CN116179622A - 一种酶法制备n-3多不饱和脂肪酸甘油二酯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶法制备n‑3多不饱和脂肪酸甘油二酯的方法，以富含n‑3多不饱和脂肪酸的油脂为原料，选择性酶促水解法制备甘油二酯油，在酶法反应前，先对反应原料进行均质处理，以提高脂肪酶在水解混合反应体系中的催化效率，最终达到了降低反应时间，降低脂肪酶添加量的目的，从而达到了降低工业化制备成本的目的。本发明提供了一种有效、温和、低成本的酶法制备富含n‑3多不饱和脂肪酸甘油二酯的方法，大大降低了酶促反应制备甘油二酯的成本，具有一定工业化应用前景。
Description
技术领域
本发明属于食品生物技术领域，具体涉及到一种酶法制备n-3多不饱和脂肪酸甘油二酯的方法。
背景技术
甘油二酯(DAG)是指甘油三酯上一个脂肪酸被水解掉产生的一种功能性油脂，可以分为1,2-甘油二酯和1,3-甘油二酯。一般来说，大宗和特种油脂中，甘油二酯含量极低，一般不超过5％。但甘油二酯是一种功能性油脂，特别是1,3-甘油二酯，近年来诸多动物实验研究表明，甘油二酯油在体重控制、降血脂、降尿酸等方面具有良好的功效，此外，n-3多不饱和脂肪酸也具有抗炎、抗癌等诸多功效，因此，开发富含n-3多不饱和脂肪酸的甘油二酯油脂具有极大的市场价值。
传统的制备甘油二酯油脂的制备方法为高温部分水解法，该方法由于用水作为介质，不添加催化剂，具有良好的经济性，得到广泛应用，但是水解产物中的偏甘油酯(包括甘油一酯和甘油二酯)在高温的作用下，容易产生缩水甘油酯和氯丙醇酯，高温部分水解制备的甘油二酯油脂中缩水甘油酯等有害物质含量一般较高。近年来，脂肪酶在甘油二酯油制备中得到了广泛的应用，主要方法有酶法酯化、酶法甘油解和酶法水解等。酶法制备甘油二酯具有反应温和、有害因子含量低等优点，但脂肪酶的成本高昂，这严重制约脂肪酶在甘油二酯产业化中的应用。
仍需找到一种经济、高效、温和的富含n-3多不饱和脂肪酸甘油二酯的制备方法，进一步降低脂肪酶的添加量和成本，提高酶法水解的反应效率并缩短水解时间，提高脂肪酶在n-3多不饱和脂肪酸甘油二酯制备中的应用效果和前景。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
本发明的其中一个目的是提供一种酶法制备n-3多不饱和脂肪酸甘油二酯的方法，以富含n-3多不饱和脂肪酸的油脂为原料，选择性酶促水解法制备甘油二酯油，在酶法反应前，先对反应原料进行均质处理，以提高脂肪酶在水解混合反应体系中的催化效率。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种酶法制备n-3多不饱和脂肪酸甘油二酯的方法，包括，
向反应器中加入油脂和水，高压均质后，加入脂肪酶反应，反应结束后，去除水和脂肪酶，再分离出游离脂肪酸，得到甘油二酯油；
其中，所述油脂为富含n-3多不饱和脂肪酸的油脂，所述油脂中n-3多不饱和脂肪酸含量在30～70％；
所述高压均质，均质压力为10MPa以上，均质时间至少1min。
作为本发明酶法制备n-3多不饱和脂肪酸甘油二酯的方法的一种优选方案，其中：所述高压均质，均质压力为35～75MPa，均质时间为3～12min。
作为本发明酶法制备n-3多不饱和脂肪酸甘油二酯的方法的一种优选方案，其中：所述脂肪酶包括来源于Candida cylindracea的脂肪酶。
作为本发明酶法制备n-3多不饱和脂肪酸甘油二酯的方法的一种优选方案，其中：所述脂肪酶的添加量不超过所述油脂重量的0.2wt％。
作为本发明酶法制备n-3多不饱和脂肪酸甘油二酯的方法的一种优选方案，其中：所述水的添加量为所述油脂重量的20％～50％。
