WO2022059763A1 - オートファジー活性化剤 - Google Patents

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WO2022059763A1
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ascorbic acid
autophagy
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夕子 中上
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昭和電工株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to an autophagy activator and a composition for autophagy activation.
  • Autophagy responds to extracellular or intracellular stress and signals such as starvation, growth factor deficiency, and pathogen infections by breaking down aging or damaged intracellular substances and organelles to regenerate energy. It is a mechanism for production and removal of damaging substances, and is important for maintaining the homeostasis of normal cells. From past studies, it has been reported that the intracellular autophagy activity decreases sharply as aging progresses (Non-Patent Document 1). In addition, when autophagy is suppressed, aged mitochondria and accidentally folded proteins are excessively accumulated in the cells, and the oxidative stress in the cells is increased to induce cell death, resulting in cell aging. It will be. Therefore, by decomposing the aged substances and organelles in the cells and activating autophagy that recycles the decomposition products, it is possible to promptly remove unnecessary substances in the cells and increase the homeostasis of the cells. ..
  • Non-Patent Documents 2 and 3 Especially in Alzheimer's disease, since the function of autophagy is inhibited, aggregated protein called amyloid ⁇ is accumulated in the living body, and it is said that this is involved in the onset (Non-Patent Document 4).
  • SENDA disease SENDA: static encephalopathy of childhood with neurodegeneration in adulthood
  • SENDA a neurodegenerative disease associated with iron deposition in the melanoma and paleosphere of the brain and atrophy of the cerebral tract
  • clone disease which is an inflammatory bowel disease that causes it, and cancer
  • the process of autophagy has been studied in both yeast and mammals, with up to 36 proteins utilized. Among them, the formation of autophagosomes and the differentiation of their contents are controlled by the Atg protein encoded by the autophagy-related gene (ATG), and the Atg12-Atg5 binding system and the LC3-Phosphatidyl Ethanolamine (PE) binding system are used. It can be divided into 6 groups including, each of which acts stepwise in each process.
  • ATG autophagy-related gene
  • PE LC3-Phosphatidyl Ethanolamine
  • Autophagy activators include compounds that increase LC3-related factors that are markers of autophagy activity and activate autophagy, and promote autophagy flux (including fusion of autophagosomes to lysosomes). Compounds and active ingredients have been reported (Patent Documents 1 to 4).
  • an object of the present invention is to provide an autophagy activator and an autophagy activation composition containing the autophagy activator, which can effectively activate autophagy. ..
  • the present invention includes the following aspects.
  • the ascorbic acid derivative or a salt thereof is at least one ascorbic acid derivative or a salt thereof selected from the group consisting of ascorbic phosphate, a fatty acid ester of ascorbic phosphate, ethyl ascorbic acid, and ascorbic acid glucoside. , (1).
  • the autophagy activator (3) The autophagy activator according to (2), wherein the ascorbic acid derivative or a salt thereof is a fatty acid ester of ascorbyl phosphate or a salt thereof.
  • the autophagy activator according to any one of (1) to (6) which promotes the expression of the LC3 gene, the ATG5 gene, the ATG7 gene, and the Beclin1 gene.
  • the autophagy activator according to any one of (1) to (7) which is used for the prevention or treatment of Alzheimer's disease.
  • An autophagy activation composition containing the autophagy activator according to any one of (1) to (8) and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • an autophagy activator and an autophagy activation composition containing the autophagy activator can be provided.
  • the autophagy activator of the present embodiment contains an ascorbic acid derivative or a salt thereof as an active ingredient.
  • autophagy is a mechanism for regenerating energy and removing damaged substances by decomposing old or damaged intracellular substances and organelles.
  • the autophagy activator of the present embodiment can promote the expression of the LC3 gene, which is an autophagy marker, and the ATG5 gene, ATG7 gene, and Beclin1 gene contained in the autophagosome, and activate autophagy. be able to.
  • Examples of the ascorbic acid derivative in the autophagy activator of the present embodiment include ascorbic acid derivatives in which at least one hydroxyl group of ascorbic acid is derivatized.
  • ascorbic acid derivative more specifically, ascorbyl phosphate (also referred to as ascorbic acid phosphate ester) in which any of the hydroxyl groups of ascorbic acid is phosphorically esterified; any of the hydroxyl groups of ascorbic acid is phosphoric acid esterified.
  • a fatty acid ester of ascorbyl phosphate in which other hydroxyl groups are esterified with a fatty acid ethyl ascorbic acid in which any of the hydroxyl groups of ascorbic acid is ethoxylated; ascorbic acid glucoside in which any of the hydroxyl groups of ascorbic acid is glucosidated; Aylated ascorbic acid in which any of the hydroxyl groups of ascorbic acid is acylated; Ascorbyl acylated phosphate in which any of the hydroxyl groups of ascorbic acid is acylated and the other hydroxyl group is phosphoric acid esterified; Any of the hydroxyl groups of ascorbic acid.
  • Glyceryl ascorbic acid substituted with glycerin phosphoric acid diesters of ascorbic acid and tocopherol (specifically, dl- ⁇ -tocopherol 2-L-) in which ascorbic acid and tocopherol are bound by an ester bond via phosphoric acid, respectively.
  • Ascorbic acid phosphate diester, etc. and the like.
  • Examples of the salt of the ascorbic acid derivative include a salt of an ascorbic acid derivative and an inorganic base, a salt of an ascorbic acid derivative and an organic base, and the like.
  • Examples of the salt with the inorganic base include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt; aluminum salt; ammonium salt; zinc salt and the like.
  • Examples of the salt with an organic base include an alkylammonium salt and a salt with a basic amino acid.
  • Examples of the ascorbic acid derivative or salt thereof in the autophagy activator of the present embodiment include (i) ascorbic phosphate or a salt thereof, (ii) a fatty acid ester of ascorbic phosphate or a salt thereof, and (iii) ethyl. Ascorbic acid or a salt thereof, (iv) ascorbic acid glucoside or a salt thereof is preferable.
  • Ascorbic Phosphate is a compound in which a phosphate group is introduced into at least one hydroxyl group of ascorbic acid.
  • Ascorbyl phosphate a compound represented by the following chemical formula (1) is preferably mentioned.
  • the compound represented by the following chemical formula (1) is an ascorbic acid-2-phosphate ester in which the hydroxyl group at the 2-position of ascorbic acid is protected by a phosphoric acid ester.
  • Ascorbyl phosphate has D-form and L-form stereoisomers and racemic DL-form.
  • the ascorbyl phosphate in the present embodiment may be any of these stereoisomers, but from the viewpoint of availability, it is preferably L-form, and specifically, L-ascorbic acid-2- Phosphoric acid esters are preferred.
  • salt of ascorbyl phosphate examples include a salt of ascorbyl phosphate and an inorganic base, a salt of ascorbyl phosphate and an organic base, and the like.
  • Examples of the salt with the inorganic base include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt; aluminum salt; ammonium salt; zinc salt and the like.
  • Examples of the salt with an organic base include an alkylammonium salt and a salt with a basic amino acid.
  • the salt of ascorbyl phosphate is preferably an alkali metal salt or an alkaline earth metal salt, more preferably a sodium salt or a magnesium salt, and even more preferably a magnesium salt.
  • the magnesium salt of ascorbyl phosphate is preferable from the viewpoint of high stability and resistance to coloring.
  • the ascorbyl phosphate or a salt thereof in the autophagy activator of the present embodiment is preferably a salt of ascorbyl phosphate from the viewpoint of improving stability, and is represented by the above chemical formula (1).
  • An alkali metal salt of the compound or an alkaline earth metal salt of the compound represented by the above chemical formula (1) is more preferable, and a sodium salt of the compound represented by the above chemical formula (1) or the above chemical formula (1) is used.
  • the magnesium salt of the represented compound is more preferred.
  • the magnesium salt of the compound represented by the chemical formula (1) specifically, the magnesium salt of L-ascorbic acid-2-phosphate ester is particularly preferable.
  • the sodium salt of the compound represented by the chemical formula (1) specifically, the sodium salt of L-ascorbic acid-2-phosphate ester is particularly preferable.
  • Ascorbyl phosphate or a salt thereof in the autophagy activator of the present embodiment may be used alone or in combination of two or more.
  • Ascorbyl phosphate or a salt thereof can be produced by a known production method, for example, the method described in JP-A-2-279690 and JP-A-6-345786.
  • a specific method for producing ascorbic phosphate it can be obtained by reacting ascorbic acid with phosphorus oxychloride or the like to phosphorylate it.
  • phosphorus is obtained by neutralizing an ascorbyl phosphate solution with a metal oxide such as magnesium oxide or a metal hydroxide such as sodium hydroxide.
  • a salt of ascorbyl acid can be obtained.
  • ascorbic acid PS compound name; L-ascorbic acid-2-phosphate ester sodium salt (L-ascorbin) manufactured by Showa Denko Co., Ltd. Acid-2-sodium phosphate
  • display name Na ascorbyl phosphate
  • ascorbic acid PM manufactured by Showa Denko Co., Ltd.
  • display name ascorbyl phosphate Mg
  • the fatty acid ester of ascorbyl phosphate is a compound in which a fatty acid is ester-bonded to at least one hydroxyl group of ascorbyl phosphate.
  • the fatty acid is a linear or branched fatty acid having 6 to 22 carbon atoms (that is, a fatty acid having a linear or branched alkyl group bonded to a carboxy group having 5 to 21 carbon atoms).
  • fatty acid ester of phosphoric acid ascorbyl examples include compounds represented by the following general formula (2).
  • the compound represented by the following general formula (2) has ascorbic acid-2-phosphate-6-fatty acid in which phosphoric acid is ester-bonded to the hydroxyl group at the 2-position of ascorbic acid and fatty acid is ester-bonded to the hydroxyl group at the 6-position. Is.
  • R 1 is a linear or branched-chain alkyl group having 5 to 21 carbon atoms.
  • R 1 is a linear or branched-chain alkyl group having 5 to 21 carbon atoms. Specifically, a linear or branched pentyl group, a linear or branched hexyl group, a linear or branched heptyl group, a linear or branched octyl group, a direct chain.
  • Chained or branched nonyl group linear or branched decyl group, linear or branched undecyl group, linear or branched dodecyl group, linear or branched chain Tridecyl group, linear or branched tetradecyl group, linear or branched pentadecyl group, linear or branched hexadecyl group, linear or branched heptadecyl group, straight chain Examples thereof include a linear or branched octadecyl group, a linear or branched nonadesyl group, a linear or branched icosyl group, and a linear or branched henicosyl group.
  • R 1 is preferably a linear or branched alkyl group having 9 to 19 carbon atoms, and is a linear or branched alkyl group having 11 to 17 carbon atoms.
  • a branched alkyl group is more preferable, and a linear or branched alkyl group having 13 to 15 carbon atoms is more preferable, and the carbon atom number is 15 from the viewpoint of raw material availability and the like.
  • Fatty acid esters of ascorbyl phosphate include D-form and L-form stereoisomers and racemic DL-forms.
  • the fatty acid ester of ascorbyl phosphate in the present embodiment may be any of these three steric isomers, but from the viewpoint of availability, it is preferably L-form, and specifically, L-ascorbic acid.
  • Fatty acid esters of -2-phosphate esters are preferred.
  • the salt of fatty acid ester of ascorbyl phosphate include a salt of a fatty acid ester of ascorbyl phosphate and an inorganic base, a salt of a fatty acid ester of ascorbyl phosphate and a salt of an organic base, and the like. Be done.
  • Examples of the salt with the inorganic base include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt; aluminum salt; ammonium salt; zinc salt and the like.
  • Examples of the salt with an organic base include an alkylammonium salt and a salt with a basic amino acid.
  • the salt of the fatty acid ester of ascorbyl phosphate is preferably an alkali metal salt or an alkaline earth metal salt, more preferably a sodium salt or a magnesium salt, and even more preferably a sodium salt.
  • Sodium salts of fatty acid esters of ascorbyl phosphate are preferred from the standpoint of stability and ease of formulation.
  • the fatty acid ester of ascorbyl phosphate or a salt thereof in the autophagy activator of the present embodiment may be a salt of the fatty acid ester of ascorbyl phosphate from the viewpoint of stability and ease of formulation into a preparation.
  • an alkali metal salt of the compound represented by the general formula (2) or an alkaline earth metal salt of the compound represented by the general formula (2) is more preferable, and it is represented by the general formula (2).
  • the sodium salt of the compound or the magnesium salt of the compound represented by the general formula (2) is more preferable, and the sodium salt of the compound represented by the general formula (2), specifically, L-ascorbic acid.
  • the sodium salt of -2-phosphoric acid-6-palmitic acid is particularly preferred.
  • the fatty acid ester of ascorbyl phosphate or a salt thereof in the autophagy activator of the present embodiment may be used alone or in combination of two or more.
  • the fatty acid ester of ascorbyl phosphate or a salt thereof in the autophagy activator of the present embodiment can be produced by a known production method, for example, the method described in Patent 6265550.
  • a specific method for producing a fatty acid ester of ascorbyl phosphate after producing ascorbyl phosphate by the same method as the above-mentioned method for producing ascorbyl phosphate, the ascorbyl phosphate and the fatty acid or an ester thereof are used. It can be obtained by subjecting it to a condensation reaction.
  • a fatty acid ester solution of ascorbyl phosphate is mixed with a metal oxide such as magnesium oxide or a metal hydroxide such as sodium hydroxide.
  • a salt of a fatty acid ester of ascorbyl phosphate can be obtained.
  • the salt of the fatty acid ester of ascorbyl phosphate in the autophagy activator of the present embodiment is owned by Showa Denko Co., Ltd.
  • Examples thereof include a sodium salt of -6-palmitic acid (also referred to as a sodium salt of L-6-O-palmitoyle ascorbic acid-2-phosphate ester), a display name; ascorbyl phosphate 3Na of palmitate) and the like.
  • Ethyl ascorbic acid is a compound in which an ethyl group is introduced into at least one hydroxyl group of ascorbic acid.
