TW202228676A - 自噬活化劑 - Google Patents

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Abstract

含有抗壞血酸衍生物或其鹽作為有效成分之自噬活化劑，以及含有該自噬活化劑及藥學上可容許之載體之自噬活化用組成物。

Description

自噬活化劑
本發明係關於自噬活化劑及自噬活化用組成物。 本申請案係基於在2020年9月17日於日本申請之日本專利特願2020-156457號主張優先權，並將其內容援用於此。
自噬(autophagy)為對飢餓、生長因子缺乏及病原體感染等細胞外或細胞內之壓力及訊息進行應答，並藉由將已衰老化或損傷之細胞內物質及胞器進行分解而進行能量的再生產及損傷物質的去除之機制，對維持正常的細胞的恆定性而言實屬重要。從過去的研究中，已報導老化越進展，細胞內之自噬活性越急遽地減少(非專利文獻1)。此外，在抑制自噬之情況，衰老粒線體或經錯誤折疊之蛋白質等會過量地蓄積於細胞內，由於細胞內之氧化壓力增加而誘導細胞死亡，就結果而言，導致細胞老化。 從而，藉由活化將細胞內之已老化之物質及胞器進行分解並回收再利用其分解產物之自噬，便可藉由迅速地去除細胞內之不需要物而提高細胞的恆定性。
另一方面，作為老化對自噬所帶來之影響，已知在人類的腦中，ATG5、ATG7及Beclin 1基因的表現量會隨著年齡增長而降低。此外，一般認為在阿茲海默症(Alzheimer’s disease)等神經退化性疾患中，可看出自噬的活性降低。因此，已知自噬的活化係有助於治療及預防以阿茲海默症為首之亨丁頓氏症(Huntington’s disease)、帕金森氏症(Parkinson’s disease)等神經退化性疾患(非專利文獻2、3)。特定而言，在阿茲海默症中，自噬的機能受到阻礙，因而被稱為類澱粉β之凝集蛋白質蓄積於生體內，一般認為此與發病有關(非專利文獻4)。此外，針對屬於伴隨腦的黑質及蒼白球中之鐵的沉積及大腦的萎縮之神經退化性疾患之SENDA病(SENDA：static encephalopathy of childhood with neurodegeneration in adulthood)、屬於在消化道引起嚴重的炎症或潰瘍之炎症性腸疾患之克隆氏症(Crohn's disease)以及癌症，一般認為自噬相關基因或涉及選擇性自噬之基因的變異亦產生影響(非專利文獻5)。
自噬的過程已在酵母及哺乳類兩者中進行研究，最多已利用36種蛋白質。該等之中，從自噬體的形成至其內容物的分化係由自噬相關基因(ATG)所編碼出之Atg蛋白質所控制，可分類成包含Atg12-Atg5結合系統、LC3-Phosphatidyl Ethanolamine(PE)結合系統之6個組，各自在各過程中階段性地產生作用。
作為自噬活化劑，已報導增加屬於自噬的活性狀態的標記之LC3相關的因子並活化自噬之化合物，以及促進自噬通量(包含自噬體向溶酶體之融合)之化合物/有效成分(專利文獻1～4)。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1] 國際公開第2018/173653號 [專利文獻2] 日本專利特開2018-80204號公報 [專利文獻3] 日本專利特表2018-510902號公報 [專利文獻4] 日本專利特表2019-529514號公報 [非專利文獻]
[非專利文獻1] Yogendra S. Rajawat et al., Aging: Central role for autophagy and the lysosomal degradative system. Ageing Research Reviews 8 (2009) 199-213. [非專利文獻2] Aaron Barnett et al., Autophagy in Aging and Alzheimer’s Disease: Pathologic or Protective?. J Alzheimers Dis. 2011; 25(3): 385-394. [非專利文獻3] Marta M. Lipinski et al., Genome-wide analysis reveals mechanisms modulating autophagy in normal brain aging and in Alzheimer’s disease. Proc Natl Acad Sci USA. 2010, 107, 14164-14169. [非專利文獻4] Xiangqing Li et al., Cubeben induces autophagy via PI3K-AKT-mTOR pathway to protect primary neurons against amyloid beta in Alzheimer’s disease. Cytotechnology (2019) 71: 679-686. [非專利文獻5] 蔭山等人，「自噬及疾患」，領域融合評論，2014年，3，e006
[發明所欲解決之課題]
如上述，已知在阿茲海默症等各式各樣的疾患中，自噬機能降低，遂謀求可有效地活化自噬之藥劑。然而，就以往所知之藥劑而言，其效果可謂仍不充分。
於是，本發明之目的為提供可有效地活化自噬之自噬活化劑及含有前述自噬活化劑之自噬活化用組成物。 [解決課題之手段]
本發明包含以下態樣。 (1)一種自噬活化劑，其含有抗壞血酸衍生物或其鹽作為有效成分。 (2)如(1)所記載之自噬活化劑，其中，前述抗壞血酸衍生物或其鹽為選自由磷酸抗壞血酸酯、磷酸抗壞血酸酯的脂肪酸酯、乙基抗壞血酸及抗壞血酸葡萄糖苷所組成之群組之至少1種抗壞血酸衍生物或其鹽。 (3)如(2)所記載之自噬活化劑，其中，前述抗壞血酸衍生物或其鹽為磷酸抗壞血酸酯的脂肪酸酯或其鹽。 (4)如(3)所記載之自噬活化劑，其中，前述磷酸抗壞血酸酯的脂肪酸酯或其鹽為磷酸抗壞血酸酯的棕櫚酸酯或其鹽。 (5)如(1)～(4)中任一項所記載之自噬活化劑，其含有前述抗壞血酸衍生物的鹽作為有效成分，前述抗壞血酸衍生物的鹽為抗壞血酸衍生物的鎂鹽或鈉鹽。 (6)如(1)～(5)中任一項所記載之自噬活化劑，其促進LC3基因的表現。 (7)如(1)～(6)中任一項所記載之自噬活化劑，其促進LC3基因、ATG5基因、ATG7基因及Beclin 1基因的表現。 (8)如(1)～(7)中任一項所記載之自噬活化劑，其係用於預防或治療阿茲海默症。 (9)一種自噬活化用組成物，其含有如(1)～(8)中任一項所記載之自噬活化劑及藥學上可容許之載體。 (10)如(9)所記載之自噬活化用組成物，其中，前述抗壞血酸衍生物或其鹽之合計含量係相對於自噬活化用組成物全量而言為0.05～15質量%。 [發明效果]