作为本发明酶法制备n-3多不饱和脂肪酸甘油二酯的方法的一种优选方案，其中：所述加入脂肪酶反应，反应温度为20～50℃，反应时间为3～8h。
作为本发明酶法制备n-3多不饱和脂肪酸甘油二酯的方法的一种优选方案，其中：还包括，高压均质前向反应底物中加入乳化剂。
作为本发明酶法制备n-3多不饱和脂肪酸甘油二酯的方法的一种优选方案，其中：所述乳化剂包括不饱和脂肪酸单甘酯和/或中链脂肪酸单甘酯。
作为本发明酶法制备n-3多不饱和脂肪酸甘油二酯的方法的一种优选方案，其中：所述乳化剂的添加量为所述油脂重量的0.2％以上。
本发明的另一个目的是提供如上述任一项所述的酶法制备n-3多不饱和脂肪酸甘油二酯的方法在食品和医药品领域中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明对反应底物(水和富含n-3多不饱和脂肪酸油脂)进行均质处理，使其充分混合，随后添加脂肪酶，均质处理显著提高了底物的水解效率，缩短反应时间；反应原料经过均质处理一段时间后，水解效率增加，脂肪酶添加量可相应的降低，相应地，n-3多不饱和脂肪酸甘油二酯的制造成本也降低，有利于酶法水解在制备n-3多不饱和脂肪酸甘油二酯油脂中的应用。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
如无特别说明，实施例中所采用的原料均为商业购买。
甘油二酯含量的检测方法：HPLC检测的操作方法和参数，参考江聪(Jiang Conget al.,Concentration of n-3polyunsaturated fatty acid glycerides by Candidaantarctica lipase A-catalyzed selective methanolysis[J].Food Bioscience，2022，46，101562)的方法。
实施例1
将200g精炼金枪鱼油(n-3多不饱和脂肪酸含量为36.6％)和100g水混合后，在不同的均质压力(15MPa～45MPa)下均质8min，均质后向反应底物中添加0.2g的Lipase AY400SD脂肪酶(来源于Candida cylindracea)进行酶法水解反应，在36℃反应不同时间后(2h～8h)，分离出水和脂肪酶后，取样分析粗产物中甘油二酯的含量，结果见表1所示。
表1不同均质压力和水解时间对粗产物中甘油二酯含量的影响
当反应底物(金枪鱼油和水)在反应前不进行均质时，在0.1％脂肪酶催化反应8h后，产物中甘二酯含量达到平衡，此时甘油二酯含量最高，为31.3％，随后继续增加水解时间，产物中甘油二酯含量呈逐渐降低的趋势，增加反应时间到10h时，产物中甘油二酯的含量降低到27.5％。
当反应底物在15MPa的压力下均质后再进行酶促水解反应，反应达到平衡需要的时间相比于未均质组从8h降低到6h。当均质压力提高至45MPa时，反应达到平衡所需的时间进一步缩短。由表中结果可知，反应前对底物进行均质处理可显著缩短酶促水解时间，并可以提高反应平衡时水解粗产物中甘油二酯的含量。
由表1可知，45MPa条件下均质后的混合物反应至4h后，已经达到平衡，再增加反应时间，反而导致粗产物中甘二酯含量降低，当提高均质压力至60、75和90MPa，水解时间设定为4h时，粗产物中甘二酯含量变化不大，其含量分别为：37.1％、38％和38.4％。
甘油二酯油新食品原料质量指标中规定，甘油二酯油中单甘酯的含量要小于1.5％，游离脂肪酸的含量小于0.5％，甘油二酯含量大于等于40％。为了进一步确定粗产物经过纯化后，其单甘酯和游离脂肪酸含量是否符合要求，我们对其粗产物进行了分子蒸馏纯化，因为单甘酯和甘油二酯是最难分离的，而游离脂肪酸和甘二酯性质差异大，易分离，因此，分子蒸馏后游离脂肪酸是比较容易符合新食品原料的要求，而单甘酯含量是比较难符合要求。