  • a compound represented by the following chemical formula (3) is preferably mentioned.
  • the compound represented by the following chemical formula (3) is 3-O-ethylascorbic acid in which the hydrogen atom of the hydroxyl group at the 3-position of ascorbic acid is substituted with an ethyl group.
  • Ethyl ascorbic acid has D-form and L-form stereoisomers and racemic DL-form.
  • Ethyl ascorbic acid may be any of these stereoisomers, but from the viewpoint of availability, it is preferably L-form, and specifically, L-3-O-ethylascorbic acid (3). -O-ethyl-L-ascorbic acid) is preferable.
  • salt of ethyl ascorbic acid examples include a salt of ethyl ascorbic acid and an inorganic base, a salt of ethyl ascorbic acid and an organic base, and the like.
  • Examples of the salt with the inorganic base include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt; aluminum salt; ammonium salt; zinc salt and the like.
  • Examples of the salt with an organic base include an alkylammonium salt and a salt with a basic amino acid.
  • ethyl ascorbic acid or a salt thereof in the autophagy activator of the present embodiment is preferably ethyl ascorbic acid, and L-3-O-ethylascorbic acid is more preferable. preferable.
  • Ethyl ascorbic acid or a salt thereof in the autophagy activator of the present embodiment may be used alone or in combination of two or more.
  • Ethyl ascorbic acid or a salt thereof can be produced by a known production method.
  • a method for producing ethyl ascorbic acid a method of alkylating ascorbic acid in dimethyl sulfoxide (DMSO) with an alkyl halide in the presence of sodium methoxide; It can be manufactured by a method or the like.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • a salt of ethyl ascorbic acid ethyl ascorbic acid solution is neutralized with a metal oxide such as magnesium oxide or a metal hydroxide such as sodium hydroxide to ethyl.
  • a salt of ascorbic acid can be obtained.
  • ethylascorbic acid in the autophagy activator of the present embodiment examples include 3-O-ethyl-L-ascorbic acid (labeled name; 3-O-ethylascorbic acid) manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Can be mentioned.
  • Ascorbic acid glucoside is a compound in which at least one hydroxyl group of ascorbic acid is glucosided.
  • the glucosidic bond is preferably an ⁇ -glucoside bond.
  • Ascorbic acid glucoside is preferably a compound represented by the following chemical formula (4).
  • the compound represented by the following chemical formula (4) is ascorbic acid 2-glucoside in which glucose is bound to the hydroxyl group at the 2-position of ascorbic acid.
  • Ascorbic acid has D-form and L-form stereoisomers, and racemic DL-form.
  • the ascorbic acid in the ascorbic acid glucoside may be any of these stereoisomers, but from the viewpoint of availability, it is preferably L-form, and the ascorbic acid glucoside is specifically L-. Ascorbic acid-2-glucoside is preferred.
  • the glucose in the ascorbic acid glucoside may be D-form or L-form, but is preferably D-form from the viewpoint of availability.
  • the salt of ascorbic acid glucoside examples include a salt of ascorbic acid glucoside and an inorganic base, a salt of ascorbic acid glucoside and an organic base, and the like.
  • Examples of the salt with the inorganic base include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt; aluminum salt; ammonium salt; zinc salt and the like.
  • Examples of the salt with an organic base include an alkylammonium salt and a salt with a basic amino acid.
  • ascorbic acid glucoside or a salt thereof in the autophagy activator of the present embodiment is preferably ascorbic acid glucoside, and more preferably L-ascorbic acid 2-glucoside, from the viewpoint of availability.
  • Ascorbic acid glucoside or a salt thereof in the autophagy activator of the present embodiment may be used alone or in combination of two or more.
  • Ascorbic acid glucoside or a salt thereof can be produced, for example, by the method described in JP-A-03-139288.
  • Ascorbic acid glucoside it can be produced by binding one molecule of glucose to the hydroxyl group at the 2-position of ascorbic acid by an enzymatic reaction.
  • Ascorbin is obtained by neutralizing the ascorbic acid glucoside solution with a metal oxide such as magnesium oxide or a metal hydroxide such as sodium hydroxide.
  • a salt of acid glucoside can be obtained.
  • ascorbic acid glucoside in the autophagy activator of the present embodiment examples include ascorbic acid 2-glucoside (compound name; L-ascorbic acid 2-glucoside, display name; ascorbic acid glucoside) manufactured by Hayashibara Co., Ltd. ..
  • the ascorbic acid derivative or a salt thereof in the autophagy activator of the present embodiment may be used alone or in combination of two or more.
  • As the ascorbic acid derivative or its salt in the autophagy activator of the present embodiment among the above, from the viewpoint of further activating autophagy, (i) ascorbyl phosphate or a salt thereof or (ii) ascorbyl phosphate. It is preferably a fatty acid ester or a salt thereof, and more preferably a fatty acid ester of (ii) ascorbyl phosphate or a salt thereof.
  • the autophagy activator of the present embodiment can be used by administering itself to a patient for the purpose of treating neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, Huntington's disease, and Parkinson's disease.
  • the autophagy activator of the present embodiment can also be used by blending with pharmaceuticals and cosmetics for the purpose of activating autophagy. Further, it may be blended with the composition for activating autophagy described later and used.
  • the autophagy activator of the present embodiment can effectively activate autophagy by promoting the expression of the LC3 gene.
  • the autophagy activator of the present embodiment can effectively activate autophagy by promoting the expression of the ATG5 gene.
  • the autophagy activator of the present embodiment can effectively activate autophagy by promoting the expression of the ATG7 gene.
  • the autophagy activator of the present embodiment can effectively activate autophagy by promoting the expression of the Beclin 1 gene. Since the autophagy activator of the present embodiment can effectively activate autophagy, it can be used for the prevention or treatment of Alzheimer's disease.
  • Amyloid ⁇ is known to cause a decrease in autophagy in nerve cells.
  • amyloid ⁇ is known to induce a decrease in autophagy and cell death called apoptosis of nerve cells.
  • the autophagy activator of the present embodiment can promote LC3 gene expression in the presence of amyloid ⁇ .
  • the autophagy activator of the present embodiment can promote ATG5 gene expression in the presence of amyloid ⁇ .
  • the autophagy activator of the present embodiment can promote ATG7 gene expression in the presence of amyloid ⁇ .
  • the autophagy activator of the present embodiment can promote the expression of the Beclin 1 gene in the presence of amyloid ⁇ .
  • the autophagy activator of the present embodiment can suppress apoptosis in the presence of amyloid ⁇ .
  • the autophagy activator of the present embodiment expresses at least one gene selected from the group consisting of the LC3 gene, the ATG5 gene, the ATG7 gene, and the Beclin 1 gene in the presence of amyloid ⁇ , particularly in nerve cells. Can be promoted.
  • the autophagy activator of the present embodiment can suppress apoptosis in the presence of amyloid ⁇ , especially in nerve cells.
  • Promoting LC3 gene expression in the presence of amyloid ⁇ means that the autophagy activator of the present embodiment is administered in the presence of amyloid ⁇ , as compared with the case where the autophagy activator is not administered. This means that the expression level of the LC3 gene is increased. The same applies to the ATG5 gene, the ATG7 gene and the Beclin1 gene. Suppressing apoptosis in the presence of amyloid ⁇ means that by administering the autophagy activator of the present embodiment in the presence of amyloid ⁇ , the apoptosis is compared with the case where the autophagy activator is not administered. Means that is suppressed.
  • LC3 microtubule assisted protein 1 light chain 3 alpha: NCBI Gene ID: 84557
  • LC3-II is converted to LC3-II, which is attracted to the autophagosome membrane by adding phosphatidylethanolamine upstream of autophagy signal transduction. It binds to the membrane.
  • LC3 is used as a marker for autophagosomes. Examples of the base sequence of the human LC3 gene include NM_032514.4 and NM_181509.3 registered in the NCBI Reference Sequence database.
  • ATG5 (autophagy processed 5: NCBI Gene ID: 9474) binds to ATG12 and functions as an E1-like activating enzyme in a ubiquitin-like conjugated system.
  • Examples of the base sequence of the human ATG5 gene include NM_001286106.1, NM_001286107.1, NM_001286108.1, NM_001286111.1.
  • ATG7 (autophagy processed 7: NCBI Gene ID: 10533) functions as an E1-like activating enzyme that activates LC3 and ATG12 in an ATP-dependent manner.
  • Examples of the base sequence of the human ATG7 gene include NM_001136031.3, NM_001144912.2, NM_0013492322.2, NM_001349233.2.
  • Beclin 1 (NCBI Gene ID: 8678) forms the Cress III PI3K complex together with ATG14L and Vps34mp150 and functions as a positive regulator of autophagosome formation.
  • Examples of the base sequence of the human Beclin 1 gene include NM_00131398.2, NM_0013139991, NM_001314000.1, and NM_003766.4 registered in the NCBI Reference Sequence database.
  • the autophagy activator of the present embodiment is administered to a patient having a high risk of developing neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, Huntington's disease, and Parkinson's disease, and prevents neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, Huntington's disease, and Parkinson's disease. May be used for. Further, the autophagy activator of the present embodiment may be administered to a patient who has developed a neurodegenerative disease such as Alzheimer's disease, Huntington's disease, or Parkinson's disease, and may be used to suppress the progression or worsening of the neurodegenerative disease. good.
  • the autophagy activator of the present embodiment can be administered to a patient in the same manner as the composition for autophagy activation described later, and may be administered orally or parenterally. It may be administered intravenously, intraarterially, intramuscularly, intradermally, subcutaneously, intraperitoneally or the like, or may be administered intrarectally as a suppository, or may be administered to the skin as an external preparation for skin.
  • composition for activating autophagy of the present embodiment contains an autophagy activator containing the above-mentioned ascorbic acid derivative or a salt thereof, and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • composition for activating autophagy of the present embodiment follows a conventional method (for example, the method described in the Japanese Pharmacopoeia), the above-mentioned autophagy activator, a pharmaceutically acceptable carrier, and possibly other components. Can be produced by mixing and formulating.
  • the term "pharmaceutically acceptable carrier” means a carrier that does not inhibit the physiological activity of the active ingredient and is not substantially toxic to the subject to be administered.
  • does not show substantial toxicity means that the component does not show toxicity to the administration subject at the dose normally used.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is not particularly limited, and is not particularly limited.
  • Polymer / thickening / gelling agent solvent, propellant, antioxidant, reducing agent, oxidizing agent, chelating agent, acid, alkali, powder, inorganic salt, water, metal-containing compound, unsaturated monomer , Polyhydric alcohol, polymer additive, wetting agent, thickener, tackifier, oily raw material, liquid matrix, fat-soluble substance, polymer carboxylate and the like.
  • compositions for activating autophagy of the present embodiment may be used alone or in combination of two or more.
  • the other components are not particularly limited, and are used for preservatives, antibacterial agents, ultraviolet absorbers, whitening agents, vitamins and derivatives other than ascorbic acid derivatives or salts thereof, anti-inflammatory agents, anti-inflammatory agents, and hair growth agents.
  • Specific examples of these components include those described in International Publication No. 2016/076310. Further, specific examples of plant / animal / microbial extracts include lapsana comnis flowers / leaves / stems, tea leaves and the like. Specific examples of seed oil include Moringa oleifera seed oil. Specific examples of fragrances include perillaldehyde. As for the other components, one type may be used alone, or two or more types may be used in combination.
  • the composition for activating autophagy of the present embodiment can contain the above-mentioned autophagy activator in a therapeutically effective amount.
  • “Therapeutically effective amount” means the amount of drug effective for the treatment or prevention of a patient's disease. The therapeutically effective amount may vary depending on the condition, age, sex, body weight, etc. of the disease to be administered.
  • the therapeutically effective amount of the above-mentioned autophagy activator may be an amount that the ascorbic acid derivative or a salt thereof can activate autophagy.
  • the therapeutically effective amount of the above autophagy activator is at least one gene in which the ascorbic acid derivative or a salt thereof is selected from the group consisting of the LC3 gene, the ATG5 gene, the ATG7 gene, and the Beclin1 gene. Is an amount that can promote the expression of.
  • the therapeutically effective amount of the autophagy activator may be an amount in which the ascorbic acid derivative or a salt thereof can suppress apoptosis in the presence of amyloid ⁇ .
  • the therapeutically effective amount (total content of the ascorbic acid derivative or a salt thereof) of the autophagy activator in the composition for autophagy activation of the present embodiment is, for example, with respect to the total amount of the composition for autophagy activation. It may be 0.05 to 15% by mass, for example, 0.1 to 10% by mass, or 0.5 to 5% by mass, for example.
  • the total content of the ascorbic acid derivative or its salt means the content of the compound when one kind of ascorbic acid derivative or its salt is used alone, and two kinds of ascorbic acid derivatives or its salts are used. When used in combination as described above, it means the total content of these compounds.
  • composition for activating autophagy of the present embodiment may be a pharmaceutical composition or a cosmetic.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for autophagy activation, which comprises the above-mentioned autophagy activator and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is not particularly limited, and a carrier generally used for pharmaceutical products can be used in addition to those listed above.
  • a carrier generally used for pharmaceutical products can be used in addition to those listed above.
  • the Japanese Pharmacopoeia the Pharmaceutical Standards outside the Japanese Pharmacopoeia, the Pharmaceutical Additives Standard 2013 (Yakuji Nippo, 2013), the Pharmaceutical Additives Dictionary 2016 (edited by the Japan Pharmaceutical Additives Association, Yakuji Nippo, 2016), Handbook of General raw materials described in Pharmaceutical Excipients, 7th edition (Pharmaceutical Press, 2012) and the like can be used.
  • the pharmaceutically acceptable carrier one type may be used alone, or two or more types may be used in combination.
  • the pharmaceutical composition of the present embodiment may contain other components in addition to the autophagy activator and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the other ingredients are not particularly limited, and general pharmaceutical additives can be used.
  • an active ingredient other than the above-mentioned autophagy activator can also be used.