根據本發明，可提供可促進選自由LC3基因、ATG5基因、ATG7基因及Beclin 1基因所組成之群組之至少1種基因的表現，有效地活化自噬之自噬活化劑及含有前述自噬活化劑之自噬活化用組成物。
(自噬活化劑)
本實施形態之自噬活化劑含有抗壞血酸衍生物或其鹽作為有效成分。 在此處，所謂「自噬(autophagy)」，係藉由將已衰老或損傷之細胞內物質及胞器進行分解而進行能量的再生產及損傷物質的去除之機制。 本實施形態之自噬活化劑可促進屬於自噬標記之LC3基因以及自噬體中所包含之ATG5基因、ATG7基因及Beclin 1基因的表現，可使自噬活化。
＜抗壞血酸衍生物或其鹽＞ 作為本實施形態之自噬活化劑中之抗壞血酸衍生物，可列舉將抗壞血酸的至少1個羥基進行衍生化而得之抗壞血酸衍生物。 作為抗壞血酸衍生物，更具體而言，可列舉使抗壞血酸的羥基中之任一者進行磷酸酯化而得之磷酸抗壞血酸酯(亦稱為抗壞血酸磷酸酯)；將抗壞血酸的羥基中之任一者進行磷酸酯化，並使其他羥基藉由脂肪酸進行酯化而得之磷酸抗壞血酸酯的脂肪酸酯；使抗壞血酸的羥基中之任一者進行乙氧基化而得之乙基抗壞血酸；使抗壞血酸的羥基中之任一者進行葡萄糖苷化而得之抗壞血酸葡萄糖苷；使抗壞血酸的羥基中之任一者進行醯化而得之醯化抗壞血酸；將抗壞血酸的羥基中之任一者進行醯化，並使其他羥基進行磷酸酯化而得之醯化磷酸抗壞血酸酯；將抗壞血酸的羥基中之任一者以甘油進行取代而得之甘油基抗壞血酸；經由磷酸將抗壞血酸及生育酚各自以酯鍵結進行鍵結而得之抗壞血酸與生育酚的磷酸二酯(具體而言，dl-α-生育酚2-L-抗壞血酸磷酸二酯等)等。
作為抗壞血酸衍生物的鹽，可列舉例如抗壞血酸衍生物與無機鹼的鹽、抗壞血酸衍生物與有機鹼的鹽等。 作為與無機鹼的鹽，可列舉例如鈉鹽、鉀鹽等鹼金屬鹽；鈣鹽、鎂鹽等鹼土族金屬鹽；鋁鹽；銨鹽；鋅鹽等。 作為與有機鹼的鹽，可列舉例如烷基銨鹽、與鹼性胺基酸的鹽等。
作為本實施形態之自噬活化劑中之抗壞血酸衍生物或其鹽，在上述之中，較佳為(i)磷酸抗壞血酸酯或其鹽、(ii)磷酸抗壞血酸酯的脂肪酸酯或其鹽、(iii)乙基抗壞血酸或其鹽、(iv)抗壞血酸葡萄糖苷或其鹽。
≪(i)磷酸抗壞血酸酯或其鹽≫ ・磷酸抗壞血酸酯 磷酸抗壞血酸酯為將磷酸基導入抗壞血酸的至少1個羥基中而得之化合物。 作為磷酸抗壞血酸酯，可適合地列舉下述化學式(1)所示之化合物。 下述化學式(1)所示之化合物為藉由磷酸酯保護抗壞血酸的2位的羥基而得之抗壞血酸-2-磷酸酯。
Figure 02_image001
在磷酸抗壞血酸酯中，存在D體及L體的立體異構物，以及外消旋體的DL體。本實施形態中之磷酸抗壞血酸酯可為此等立體異構物中之任何者，從取得容易性之觀點而言，較佳為L體，具體而言，較佳為L-抗壞血酸-2-磷酸酯。
・磷酸抗壞血酸酯的鹽 作為磷酸抗壞血酸酯的鹽，可列舉例如磷酸抗壞血酸酯與無機鹼的鹽、磷酸抗壞血酸酯與有機鹼的鹽等。
作為與無機鹼的鹽，可列舉例如鈉鹽、鉀鹽等鹼金屬鹽；鈣鹽、鎂鹽等鹼土族金屬鹽；鋁鹽；銨鹽；鋅鹽等。 作為與有機鹼的鹽，可列舉例如烷基銨鹽、與鹼性胺基酸的鹽等。
作為磷酸抗壞血酸酯的鹽，在上述之中，較佳為鹼金屬鹽或鹼土族金屬鹽，更佳為鈉鹽或鎂鹽，再佳為鎂鹽。 磷酸抗壞血酸酯的鎂鹽從安定性較高且不易被著色之觀點而言係較佳。
作為本實施形態之自噬活化劑中之磷酸抗壞血酸酯或其鹽，在上述之中，從安定性提升之觀點而言，較佳為磷酸抗壞血酸酯的鹽，更佳為上述化學式(1)所示之化合物的鹼金屬鹽或上述化學式(1)所示之化合物的鹼土族金屬鹽，再佳為上述化學式(1)所示之化合物的鈉鹽或上述化學式(1)所示之化合物的鎂鹽。 具體而言，上述化學式(1)所示之化合物的鎂鹽特佳為L-抗壞血酸-2-磷酸酯的鎂鹽。 具體而言，上述化學式(1)所示之化合物的鈉鹽特佳為L-抗壞血酸-2-磷酸酯的鈉鹽。
本實施形態之自噬活化劑中之磷酸抗壞血酸酯或其鹽可單獨使用1種，亦可併用2種以上而使用。
磷酸抗壞血酸酯或其鹽可藉由公知的製造方法，例如日本專利特開平2-279690、日本專利特開平6-345786所記載之方法等來予以製造。 例如，作為磷酸抗壞血酸酯的具體製造方法，可藉由使抗壞血酸及氧氯化磷等進行反應來進行磷酸化而獲得。 此外，作為磷酸抗壞血酸酯的鹽的具體製造方法，可藉由將磷酸抗壞血酸酯溶液以氧化鎂等金屬氧化物或氫氧化鈉等金屬氫氧化物等進行中和而獲得磷酸抗壞血酸酯的鹽。
作為本實施形態之自噬活化劑中之磷酸抗壞血酸酯的鹽之市售例，可列舉昭和電工公司製的抗壞血酸PS(化合物名；L-抗壞血酸-2-磷酸酯的鈉鹽(亦稱為L-抗壞血酸-2-磷酸鈉)，標示名稱；磷酸抗壞血酸酯鈉)、昭和電工公司製的抗壞血酸PM(化合物名；L-抗壞血酸-2-磷酸酯的鎂鹽(亦稱為L-抗壞血酸-2-磷酸鎂)，標示名稱；磷酸抗壞血酸酯鎂)等。
≪(ii)磷酸抗壞血酸酯的脂肪酸酯或其鹽≫ ・磷酸抗壞血酸酯的脂肪酸酯 磷酸抗壞血酸酯的脂肪酸酯為脂肪酸進行酯鍵結至磷酸抗壞血酸酯的至少1個羥基而得之化合物。作為該脂肪酸，較佳為碳原子數6～22的直鏈狀或分枝鏈狀脂肪酸(即，鍵結至羧基之直鏈狀或分枝鏈狀烷基的碳原子數為5～21之脂肪酸)，更佳為碳原子數10～20的直鏈狀或分枝鏈狀脂肪酸，再佳為碳原子數12～18的直鏈狀或分枝鏈狀脂肪酸。 作為磷酸抗壞血酸酯的脂肪酸酯，可列舉下述一般式(2)所示之化合物。下述一般式(2)所示之化合物為磷酸進行酯鍵結至抗壞血酸的2位的羥基，且脂肪酸進行酯鍵結至6位的羥基而得之抗壞血酸-2-磷酸-6-脂肪酸。
Figure 02_image003
[式中，R 1為碳原子數5～21的直鏈狀或分枝鏈狀烷基]。
上述一般式(2)中，R 1為碳原子數5～21的直鏈狀或分枝鏈狀烷基。具體而言，可列舉直鏈狀或分枝鏈狀戊基、直鏈狀或分枝鏈狀己基、直鏈狀或分枝鏈狀庚基、直鏈狀或分枝鏈狀辛基、直鏈狀或分枝鏈狀壬基、直鏈狀或分枝鏈狀癸基、直鏈狀或分枝鏈狀十一烷基、直鏈狀或分枝鏈狀十二烷基、直鏈狀或分枝鏈狀十三烷基、直鏈狀或分枝鏈狀十四烷基、直鏈狀或分枝鏈狀十五烷基、直鏈狀或分枝鏈狀十六烷基、直鏈狀或分枝鏈狀十七烷基、直鏈狀或分枝鏈狀十八烷基、直鏈狀或分枝鏈狀十九烷基、直鏈狀或分枝鏈狀二十烷基、直鏈狀或分枝鏈狀二十一烷基。
