，在培养基中添加溶解在了纯化水中的APPS。在实施例4中，以AG的终浓度为100μM的方式，在培养基中添加溶解在了纯化水中的AG。在实施例5中，以AE的终浓度为100μM的方式，在培养基中添加溶解在了纯化水中的AE。
另外，在比较例1中，在培养基中仅添加纯化水。
接着，将各个培养基在24小时、37℃、5％CO2下进行培养。
另一方面，作为参考例1，将上述人正常成纤维细胞以10000个/cm2的接种密度准备，用添加了10％胎牛血清(MP Biomedicals社制)的D-MEM培养基(Sigma-Aldrich社制)培养24小时，在该培养基中仅添加纯化水。接着，将该培养基在24小时、37℃、5％CO2下进行培养。
然后，使用Nucleospin(注册商标)RNA试剂盒(タカラバイオ社制)，从各例的老化成纤维细胞、或人正常成纤维细胞提取RNA，由所得的RNA合成cDNA。接着，以该cDNA为模板，通过实时定量PCR，分别使用对LC3基因、ATG5基因、ATG7基因、和Beclin 1基因特异的引物(タカラバイオ社制)，将各基因的表达量进行定量。
作为内标基因，将通过化合物添加而基因表达观察不到变动的持家基因的GAPDH(引物；タカラバイオ社制)的表达量进行定量，通过其值将各基因的表达量标准化。关于所述各例中的基因表达量，求出以比较例1中的各基因的表达量分别作为1.00时的相对基因表达量。将其结果示于表1。
表1
Figure BDA0004220787980000241
如表1，在参考例1和比较例1中，在分别仅添加了纯化水而培养了的人正常成纤维细胞和老化成纤维细胞之间，能够确认老化成纤维细胞的LC3基因、ATG5基因、ATG7基因、和Beclin 1基因的表达量均降低。
另一方面，实施例1～5的添加自噬激活剂而培养了的老化成纤维细胞，与比较例1的仅添加纯化水而培养了的老化成纤维细胞相比，特别是LC3基因的表达量高，能够确认LC3基因的表达促进效果。
另外，其中，实施例1-3的添加了自噬激活剂的情况下，即使抗坏血酸衍生物(APM和APPS)为低浓度，LC3基因的表达量也高，能够确认显著的LC3基因的表达促进效果。
另外，在实施例2和3中，即使APPS为非常低的浓度，LC3基因、ATG5基因、ATG7基因、和Beclin 1基因的全部表达量也都能够提高，可以确认APPS的LC3基因、ATG5基因、ATG7基因、和Beclin 1基因的表达促进效果特别优异。
<人神经母细胞瘤中的LC3基因、ATG5基因、ATG7基因、和Beclin1基因的表达促进效果的评价>
在自噬激活剂存在下，通过以下的试验方法测定人神经母细胞瘤(SH-SY5Y；由ATCC获得)中的LC3基因、ATG5基因、ATG7基因、和Beclin 1基因的表达量，评价由自噬激活剂产生的LC3基因、ATG5基因、ATG7基因、和Beclin 1基因的表达促进效果。
在以下的实施例和比较例中，在各培养基中添加已知引起神经细胞中的自噬的降低的β-淀粉样蛋白进行试验。
将上述SH-SY5Y细胞以10000个/cm2的接种密度准备，用添加了10％胎牛血清(MPBiomedicals社制)的D-MEM/Ham’s F-12培养基(Sigma-Aldrich社制)培养24小时。接着，在实施例6中，以APM的终浓度为10μM的方式，在培养基中添加溶解在了纯化水中的APM。在实施例7中，以APPS的终浓度为1μM的方式，在培养基中添加溶解在了纯化水中的APPS。在实施例8中，以APPS的终浓度为10μM的方式，在培养基中添加溶解在了纯化水中的APPS。在实施例9中，以AG的终浓度为100μM的方式，在培养基中添加溶解在了纯化水中的AG。在实施例10中，以AE的终浓度为100μM的方式，在培养基中添加溶解在了纯化水中的AE。