  • pharmaceutical additives and active ingredients as other ingredients include, for example, the Japanese Pharmacopoeia, the Pharmaceutical Standards outside the Japanese Pharmacopoeia, the Pharmaceutical Additive Standard 2013 (Yakuji Nippo Co., Ltd., 2013), and the addition of pharmaceuticals.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present embodiment is not particularly limited, and can be a dosage form generally used as a pharmaceutical preparation.
  • dosage forms for oral administration such as tablets, coated tablets, pills, powders, granules, capsules, liquids, suspensions, emulsions; and parenteral such as injections, suppositories, external preparations for skin, etc. Examples thereof include a dosage form to be administered.
  • Pharmaceutical compositions of these dosage forms can be formulated according to a conventional method (for example, the method described in the Japanese Pharmacopoeia).
  • the method for administering the pharmaceutical composition of the present embodiment is not particularly limited, and the pharmaceutical composition can be administered by a method generally used as a method for administering the drug.
  • it may be orally administered as a tablet, a coated tablet, a pill, a powder, a granule, a capsule, a liquid, a suspending agent, an emulsion, etc.
  • It may be mixed with a general infusion solution such as, and administered intravenously, intraarterial, intramuscularly, intradermally, subcutaneously, intraperitoneally, etc. It may be administered to the skin.
  • the dose of the pharmaceutical composition of the present embodiment can be a therapeutically effective amount.
  • the therapeutically effective amount may be appropriately determined depending on the patient's symptoms, body weight, age, sex, etc., the dosage form of the pharmaceutical composition, the administration method, and the like.
  • the dose of the pharmaceutical composition of the present embodiment is 0.01 to 500 mg per administration unit form as the total content of the ascorbic acid derivative or a salt thereof in the case of oral administration, and ascorbic acid in the case of an injection.
  • the total content of the acid derivative or its salt is 0.02 to 250 mg per administration unit form, and in the case of suppositories, the total content of the ascorbic acid derivative or its salt is 0.01 to 500 mg per administration unit form, for external use on the skin.
  • the total content of the ascorbic acid derivative or a salt thereof may be 0.01 to 500 mg per administration unit form.
  • the administration interval of the pharmaceutical composition of the present embodiment may be appropriately determined depending on the patient's symptoms, body weight, age, sex, etc., the dosage form of the pharmaceutical composition, the administration method, and the like. For example, it may be once a day or about 2 to 3 times.
  • the pharmaceutical composition of the present embodiment can be used for the treatment or prevention of diseases caused by a decrease in autophagy activity.
  • diseases include neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, Huntington's disease, Parkinson's disease and SENDA's disease; inflammatory bowel diseases such as Crohn's disease; and cancer.
  • the pharmaceutical composition of the present embodiment is administered to a neurodegenerative disease such as Alzheimer's disease, Huntington's disease, Parkinson's disease, SENDA's disease; inflammatory bowel disease such as Crohn's disease; , Inflammatory bowel disease, or can be used to control the progression of cancer. Further, the pharmaceutical composition of the present embodiment is administered to a neurodegenerative disease such as Alzheimer's disease, Huntington's disease, Parkinson's disease, SENDA's disease; an inflammatory bowel disease such as Crohn's disease; or a cancer patient to cause a neurodegenerative disease. , Inflammatory bowel disease, or can be used to treat cancer. In addition, the pharmaceutical composition of the present embodiment can be used for treating a disease caused by amyloid ⁇ .
  • the pharmaceutical composition of the present embodiment can be used for treating a disease caused by a decrease in the expression level of the LC3 gene, the ATG5 gene, the ATG7 gene, or the Beclin1 gene.
  • the pharmaceutical composition of the present embodiment can be suitably used for treating Alzheimer's disease in particular.
  • the pharmaceutical composition of the present embodiment can also be administered to patients at high risk of developing neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, Huntington's disease, Parkinson's disease, and SENDA's disease to prevent neurodegenerative diseases. ..
  • the pharmaceutical composition of the present embodiment can be administered to a patient at high risk of developing inflammatory bowel disease such as Crohn's disease and used to prevent inflammatory bowel disease.
  • the pharmaceutical composition of the present embodiment can be administered to a patient at high risk of developing cancer and used to prevent cancer.
  • the present invention provides a cosmetic for autophagy activation, which comprises the autophagy activator described above and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is not particularly limited, and a carrier generally used for cosmetics can be used in addition to those listed above.
  • a carrier generally used for cosmetics can be used in addition to those listed above.
  • commentary on the second edition of the cosmetic raw material standard (edited by the Japan Official Regulations Association, Yakuji Nippo Co., Ltd., 1984), the cosmetic raw material non-standard ingredient standard (supervised by the Examination Division, Pharmaceutical Affairs Bureau, Ministry of Health and Welfare, Yakuji Nippo Co., Ltd., 1993), cosmetic raw material standard.
  • the cosmetic of this embodiment may contain other components in addition to the autophagy activator and the pharmaceutically acceptable carrier.
  • the other ingredients are not particularly limited, and general cosmetic additives can be used.
  • an active ingredient other than the above-mentioned autophagy activator can also be used.
  • cosmetic additives and active ingredients as other ingredients include, for example, commentary on the second edition of the cosmetic raw material standard (edited by the Japan Official Regulations Association, Yakuji Nippo, 1984), non-standard cosmetic raw material ingredients.
  • the form of the cosmetic of the present embodiment is not particularly limited, and can be a form generally used as a cosmetic.
  • hair cosmetics such as shampoo, rinse and hair conditioner
  • basic cosmetics such as wash pigments, cleansing agents, lotions, milky lotions, lotions, creams, gels, sunscreen agents, packs, masks and beauty liquids
  • foundations makeup base, make-up cosmetics such as lipsticks, lip gloss, cheeks; body cleansers, body powders, deodorant cosmetics and the like.
  • These cosmetics can be manufactured according to a conventional method.
  • the dosage form of the cosmetic of the present embodiment is not particularly limited, and is, for example, oil in water (O / W) type, water in oil (W / O) type, W / O / W type, O / W.
  • Emulsified type such as / O type, emulsified polymer type, oily, solid, liquid, paste, stick, volatile oil type, powder, jelly, gel, paste, cream, sheet, film , Mist-like, spray-type, aerosol-like, multi-layered, foam-like, flake-like and the like.
  • the amount of the cosmetic used in this embodiment is not particularly limited, but can be an amount effective for activating autophagy.
  • the amount of the cosmetic used in the present embodiment is 0.01 to 500 mg per use as the total content of the ascorbic acid derivative or a salt thereof, and may be, for example, 0.15 to 300 mg, for example. It may be 0.15 to 200 mg, for example 0.2 to 100 mg.
  • the interval of use of the cosmetics of this embodiment is not particularly limited, but may be, for example, once a day or about 2 to 3 times a day.
  • the cosmetic of this embodiment can be used to alleviate the symptoms caused by the decrease in autophagy activity.
  • it may be used in routine skin care and makeup by subjects at high risk of developing these symptoms in order to prevent the onset of symptoms resulting from decreased autophagy activity.
  • the present invention provides a method for activating autophagy, which comprises the step of administering an ascorbic acid derivative or a salt thereof to a subject.
  • the present invention provides a method for promoting the expression of an LC3 gene, an ATG5 gene, an ATG7 gene, or a Beclin 1 gene, which comprises a step of administering an ascorbic acid derivative or a salt thereof to a subject.
  • the present invention provides a method for suppressing apoptosis in the presence of amyloid ⁇ , which comprises a step of administering an ascorbic acid derivative or a salt thereof to a subject.
  • the present invention provides an ascorbic acid derivative or a salt thereof for activating autophagy.
  • the present invention provides an ascorbic acid derivative or a salt thereof for promoting the expression of the LC3 gene, ATG5 gene, ATG7 gene, or Beclin1 gene.
  • the present invention provides an ascorbic acid derivative or a salt thereof for suppressing apoptosis in the presence of amyloid ⁇ .
  • the present invention provides an ascorbic acid derivative or a salt thereof for preventing or treating Alzheimer's disease, Huntington's disease, Parkinson's disease, SENDA disease, Crohn's disease, or cancer.
  • the present invention provides the use of an ascorbic acid derivative or a salt thereof for producing an autophagy activator.
  • the present invention provides the use of an ascorbic acid derivative or a salt thereof for producing an LC3 gene, an ATG5 gene, an ATG7 gene, or a Beclin1 gene expression promoter.
  • the present invention provides the use of an ascorbic acid derivative or a salt thereof for producing an LC3 gene, an ATG5 gene, an ATG7 gene, or a Beclin 1 gene expression promoter in the presence of amyloid ⁇ .
  • the present invention provides the use of an ascorbic acid derivative or a salt thereof for producing an inhibitor of apoptosis in the presence of amyloid ⁇ .
  • the present invention provides the use of an ascorbic acid derivative or a salt thereof for producing a composition for activating autophagy.
  • the present invention provides the use of an ascorbic acid derivative or a salt thereof for producing a composition for promoting the expression of the LC3 gene, the ATG5 gene, the ATG7 gene, or the Beclin1 gene.
  • the present invention provides the use of an ascorbic acid derivative or a salt thereof for producing a composition for promoting expression of the LC3 gene, ATG5 gene, ATG7 gene, or Beclin 1 gene in the presence of amyloid ⁇ . do.
  • the present invention provides the use of an ascorbic acid derivative or a salt thereof for producing a composition for suppressing apoptosis in the presence of amyloid ⁇ .
  • APM Magnesium salt of L-ascorbic acid-2-phosphate ester (display name; ascorbyl phosphate Mg, product name; ascorbic acid PM, manufactured by Showa Denko KK)
  • APPS Sodium salt of L-ascorbic acid-2-phosphate-6-palmitic acid (display name; ascorbyl palmitate 3Na, product name; APPS, manufactured by Showa Denko)
  • L-ascorbic acid 2-glucoside display name; ascorbic glucoside, product name; ascorbic acid 2-glucoside, manufactured by Hayashibara Co., Ltd.
  • AE 3-O-ethyl-L-ascorbic acid (display name; 3-O-ethylascorbic acid, product name; 3-O-ethyl-L-ascorbic acid, manufactured by Fuji Film Wako Pure
  • ⁇ Preparation of aging fibroblasts Human normal fibroblasts (NB1RGB; RIKEN BRC Cellbank) were cultured in D-MEM medium (Sigma-Aldrich) supplemented with 10% fetal bovine serum (MP Biomedicals) until confluent. Then, it was treated with 250 ⁇ M hydrogen peroxide solution for 2 hours, and cultured in D-MEM medium supplemented with fresh 10% fetal bovine serum for 24 hours. This treatment with hydrogen peroxide solution and the operation of cell culture were repeated three times, and the obtained fibroblasts were designated as senescent fibroblasts.
  • Example 1 APM dissolved in purified water was added to the medium so that the final concentration of APM was 10 ⁇ M.
  • APPS dissolved in purified water was added to the medium so that the final concentration of APPS was 1 ⁇ M.
  • Example 3 APPS dissolved in purified water was added to the medium so that the final concentration of APPS was 10 ⁇ M.
  • Example 4 AG dissolved in purified water was added to the medium so that the final concentration of AG was 100 ⁇ M.
  • AE dissolved in purified water was added to the medium so that the final concentration of AE was 100 ⁇ M.
  • Comparative Example 1 only purified water was added to the medium. Each medium was then cultured for 24 hours at 37 ° C. under 5% CO 2 .
  • Reference Example 1 the above-mentioned normal human fibroblasts were prepared at a seeding density of 10,000 cells / cm 2 , and 10% fetal bovine serum (manufactured by MP Biomedicals) was added to the D-MEM medium (Sigma-). The cells were cultured in Aldrich) for 24 hours, and only purified water was added to the medium. The medium was then cultured for 24 hours at 37 ° C. under 5% CO 2 .
  • RNA was extracted from the aged fibroblasts or human normal fibroblasts of each example, and cDNA was synthesized from the obtained RNA.
  • cDNA was synthesized from the obtained RNA.
  • the expression level of each gene was quantified by quantitative real-time PCR using primers specific for the LC3 gene, ATG5 gene, ATG7 gene, and Beclin1 gene (manufactured by Takara Bio Inc.). ..
  • GAPDH primary; manufactured by Takara Bio Inc.
  • the expression level of GAPDH which is a housekeeping gene whose gene expression does not change due to the addition of a compound, was quantified, and the expression level of each gene was standardized based on the value.
  • the relative gene expression level was determined when the expression level of each gene in Comparative Example 1 was 1.00. The results are shown in Table 1.
  • the aged fibroblasts had the LC3 gene and the ATG5 gene, respectively. It was confirmed that the expression levels of both the ATG7 gene and the Beclin1 gene were decreased.
  • the LC3 gene was particularly higher than that of the aged fibroblasts cultured with the addition of only purified water of Comparative Example 1.
  • the expression level was high, and the effect of promoting the expression of the LC3 gene was confirmed.
  • the autophagy activators of Examples 1 to 3 were added, the expression level of the LC3 gene was high even at a low concentration of the ascorbic acid derivative (APM and APPS), and the LC3 gene was remarkable.
  • the expression levels of the LC3 gene, the ATG5 gene, the ATG7 gene, and the Beclin1 gene can be improved even at a very low concentration of APPS, and APPS is particularly effective. It was confirmed that the LC3 gene, ATG5 gene, ATG7 gene, and Beclin1 gene are excellent in the expression promoting effect.
  • SH-SY5Y cells were prepared at a seeding density of 10000 cells / cm 2 , and D-MEM / Ham's F-12 medium (manufactured by Sigma-Aldrich) supplemented with 10% fetal bovine serum (manufactured by MP Biomedicals).
  • D-MEM / Ham's F-12 medium manufactured by Sigma-Aldrich
  • 10% fetal bovine serum manufactured by MP Biomedicals
  • Example 9 AG dissolved in purified water was added to the medium so that the final concentration of AG was 100 ⁇ M.
  • AE dissolved in purified water was added to the medium so that the final concentration of AE was 100 ⁇ M.