上述一般式(2)中，R 1在上述之中，較佳為碳原子數9～19的直鏈狀或分枝鏈狀烷基，更佳為碳原子數11～17的直鏈狀或分枝鏈狀烷基，再佳為碳原子數13～15的直鏈狀或分枝鏈狀烷基，從原料取得性等之觀點而言，特佳為碳原子數15的直鏈狀烷基(直鏈狀十五烷基)。 即，作為上述一般式(2)所示之化合物，特佳為6-O-棕櫚醯基抗壞血酸-2-磷酸酯(亦稱為抗壞血酸-2-磷酸-6-棕櫚酸)。
在磷酸抗壞血酸酯的脂肪酸酯中，存在D體及L體的立體異構物，以及外消旋體的DL體。本實施形態中之磷酸抗壞血酸酯的脂肪酸酯可為此等立體異構物中之任何者，從取得容易性之觀點而言，較佳為L體，具體而言，較佳為L-抗壞血酸-2-磷酸酯的脂肪酸酯。
・磷酸抗壞血酸酯的脂肪酸酯的鹽 作為磷酸抗壞血酸酯的脂肪酸酯的鹽，可列舉例如磷酸抗壞血酸酯的脂肪酸酯與無機鹼的鹽、磷酸抗壞血酸酯的脂肪酸酯與有機鹼的鹽等。
作為與無機鹼的鹽，可列舉例如鈉鹽、鉀鹽等鹼金屬鹽；鈣鹽、鎂鹽等鹼土族金屬鹽；鋁鹽；銨鹽；鋅鹽等。 作為與有機鹼的鹽，可列舉例如烷基銨鹽、與鹼性胺基酸的鹽等。
作為磷酸抗壞血酸酯的脂肪酸酯的鹽，在上述之中，較佳為鹼金屬鹽或鹼土族金屬鹽，更佳為鈉鹽或鎂鹽，再佳為鈉鹽。 磷酸抗壞血酸酯的脂肪酸酯的鈉鹽從安定性及向製劑之摻合容易性之觀點而言係較佳。
作為本實施形態之自噬活化劑中之磷酸抗壞血酸酯的脂肪酸酯或其鹽，在上述之中，從安定性及向製劑之摻合容易性之觀點而言，較佳為磷酸抗壞血酸酯的脂肪酸酯的鹽，更佳為上述一般式(2)所示之化合物的鹼金屬鹽或上述一般式(2)所示之化合物的鹼土族金屬鹽，再佳為上述一般式(2)所示之化合物的鈉鹽或上述一般式(2)所示之化合物的鎂鹽，特佳為上述一般式(2)所示之化合物的鈉鹽，具體而言，L-抗壞血酸-2-磷酸-6-棕櫚酸的鈉鹽。
本實施形態之自噬活化劑中之磷酸抗壞血酸酯的脂肪酸酯或其鹽可單獨使用1種，亦可併用2種以上而使用。
本實施形態之自噬活化劑中之磷酸抗壞血酸酯的脂肪酸酯或其鹽可藉由公知的製造方法，例如日本專利6265550所記載之方法等來予以製造。 例如，作為磷酸抗壞血酸酯的脂肪酸酯的具體製造方法，可藉由以與上述之磷酸抗壞血酸酯的製造方法同樣的方法製造磷酸抗壞血酸酯後，使該磷酸抗壞血酸酯及脂肪酸或其酯進行縮合反應而獲得。 此外，作為磷酸抗壞血酸酯的脂肪酸酯的鹽的具體製造方法，可藉由將磷酸抗壞血酸酯的脂肪酸酯溶液以氧化鎂等金屬氧化物或氫氧化鈉等金屬氫氧化物等進行中和，而獲得磷酸抗壞血酸酯的脂肪酸酯的鹽。
作為本實施形態之自噬活化劑中之磷酸抗壞血酸酯的脂肪酸酯的鹽之市售例，可列舉昭和電工公司製的Apprecier(註冊商標)(APPS)(化合物名；L-抗壞血酸-2-磷酸-6-棕櫚酸的鈉鹽(亦稱為L-6-O-棕櫚醯基抗壞血酸-2-磷酸酯的鈉鹽)，標示名稱；抗壞血酸棕櫚酸酯磷酸酯三鈉)等。
≪(iii)乙基抗壞血酸或其鹽≫ ・乙基抗壞血酸 乙基抗壞血酸為將乙基導入抗壞血酸的至少1個羥基中而得之化合物。 作為乙基抗壞血酸，可適合地列舉下述化學式(3)所示之化合物。 下述化學式(3)所示之化合物為抗壞血酸的3位的羥基的氫原子經乙基所取代而得之3-O-乙基抗壞血酸。
Figure 02_image005
在乙基抗壞血酸中，存在D體及L體的立體異構物，以及外消旋體的DL體。乙基抗壞血酸可為此等立體異構物中之任何者，從取得容易性之觀點而言，較佳為L體，具體而言，較佳為L-3-O-乙基抗壞血酸(亦稱為3-O-乙基-L-抗壞血酸)。
・乙基抗壞血酸的鹽 作為乙基抗壞血酸的鹽，可列舉例如乙基抗壞血酸與無機鹼的鹽、乙基抗壞血酸與有機鹼的鹽等。
作為與無機鹼的鹽，可列舉例如鈉鹽、鉀鹽等鹼金屬鹽；鈣鹽、鎂鹽等鹼土族金屬鹽；鋁鹽；銨鹽；鋅鹽等。 作為與有機鹼的鹽，可列舉例如烷基銨鹽、與鹼性胺基酸的鹽等。
作為本實施形態之自噬活化劑中之乙基抗壞血酸或其鹽，在上述之中，從取得容易性之觀點而言，較佳為乙基抗壞血酸，更佳為L-3-O-乙基抗壞血酸。
本實施形態之自噬活化劑中之乙基抗壞血酸或其鹽可單獨使用1種，亦可併用2種以上而使用。
乙基抗壞血酸或其鹽可藉由公知的製造方法來予以製造。 例如，作為乙基抗壞血酸的製造方法，可藉由將抗壞血酸於二甲基亞碸(DMSO)中在甲氧化鈉存在下藉由鹵化烷基進行烷基化之方法；日本專利特開平8-134055、日本專利特開平1-228977所記載之方法等來予以製造。 此外，作為乙基抗壞血酸的鹽的具體製造方法，可藉由將乙基抗壞血酸溶液以氧化鎂等金屬氧化物或氫氧化鈉等金屬氫氧化物等進行中和，而獲得乙基抗壞血酸的鹽。
作為本實施形態之自噬活化劑中之乙基抗壞血酸之市售例，可列舉富士Film和光純藥公司製的3-O-乙基-L-抗壞血酸(標示名稱；3-O-乙基抗壞血酸)等。
≪(iv)抗壞血酸葡萄糖苷或其鹽≫ ・抗壞血酸葡萄糖苷 抗壞血酸葡萄糖苷為抗壞血酸的至少1個羥基經葡萄糖苷化而得之化合物。葡萄糖苷鍵結較佳為α-葡萄糖苷鍵結。 作為抗壞血酸葡萄糖苷，可適合地列舉下述化學式(4)所示之化合物。 下述化學式(4)所示之化合物為葡萄糖鍵結至抗壞血酸的2位的羥基而得之抗壞血酸2-葡萄糖苷。
Figure 02_image007
在抗壞血酸中，存在D體及L體的立體異構物，以及外消旋體的DL體。抗壞血酸葡萄糖苷中之抗壞血酸可為此等立體異構物中之任何者，從取得容易性之觀點而言，較佳為L體，具體而言，抗壞血酸葡萄糖苷較佳為L-抗壞血酸-2-葡萄糖苷。抗壞血酸葡萄糖苷中之葡萄糖可為D體，亦可為L體，從取得容易性之觀點而言，較佳為D體。
・抗壞血酸葡萄糖苷的鹽 作為抗壞血酸葡萄糖苷的鹽，可列舉例如抗壞血酸葡萄糖苷與無機鹼的鹽、抗壞血酸葡萄糖苷與有機鹼的鹽等。
作為與無機鹼的鹽，可列舉例如鈉鹽、鉀鹽等鹼金屬鹽；鈣鹽、鎂鹽等鹼土族金屬鹽；鋁鹽；銨鹽；鋅鹽等。 作為與有機鹼的鹽，可列舉例如烷基銨鹽、與鹼性胺基酸的鹽等。
作為本實施形態之自噬活化劑中之抗壞血酸葡萄糖苷或其鹽，在上述之中，從取得容易性之觀點而言，較佳為抗壞血酸葡萄糖苷，更佳為L-抗壞血酸2-葡萄糖苷。
本實施形態之自噬活化劑中之抗壞血酸葡萄糖苷或其鹽可單獨使用1種，亦可併用2種以上而使用。
抗壞血酸葡萄糖苷或其鹽可藉由例如日本專利特開平03-139288所記載之方法等來予以製造。 例如，作為抗壞血酸葡萄糖苷的具體製造方法，可藉由使1分子葡萄糖以酵素反應進行α-葡萄糖苷鍵結至抗壞血酸的2位的羥基而予以製造。 此外，作為抗壞血酸葡萄糖苷的鹽的具體製造方法，可藉由將抗壞血酸葡萄糖苷溶液以氧化鎂等金屬氧化物或氫氧化鈉等金屬氫氧化物等進行中和，而獲得抗壞血酸葡萄糖苷的鹽。