具体分子蒸馏条件为：主蒸发温度170℃、冷凝温度30℃、真空度＜0.001mbar。在上述条件下，以在不同均质压力下，反应4h的甘油解粗产物作为原料，对其进行分子蒸馏，经过一次分子蒸馏后，其粗产物中单甘酯的含量和过氧化值如下表2所示。由表2可知，经蒸馏后，其单甘酯含量均符合新食品原料的要求。
表2均质压力对纯化产物中单甘酯、游离脂肪酸含量和过氧化值的影响
根据鱼油制品SC/T-3503-2000的规定，多烯鱼油产品的过氧化值需小于等于5.0mmol/kg，因此，均质压力优选35MPa～75MPa。
实施例2
将200g精炼金枪鱼油(n-3多不饱和脂肪酸含量为36.6％)和60g水混合后，在45MPa均质压力下均质一段时间，均质后向反应底物中添加0.3g的Lipase AY 30SD脂肪酶(来源于Candida cylindracea)进行酶法水解反应，在36℃反应4h，分离出水和脂肪酶后，取样分析粗产物中甘油二酯的含量。粗产物经一次分子蒸馏后，分析其单甘酯含量和过氧化值，结果见表3所示。
表3均质处理时间对水解粗产物中甘油二酯含量、纯化产物中单甘酯含量和过氧化值的影响
由表3中结果可知，相比于未均质组的甘油二酯含量，均质处理能明显提高脂肪酶的催化效率，在相同的反应时间下，提高水解产物中甘油二酯的含量。经分子蒸馏后，其单甘酯含量仍符合要求，但经过较长时间的均质后(≧15min)，其过氧化值含量较高。因此，均质时间优选6～12min。
实施例3
将200g精炼金枪鱼油(n-3多不饱和脂肪酸含量为36.6％)和80g水混合后，在35MPa均质压力下均质6min，均质后向反应底物中添加一定量的Lipase AY 400SD脂肪酶(来源于Candida cylindracea)进行酶法水解反应，在36℃反应不同时间后4h，分离出水和脂肪酶后，取样分析粗产物中甘油二酯的含量。粗产物经分子蒸馏后，分析其单甘酯含量和过氧化值，结果见表4所示。
表4酶添加量和均质处理时间对粗产物中甘油二酯含量和纯化产物的单甘酯含量和过氧化值的影响
由表4中结果可知，当脂肪酶添加量不超过0.15％时，反应底物的均质处理有利于提高脂肪酶的催化效率和产物中甘油二酯的含量。当脂肪酶添加量达到0.2％时，在同样反应4h条件下，均质处理对提高产物中甘油二酯的含量无显著影响。这说明均质处理后，高酶添加量的水解最佳时间低于4h，最佳时间缩短为3h，但当脂肪酶添加量低时(0.05％)，不管是否进行均质处理，最佳水解时间都要超过4h，最佳反应时间为7h。对底物在35MPa处理6min，在0.1％脂肪酶催化下的甘油二酯含量与无均质处理0.2％脂肪酶添加量的对照组甘油二酯含量一样。因此，我们发明了可以在低酶添加量情况下生产甘油二酯的技术，低脂肪酶添加有利于大大的降低甘油二酯的生产成本。
实施例4
将200g精炼金枪鱼油(n-3多不饱和脂肪酸含量为36.6％)和80g水混合后，在35MPa均质压力下均质6min，均质后向反应底物中添加0.1％的脂肪酶(包括来源于Candidacylindracea的Lipase AY 400SD，来源于Thermomyces lanuginosus的Lipozyme TL IM、来源于Candida antarctica的Novozym 435、来源于Burkaholderia cepacia的Lipase PS和来源于Rhizomucor miehei的Lipozyme RM IM)进行酶法水解反应，在36℃反应不同时间后4h，分离出水和脂肪酶后，取样分析水解粗产物中甘油二酯的含量，粗产物经分子蒸馏后，分析其单甘酯含量和过氧化值，结果见表5所示。
表5脂肪酶种类对粗产物中甘油二酯含量、纯化产物中单甘酯含量和过氧化值的影响