  • Comparative Example 2 only purified water was added to the medium.
  • an amyloid ⁇ solution prepared by dissolving amyloid ⁇ (manufactured by Sigma-Aldrich) in 0.01% (V / V) DMSO was prepared, and the amyloid ⁇ was prepared so that the final concentration of amyloid ⁇ in each medium was 20 ⁇ M. The solution was added to each medium.
  • Reference Example 2 only purified water was added, and the amyloid ⁇ solution was not added.
  • Each medium was then cultured for 48 hours at 37 ° C. under 5% CO 2 .
  • RNA was extracted from the SH-SY5Y cells of each example using a Nucleospin (registered trademark) RNA kit (manufactured by Takara Bio Inc.), and cDNA was synthesized from the obtained RNA.
  • cDNA was synthesized from the obtained RNA.
  • the expression level of each gene was quantified by quantitative real-time PCR using primers specific for the LC3 gene, ATG5 gene, ATG7 gene, and Beclin1 gene (manufactured by Takara Bio Inc.). ..
  • GAPDH GAPDH
  • Takara Bio Inc. a housekeeping gene whose expression does not change due to the addition of a compound.
  • the expression level of each gene was standardized based on the value.
  • the relative gene expression level was determined when the expression level of each gene in Reference Example 2 was 1.00. The results are shown in Table 2.
  • the SH-SY5Y cells cultured by adding the autophagy activator and the amyloid ⁇ solution of Examples 6 to 10 purified water and the amyloid ⁇ solution of Comparative Example 2 were added and cultured.
  • the expression level of the LC3 gene was particularly high as compared with SH-SY5Y cells, and the effect of promoting the expression of the LC3 gene by the autophagy activator of Examples 6 to 10 was confirmed.
  • the SH-SY5Y cells cultured with the addition of the autophagy activator and the amyloid ⁇ solution of Examples 6 to 10 were more than the SH-SY5Y cells cultured with the addition of only purified water of Reference Example 2. It was confirmed that the expression levels of ATG5, ATG7, and Beclin1 genes were increased.
  • the expression level of the LC3 gene was high even at a low concentration of the ascorbic acid derivative (APM and APPS), and a remarkable effect of promoting the expression of the LC3 gene was confirmed. Further, in Examples 7 and 8, the expression levels of the LC3 gene, the ATG5 gene, the ATG7 gene, and the Beclin1 gene can be improved even at a very low concentration of APPS, and in particular, the LC3 gene, It was confirmed that the ATG5 gene, the ATG7 gene, and the Beclin1 gene are excellent in the expression promoting effect.
  • amyloid ⁇ which is known to induce a decrease in autophagy and cell death called apoptosis of nerve cells, was added to each medium for the test.
  • SH-SY5Y cells were prepared at a seeding density of 50,000 cells / cm 2 and placed in D-MEM / Ham's F-12 medium (manufactured by Sigma-Aldrich) supplemented with 10% fetal bovine serum (manufactured by MP Biomedicals). Was cultured for 24 hours. Then, in Example 11, APM dissolved in purified water was added to the medium so that the final concentration of APM was 10 ⁇ M. In Example 12, APM dissolved in purified water was added to the medium so that the final concentration of APM was 100 ⁇ M. In Example 13, APPS dissolved in purified water was added to the medium so that the final concentration of APPS was 1 ⁇ M.
  • Example 14 APPS dissolved in purified water was added to the medium so that the final concentration of APPS was 10 ⁇ M.
  • AG dissolved in purified water was added to the medium so that the final concentration of AG was 100 ⁇ M.
  • AE dissolved in purified water was added to the medium so that the final concentration of AE was 100 ⁇ M.
  • Comparative Example 3 only purified water was added to the medium.
  • an amyloid ⁇ solution prepared by dissolving amyloid ⁇ (manufactured by Sigma-Aldrich) in 0.01% (V / V) DMSO was prepared, and the amyloid ⁇ was prepared so that the final concentration of amyloid ⁇ in each medium was 30 ⁇ M. The solution was added to each medium.
  • Reference Example 3 only purified water was added, and the amyloid ⁇ solution was not added.
  • Each medium was then cultured for 48 hours at 37 ° C. under 5% CO 2 .
  • each SH-SY5Y cell was washed with phosphate buffer (PBS, manufactured by Fujifilm Wako Junyaku Co., Ltd.), and the number of cells showing strong Hoechst fluorescence like apoptosis due to chromatin aggregation under a fluorescence microscope (Hoechst). (+) Cells) were measured.
  • PBS phosphate buffer
  • Table 4 shows Formulation Examples 1 to 4 of an external preparation as a composition for activating autophagy.
  • an autophagy activator capable of effectively activating autophagy and an autophagy activation composition containing the autophagy activator are provided.

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Abstract

アスコルビン酸誘導体又はその塩を有効成分として含有する、オートファジー活性化剤、および、当該オートファジー活性化剤と薬学的に許容される担体とを含有する、オートファジー活性化用組成物。

Description

オートファジー活性化剤
　本発明は、オートファジー活性化剤およびオートファジー活性化用組成物に関する。
　本願は、２０２０年９月１７日に、日本に出願された特願２０２０－１５６４５７号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　オートファジー（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）は、飢餓、成長因子欠乏、および病原体感染などの細胞外もしくは細胞内のストレスおよびシグナルに応答し、老朽化もしくは損傷した細胞内物質およびオルガネラを分解することで、エネルギーの再生産および損傷物質の除去をするメカニズムであり、正常な細胞の恒常性維持に重要である。過去の研究から、老化が進むほど細胞内のオートファジー活性が急激に減少すると報告されている（非特許文献１）。また、オートファジーを抑制した場合、細胞内に老朽ミトコンドリアや誤って折りたたまれたタンパク質などが過剰に蓄積し、細胞内の酸化ストレスが増加することで細胞死が誘導され、結果として細胞が老化することになる。
　したがって、細胞内の老化した物質およびオルガネラを分解し、その分解産物をリサイクルするオートファジーを活性化することで、細胞内の不要物をすみやかに除去することで細胞の恒常性を高めることができる。
　一方、老化がオートファジーに及ぼす影響として、ヒトの脳では加齢とともにＡＴＧ５、ＡＴＧ７、およびＢｅｃｌｉｎ　１遺伝子の発現量が低下することが知られている。また、アルツハイマー病等の神経変性疾患では、オートファジーの活性低下が認められるとされる。そのため、オートファジーの活性化はアルツハイマー病をはじめ、ハンチントン病、パーキンソン病などの神経変性疾患の治療および予防に寄与することが知られている（非特許文献２、３）。特にアルツハイマー病ではオートファジーの機能が阻害されているため、アミロイドβと呼ばれる凝集タンパク質が生体内に蓄積され、これが発症に関わっているといわれている（非特許文献４）。また、脳の黒質および淡蒼球における鉄の沈着と大脳の萎縮をともなう神経変性疾患であるＳＥＮＤＡ病（ＳＥＮＤＡ：ｓｔａｔｉｃ　ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ　ｏｆ　ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ　ｗｉｔｈ　ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ａｄｕｌｔｈｏｏｄ）、消化管に重篤な炎症あるいは潰瘍をひき起こす炎症性腸疾患であるクローン病、およびがんについても、オートファジー関連遺伝子や選択的オートファジーに関与する遺伝子の変異が影響するといわれている（非特許文献５）。
　オートファジーの過程は、酵母および哺乳類の両方で研究されており、最大で３６のタンパク質が利用されている。なかでもオートファゴソームの形成からその内容物の分化までは、オートファジー関連遺伝子（ＡＴＧ）にコードされるＡｔｇタンパク質により制御されており、Ａｔｇ１２－Ａｔｇ５結合系、ＬＣ３－Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ　Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＰＥ）結合系を含む６つのグループに分類することができ、それぞれが各過程で段階的に作用している。
　オートファジー活性化剤としては、オートファジーの活性状態のマーカーであるＬＣ３関連の因子を増やしオートファジーを活性化する化合物、および、オートファジーフラックス（オートファゴソームのリソソームへの融合を含む）を促進する化合物・有効成分が報告されている（特許文献１～４）。
国際公開第２０１８／１７３６５３号 特開２０１８－８０２０４号公報 特表２０１８－５１０９０２号公報 特表２０１９－５２９５１４号公報
Yogendra S. Rajawat et al., Aging: Central role for autophagy and the lysosomal degradative system. Ageing Research Reviews 8 (2009) 199-213. Aaron Barnett et al., Autophagy in Aging and Alzheimer's Disease: Pathologic or Protective?. J Alzheimers Dis. 2011; 25(3): 385-394. Marta M. Lipinski et al., Genome-wide analysis reveals mechanisms modulating autophagy in normal brain aging and in Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci USA. 2010, 107, 14164-14169. Xiangqing Li et al., Cubeben induces autophagy via PI3K-AKT-mTOR pathway to protect primary neurons against amyloid beta in Alzheimer's disease. Cytotechnology (2019) 71: 679-686. 蔭山ら、「オートファジーと疾患」、領域融合レビュー、２０１４年、３、ｅ００６
　上記のように、アルツハイマー病等の様々な疾患においてオートファジー機能が低下することが知られており、オートファジーを効果的に活性化することのできる薬剤が求められている。しかしながら、従来知られている薬剤では、その効果はまだ不十分といえる。
　そこで、本発明は、オートファジーを効果的に活性化することができる、オートファジー活性化剤、および前記オートファジー活性化剤を含有するオートファジー活性化用組成物を提供することを目的とする。
　本発明は以下の態様を含む。
　（１）アスコルビン酸誘導体又はその塩を有効成分として含有する、オートファジー活性化剤。