作為本實施形態之自噬活化劑中之抗壞血酸葡萄糖苷之市售例，可列舉林原公司製的抗壞血酸2-葡萄糖苷(化合物名；L-抗壞血酸2-葡萄糖苷，標示名稱；抗壞血酸葡萄糖苷)等。
本實施形態之自噬活化劑中之抗壞血酸衍生物或其鹽可單獨使用1種，亦可併用2種以上而使用。 作為本實施形態之自噬活化劑中之抗壞血酸衍生物或其鹽，在上述之中，從使自噬更活化之觀點而言，較佳為(i)磷酸抗壞血酸酯或其鹽或(ii)磷酸抗壞血酸酯的脂肪酸酯或其鹽，更佳為(ii)磷酸抗壞血酸酯的脂肪酸酯或其鹽。
本實施形態之自噬活化劑在治療阿茲海默症、亨丁頓氏症、帕金森氏症等神經退化性疾患之目的下，可將其本身投予至患者而使用。此外，本實施形態之自噬活化劑在活化自噬之目的下，亦可摻合至醫藥品或化妝品中而使用。此外，亦可摻合至後述之自噬活化用組成物中而使用。
本實施形態之自噬活化劑可藉由促進LC3基因的表現而有效地活化自噬。 本實施形態之自噬活化劑可藉由促進ATG5基因的表現而有效地活化自噬。 本實施形態之自噬活化劑可藉由促進ATG7基因的表現而有效地活化自噬。 本實施形態之自噬活化劑可藉由促進Beclin 1基因的表現而有效地活化自噬。 本實施形態之自噬活化劑可有效地活化自噬，故可用於預防或治療阿茲海默症。
已知類澱粉β會引起神經細胞中之自噬的降低。此外，已知類澱粉β會誘使自噬的降低及其所引發之神經細胞的被稱為細胞凋亡之細胞死亡。 本實施形態之自噬活化劑可促進在類澱粉β存在下之LC3基因表現。 本實施形態之自噬活化劑可促進在類澱粉β存在下之ATG5基因表現。 本實施形態之自噬活化劑可促進在類澱粉β存在下之ATG7基因表現。 本實施形態之自噬活化劑可促進在類澱粉β存在下之Beclin 1基因表現。 本實施形態之自噬活化劑可抑制在類澱粉β存在下之細胞凋亡。 本實施形態之自噬活化劑，特定而言，在神經細胞中，可促進在類澱粉β存在下之選自由LC3基因、ATG5基因、ATG7基因及Beclin 1基因所組成之群組之至少1種基因的表現。此外，本實施形態之自噬活化劑，特定而言，在神經細胞中，可抑制在類澱粉β存在下之細胞凋亡。
所謂在類澱粉β存在下促進LC3基因表現，係意味藉由在類澱粉β存在下投予本實施形態之自噬活化劑，而使LC3基因的表現量相較於未投予前述自噬活化劑之情況而言上升。針對ATG5基因、ATG7基因及Beclin 1基因亦相同。 所謂在類澱粉β存在下抑制細胞凋亡，係意味藉由在類澱粉β存在下投予本實施形態之自噬活化劑，而使細胞凋亡相較於未投予前述自噬活化劑之情況而言受到抑制。
LC3(microtubule associated protein 1 light chain 3 alpha：NCBI Gene ID：84557)係在自噬的訊息傳遞上游被附加磷脂醯乙醇胺，轉換成會被自噬體膜所吸引之LC3-II，結合至自噬體膜。LC3係用作自噬體的標記。作為人類LC3基因的鹼基序列，可列舉例如登錄於NCBI Reference Sequence資料庫之NM_032514.4及NM_181509.3等。
ATG5(autophagy related 5：NCBI Gene ID：9474)係與ATG12進行結合，在泛素樣共軛系統中作為E1樣活化酵素而發揮機能。作為人類ATG5基因的鹼基序列，可列舉例如登錄於NCBI Reference Sequence資料庫之NM_001286106.1、NM_001286107.1、NM_001286108.1、NM_001286111.1及NM_004849.4等。
ATG7(autophagy related 7：NCBI Gene ID：10533)係作為ATP依存性地活化LC3及ATG12之E1樣活化酵素而發揮機能。作為人類ATG7基因的鹼基序列，可列舉例如登錄於NCBI Reference Sequence資料庫之NM_001136031.3、NM_001144912.2、NM_001349232.2、NM_001349233.2、NM_001349234.2等。
Beclin 1(NCBI Gene ID：8678)係與ATG14L、Vps34mp150共同地形成第III類PI3K複合體，作為自噬體形成的正控制因子而發揮機能。作為人類Beclin 1基因的鹼基序列，可列舉例如登錄於NCBI Reference Sequence資料庫之NM_001313998.2、NM_001313999.1、NM_001314000.1及NM_003766.4等。
本實施形態之自噬活化劑可投予至阿茲海默症、亨丁頓氏症、帕金森氏症等神經退化性疾患的發病風險較高的患者，用於預防阿茲海默症、亨丁頓氏症、帕金森氏症等神經退化性疾患。此外，本實施形態之自噬活化劑亦可投予至阿茲海默症、亨丁頓氏症、帕金森氏症等神經退化性疾患已發病之患者，用於抑制神經退化性疾患的進展或惡化。
本實施形態之自噬活化劑可藉由與後述之自噬活化用組成物同樣的方法來投予至患者，可經口投予，亦可非經口投予，可進行靜脈內、動脈內、肌肉內、皮內、皮下、腹腔內等投予，亦可以栓劑之形式進行直腸內投予，亦可以皮膚外用劑之形式投予至皮膚。
(自噬活化用組成物) 本實施形態之自噬活化用組成物含有上述之含有抗壞血酸衍生物或其鹽之自噬活化劑，及藥學上可容許之載體。
本實施形態之自噬活化用組成物可依照常法(例如日本藥典所記載之方法)，藉由將上述之自噬活化劑、藥學上可容許之載體及視情況其他成分進行混合並加以製劑化而予以製造。
在本說明書中，所謂「藥學上可容許之載體」，係意味不會阻礙有效成分的生理活性，且對其投予對象不會顯示出實質的毒性之載體。 另外，所謂「不會顯示出實質的毒性」，係意味該成分在通常所使用之投予量下，對投予對象不會顯示出毒性。 作為藥學上可容許之載體，並無特別限制，可列舉賦形劑、黏合劑、崩解劑、潤滑劑、安定劑、稀釋劑、注射劑用溶劑、保濕劑、觸感提升劑、界面活性劑、高分子/增黏/凝膠化劑、溶劑、噴射劑、抗氧化劑、還原劑、氧化劑、螯合劑、酸、鹼、粉體、無機鹽、水、含有金屬之化合物、不飽和單體、多元醇、高分子添加劑、潤濕劑、增黏劑、黏著賦予物質、油性原料、液狀基質、脂溶性物質、高分子羧酸鹽等。
作為此等成分之具體例，可列舉例如國際公開公報第2016/076310號所記載者等。再者，作為高分子/增黏/凝膠化劑之具體例，可列舉甲基丙烯醯基氧基乙基磷醯膽鹼、甲基丙烯酸丁酯或此等的聚合物等。 本實施形態之自噬活化用組成物中之藥學上可容許之載體可單獨使用1種，亦可併用2種以上。