另外，比较例2中，在培养基中仅添加纯化水。
接着，调制将β-淀粉样蛋白(Sigma-Aldrich社制)以0.01％(V/V)溶解于DMSO而得的β-淀粉样蛋白溶液，以各培养基中的β-淀粉样蛋白的终浓度为20μM的方式，在各培养基中添加该β-淀粉样蛋白溶液。
此外，在参考例2中仅添加纯化水，不添加β-淀粉样蛋白溶液。
接着，将各个培养基在48小时、37℃、5％CO2下进行培养。
然后，使用Nucleospin(注册商标)RNA试剂盒(タカラバイオ社制)，由各例的SH-SY5Y细胞提取RNA，由所得的RNA合成cDNA。接着，以该cDNA为模板，通过实时定量PCR，分别使用对LC3基因、ATG5基因、ATG7基因、和Beclin 1基因特异的引物(タカラバイオ社制)，将各基因的表达量进行定量。
作为内标基因，将通过化合物添加而基因表达观察不到变动的持家基因的GAPDH(引物；タカラバイオ社制)的表达量进行定量，通过其值将各基因的表达量标准化。关于上述各例中的基因表达量，求出以参考例2中的各基因的表达量分别作为1.00时的相对基因表达量。将其结果示于表2。
表2
Figure BDA0004220787980000261
如表2所示，在参考例2和比较例2中，与仅添加纯化水而培养了的SH-SY5Y细胞相比，在进一步添加β-淀粉样蛋白而培养了的SH-SY5Y细胞中，能够确认LC3基因、ATG5基因、ATG7基因、和Beclin 1基因的表达量均降低。另外能够确认，其中，特别是LC3基因的表达量降低。
另一方面，实施例6～10的添加自噬激活剂和β-淀粉样蛋白溶液而培养了的SH-SY5Y细胞，与比较例2的添加纯化水和β-淀粉样蛋白溶液而培养了的SH-SY5Y细胞相比，特别是LC3基因的表达量高，能够确认由实施例6～10的自噬激活剂产生的LC3基因的表达促进效果。
另外，实施例6～10的添加自噬激活剂和β-淀粉样蛋白溶液而培养了的SH-SY5Y细胞，与参考例2的仅添加纯化水而培养了的SH-SY5Y细胞，相比，能够确认ATG5、ATG7、和Beclin 1基因的表达量提高。
实施例中，在实施例6～8中能够确认即使抗坏血酸衍生物(APM和APPS)为低浓度，LC3基因的表达量也高，能够确认显著的LC3基因的表达促进效果。
另外，在实施例7和8中，即使APPS为非常低的浓度，LC3基因、ATG5基因、ATG7基因、和Beclin 1基因的全部的表达量也都能提高，特别能够确认LC3基因、ATG5基因、ATG7基因、和Beclin 1基因的表达促进效果优异。
<人神经母细胞瘤中的由β-淀粉样蛋白引起的细胞凋亡抑制作用的评价>
通过以下的试验方法测定自噬激活剂存在下的人神经母细胞瘤(SH-SY5Y；从ATCC获得)中的凋亡细胞的比例，评价自噬激活剂的细胞凋亡抑制作用。
在以下的实施例和比较例中，在各培养基中添加已知诱发自噬的降低和由此引起的神经细胞的被称为细胞凋亡的细胞死亡的β-淀粉样蛋白而进行试验。
将SH-SY5Y细胞以50000个/cm2的接种密度准备，用添加了10％胎牛血清(MPBiomedicals社制)的D-MEM/Ham’s F-12培养基(Sigma-Aldrich社制)培养24小时。接着，在实施例11中，以APM的终浓度为10μM的方式，在培养基中添加溶解在了纯化水中的APM。在实施例12中，以APM的终浓度为100μM的方式，在培养基中添加溶解在了纯化水中的APM。在实施例13中，以APPS的终浓度为1μM的方式，在培养基中添加溶解在了纯化水中的APPS。在实施例14中，以APPS的终浓度为10μM的方式，在培养基中添加溶解在了纯化水中的APPS。在实施例15中，以AG的终浓度为100μM的方式，在培养基中添加溶解在了纯化水中的AG。在实施例16中，以AE的终浓度为100μM的方式，在培养基中添加溶解在了纯化水中的AE。