　（２）前記アスコルビン酸誘導体又はその塩が、リン酸アスコルビル、リン酸アスコルビルの脂肪酸エステル、エチルアスコルビン酸、およびアスコルビン酸グルコシドからなる群より選択される少なくとも１種のアスコルビン酸誘導体又はその塩である、（１）に記載のオートファジー活性化剤。
　（３）前記アスコルビン酸誘導体又はその塩が、リン酸アスコルビルの脂肪酸エステル又はその塩である、（２）に記載のオートファジー活性化剤。
　（４）前記リン酸アスコルビルの脂肪酸エステル又はその塩が、リン酸アスコルビルのパルミチン酸エステル又はその塩である、（３）に記載のオートファジー活性化剤。
　（５）前記アスコルビン酸誘導体の塩を有効成分として含有し、前記アスコルビン酸誘導体の塩が、アスコルビン酸誘導体のマグネシウム塩又はナトリウム塩である、（１）～（４）のいずれか一項に記載のオートファジー活性化剤。
　（６）ＬＣ３遺伝子の発現を促進する、（１）～（５）のいずれか一項に記載のオートファジー活性化剤。
　（７）ＬＣ３遺伝子、ＡＴＧ５遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、および、Ｂｅｃｌｉｎ　１遺伝子の発現を促進する、（１）～（６）のいずれか一項に記載のオートファジー活性化剤。
　（８）アルツハイマー病の予防または治療に用いる、（１）～（７）のいずれか一項に記載のオートファジー活性化剤。
　（９）（１）～（８）のいずれか一項に記載のオートファジー活性化剤および薬学的に許容される担体を含有する、オートファジー活性化用組成物。
　（１０）前記アスコルビン酸誘導体又はその塩の合計含有量が、オートファジー活性化用組成物全量に対して、０．０５～１５質量％である、（９）に記載のオートファジー活性化用組成物。
　本発明によれば、ＬＣ３遺伝子、ＡＴＧ５遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、および、Ｂｅｃｌｉｎ　１遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現を促進し、オートファジーを効果的に活性化することができる、オートファジー活性化剤、および前記オートファジー活性化剤を含有するオートファジー活性化用組成物を提供することができる。
　（オートファジー活性化剤）
　本実施形態のオートファジー活性化剤は、アスコルビン酸誘導体又はその塩を有効成分として含有する。
　ここで「オートファジー（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）」とは、老朽または損傷した細胞内物質およびオルガネラを分解することで、エネルギーの再生産および損傷物質の除去をするメカニズムである。
　本実施形態のオートファジー活性化剤は、オートファジーマーカーであるＬＣ３遺伝子、ならびにオートファゴソームに含まれるＡＴＧ５遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、およびＢｅｃｌｉｎ　１遺伝子の発現を促進することができ、オートファジーを活性化させることができる。
　＜アスコルビン酸誘導体又はその塩＞
　本実施形態のオートファジー活性化剤におけるアスコルビン酸誘導体としては、アスコルビン酸の少なくとも１つの水酸基を誘導化したアスコルビン酸誘導体が挙げられる。
　アスコルビン酸誘導体として、より具体的には、アスコルビン酸の水酸基のいずれかをリン酸エステル化させたリン酸アスコルビル（アスコルビン酸リン酸エステルともいう）；アスコルビン酸の水酸基のいずれかをリン酸エステル化し、他の水酸基を脂肪酸によりエステル化させたリン酸アスコルビルの脂肪酸エステル；アスコルビン酸の水酸基のいずれかをエトキシ化させたエチルアスコルビン酸；アスコルビン酸の水酸基のいずれかをグルコシド化させたアスコルビン酸グルコシド；アスコルビン酸の水酸基のいずれかをアシル化させたアシル化アスコルビン酸；アスコルビン酸の水酸基のいずれかをアシル化し、他の水酸基をリン酸エステル化させたアシル化リン酸アスコルビル；アスコルビン酸の水酸基のいずれかをグリセリンで置換したグリセリルアスコルビン酸；リン酸を介してアスコルビン酸とトコフェロールとがそれぞれエステル結合で結合したアスコルビン酸とトコフェロールのリン酸ジエステル（具体的には、ｄｌ－α－トコフェロール２－Ｌ－アスコルビン酸リン酸ジエステルなど）等が挙げられる。
　アスコルビン酸誘導体の塩としては、例えば、アスコルビン酸誘導体と無機塩基との塩、アスコルビン酸誘導体と有機塩基との塩等が挙げられる。
　無機塩基との塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；アンモニウム塩；亜鉛塩等が挙げられる。
　有機塩基との塩としては、例えば、アルキルアンモニウム塩、塩基性アミノ酸との塩等が挙げられる。
　本実施形態のオートファジー活性化剤におけるアスコルビン酸誘導体又はその塩としては、上記の中でも、（ｉ）リン酸アスコルビル又はその塩、（ｉｉ）リン酸アスコルビルの脂肪酸エステル又はその塩、（ｉｉｉ）エチルアスコルビン酸又はその塩、（ｉｖ）アスコルビン酸グルコシド又はその塩が好ましい。
　≪（ｉ）リン酸アスコルビル又はその塩≫
　・リン酸アスコルビル
　リン酸アスコルビルは、アスコルビン酸の少なくとも１つの水酸基にリン酸基が導入された化合物である。
　リン酸アスコルビルとしては、下記化学式（１）で表される化合物が好適に挙げられる。
　下記化学式（１）で表される化合物は、アスコルビン酸の２位の水酸基をリン酸エステルによって保護した、アスコルビン酸－２－リン酸エステルである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　リン酸アスコルビルには、Ｄ体およびＬ体の立体異性体、ならびにラセミ体のＤＬ体が存在する。本実施形態におけるリン酸アスコルビルは、これらの立体異性体のいずれであってもよいが、入手容易性の観点から、Ｌ体であることが好ましく、具体的には、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸エステルが好ましい。
　・リン酸アスコルビルの塩
　リン酸アスコルビルの塩としては、例えば、リン酸アスコルビルと無機塩基との塩、リン酸アスコルビルと有機塩基との塩等が挙げられる。
　無機塩基との塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；アンモニウム塩；亜鉛塩等が挙げられる。
　有機塩基との塩としては、例えば、アルキルアンモニウム塩、塩基性アミノ酸との塩等が挙げられる。
　リン酸アスコルビルの塩としては、上記の中でも、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩が好ましく、ナトリウム塩またはマグネシウム塩がより好ましく、マグネシウム塩がさらに好ましい。
　リン酸アスコルビルのマグネシウム塩は、安定性が高く、かつ、着色されにくいという観点から好ましい。
　本実施形態のオートファジー活性化剤におけるリン酸アスコルビル又はその塩としては、上記の中でも、安定性向上の観点から、リン酸アスコルビルの塩であることが好ましく、上記化学式（１）で表される化合物のアルカリ金属塩、または、上記化学式（１）で表される化合物のアルカリ土類金属塩がより好ましく、上記化学式（１）で表される化合物のナトリウム塩、または、上記化学式（１）で表される化合物のマグネシウム塩がさらに好ましい。
　上記化学式（１）で表される化合物のマグネシウム塩は、具体的には、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸エステルのマグネシウム塩が特に好ましい。
　上記化学式（１）で表される化合物のナトリウム塩は、具体的には、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸エステルのナトリウム塩が特に好ましい。
　本実施形態のオートファジー活性化剤におけるリン酸アスコルビル又はその塩は、１種単独で用いてもよく、２種以上を併用して用いてもよい。
　リン酸アスコルビル又はその塩は、公知の製造方法、例えば、特開平２－２７９６９０、特開平６－３４５７８６に記載の方法等により製造することができる。
　例えば、リン酸アスコルビルの具体的な製造方法としては、アスコルビン酸と、オキシ塩化リン等とを反応させて、ホスホリル化することにより得ることができる。
　また、リン酸アスコルビルの塩の具体的な製造方法としては、リン酸アスコルビル溶液を、酸化マグネシウム等の金属酸化物、または、水酸化ナトリウム等の金属水酸化物等で中和することにより、リン酸アスコルビルの塩を得ることができる。
　本実施形態のオートファジー活性化剤におけるリン酸アスコルビルの塩の市販例としては、昭和電工社製のアスコルビン酸ＰＳ（化合物名；Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸エステルのナトリウム塩（Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸ナトリウムともいう）、表示名称；アスコルビルリン酸Ｎａ）、昭和電工社製のアスコルビン酸ＰＭ（化合物名；Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸エステルのマグネシウム塩（Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウムともいう）、表示名称；リン酸アスコルビルＭｇ）等が挙げられる。
　≪（ｉｉ）リン酸アスコルビルの脂肪酸エステル又はその塩≫
　・リン酸アスコルビルの脂肪酸エステル
　リン酸アスコルビルの脂肪酸エステルは、リン酸アスコルビルの少なくとも１つの水酸基に脂肪酸がエステル結合した化合物である。該脂肪酸としては、炭素原子数６～２２の直鎖状又は分岐鎖状の脂肪酸（すなわち、カルボキシ基に結合する直鎖状または分岐鎖状のアルキル基の炭素原子数が５～２１の脂肪酸）であることが好ましく、炭素原子数１０～２０の直鎖状または分岐鎖状の脂肪酸であることがより好ましく、炭素原子数１２～１８の直鎖状または分岐鎖状の脂肪酸であることがさらに好ましい。
　リン酸アスコルビルの脂肪酸エステルとしては、下記一般式（２）で表される化合物が挙げられる。下記一般式（２）で表される化合物は、アスコルビン酸の２位の水酸基にリン酸がエステル結合し、６位の水酸基に脂肪酸がエステル結合した、アスコルビン酸－２－リン酸－６－脂肪酸である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 ［式中、Ｒ１は炭素原子数５～２１の直鎖状または分岐鎖状のアルキル基である。］
　上記一般式（２）中、Ｒ１は炭素原子数５～２１の直鎖状または分岐鎖状のアルキル基である。具体的には、直鎖状又は分岐鎖状のペンチル基、直鎖状又は分岐鎖状のヘキシル基、直鎖状又は分岐鎖状のヘプチル基、直鎖状又は分岐鎖状のオクチル基、直鎖状又は分岐鎖状のノニル基、直鎖状又は分岐鎖状のデシル基、直鎖状又は分岐鎖状のウンデシル基、直鎖状又は分岐鎖状のドデシル基、直鎖状又は分岐鎖状のトリデシル基、直鎖状又は分岐鎖状のテトラデシル基、直鎖状又は分岐鎖状のペンタデシル基、直鎖状又は分岐鎖状のヘキサデシル基、直鎖状又は分岐鎖状のヘプタデシル基、直鎖状又は分岐鎖状のオクタデシル基、直鎖状又は分岐鎖状のノナデシル基、直鎖状又は分岐鎖状のイコシル基、直鎖状又は分岐鎖状のヘンイコシル基が挙げられる。
　上記一般式（２）中、Ｒ１は、上記の中でも、炭素原子数９～１９の直鎖状または分岐鎖状のアルキル基であることが好ましく、炭素原子数１１～１７の直鎖状または分岐鎖状のアルキル基であることがより好ましく、炭素原子数１３～１５の直鎖状または分岐鎖状のアルキル基であることがさらに好ましく、原料入手性などの観点から、炭素原子数１５の直鎖状のアルキル基（直鎖状のペンタデシル基）であることが特に好ましい。
　すなわち、上記一般式（２）で表される化合物としては、６－Ｏ－パルミトイルアスコルビン酸－２－リン酸エステル（アスコルビン酸－２－リン酸－６－パルミチン酸ともいう）が特に好ましい。
　リン酸アスコルビルの脂肪酸エステルには、Ｄ体およびＬ体の立体異性体、ならびにラセミ体のＤＬ体が存在する。本実施形態におけるリン酸アスコルビルの脂肪酸エステルは、これらの立体異性体のいずれであってもよいが、入手容易性の観点から、Ｌ体であることが好ましく、具体的には、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸エステルの脂肪酸エステルが好ましい。
　・リン酸アスコルビルの脂肪酸エステルの塩
　リン酸アスコルビルの脂肪酸エステルの塩としては、例えば、リン酸アスコルビルの脂肪酸エステルと無機塩基との塩、リン酸アスコルビルの脂肪酸エステルと有機塩基との塩等が挙げられる。
　無機塩基との塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；アンモニウム塩；亜鉛塩等が挙げられる。
　有機塩基との塩としては、例えば、アルキルアンモニウム塩、塩基性アミノ酸との塩等が挙げられる。
　リン酸アスコルビルの脂肪酸エステルの塩としては、上記の中でも、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩が好ましく、ナトリウム塩またはマグネシウム塩がより好ましく、ナトリウム塩がさらに好ましい。
　リン酸アスコルビルの脂肪酸エステルのナトリウム塩は、安定性及び製剤への配合容易性の観点から好ましい。
　本実施形態のオートファジー活性化剤におけるリン酸アスコルビルの脂肪酸エステル又はその塩としては、上記の中でも、安定性及び製剤への配合容易性の観点からリン酸アスコルビルの脂肪酸エステルの塩であることが好ましく、上記一般式（２）で表される化合物のアルカリ金属塩、または、上記一般式（２）で表される化合物のアルカリ土類金属塩がより好ましく、上記一般式（２）で表される化合物のナトリウム塩、または、上記一般式（２）で表される化合物のマグネシウム塩がさらに好ましく、上記一般式（２）で表される化合物のナトリウム塩、具体的には、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸－６－パルミチン酸のナトリウム塩が特に好ましい。
　本実施形態のオートファジー活性化剤におけるリン酸アスコルビルの脂肪酸エステル又はその塩は、１種単独で用いてもよく、２種以上を併用して用いてもよい。
　本実施形態のオートファジー活性化剤におけるリン酸アスコルビルの脂肪酸エステル又はその塩は、公知の製造方法、例えば、特許６２６５５５０に記載の方法等により製造することができる。
　例えば、リン酸アスコルビルの脂肪酸エステルの具体的な製造方法としては、上述したリン酸アスコルビルの製造方法と同様の方法でリン酸アスコルビルを製造した後、該リン酸アスコルビルと、脂肪酸またはそのエステルとを縮合反応させることにより得ることができる。
　また、リン酸アスコルビルの脂肪酸エステルの塩の具体的な製造方法としては、リン酸アスコルビルの脂肪酸エステル溶液を、酸化マグネシウム等の金属酸化物、または、水酸化ナトリウム等の金属水酸化物等で中和することにより、リン酸アスコルビルの脂肪酸エステルの塩を得ることができる。
　本実施形態のオートファジー活性化剤におけるリン酸アスコルビルの脂肪酸エステルの塩の市販例としては、昭和電工社製のアプレシエ（登録商標）（ＡＰＰＳ）（化合物名；Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸－６－パルミチン酸のナトリウム塩（Ｌ－６－Ｏ－パルミトイルアスコルビン酸－２－リン酸エステルのナトリウム塩ともいう）、表示名称；パルミチン酸アスコルビルリン酸３Ｎａ）等が挙げられる。
　≪（ｉｉｉ）エチルアスコルビン酸又はその塩≫
　・エチルアスコルビン酸
　エチルアスコルビン酸は、アスコルビン酸の少なくとも１つの水酸基にエチル基が導入された化合物である。
　エチルアスコルビン酸としては、下記化学式（３）で表される化合物が好適に挙げられる。
　下記化学式（３）で表される化合物は、アスコルビン酸の３位の水酸基の水素原子をエチル基によって置換した、３－Ｏ－エチルアスコルビン酸である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　エチルアスコルビン酸には、Ｄ体およびＬ体の立体異性体、ならびにラセミ体のＤＬ体が存在する。エチルアスコルビン酸は、これらの立体異性体のいずれであってもよいが、入手容易性の観点から、Ｌ体であることが好ましく、具体的には、Ｌ－３－Ｏ－エチルアスコルビン酸（３－Ｏ－エチル－Ｌ－アスコルビン酸ともいう）が好ましい。
　・エチルアスコルビン酸の塩
　エチルアスコルビン酸の塩としては、例えば、エチルアスコルビン酸と無機塩基との塩、エチルアスコルビン酸と有機塩基との塩等が挙げられる。
　無機塩基との塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；アンモニウム塩；亜鉛塩等が挙げられる。
　有機塩基との塩としては、例えば、アルキルアンモニウム塩、塩基性アミノ酸との塩等が挙げられる。
　本実施形態のオートファジー活性化剤におけるエチルアスコルビン酸又はその塩としては、上記の中でも、入手容易性の観点から、エチルアスコルビン酸であることが好ましく、Ｌ－３－Ｏ－エチルアスコルビン酸がより好ましい。