此外，作為其他成分，並無特別限制，可列舉防腐劑、抗菌劑、紫外線吸收劑、美白劑、抗壞血酸衍生物或其鹽以外之維生素類及其衍生物類、消炎劑、抗炎症劑、生髮用藥劑、血液循環促進劑、刺激劑、激素類、抗皺劑、抗老化劑、緊緻劑、冷感劑、溫感劑、創傷治癒促進劑、刺激緩和劑、鎮痛劑、細胞賦活劑、植物/動物/微生物萃取物、種子油、鎮癢劑、角質剝離/溶解劑、制汗劑、清涼劑、收斂劑、酵素、核酸、香料、色素、著色劑、染料、顏料、消炎鎮痛劑、抗真菌劑、抗組織胺劑、催眠鎮靜劑、精神安定劑、抗高血壓劑、降壓利尿劑、抗生物質、麻醉劑、抗菌性物質、抗癲癇劑、冠狀血管擴張劑、生藥、止癢劑、角質軟化剝離劑、紫外線遮斷劑、殺菌劑、抗氧化物質、pH調整劑、添加劑、金屬皂等。作為此等成分之具體例，可列舉例如國際公開公報第2016/076310號所記載者等。再者，作為植物/動物/微生物萃取物之具體例，可列舉歐洲稻槎菜(Lapsana communis)花/葉/莖、茶葉等。作為種子油之具體例，可列舉辣木種子油。作為香料之具體例，可列舉紫蘇醛。 其他成分可單獨使用1種，亦可併用2種以上。
本實施形態之自噬活化用組成物可含有治療有效量的前述自噬活化劑。所謂「治療有效量」，係意味有效於治療或預防患者的疾患之藥劑的量。治療有效量可依投予對象的疾患的狀態、年齡、性別及體重等而變動。 在本實施形態之自噬活化用組成物中，上述自噬活化劑的治療有效量可為抗壞血酸衍生物或其鹽可活化自噬之量。此外，上述自噬活化劑的治療有效量為抗壞血酸衍生物或其鹽可促進選自由LC3基因、ATG5基因、ATG7基因及Beclin 1基因所組成之群組之至少1種基因的表現之量。此外，上述自噬活化劑的治療有效量可為抗壞血酸衍生物或其鹽可在類澱粉β的存在下抑制細胞凋亡之量。
本實施形態之自噬活化用組成物中之前述自噬活化劑的治療有效量(抗壞血酸衍生物或其鹽之合計含量)係相對於自噬活化用組成物全量而言，可例如為0.05～15質量%，亦可例如為0.1～10質量%，亦可例如為0.5～5質量%。 另外，所謂抗壞血酸衍生物或其鹽之合計含量，在單獨使用1種抗壞血酸衍生物或其鹽之情況，係意味該化合物的含量，在組合使用2種以上抗壞血酸衍生物或其鹽之情況，係意味此等化合物之合計的含量。
本實施形態之自噬活化用組成物可為醫藥組成物，亦可為化妝料。
(醫藥組成物) 在一實施形態中，本發明係提供一種自噬活化用醫藥組成物，其含有上述之自噬活化劑及藥學上可容許之載體。
在本實施形態之醫藥組成物中，作為藥學上可容許之載體，並無特別限制，除了上述所列舉者以外，尚可使用一般使用於醫藥品之載體。例如，可使用記載於日本藥典、日本藥典外醫藥品規格、醫藥品添加物規格2013(藥事日報社，2013年)、醫藥品添加物辭典2016(日本醫藥品添加劑協會編，藥事日報社，2016年)、Handbook of Pharmaceutical Excipients, 7th edition(Pharmaceutical Press，2012年)等之一般的原料。 藥學上可容許之載體可單獨使用1種，亦可併用2種以上。
本實施形態之醫藥組成物係除了前述自噬活化劑及藥學上可容許之載體以外，亦可含有其他成分。作為其他成分，並無特別限制，可使用一般的醫藥品添加物。此外，作為其他成分，亦可使用上述之自噬活化劑以外之活性成分。作為當作其他成分之醫藥品添加物及活性成分，除了上述所列舉者以外，尚可使用例如記載於日本藥典、日本藥典外醫藥品規格、醫藥品添加物規格2013(藥事日報社，2013年)、醫藥品添加物辭典2016(日本醫藥品添加劑協會編，藥事日報社，2016年)、Handbook of Pharmaceutical Excipients, 7th edition(Pharmaceutical Press，2012年)等之一般的原料。其他成分可單獨使用1種，亦可併用2種以上。
作為本實施形態之醫藥組成物的劑型，並無特別限制，可製成一般用作醫藥品製劑之劑型。可列舉例如錠劑、被覆錠劑、丸劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑、液劑、懸浮劑、乳劑等經口投予之劑型；以及注射劑、栓劑、皮膚外用劑等非經口投予之劑型等。此等劑型的醫藥組成物可依照常規法(例如日本藥典所記載之方法)來予以製劑化。
本實施形態之醫藥組成物的投予方法並無特別限制，可藉由一般用作醫藥品的投予方法之方法來進行投予。例如，可以錠劑、被覆錠劑、丸劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑、液劑、懸浮劑、乳劑等之形式進行經口投予，亦可以注射劑、輸液製劑等之形式單獨地或與葡萄糖液、林格氏液等一般的輸液進行混合，進行靜脈內、動脈內、肌肉內、皮內、皮下、腹腔內等投予，亦可以栓劑之形式進行直腸內投予，亦可以皮膚外用劑之形式投予至皮膚。
本實施形態之醫藥組成物的投予量可設為治療有效量。治療有效量只要依患者的症狀、體重、年齡及性別等以及醫藥組成物的劑型及投予方法等而適宜決定即可。 例如，本實施形態之醫藥組成物的投予量可列舉如下：在經口投予之情況，就抗壞血酸衍生物或其鹽之合計含量而言每投予單位形態0.01～500mg，在注射劑之情況，就抗壞血酸衍生物或其鹽之合計含量而言每投予單位形態0.02～250mg，在栓劑之情況，就抗壞血酸衍生物或其鹽之合計含量而言每投予單位形態0.01～500mg，在皮膚外用劑之情況，就抗壞血酸衍生物或其鹽之合計含量而言每投予單位形態0.01～500mg等。
本實施形態之醫藥組成物的投予間隔只要依患者的症狀、體重、年齡及性別等以及醫藥組成物的劑型及投予方法等而適宜決定即可。例如，可設為1日1次或2～3次左右等。
本實施形態之醫藥組成物可用於治療或預防起因於自噬活性的降低之疾患。作為該種疾患，可列舉例如阿茲海默症、亨丁頓氏症、帕金森氏症、SENDA病等神經退化性疾患；克隆氏症等炎症性腸疾患；癌症等。
本實施形態之醫藥組成物可投予至例如阿茲海默症、亨丁頓氏症、帕金森氏症、SENDA病等神經退化性疾患；克隆氏症等炎症性腸疾患；或癌症的患者，用於抑制神經退化性疾患、炎症性腸疾患或癌症的進展。此外，本實施形態之醫藥組成物可投予至阿茲海默症、亨丁頓氏症、帕金森氏症、SENDA病等神經退化性疾患；克隆氏症等炎症性腸疾患；或癌症的患者，用於治療神經退化性疾患、炎症性腸疾患或癌症。此外，本實施形態之醫藥組成物可用於治療起因於類澱粉β之疾患。此外，本實施形態之醫藥組成物可用於治療起因於LC3基因、ATG5基因、ATG7基因或Beclin 1基因的表現量降低之疾患。 在上述之中，本實施形態之醫藥組成物可特別適合地用於治療阿茲海默症。