另外，作为比较例3，在培养基中仅添加纯化水。
接着，调制将β-淀粉样蛋白(Sigma-Aldrich社制)以0.01％(V/V)溶解于DMSO而得的β-淀粉样蛋白溶液，以各培养基中的β-淀粉样蛋白的终浓度为30μM的方式，在各培养基中添加该β-淀粉样蛋白溶液。
此外，在参考例3中仅添加纯化水，不添加β-淀粉样蛋白溶液。
接着，将各个培养基在48小时、37℃、5％CO2下进行培养。
然后，在除去了培养基的各SH-SY5Y细胞中添加10μM Hoechst33342(Sigma-Aldrich社制)水溶液，在室温(25℃)静置10分钟。除去溶液之后，将各SH-SY5Y细胞用磷酸缓冲液(PBS、富士フイルム和光純薬社制)洗涤，在荧光显微镜下测量由染色质凝聚引起的细胞凋亡样强的观察到Hoechst荧光的细胞数(Hoechst(+)细胞)。在为独立试验的4个实验中，测量各视野5000细胞以上，将该4个试验中的Hoechst(+)细胞的比例的平均值作为引起了细胞凋亡的细胞的比例。对于各例，计算出以参考例3中的凋亡细胞的比例作为1.00时的相对值，将其结果示于表3。
表3
Figure BDA0004220787980000281
如表3所示，在参考例3和比较例3中，与仅添加纯化水而培养了的参考例3的SH-SY5Y细胞相比，在进一步添加β-淀粉样蛋白而培养了的比较例3的SH-SY5Y细胞中，凋亡细胞的比例增加。
另一方面，在实施例11～16的添加自噬激活剂和β-淀粉样蛋白溶液而培养了的SH-SY5Y细胞中，与比较例3的添加纯化水和β-淀粉样蛋白溶液而培养了的SH-SY5Y细胞相比，能够确认凋亡细胞的比例降低。
[处方例]
作为自噬激活用组合物，将外用剂的处方例1～4示于表4。
表4
Figure BDA0004220787980000291
产业可利用性
通过本发明，提供能够有效地激活自噬的自噬激活剂、和含有所述自噬激活剂的自噬激活用组合物。
以上说明了本发明的优选实施例，但本发明不限于这些实施例。在不脱离本发明的宗旨的范围内，可以进行构成的添加、省略、替换、和其他变更。本发明不受前述的说明限定，仅受权利要求的范围限定。

Claims (10)

1.自噬激活剂，含有抗坏血酸衍生物或其盐作为有效成分。
2.根据权利要求1所述的自噬激活剂，所述抗坏血酸衍生物或其盐是选自抗坏血酸磷酸酯、抗坏血酸磷酸酯的脂肪酸酯、乙基抗坏血酸、和抗坏血酸葡糖苷中的至少1种抗坏血酸衍生物或其盐。
3.根据权利要求2所述的自噬激活剂，所述抗坏血酸衍生物或其盐是抗坏血酸磷酸酯的脂肪酸酯或其盐。
4.根据权利要求3所述的自噬激活剂，所述抗坏血酸磷酸酯的脂肪酸酯或其盐是抗坏血酸磷酸酯的棕榈酸酯或其盐。
5.根据权利要求1～4的任一项所述的自噬激活剂，含有所述抗坏血酸衍生物的盐作为有效成分，所述抗坏血酸衍生物的盐是抗坏血酸衍生物的镁盐或钠盐。
6.根据权利要求1～5的任一项所述的自噬激活剂，该自噬激活剂促进LC3基因的表达。
7.根据权利要求1～6的任一项所述的自噬激活剂，该自噬激活剂促进LC3基因、ATG5基因、ATG7基因、和Beclin 1基因的表达。
8.根据权利要求1～7的任一项所述的自噬激活剂，该自噬激活剂用于阿尔茨海默病的预防或治疗。
9.自噬激活用组合物，含有权利要求1～8的任一项所述的自噬激活剂和药学上可接受的载体。
10.根据权利要求9所述的自噬激活用组合物，所述抗坏血酸衍生物或其盐的合计含量相对于自噬激活用组合物总量为0.05～15质量％。
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