　本実施形態のオートファジー活性化剤におけるエチルアスコルビン酸又はその塩は、１種単独で用いてもよく、２種以上を併用して用いてもよい。
　エチルアスコルビン酸又はその塩は、公知の製造方法で製造することができる。
　例えば、エチルアスコルビン酸の製造方法としては、アスコルビン酸をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中でナトリウムメトキシド存在下にハロゲン化アルキルによりアルキル化する方法；特開平８－１３４０５５、特開平１－２２８９７７に記載の方法等により製造することができる。
　また、エチルアスコルビン酸の塩の具体的な製造方法としては、エチルアスコルビン酸溶液を、酸化マグネシウム等の金属酸化物、または、水酸化ナトリウム等の金属水酸化物等で中和することにより、エチルアスコルビン酸の塩を得ることができる。
　本実施形態のオートファジー活性化剤におけるエチルアスコルビン酸の市販例としては、富士フィルム和光純薬社製の３－Ｏ－エチル－Ｌ－アスコルビン酸（表示名称；３－Ｏ－エチルアスコルビン酸）等が挙げられる。
　≪（ｉｖ）アスコルビン酸グルコシド又はその塩≫
　・アスコルビン酸グルコシド
　アスコルビン酸グルコシドは、アスコルビン酸の少なくとも１つの水酸基がグルコシド化された化合物である。グルコシド結合は、α－グルコシド結合であることが好ましい。
　アスコルビン酸グルコシドとしては、下記化学式（４）で表される化合物が好適に挙げられる。
　下記化学式（４）で表される化合物は、アスコルビン酸の２位の水酸基にグルコースが結合した、アスコルビン酸２－グルコシドである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　アスコルビン酸には、Ｄ体およびＬ体の立体異性体、ならびにラセミ体のＤＬ体が存在する。アスコルビン酸グルコシド中のアスコルビン酸は、これらの立体異性体のいずれであってもよいが、入手容易性の観点から、Ｌ体であることが好ましく、アスコルビン酸グルコシドは、具体的には、Ｌ－アスコルビン酸－２－グルコシドが好ましい。アスコルビン酸グルコシド中のグルコースは、Ｄ体であってもＬ体であってもよいが、入手容易性の観点から、Ｄ体であることが好ましい。
　・アスコルビン酸グルコシドの塩
　アスコルビン酸グルコシドの塩としては、例えば、アスコルビン酸グルコシドと無機塩基との塩、アスコルビン酸グルコシドと有機塩基との塩等が挙げられる。
　無機塩基との塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；アンモニウム塩；亜鉛塩等が挙げられる。
　有機塩基との塩としては、例えば、アルキルアンモニウム塩、塩基性アミノ酸との塩等が挙げられる。
　本実施形態のオートファジー活性化剤におけるアスコルビン酸グルコシド又はその塩としては、上記の中でも、入手容易性の観点から、アスコルビン酸グルコシドであることが好ましく、Ｌ－アスコルビン酸２－グルコシドがより好ましい。
　本実施形態のオートファジー活性化剤におけるアスコルビン酸グルコシド又はその塩は、１種単独で用いてもよく、２種以上を併用して用いてもよい。
　アスコルビン酸グルコシド又はその塩は、例えば、特開平０３－１３９２８８に記載の方法等により製造することができる。
　例えば、アスコルビン酸グルコシドの具体的な製造方法としては、アスコルビン酸の２位の水酸基にグルコース１分子を酵素反応でα－グルコシド結合させることにより製造することができる。
　また、アスコルビン酸グルコシドの塩の具体的な製造方法としては、アスコルビン酸グルコシド溶液を、酸化マグネシウム等の金属酸化物、または、水酸化ナトリウム等の金属水酸化物等で中和することにより、アスコルビン酸グルコシドの塩を得ることができる。
　本実施形態のオートファジー活性化剤におけるアスコルビン酸グルコシドの市販例としては、林原社製のアスコルビン酸２－グルコシド（化合物名；Ｌ－アスコルビン酸２－グルコシド、表示名称；アスコルビルグルコシド）等が挙げられる。
　本実施形態のオートファジー活性化剤におけるアスコルビン酸誘導体又はその塩は、１種単独で用いてもよく、２種以上を併用して用いてもよい。
　本実施形態のオートファジー活性化剤におけるアスコルビン酸誘導体又はその塩としては、上記の中でも、よりオートファジーを活性化できる観点から、（ｉ）リン酸アスコルビル若しくはその塩又は（ｉｉ）リン酸アスコルビルの脂肪酸エステル若しくはその塩であることが好ましく、（ｉｉ）リン酸アスコルビルの脂肪酸エステル又はその塩であることがより好ましい。
　本実施形態のオートファジー活性化剤は、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病などの神経変性疾患の治療の目的で、それ自体を患者に投与して使用することができる。また、本実施形態のオートファジー活性化剤は、オートファジーを活性化する目的で、医薬品や化粧品に配合して使用することもできる。また、後述するオートファジー活性化用組成物に配合して使用してもよい。
　本実施形態のオートファジー活性化剤は、ＬＣ３遺伝子の発現を促進することで、オートファジーを効果的に活性化することができる。
　本実施形態のオートファジー活性化剤は、ＡＴＧ５遺伝子の発現を促進することで、オートファジーを効果的に活性化することができる。
　本実施形態のオートファジー活性化剤は、ＡＴＧ７遺伝子の発現を促進することで、オートファジーを効果的に活性化することができる。
　本実施形態のオートファジー活性化剤は、Ｂｅｃｌｉｎ　１遺伝子の発現を促進することで、オートファジーを効果的に活性化することができる。
　本実施形態のオートファジー活性化剤は、オートファジーを効果的に活性化することができるので、アルツハイマー病の予防または治療に用いることができる。
　アミロイドβは、神経細胞におけるオートファジーの低下を引き起こすことが知られている。また、アミロイドβは、オートファジーの低下とそれによる神経細胞のアポトーシスと呼ばれる細胞死を誘引することが知られている。
　本実施形態のオートファジー活性化剤は、アミロイドβ存在下でのＬＣ３遺伝子発現を促進させることができる。
　本実施形態のオートファジー活性化剤は、アミロイドβ存在下でのＡＴＧ５遺伝子発現を促進させることができる。
　本実施形態のオートファジー活性化剤は、アミロイドβ存在下でのＡＴＧ７遺伝子発現を促進させることができる。
　本実施形態のオートファジー活性化剤は、アミロイドβ存在下でのＢｅｃｌｉｎ　１遺伝子発現を促進させることができる。
　本実施形態のオートファジー活性化剤は、アミロイドβ存在下でのアポトーシスを抑制することができる。
　本実施形態のオートファジー活性化剤は、特に神経細胞において、アミロイドβ存在下でのＬＣ３遺伝子、ＡＴＧ５遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、及びＢｅｃｌｉｎ　１遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現を促進させることができる。また、本実施形態のオートファジー活性化剤は、特に神経細胞において、アミロイドβ存在下でのアポトーシスを抑制することができる。
　アミロイドβ存在下でＬＣ３遺伝子発現を促進させるとは、アミロイドβ存在下において、本実施形態のオートファジー活性化剤を投与することにより、前記オートファジー活性化剤を投与しなかった場合と比較して、ＬＣ３遺伝子の発現量が上昇することを意味する。ＡＴＧ５遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子およびＢｅｃｌｉｎ　１遺伝子についても同様である。
　アミロイドβ存在下でアポトーシスを抑制するとは、アミロイドβ存在下において、本実施形態のオートファジー活性化剤を投与することにより、前記オートファジー活性化剤を投与しなかった場合と比較して、アポトーシスが抑制されることを意味する。
　ＬＣ３（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１　ｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎ　３　ａｌｐｈａ：ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：８４５５７）は、オートファジーのシグナル伝達上流でホスファチジルエタノールアミンを付加され、オートファゴソーム膜に誘引されるＬＣ３－ＩＩへと変換され、オートファゴソーム膜に結合する。ＬＣ３は、オートファゴソームのマーカーとして用いられる。ヒトＬＣ３遺伝子の塩基配列としては、例えば、ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅデータベースに登録されているＮＭ＿０３２５１４．４、及びＮＭ＿１８１５０９．３等が挙げられる。
　ＡＴＧ５（ａｕｔｏｐｈａｇｙ　ｒｅｌａｔｅｄ　５：ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：９４７４）は、ＡＴＧ１２と結合して、ユビキチン様共役系でＥ１様活性化酵素として機能する。ヒトＡＴＧ５遺伝子の塩基配列としては、例えば、ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅデータベースに登録されているＮＭ＿００１２８６１０６．１、ＮＭ＿００１２８６１０７．１、ＮＭ＿００１２８６１０８．１、ＮＭ＿００１２８６１１１．１、及びＮＭ＿００４８４９．４等が挙げられる。
　ＡＴＧ７（ａｕｔｏｐｈａｇｙ　ｒｅｌａｔｅｄ　７：ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：１０５３３）は、ＡＴＰ依存的にＬＣ３及びＡＴＧ１２を活性化するＥ１様活性化酵素として機能する。ヒトＡＴＧ７遺伝子の塩基配列としては、例えば、ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅデータベースに登録されているＮＭ＿００１１３６０３１．３、ＮＭ＿００１１４４９１２．２、ＮＭ＿００１３４９２３２．２、ＮＭ＿００１３４９２３３．２、ＮＭ＿００１３４９２３４．２等が挙げられる。
　Ｂｅｃｌｉｎ　１（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：８６７８）は、ＡＴＧ１４Ｌ、Ｖｐｓ３４ｍｐ１５０と共にクレスＩＩＩ　ＰＩ３Ｋ複合体を形成し、オートファゴソーム形成の正の制御因子として機能する。ヒトＢｅｃｌｉｎ　１遺伝子の塩基配列としては、例えば、ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅデータベースに登録されているＮＭ＿００１３１３９９８．２、ＮＭ＿００１３１３９９９．１、ＮＭ＿００１３１４０００．１、及びＮＭ＿００３７６６．４等が挙げられる。
　本実施形態のオートファジー活性化剤は、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病等の神経変性疾患の発症リスクが高い患者に投与し、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病などの神経変性疾患を予防するために使用してもよい。また、本実施形態のオートファジー活性化剤は、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病などの神経変性疾患を発症した患者に投与し、神経変性疾患の進行や悪化を抑制するために使用してもよい。
　本実施形態のオートファジー活性化剤は、後述するオートファジー活性化用組成物と同様の方法で患者に投与することができ、経口的に投与してもよく、非経口的に投与してもよく、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、腹腔内等に投与してもよく、坐剤として直腸内投与してもよく、皮膚外用剤として皮膚に投与してもよい。
　（オートファジー活性化用組成物）
　本実施形態のオートファジー活性化用組成物は、上述したアスコルビン酸誘導体又はその塩を含有する、オートファジー活性化剤と、薬学的に許容される担体とを含有する。
　本実施形態のオートファジー活性化用組成物は、常法（例えば、日本薬局方記載の方法）に従って、上述したオートファジー活性化剤、薬学的に許容される担体、および場合によっては他の成分を混合して製剤化することにより製造することができる。
　本明細書において、「薬学的に許容される担体」とは、有効成分の生理活性を阻害せず、かつ、その投与対象に対して実質的な毒性を示さない担体を意味する。
　なお、「実質的な毒性を示さない」とは、その成分が通常使用される投与量において、投与対象に対して毒性を示さないことを意味する。
　薬学的に許容される担体としては、特に制限されず、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、希釈剤、注射剤用溶剤、保湿剤、感触向上剤、界面活性剤、高分子・増粘・ゲル化剤、溶剤、噴射剤、酸化防止剤、還元剤、酸化剤、キレート剤、酸、アルカリ、粉体、無機塩、水、金属含有化合物、不飽和単量体、多価アルコール、高分子添加剤、湿潤剤、増粘剤、粘着付与物質、油性原料、液状マトリックス、脂溶性物質、高分子カルボン酸塩等を挙げることができる。
　これらの成分の具体例としては、例えば、国際公開公報第２０１６／０７６３１０号に記載のもの等が挙げられる。さらに、高分子・増粘・ゲル化剤の具体例としては、メタクロイルオキシエチルホスホリルコリン、メタクリル酸ブチルまたはこれらの重合体等が挙げられる。
　本実施形態のオートファジー活性化用組成物における薬学的に許容される担体は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
　また、他の成分としては、特に制限されず、防腐剤、抗菌剤、紫外線吸収剤、美白剤、アスコルビン酸誘導体又はその塩以外のビタミン類及びその誘導体類、消炎剤、抗炎症剤、育毛用薬剤、血行促進剤、刺激剤、ホルモン類、抗しわ剤、抗老化剤、ひきしめ剤、冷感剤、温感剤、創傷治癒促進剤、刺激緩和剤、鎮痛剤、細胞賦活剤、植物・動物・微生物エキス、種子油、鎮痒剤、角質剥離・溶解剤、制汗剤、清涼剤、収れん剤、酵素、核酸、香料、色素、着色剤、染料、顔料、消炎鎮痛剤、抗真菌剤、抗ヒスタミン剤、催眠鎮静剤、精神安定剤、抗高血圧剤、降圧利尿剤、抗生物質、麻酔剤、抗菌性物質、抗てんかん剤、冠血管拡張剤、生薬、止痒剤、角質軟化剥離剤、紫外線遮断剤、殺菌剤、抗酸化物質、ｐＨ調整剤、添加剤、金属セッケン等を挙げることができる。これらの成分の具体例としては、例えば、国際公開公報第２０１６／０７６３１０号に記載のもの等が挙げられる。さらに、植物・動物・微生物エキスの具体例としては、ラプサナコムニス花／葉／茎、チャ葉等が挙げられる。種子油の具体例としては、ワサビノキ種子油が挙げられる。香料の具体例としては、ペリルアルデヒドが挙げられる。
　他の成分は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
　本実施形態のオートファジー活性化用組成物は、前記オートファジー活性化剤を治療的有効量含有することができる。「治療的有効量」とは、患者の疾患の治療又は予防のために有効な薬剤の量を意味する。治療的有効量は、投与対象の疾患の状態、年齢、性別、および体重等によって変動し得る。
　本実施形態のオートファジー活性化用組成物において、上記のオートファジー活性化剤の治療的有効量は、アスコルビン酸誘導体又はその塩が、オートファジーを活性化し得る量であり得る。また、上記のオートファジー活性化剤の治療的有効量は、アスコルビン酸誘導体又はその塩が、ＬＣ３遺伝子、ＡＴＧ５遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、および、Ｂｅｃｌｉｎ　１遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子の発現を促進し得る量である。また、上記オートファジー活性化剤の治療的有効量は、アスコルビン酸誘導体又はその塩が、アミロイドβの存在下で、アポトーシスを抑制し得る量であり得る。
　本実施形態のオートファジー活性化用組成物における前記オートファジー活性化剤の治療的有効量（アスコルビン酸誘導体又はその塩の合計含有量）は、オートファジー活性化用組成物全量に対して、例えば０．０５～１５質量％であってもよく、例えば０．１～１０質量％であってもよく、例えば０．５～５質量％であってもよい。
　なお、アスコルビン酸誘導体又はその塩の合計含有量とは、１種のアスコルビン酸誘導体又はその塩を単独で使用する場合にはその化合物の含有量を意味し、アスコルビン酸誘導体又はその塩を２種以上組み合わせて用いる場合には、これらの化合物の合計の含有量を意味する。
　本実施形態のオートファジー活性化用組成物は、医薬組成物であってもよく、化粧料であってもよい。
　（医薬組成物）
　一実施形態において、本発明は、上述したオートファジー活性化剤及び薬学的に許容される担体を含有する、オートファジー活性化用医薬組成物を提供する。