本實施形態之醫藥組成物亦可投予至以阿茲海默症為首之亨丁頓氏症、帕金森氏症、SENDA病等神經退化性疾患的發病風險較高的患者，用於預防神經退化性疾患。此外，本實施形態之醫藥組成物亦可投予至克隆氏症等炎症性腸疾患的發病風險較高的患者，用於預防炎症性腸疾患。此外，本實施形態之醫藥組成物亦可投予至癌症的發病風險較高的患者，用於預防癌症。
(化妝料) 在一實施形態中，本發明係提供一種用於活化自噬之化妝料，其含有上述之自噬活化劑及藥學上可容許之載體。
在本實施形態之化妝料中，作為藥學上可容許之載體，並無特別限制，除了上述所列舉者以外，尚可使用一般使用於化妝料之載體。例如，可使用記載於化妝品原料基準第二版註解(日本公定書協會編，藥事日報社，1984年)、化妝品原料基準外成分規格(日本厚生省藥務局審查課監修，藥事日報社，1993年)、化妝品原料基準外成分規格追補(日本厚生省藥務局審查課監修，藥事日報社，1993年)、化妝品種別許可基準(日本厚生省藥務局審查課監修，藥事日報社，1993年)、化妝品原料辭典(日光Chemicals公司，日本平成3年)、International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook 2002 Ninth Edition Vol.1~4, by CTFA等之一般的原料。 藥學上可容許之載體可單獨使用1種，亦可併用2種以上。
本實施形態之化妝料係除了自噬活化劑及藥學上可容許之載體以外，亦可含有其他成分。作為其他成分，並無特別限制，可使用一般的化妝品添加物。此外，作為其他成分，亦可使用上述之自噬活化劑以外之活性成分。作為當作其他成分之化妝品添加物及活性成分，除了上述所列舉者以外，尚可使用例如記載於化妝品原料基準第二版註解(日本公定書協會編，藥事日報社，1984年)、化妝品原料基準外成分規格(日本厚生省藥務局審查課監修，藥事日報社，1993年)、化妝品原料基準外成分規格追補(日本厚生省藥務局審查課監修，藥事日報社，1993年)、化妝品種別許可基準(日本厚生省藥務局審查課監修，藥事日報社，1993年)、化妝品原料辭典(日光Chemicals公司，日本平成3年)、International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook 2002 Ninth Edition Vol.1~4, by CTFA等之一般的原料。其他成分可單獨使用1種，亦可併用2種以上。
作為本實施形態之化妝料的形態，並無特別限制，可製成一般用作化妝料之形態。可列舉例如洗髮精、潤絲精、整髮劑等毛髮用化妝料；洗顏料、清潔劑、化妝水、乳液、護膚液、乳霜、凝膠、防曬劑、面膜、臉膜、美容液等基礎化妝料；粉底類、妝前修飾品、口紅類、唇蜜、腮紅類等彩妝化妝料；身體洗淨料、身體粉、防臭化妝料等身體化妝料等。此等化妝料可依照常規法來予以製造。
此外，作為本實施形態之化妝料的劑型，並無特別限制，可列舉例如水中油(O/W)型、油中水(W/O)型、W/O/W型、O/W/O型等乳化型、乳化高分子型、油性、固形、液狀、糊狀、棒狀、揮發性油型、粉狀、膠凍狀、凝膠狀、膏狀、乳霜狀、片狀、膜狀、霧狀、噴霧型、氣溶膠狀、多層狀、泡狀、碎片狀等。
本實施形態之化妝料的使用量並無特別限制，可設為有效於活化自噬之量。 例如，本實施形態之化妝料的使用量就抗壞血酸衍生物或其鹽之合計含量而言每1次使用為0.01～500mg，亦可例如為0.15～300mg，亦可例如為0.15～200mg，亦可例如為0.2～100mg。
本實施形態之化妝料的使用間隔並無特別限制，例如，可設為1日1次或2～3次左右等。
本實施形態之化妝料可用於緩和起因於自噬活性的降低之症狀。或者，亦可為了預防起因於自噬活性的降低之症狀的發病，而由此等的發病風險較高的被驗者使用於日常的肌膚保養或彩妝。
(其他實施形態) 在一實施形態中，本發明係提供一種活化自噬之方法，其包含將抗壞血酸衍生物或其鹽投予至對象之步驟。
在一實施形態中，本發明係提供一種促進LC3基因、ATG5基因、ATG7基因或Beclin 1基因的表現之方法，其包含將抗壞血酸衍生物或其鹽投予至對象之步驟。
在一實施形態中，本發明係提供一種抑制在類澱粉β存在下之細胞凋亡之方法，其包含將抗壞血酸衍生物或其鹽投予至對象之步驟。
在一實施形態中，本發明係提供一種抗壞血酸衍生物或其鹽，其係用於活化自噬。
在一實施形態中，本發明係提供一種抗壞血酸衍生物或其鹽，其係用於促進LC3基因、ATG5基因、ATG7基因或Beclin 1基因的表現。
在一實施形態中，本發明係提供一種抗壞血酸衍生物或其鹽，其係用於抑制在類澱粉β存在下之細胞凋亡。
在一實施形態中，本發明係提供一種抗壞血酸衍生物或其鹽，其係用於預防或治療阿茲海默症、亨丁頓氏症、帕金森氏症、SENDA病、克隆氏症或癌症。
在一實施形態中，本發明係提供一種抗壞血酸衍生物或其鹽的使用，其係用於製造自噬活化劑。
在一實施形態中，本發明係提供一種抗壞血酸衍生物或其鹽的使用，其係用於製造LC3基因、ATG5基因、ATG7基因或Beclin 1基因表現的促進劑。
在一實施形態中，本發明係提供一種抗壞血酸衍生物或其鹽的使用，其係用於製造在類澱粉β存在下之LC3基因、ATG5基因、ATG7基因或Beclin 1基因表現的促進劑。
在一實施形態中，本發明係提供一種抗壞血酸衍生物或其鹽的使用，其係用於製造在類澱粉β存在下之細胞凋亡的抑制劑。
在一實施形態中，本發明係提供一種抗壞血酸衍生物或其鹽的使用，其係用於製造自噬活化用組成物。
在一實施形態中，本發明係提供一種抗壞血酸衍生物或其鹽的使用，其係用於製造LC3基因、ATG5基因、ATG7基因或Beclin 1基因表現的促進用組成物。
在一實施形態中，本發明係提供一種抗壞血酸衍生物或其鹽的使用，其係用於製造在類澱粉β存在下之LC3基因、ATG5基因、ATG7基因或Beclin 1基因表現的促進用組成物。
在一實施形態中，本發明係提供一種抗壞血酸衍生物或其鹽的使用，其係用於製造在類澱粉β存在下之細胞凋亡的抑制用組成物。 [實施例]
以下，藉由實施例來進一步詳細地說明本發明，但本發明並不受此等例所限定。
[抗壞血酸衍生物或其鹽] 在以下實施例及配方例中，係使用下述抗壞血酸衍生物或其鹽。 APM：L-抗壞血酸-2-磷酸酯的鎂鹽(標示名稱；磷酸抗壞血酸酯鎂，製品名；抗壞血酸PM，昭和電工公司製) APPS：L-抗壞血酸-2-磷酸-6-棕櫚酸的鈉鹽(標示名稱；抗壞血酸棕櫚酸酯磷酸酯三鈉，製品名；Apprecier (APPS)，昭和電工公司製) AG：L-抗壞血酸2-葡萄糖苷(標示名稱；抗壞血酸葡萄糖苷，製品名；抗壞血酸2-葡萄糖苷，林原公司製) AE：3-O-乙基-L-抗壞血酸(標示名稱；3-O-乙基抗壞血酸，製品名；3-O-乙基-L-抗壞血酸，富士Film和光純藥公司製)
＜人類老化纖維母細胞中之LC3基因、ATG5基因、ATG7基因及Beclin 1基因的表現促進效果的評估＞ 為了製作經人為誘發老化之細胞，係使用纖維母細胞來施行試驗。老化纖維母細胞係藉由以下順序來予以製作。
≪老化纖維母細胞的製作≫ 在經添加10%胎牛血清(MP Biomedicals公司製)之D-MEM培養基(Sigma-Aldrich公司製)中，將人類正常纖維母細胞(NB1RGB；RIKEN BRC Cell Bank製)進行培養，直至呈匯合。然後，以250μM過氧化氫水處理2小時，以新的經添加10%胎牛血清之D-MEM培養基培養24小時。將此經由過氧化氫水之處理及細胞培養的操作重複進行3次，使所獲得之纖維母細胞成為老化纖維母細胞。
≪基因的表現促進效果的評估試驗≫ 以10000個/cm 2的接種密度準備所製作而得之老化纖維母細胞，以經添加10%胎牛血清(MP Biomedicals公司製)之D-MEM培養基(Sigma-Aldrich公司製)培養24小時。接著，在實施例1中，以APM的終濃度成為10μM之方式，將已溶於精製水中之APM添加至培養基中。在實施例2中，以APPS的終濃度成為1μM之方式，將已溶於精製水中之APPS添加至培養基中。在實施例3中，以APPS的終濃度成為10μM之方式，將已溶於精製水中之APPS添加至培養基中。在實施例4中，以AG的終濃度成為100μM之方式，將已溶於精製水中之AG添加至培養基中。在實施例5中，以AE的終濃度成為100μM之方式，將已溶於精製水中之AE添加至培養基中。 此外，在比較例1中，僅在培養基中添加精製水。 接著，將各培養基在37℃、5%CO 2下培養24小時。
在另一方面，作為參考例1，係以10000個/cm 2的接種密度準備上述人類正常纖維母細胞，以經添加10%胎牛血清(MP Biomedicals公司製)之D-MEM培養基(Sigma-Aldrich公司製)培養24小時，僅在該培養基中添加精製水。接著，將該培養基在37℃、5%CO 2下培養24小時。
然後，使用Nucleospin(註冊商標)RNA套組(Takara Bio公司製)，從各例的老化纖維母細胞或人類正常纖維母細胞中萃取出RNA，從所獲得之RNA合成cDNA。接著，以此cDNA當作模板，藉由定量即時PCR，各自使用LC3基因、ATG5基因、ATG7基因及Beclin 1基因特異性引子(Takara Bio公司製)對各基因的表現量進行定量。
對作為內部標準基因且不會因添加化合物而在基因表現上出現變動之管家基因GAPDH(引子；Takara Bio公司製)的表現量進行定量，藉由其值來對各基因的表現量進行標準化。針對前述各例中之基因表現量，求出將比較例1中之各基因的表現量各自設為1.00時之相對基因表現量。將其結果示於表1。
Figure 02_image009
如表1所示，在參考例1及比較例1中，就各自僅添加精製水所培養而得之人類正常纖維母細胞及老化纖維母細胞而言，可確認到老化纖維母細胞係LC3基因、ATG5基因、ATG7基因及Beclin 1基因的表現量皆降低。
在另一方面，就實施例1～5的添加自噬活化劑所培養而得之老化纖維母細胞而言，與比較例1的僅添加精製水所培養而得之老化纖維母細胞相比，特定而言，LC3基因的表現量較高，可確認到LC3基因的表現促進效果。 此外，在該等之中，在經添加實施例1～3的自噬活化劑之情況，即便抗壞血酸衍生物(APM及APPS)為低濃度，LC3基因的表現量亦較高，可確認到顯著的LC3基因的表現促進效果。 此外，在實施例2及3中，即便APPS為非常低濃度，亦可使LC3基因、ATG5基因、ATG7基因及Beclin 1基因中之任何者的表現量提升，可確認到APPS係LC3基因、ATG5基因、ATG7基因及Beclin 1基因的表現促進效果特別優異。
＜人類神經母細胞瘤中之LC3基因、ATG5基因、ATG7基因及Beclin 1基因的表現促進效果的評估＞ 藉由以下試驗方法來測定在自噬活化劑存在下，人類神經母細胞瘤(SH-SY5Y；從ATCC取得)中之LC3基因、ATG5基因、ATG7基因及Beclin 1基因的表現量，對自噬活化劑所引發之LC3基因、ATG5基因、ATG7基因及Beclin 1基因的表現促進效果進行評估。 在以下實施例及比較例中，係將已知會引起神經細胞中之自噬的降低之類澱粉β添加至各培養基中而施行試驗。
以10000個/cm 2的接種密度準備上述SH-SY5Y細胞，以經添加10%胎牛血清(MP Biomedicals公司製)之D-MEM/Ham’s F-12培養基(Sigma-Aldrich公司製)培養24小時。接著，在實施例6中，以APM的終濃度成為10μM之方式，將已溶於精製水中之APM添加至培養基中。在實施例7中，以APPS的終濃度成為1μM之方式，將已溶於精製水中之APPS添加至培養基中。在實施例8中，以APPS的終濃度成為10μM之方式，將已溶於精製水中之APPS添加至培養基中。在實施例9中，以AG的終濃度成為100μM之方式，將已溶於精製水中之AG添加至培養基中。在實施例10中，以AE的終濃度成為100μM之方式，將已溶於精製水中之AE添加至培養基中。 此外，在比較例2中，僅在培養基中添加精製水。 接著，調製將類澱粉β(Sigma-Aldrich公司製)溶於0.01%(V/V)DMSO中而得之類澱粉β溶液，以各培養基中之類澱粉β的終濃度成為20μM之方式，將該類澱粉β溶液添加至各培養基中。 另外，在參考例2中，僅添加精製水，並未添加類澱粉β溶液。 接著，將各培養基在37℃、5%CO 2下培養48小時。
然後，使用Nucleospin(註冊商標)RNA套組(Takara Bio公司製)，從各例的SH-SY5Y細胞中萃取出RNA，從所獲得之RNA合成cDNA。接著，以此cDNA當作模板，藉由定量即時PCR，各自使用LC3基因、ATG5基因、ATG7基因及Beclin 1基因特異性引子(Takara Bio公司製)對各基因的表現量進行定量。