　本実施形態の医薬組成物において、薬学的に許容される担体としては、特に制限されず、上記に挙げたもののほか医薬品に一般的に使用される担体を使用することができる。例えば、日本薬局方、日本薬局方外医薬品規格、医薬品添加物規格２０１３（薬事日報社、２０１３年）、医薬品添加物辞典２０１６（日本医薬品添加剤協会編、薬事日報社、２０１６年）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，７ｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｐｒｅｓｓ、２０１２年）等に記載されている一般的な原料を使用することができる。
　薬学的に許容される担体は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
　本実施形態の医薬組成物は、前記オートファジー活性化剤及び薬学的に許容される担体に加えて、他の成分を含有していてもよい。他の成分としては、特に制限されず、一般的な医薬品添加物を使用することができる。また、他の成分として、上述したオートファジー活性化剤以外の活性成分を使用することもできる。他の成分としての医薬品添加物及び活性成分としては、上記に挙げたもののほか、例えば、日本薬局方、日本薬局方外医薬品規格、医薬品添加物規格２０１３（薬事日報社、２０１３年）、医薬品添加物辞典２０１６（日本医薬品添加剤協会編、薬事日報社、２０１６年）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，７ｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｐｒｅｓｓ、２０１２年）等に記載されている一般的な原料を使用することができる。他の成分は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
　本実施形態の医薬組成物の剤型としては、特に制限されず、医薬品製剤として一般的に用いられる剤型とすることができる。例えば、錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の経口的に投与する剤型；及び、注射剤、坐剤、皮膚外用剤等の非経口的に投与する剤型等が挙げられる。これらの剤型の医薬組成物は、定法（例えば、日本薬局方記載の方法）に従って、製剤化することができる。
　本実施形態の医薬組成物の投与方法は、特に制限されず、医薬品の投与方法として一般的に用いられる方法で投与することができる。例えば、錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等として経口投与してもよく、注射剤、輸液製剤等として、単独で、又はブドウ糖液、リンゲル液等の一般的な輸液と混合して、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、腹腔内等に投与してもよく、坐剤として直腸内投与してもよく、皮膚外用剤として皮膚に投与してもよい。
　本実施形態の医薬組成物の投与量は、治療的有効量とすることができる。治療的有効量は、患者の症状、体重、年齢、及び性別等、並びに医薬組成物の剤型、及び投与方法等によって適宜決定すればよい。
　例えば、本実施形態の医薬組成物の投与量は、経口投与の場合には、アスコルビン酸誘導体又はその塩の合計含有量として投与単位形態あたり０．０１～５００ｍｇ、注射剤の場合には、アスコルビン酸誘導体又はその塩の合計含有量として投与単位形態あたり０．０２～２５０ｍｇ、坐剤の場合には、アスコルビン酸誘導体又はその塩の合計含有量として投与単位形態あたり０．０１～５００ｍｇ、皮膚外用剤の場合には、アスコルビン酸誘導体又はその塩の合計含有量として投与単位形態あたり０．０１～５００ｍｇ等が挙げられる。
　本実施形態の医薬組成物の投与間隔は、患者の症状、体重、年齢、および性別等、ならびに医薬組成物の剤型、および投与方法等によって適宜決定すればよい。例えば、１日１回又は２～３回程度等とすることができる。
　本実施形態の医薬組成物は、オートファジー活性の低下に起因する疾患の治療又は予防のために用いることができる。そのような疾患としては、例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ＳＥＮＤＡ病などの神経変性疾患；クローン病などの炎症性腸疾患；がんなどが挙げられる。
　本実施形態の医薬組成物は、例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ＳＥＮＤＡ病などの神経変性疾患；クローン病などの炎症性腸疾患；又はがんの患者に投与して、神経変性疾患、炎症性腸疾患、又はがんの進行を抑制するために用いることができる。また、本実施形態の医薬組成物は、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ＳＥＮＤＡ病などの神経変性疾患；クローン病などの炎症性腸疾患；又はがんの患者に投与して、神経変性疾患、炎症性腸疾患、又はがんを治療するために用いることができる。また、本実施形態の医薬組成物は、アミロイドβに起因する疾患を治療するために用いることができる。また、本実施形態の医薬組成物は、ＬＣ３遺伝子、ＡＴＧ５遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、または、Ｂｅｃｌｉｎ　１遺伝子の発現量低下に起因する疾患を治療するために用いることができる。
　本実施形態の医薬組成物は、上記の中でも、特にアルツハイマー病を治療するために好適に用いることができる。
　本実施形態の医薬組成物は、アルツハイマー病をはじめ、ハンチントン病、パーキンソン病、ＳＥＮＤＡ病などの神経変性疾患の発症リスクの高い患者に投与して、神経変性疾患を予防するために用いることもできる。また、本実施形態の医薬組成物は、クローン病などの炎症性腸疾患の発症リスクの高い患者に投与して、炎症性腸疾患を予防するために用いることもできる。また、本実施形態の医薬組成物は、がんの発症リスクの高い患者に投与して、がんを予防するために用いることもできる。
　（化粧料）
　一実施形態において、本発明は、上述したオートファジー活性化剤及び薬学的に許容される担体を含有する、オートファジー活性化のための化粧料を提供する。
　本実施形態の化粧料において、薬学的に許容される担体としては、特に制限されず、上記に挙げたもののほか化粧料に一般的に使用される担体を使用することができる。例えば、化粧品原料基準第二版注解（日本公定書協会編、薬事日報社、１９８４年）、化粧品原料基準外成分規格（厚生省薬務局審査課監修、薬事日報社、１９９３年）、化粧品原料基準外成分規格追補（厚生省薬務局審査課監修、薬事日報社、１９９３年）、化粧品種別許可基準（厚生省薬務局審査課監修、薬事日報社、１９９３年）、化粧品原料辞典（日光ケミカルズ社、平成３年）、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｓｍｅｔｉｃ　Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ　Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ　ａｎｄ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　２００２　Ｎｉｎｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ　Ｖｏｌ．１～４，ｂｙ　ＣＴＦＡ等に記載されている一般的な原料を使用することができる。
　薬学的に許容される担体は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
　本実施形態の化粧料は、オートファジー活性化剤及び薬学的に許容される担体に加えて、他の成分を含有していてもよい。他の成分としては、特に制限されず、一般的な化粧品添加物を使用することができる。また、他の成分として、上述したオートファジー活性化剤以外の活性成分を使用することもできる。他の成分としての化粧品添加物及び活性成分としては、上記に挙げたもののほか、例えば、化粧品原料基準第二版注解（日本公定書協会編、薬事日報社、１９８４年）、化粧品原料基準外成分規格（厚生省薬務局審査課監修、薬事日報社、１９９３年）、化粧品原料基準外成分規格追補（厚生省薬務局審査課監修、薬事日報社、１９９３年）、化粧品種別許可基準（厚生省薬務局審査課監修、薬事日報社、１９９３年）、化粧品原料辞典（日光ケミカルズ社、平成３年）、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｓｍｅｔｉｃ　Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ　Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ　ａｎｄ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　２００２　Ｎｉｎｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ　Ｖｏｌ．１～４，ｂｙ　ＣＴＦＡ等に記載されている一般的な原料を使用することができる。他の成分は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
　本実施形態の化粧料の形態としては、特に制限されず、化粧料として一般的に用いられる形態とすることができる。例えば、シャンプー、リンス、整髪剤などの毛髪用化粧料；洗顔料、クレンジング剤、化粧水、乳液、ローション、クリーム、ジェル、サンスクリーン剤、パック、マスク、美容液などの基礎化粧料；ファンデーション類、化粧下地、口紅類、リップグロス、頬紅類などのメーキャップ化粧料；ボディ洗浄料、ボディーパウダー、防臭化粧料などのボディ化粧料等が挙げられる。これらの化粧料は、定法に従って製造することができる。
　また、本実施形態の化粧料の剤型としては、特に制限されず、例えば、水中油（Ｏ／Ｗ）型、油中水（Ｗ／Ｏ）型、Ｗ／Ｏ／Ｗ型、Ｏ／Ｗ／Ｏ型等の乳化型、乳化高分子型、油性、固形、液状、練状、スティック状、揮発性油型、粉状、ゼリー状、ジェル状、ペースト状、クリーム状、シート状、フィルム状、ミスト状、スプレー型、エアゾール状、多層状、泡状、フレーク状等が挙げられる。
　本実施形態の化粧料の使用量は、特に制限されないが、オートファジーを活性化するために有効な量とすることができる。
　例えば、本実施形態の化粧料の使用量は、アスコルビン酸誘導体又はその塩の合計含有量として１回の使用あたり０．０１～５００ｍｇであり、例えば０．１５～３００ｍｇであってもよく、例えば０．１５～２００ｍｇであってもよく、例えば０．２～１００ｍｇであってもよい。
　本実施形態の化粧料の使用間隔は、特に制限されないが、例えば、１日１回又は２～３回程度等とすることができる。
　本実施形態の化粧料は、オートファジー活性の低下に起因する症状を緩和するために用いることができる。または、オートファジー活性の低下に起因する症状の発症を予防するために、これらの発症リスクが高い被験者により日常的なスキンケアやメーキャップに使用されてもよい。
　（その他の実施形態）
　一実施形態において、本発明は、アスコルビン酸誘導体又はその塩を対象に投与する工程を含む、オートファジーを活性化する方法を提供する。
　一実施形態において、本発明は、アスコルビン酸誘導体又はその塩を対象に投与する工程を含む、ＬＣ３遺伝子、ＡＴＧ５遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、又はＢｅｃｌｉｎ　１遺伝子の発現を促進する方法を提供する。
　一実施形態において、本発明は、アスコルビン酸誘導体又はその塩を対象に投与する工程を含む、アミロイドβ存在下でのアポトーシスを抑制する方法を提供する。
　一実施形態において、本発明は、オートファジーを活性化するための、アスコルビン酸誘導体又はその塩を提供する。
　一実施形態において、本発明は、ＬＣ３遺伝子、ＡＴＧ５遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、又はＢｅｃｌｉｎ　１遺伝子の発現を促進するための、アスコルビン酸誘導体又はその塩を提供する。
　一実施形態において、本発明は、アミロイドβ存在下でのアポトーシスを抑制するための、アスコルビン酸誘導体又はその塩を提供する。
　一実施形態において、本発明は、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ＳＥＮＤＡ病、クローン病、又はがんを予防又は治療するための、アスコルビン酸誘導体又はその塩を提供する。
　一実施形態において、本発明は、オートファジー活性化剤を製造するための、アスコルビン酸誘導体又はその塩の使用を提供する。
　一実施形態において、本発明は、ＬＣ３遺伝子、ＡＴＧ５遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、又はＢｅｃｌｉｎ　１遺伝子発現の促進剤を製造するための、アスコルビン酸誘導体又はその塩の使用を提供する。
　一実施形態において、本発明は、アミロイドβ存在下でのＬＣ３遺伝子、ＡＴＧ５遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、又はＢｅｃｌｉｎ　１遺伝子発現の促進剤を製造するための、アスコルビン酸誘導体又はその塩の使用を提供する。
　一実施形態において、本発明は、アミロイドβ存在下でのアポトーシスの抑制剤を製造するための、アスコルビン酸誘導体又はその塩の使用を提供する。
　一実施形態において、本発明は、オートファジー活性化用組成物を製造するための、アスコルビン酸誘導体又はその塩の使用を提供する。
　一実施形態において、本発明は、ＬＣ３遺伝子、ＡＴＧ５遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、又はＢｅｃｌｉｎ　１遺伝子発現の促進用組成物を製造するための、アスコルビン酸誘導体又はその塩の使用を提供する。
　一実施形態において、本発明は、アミロイドβ存在下でのＬＣ３遺伝子、ＡＴＧ５遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、又はＢｅｃｌｉｎ　１遺伝子発現の促進用組成物を製造するための、アスコルビン酸誘導体又はその塩の使用を提供する。
　一実施形態において、本発明は、アミロイドβ存在下でのアポトーシスの抑制用組成物を製造するための、アスコルビン酸誘導体又はその塩の使用を提供する。
　以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。
　［アスコルビン酸誘導体又はその塩］
　以下の実施例および処方例では、下記のアスコルビン酸誘導体又はその塩を使用した。
　ＡＰＭ：Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸エステルのマグネシウム塩（表示名称；リン酸アスコルビルＭｇ、製品名；アスコルビン酸ＰＭ、昭和電工社製）
　ＡＰＰＳ：Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸－６－パルミチン酸のナトリウム塩（表示名称；パルミチン酸アスコルビルリン酸３Ｎａ、製品名；アプレシエ（ＡＰＰＳ）、昭和電工社製）
　ＡＧ：Ｌ－アスコルビン酸２－グルコシド（表示名称；アスコルビルグルコシド、製品名；アスコルビン酸２－グルコシド、林原社製）
　ＡＥ：３－Ｏ－エチル－Ｌ－アスコルビン酸（表示名称；３－Ｏ－エチルアスコルビン酸、製品名；３－Ｏ－エチル－Ｌ－アスコルビン酸、富士フィルム和光純薬社製）
　＜ヒト老化線維芽細胞におけるＬＣ３遺伝子、ＡＴＧ５遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、および、Ｂｅｃｌｉｎ　１遺伝子の発現促進効果の評価＞
　人為的に老化を誘発した細胞を作製するため、線維芽細胞を用いて試験を行った。老化線維芽細胞は、以下の手順により作製した。
　≪老化線維芽細胞の作製≫
　１０％ウシ胎児血清（ＭＰ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）を添加したＤ－ＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）で、ヒト正常線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ；ＲＩＫＥＮ　ＢＲＣ　セルバンク製）をコンフルエントになるまで培養した。その後、２５０μＭ過酸化水素水で２時間処理し、新しい１０％ウシ胎児血清を添加したＤ－ＭＥＭ培地で２４時間培養した。この過酸化水素水による処理と細胞培養の操作を３回繰り返し、得られた線維芽細胞を老化線維芽細胞とした。
　≪遺伝子の発現促進効果の評価試験≫
　作製した老化線維芽細胞を、１００００個／ｃｍ２の播種密度で準備し、１０％ウシ胎児血清（ＭＰ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）を添加したＤ－ＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）にて２４時間培養した。次いで、実施例１では、ＡＰＭの終濃度が１０μＭとなるように、精製水に溶かしたＡＰＭを培地に添加した。実施例２では、ＡＰＰＳの終濃度が１μＭとなるように、精製水に溶かしたＡＰＰＳを培地に添加した。実施例３では、ＡＰＰＳの終濃度が１０μＭとなるように、精製水に溶かしたＡＰＰＳを培地に添加した。実施例４では、ＡＧの終濃度が１００μＭとなるように、精製水に溶かしたＡＧを培地に添加した。実施例５では、ＡＥの終濃度が１００μＭとなるように、精製水に溶かしたＡＥを培地に添加した。