對作為內部標準基因且不會因添加化合物而在表現上出現變動之管家基因GAPDH(引子；Takara Bio公司製)的表現量進行定量，藉由其值來對各基因的表現量進行標準化。針對前述各例中之基因表現量，求出將參考例2中之各基因的表現量各自設為1.00時之相對基因表現量。將其結果示於表2。
Figure 02_image011
如表2所示，在參考例2及比較例2中，與僅添加精製水所培養而得之SH-SY5Y細胞相比，就進一步添加類澱粉β所培養而得之SH-SY5Y細胞而言，可確認到LC3基因、ATG5基因、ATG7基因及Beclin 1基因的表現量皆降低。此外，在該等之中，特定而言，可確認到LC3基因的表現量降低。
在另一方面，就實施例6～10的添加自噬活化劑及類澱粉β溶液所培養而得之SH-SY5Y細胞而言，與比較例2的添加精製水及類澱粉β溶液所培養而得之SH-SY5Y細胞相比，特定而言，LC3基因的表現量較高，可確認到實施例6～10的自噬活化劑所引發之LC3基因的表現促進效果。 此外，實施例6～10的添加自噬活化劑及類澱粉β溶液所培養而得之SH-SY5Y細胞相較於參考例2的僅添加精製水所培養而得之SH-SY5Y細胞而言，可確認到ATG5、ATG7及Beclin 1基因的表現量較高。
在實施例之中，在實施例6～8中，即便抗壞血酸衍生物(APM及APPS)為低濃度，LC3基因的表現量亦較高，可確認到顯著的LC3基因的表現促進效果。 此外，在實施例7及8中，即便APPS為非常低濃度，亦可使LC3基因、ATG5基因、ATG7基因及Beclin 1基因中之任何者的表現量提升，可確認到LC3基因、ATG5基因、ATG7基因及Beclin 1基因的表現促進效果特別優異。
＜人類神經母細胞瘤中之起因於類澱粉β之細胞凋亡抑制作用的評估＞ 藉由以下試驗方法來測定在自噬活化劑存在下之人類神經母細胞瘤(SH-SY5Y；從ATCC取得)中之凋亡細胞的比例，對自噬活化劑所引發之細胞凋亡抑制作用進行評估。 在以下實施例及比較例中，係將已知會誘使自噬的降低及其所引發之神經細胞的被稱為細胞凋亡之細胞死亡之類澱粉β添加至各培養基中而施行試驗。
以50000個/cm 2的接種密度準備SH-SY5Y細胞，以經添加10%胎牛血清(MP Biomedicals公司製)之D-MEM/Ham’s F-12培養基(Sigma-Aldrich公司製)培養24小時。接著，在實施例11中，以APM的終濃度成為10μM之方式，將已溶於精製水中之APM添加至培養基中。在實施例12中，以APM的終濃度成為100μM之方式，將已溶於精製水中之APM添加至培養基中。在實施例13中，以APPS的終濃度成為1μM之方式，將已溶於精製水中之APPS添加至培養基中。在實施例14中，以APPS的終濃度成為10μM之方式，將已溶於精製水中之APPS添加至培養基中。在實施例15中，以AG的終濃度成為100μM之方式，將已溶於精製水中之AG添加至培養基中。在實施例16中，以AE的終濃度成為100μM之方式，將已溶於精製水中之AE添加至培養基中。 此外，作為比較例3，係僅在培養基中添加精製水。 接著，調製將類澱粉β(Sigma-Aldrich公司製)溶於0.01%(V/V)DMSO中而得之類澱粉β溶液，以各培養基中之類澱粉β的終濃度成為30μM之方式，將該類澱粉β溶液添加至各培養基中。 另外，在參考例3中，僅添加精製水，並未添加類澱粉β溶液。 接著，將各培養基在37℃、5%CO 2下培養48小時。
然後，在已移除培養基之各SH-SY5Y細胞中添加10μM Hoechst 33342(Sigma-Aldrich公司製)水溶液，於室溫(25℃)靜置10分鐘。去除溶液後，將各SH-SY5Y細胞以磷酸緩衝液(PBS，富士Film和光純藥公司製)洗淨，在螢光顯微鏡下計測可見到染色質凝集所引發之細胞凋亡樣強Hoechst螢光之細胞數(Hoechst(+)細胞)。在獨立試行的4個實驗中，各視野計測5000個細胞以上，將該4個試驗中之Hoechst(+)細胞的比例之平均值視為發生細胞凋亡之細胞的比例。針對各例，算出將參考例3中之凋亡細胞的比例設為1.00時之相對值，將其結果示於表3。
Figure 02_image013
如表3所示，在參考例3及比較例3中，與僅添加精製水所培養而得之參考例3的SH-SY5Y細胞相比，就進一步添加類澱粉β所培養而得之比較例3的SH-SY5Y細胞而言，可確認到凋亡細胞的比例增加。
在另一方面，就實施例11～16的添加自噬活化劑及類澱粉β溶液所培養而得之SH-SY5Y細胞而言，與比較例3的添加精製水及類澱粉β溶液所培養而得之SH-SY5Y細胞相比，可確認到凋亡細胞的比例降低。
[配方例] 作為自噬活化用組成物，係將外用劑的配方例1～4示於表4。
Figure 02_image015
[產業上之可利用性]
藉由本發明，係提供可有效地活化自噬之自噬活化劑及含有前述自噬活化劑之自噬活化用組成物。

Claims (10)

  1. 一種自噬活化劑，其含有抗壞血酸衍生物或其鹽作為有效成分。
  2. 如請求項1之自噬活化劑，其中，前述抗壞血酸衍生物或其鹽為選自由磷酸抗壞血酸酯、磷酸抗壞血酸酯的脂肪酸酯、乙基抗壞血酸及抗壞血酸葡萄糖苷所組成之群組之至少1種抗壞血酸衍生物或其鹽。
  3. 如請求項2之自噬活化劑，其中，前述抗壞血酸衍生物或其鹽為磷酸抗壞血酸酯的脂肪酸酯或其鹽。
  4. 如請求項3之自噬活化劑，其中，前述磷酸抗壞血酸酯的脂肪酸酯或其鹽為磷酸抗壞血酸酯的棕櫚酸酯或其鹽。
  5. 如請求項1至4中任一項之自噬活化劑，其含有前述抗壞血酸衍生物的鹽作為有效成分，前述抗壞血酸衍生物的鹽為抗壞血酸衍生物的鎂鹽或鈉鹽。
  6. 如請求項1至4中任一項之自噬活化劑，其促進LC3基因的表現。
  7. 如請求項1至4中任一項之自噬活化劑，其促進LC3基因、ATG5基因、ATG7基因及Beclin 1基因的表現。
  8. 如請求項1至4中任一項之自噬活化劑，其係用於預防或治療阿茲海默症(Alzheimer’s disease)。
  9. 一種自噬活化用組成物，其含有如請求項1至4中任一項之自噬活化劑及藥學上可容許之載體。
  10. 如請求項9之自噬活化用組成物，其中，前述抗壞血酸衍生物或其鹽之合計含量係相對於自噬活化用組成物全量而言為0.05～15質量%。
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