　また、比較例１では、培地に精製水のみを添加した。
　次いで、それぞれの培地を、２４時間、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。
　一方で、参考例１としては、上記ヒト正常線維芽細胞を、１００００個／ｃｍ２の播種密度で準備し、１０％ウシ胎児血清（ＭＰ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）を添加したＤ－ＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）にて２４時間培養し、該培地に精製水のみを添加した。次いで、該培地を、２４時間、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。
　その後、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ（登録商標）　ＲＮＡキット（タカラバイオ社製）を用いて、各例の老化線維芽細胞、または、ヒト正常線維芽細胞からＲＮＡを抽出し、得られたＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。次いで、このｃＤＮＡをテンプレートに、定量リアルタイムＰＣＲで、ＬＣ３遺伝子、ＡＴＧ５遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、およびＢｅｃｌｉｎ　１遺伝子に特異的なプライマー（タカラバイオ社製）をそれぞれ用いて、各遺伝子の発現量を定量した。
　内部標準遺伝子として化合物添加により遺伝子発現に変動がみられないハウスキーピング遺伝子のＧＡＰＤＨ（プライマー；タカラバイオ社製）の発現量を定量し、その値により各遺伝子の発現量を標準化した。前記各例における遺伝子発現量について、比較例１における各遺伝子の発現量をそれぞれ１．００としたときの、相対遺伝子発現量を求めた。その結果を表１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表１に示す通り、参考例１および比較例１において、それぞれ精製水のみ添加して培養したヒト正常線維芽細胞および老化線維芽細胞では、老化線維芽細胞の方が、ＬＣ３遺伝子、ＡＴＧ５遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、および、Ｂｅｃｌｉｎ　１遺伝子の発現量がいずれも低下していることが確認できた。
　一方で、実施例１～５のオートファジー活性化剤を添加して培養した老化線維芽細胞では、比較例１の精製水のみ添加して培養した老化線維芽細胞に比べて、特にＬＣ３遺伝子の発現量が高く、ＬＣ３遺伝子の発現促進効果が確認できた。
　また、その中でも、実施例１～３のオートファジー活性化剤を添加した場合は、アスコルビン酸誘導体（ＡＰＭおよびＡＰＰＳ）が低濃度であっても、ＬＣ３遺伝子の発現量が高く、顕著なＬＣ３遺伝子の発現促進効果が確認できた。
　また、実施例２および３では、ＡＰＰＳが非常に低濃度であっても、ＬＣ３遺伝子、ＡＴＧ５遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、および、Ｂｅｃｌｉｎ　１遺伝子のいずれの発現量も向上させることができ、ＡＰＰＳは、特にＬＣ３遺伝子、ＡＴＧ５遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、および、Ｂｅｃｌｉｎ　１遺伝子の発現促進効果に優れることが確認できた。
　＜ヒト神経芽細胞腫におけるＬＣ３遺伝子、ＡＴＧ５遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、および、Ｂｅｃｌｉｎ　１遺伝子の発現促進効果の評価＞
　オートファジー活性化剤存在下で、ヒト神経芽細胞腫（ＳＨ－ＳＹ５Ｙ；ＡＴＣＣから入手）におけるＬＣ３遺伝子、ＡＴＧ５遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、および、Ｂｅｃｌｉｎ　１遺伝子の発現量を以下の試験方法で測定し、オートファジー活性化剤によるＬＣ３遺伝子、ＡＴＧ５遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、および、Ｂｅｃｌｉｎ　１遺伝子の発現促進効果を評価した。
　以下の実施例及び比較例では、神経細胞におけるオートファジーの低下を引き起こすことが知られているアミロイドβを各培地に添加して試験を行った。
　上記ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を１００００個／ｃｍ２の播種密度で準備し、１０％ウシ胎児血清（ＭＰ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）を添加したＤ－ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）にて２４時間培養した。次いで、実施例６では、ＡＰＭの終濃度が１０μＭとなるように、精製水に溶かしたＡＰＭを培地に添加した。実施例７では、ＡＰＰＳの終濃度が１μＭとなるように、精製水に溶かしたＡＰＰＳを培地に添加した。実施例８では、ＡＰＰＳの終濃度が１０μＭとなるように、精製水に溶かしたＡＰＰＳを培地に添加した。実施例９では、ＡＧの終濃度が１００μＭとなるように、精製水に溶かしたＡＧを培地に添加した。実施例１０では、ＡＥの終濃度が１００μＭとなるように、精製水に溶かしたＡＥを培地に添加した。
　また、比較例２では、培地に精製水のみを添加した。
　次いで、アミロイドβ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を０．０１％（Ｖ／Ｖ）ＤＭＳＯに溶かしたアミロイドβ溶液を調製し、各培地におけるアミロイドβの終濃度が２０μＭとなるように、該アミロイドβ溶液を各培地に添加した。
　なお、参考例２では精製水のみ添加し、アミロイドβ溶液は添加しなかった。
　次いで、それぞれの培地を、４８時間、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。
　その後、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ（登録商標）　ＲＮＡキット（タカラバイオ社製）を用いて、各例のＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞からＲＮＡを抽出し、得られたＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。次いで、このｃＤＮＡをテンプレートに、定量リアルタイムＰＣＲで、ＬＣ３遺伝子、ＡＴＧ５遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、およびＢｅｃｌｉｎ　１遺伝子に特異的なプライマー（タカラバイオ社製）をそれぞれ用いて、各遺伝子の発現量を定量した。
　内部標準遺伝子として化合物添加により発現に変動がみられないハウスキーピング遺伝子のＧＡＰＤＨ（プライマー；タカラバイオ社製）の発現量を定量し、その値により各遺伝子の発現量を標準化した。前記各例における遺伝子発現量について、参考例２における各遺伝子の発現量をそれぞれ１．００としたときの、相対遺伝子発現量を求めた。その結果を表２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表２に示す通り、参考例２および比較例２において、精製水のみ添加して培養したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞に比べて、さらにアミロイドβを添加して培養したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞では、ＬＣ３遺伝子、ＡＴＧ５遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、および、Ｂｅｃｌｉｎ　１遺伝子の発現量がいずれも低下していることが確認できた。また、その中でも、特にＬＣ３遺伝子の発現量が低下していることが確認できた。
　一方で、実施例６～１０の、オートファジー活性化剤とアミロイドβ溶液とを添加して培養したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞では、比較例２の、精製水とアミロイドβ溶液とを添加して培養したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞に比べて、特にＬＣ３遺伝子の発現量が高く、実施例６～１０のオートファジー活性化剤によるＬＣ３遺伝子の発現促進効果が確認できた。
　また、実施例６～１０の、オートファジー活性化剤とアミロイドβ溶液とを添加して培養したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞は、参考例２の精製水のみ添加して培養したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞よりも、ＡＴＧ５、ＡＴＧ７、および、Ｂｅｃｌｉｎ　１遺伝子の発現量が高まることが確認できた。
　実施例の中でも、実施例６～８では、アスコルビン酸誘導体（ＡＰＭおよびＡＰＰＳ）が低濃度であっても、ＬＣ３遺伝子の発現量が高く、顕著なＬＣ３遺伝子の発現促進効果が確認できた。
　また、実施例７および８では、ＡＰＰＳが非常に低濃度であっても、ＬＣ３遺伝子、ＡＴＧ５遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、および、Ｂｅｃｌｉｎ　１遺伝子のいずれの発現量も向上させることができ、特にＬＣ３遺伝子、ＡＴＧ５遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、および、Ｂｅｃｌｉｎ　１遺伝子の発現促進効果に優れることが確認できた。
　＜ヒト神経芽細胞腫におけるアミロイドβに起因するアポトーシス抑制作用の評価＞　オートファジー活性化剤存在下でのヒト神経芽細胞腫（ＳＨ－ＳＹ５Ｙ；ＡＴＣＣから入手）におけるアポトーシス細胞の割合を以下の試験方法で測定し、オートファジー活性化剤によるアポトーシス抑制作用を評価した。
　以下の実施例及び比較例では、オートファジーの低下とそれによる神経細胞のアポトーシスと呼ばれる細胞死を誘引することが知られているアミロイドβを各培地に添加して試験を行った。
　ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を５００００個／ｃｍ２の播種密度で準備し、１０％ウシ胎児血清（ＭＰ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）を添加したＤ－ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）にて２４時間培養した。次いで、実施例１１では、ＡＰＭの終濃度が１０μＭとなるように、精製水に溶かしたＡＰＭを培地に添加した。実施例１２では、ＡＰＭの終濃度が１００μＭとなるように、精製水に溶かしたＡＰＭを培地に添加した。実施例１３では、ＡＰＰＳの終濃度が１μＭとなるように、精製水に溶かしたＡＰＰＳを培地に添加した。実施例１４では、ＡＰＰＳの終濃度が１０μＭとなるように、精製水に溶かしたＡＰＰＳを培地に添加した。実施例１５では、ＡＧの終濃度が１００μＭとなるように、精製水に溶かしたＡＧを培地に添加した。実施例１６では、ＡＥの終濃度が１００μＭとなるように、精製水に溶かしたＡＥを培地に添加した。
　また、比較例３としては、培地に精製水のみを添加した。
　次いで、アミロイドβ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を０．０１％（Ｖ／Ｖ）ＤＭＳＯに溶かしたアミロイドβ溶液を調製し、各培地におけるアミロイドβの終濃度が３０μＭとなるように、該アミロイドβ溶液を各培地に添加した。
　なお、参考例３では精製水のみ添加し、アミロイドβ溶液は添加しなかった。
　次いで、それぞれの培地を、４８時間、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。
　その後、培地を取り除いた各ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞に１０μＭ　Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）水溶液を添加し、室温（２５℃）で１０分間静置した。溶液を除去後、各ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ、富士フイルム和光純薬社製）で洗浄し、蛍光顕微鏡下でクロマチン凝集によるアポトーシス様の強いＨｏｅｃｈｓｔ蛍光の見られる細胞数（Ｈｏｅｃｈｓｔ（＋）細胞）を計測した。独立試行の４実験で、各視野５０００細胞以上を計測し、該４試験におけるＨｏｅｃｈｓｔ（＋）細胞の割合の平均値を、アポトーシスを起こしている細胞の割合とした。各例について、参考例３におけるアポトーシス細胞の割合を１．００とした時の相対値を算出し、その結果を表３に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表３に示す通り、参考例３および比較例３において、精製水のみ添加して培養した参考例３のＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞に比べて、さらにアミロイドβを添加して培養した比較例３のＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞では、アポトーシス細胞の割合が増加することが確認できた。
　一方で、実施例１１～１６の、オートファジー活性化剤とアミロイドβ溶液とを添加して培養したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞では、比較例３の、精製水とアミロイドβ溶液とを添加して培養したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞に比べて、アポトーシス細胞の割合が低下することが確認できた。
［処方例］
　オートファジー活性化用組成物として、外用剤の処方例１～４を表４に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　本発明により、オートファジーを効果的に活性化することができるオートファジー活性化剤、及び前記オートファジー活性化剤を含有するオートファジー活性化用組成物が提供される。
　以上、本発明の好ましい実施例を説明したが、本発明はこれら実施例に限定されることはない。本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。本発明は前述した説明によって限定されることはなく、添付のクレームの範囲によってのみ限定される。

Claims (10)

  1. 　アスコルビン酸誘導体又はその塩を有効成分として含有する、オートファジー活性化剤。
  2. 　前記アスコルビン酸誘導体又はその塩が、リン酸アスコルビル、リン酸アスコルビルの脂肪酸エステル、エチルアスコルビン酸、およびアスコルビン酸グルコシドからなる群より選択される少なくとも１種のアスコルビン酸誘導体又はその塩である、請求項１に記載のオートファジー活性化剤。
  3. 　前記アスコルビン酸誘導体又はその塩が、リン酸アスコルビルの脂肪酸エステル又はその塩である、請求項２に記載のオートファジー活性化剤。
  4. 　前記リン酸アスコルビルの脂肪酸エステル又はその塩が、リン酸アスコルビルのパルミチン酸エステル又はその塩である、請求項３に記載のオートファジー活性化剤。
  5. 　前記アスコルビン酸誘導体の塩を有効成分として含有し、前記アスコルビン酸誘導体の塩が、アスコルビン酸誘導体のマグネシウム塩又はナトリウム塩である、請求項１～４のいずれか一項に記載のオートファジー活性化剤。
  6. 　ＬＣ３遺伝子の発現を促進する、請求項１～５のいずれか一項に記載のオートファジー活性化剤。
  7. 　ＬＣ３遺伝子、ＡＴＧ５遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、および、Ｂｅｃｌｉｎ　１遺伝子の発現を促進する、請求項１～６のいずれか一項に記載のオートファジー活性化剤。
  8. 　アルツハイマー病の予防または治療に用いる、請求項１～７のいずれか一項に記載のオートファジー活性化剤。
  9. 　請求項１～８のいずれか一項に記載のオートファジー活性化剤および薬学的に許容される担体を含有する、オートファジー活性化用組成物。
  10. 　前記アスコルビン酸誘導体又はその塩の合計含有量が、オートファジー活性化用組成物全量に対して、０．０５～１５質量％である、請求項９に記載のオートファジー活性化用組成物。
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