由表5中结果可知，本实施例考察了五种脂肪酶(购于酶制剂公司)在水解金枪鱼油反应中的催化活性，结果表明，五种脂肪酶均能部分水解金枪鱼油，制备甘油二酯，Novozym 435、Lipase PS和Lipozyme RM IM的催化效果较差，来源于Candida cylindracea的Lipase AY 400SD脂肪酶具有最佳的催化效果。
当使用Lipase AY 400SD和Lipozyme TL IM作为催化剂，且不对反应底物进行均质处理时，粗产物中甘二酯含量分别为20.6％和13.5％，均质处理后，显著提高脂肪酶的催化效率，提高粗产物中甘油二酯的含量。
实施例5
将200g不同来源的精炼油脂(不同油脂中n-3多不饱和脂肪酸含量不同)和80g水混合后，在35MPa均质压力下均质6min，均质后向反应底物中添加0.1％的Lipase AY 400SD脂肪酶(来源于Candida cylindracea)进行酶法水解反应，在42℃反应不同时间后4h，分离出水和脂肪酶后，取样分析粗产物中甘油二酯的含量，粗产物经分子蒸馏后，分析其单甘酯含量和过氧化值，结果见表6所示。
表6反应底物油脂的种类对粗产物中甘油二酯含量和纯化产物中单甘酯含量和过氧化值的影响
由表6结果可知，对于一些普通的大宗油脂，例如花生油、菜籽油和大豆油等，它们基本不含n-3多不饱和脂肪酸(n-3PUFA)，因此利用它们作为原料，通过酶法水解制备甘油二酯时，产物中甘油二酯的含量不超过10％，但当原料中n-3PUFA提高时，通过酶促水解后，产物中甘油二酯的含量也随之增加，但是底物中n-3PUFA含量不能太高，n-3PUFA含量高到一定程度，水解产物中甘油二酯的含量反而降低。此外，当初始原料中n-3PUFA含量高时，其终产物中过氧化值也高，当然，增加硅胶或者活性炭吸附工序，或者其他方法可以降低产物的过氧化值。
实施例6
将200g精炼金枪鱼油(n-3多不饱和脂肪酸含量为36.6％)和80g水混合后，再添加0.5％(基于金枪鱼油重量)的乳化剂，随后在35MPa均质压力下均质6min，均质后向反应底物中添加0.1％的Lipase AY 400SD脂肪酶(来源于Candida cylindracea)进行酶法水解反应，在30℃反应不同时间后4h，分离出水和脂肪酶后，取样分析粗产物中甘油二酯的含量。粗产物经分子蒸馏后，分析其单甘酯含量和过氧化值，结果见表7所示。
表7乳化剂类型对水解粗产物中甘油二酯含量、纯化产物单甘酯和过氧化值的影响
由表7结果可知，添加单甘酯乳化剂可以改进反应效率，提高粗产物中甘油二酯的含量，特别是中链脂肪酸单甘酯(月桂酸单甘酯)和不饱和脂肪酸单甘酯(油酸单甘酯)对提高产物中甘油二酯含量效果显著。但长链饱和单甘酯乳化剂和其它两种乳化剂没有起到提高催化效率的效果。
实施例7
将200g精炼金枪鱼油(n-3多不饱和脂肪酸含量为36.6％)和80g水混合后，再添加一定量的(基于金枪鱼油重量)的油酸单甘酯，随后在35MPa均质压力下均质6min，均质后向反应底物中添加0.1％的Lipase AY 400SD脂肪酶(来源于Candida cylindracea)进行酶法水解反应，在30℃反应不同时间后4h，分离出水和脂肪酶后，取样分析粗产物中甘油二酯的含量。粗产物经分子蒸馏后，分析其单甘酯含量和过氧化值，结果见表8所示。
表8油酸单甘酯添加量对水解粗产物中甘油二酯含量、纯化产物单甘酯和过氧化值的影响
由表8结果可知，随着油酸单甘酯添加量从0.1％增加到0.5％，粗产物中甘油二酯含量从36.7％增加到41.9％；随后油酸单甘酯添加量继续增加至1％时，粗产物中甘油二酯含量变化不明显；当油酸单甘酯添加量增加至2％时，反而会导致纯化产物中单甘酯含量的增加。
实施例8
将200g精炼1812鱼油(n-3多不饱和脂肪酸含量为37.1％)和一定量的水混合后，随后在35MPa均质压力下均质6min，均质后向反应底物中添加0.1％的Lipase AY 400SD脂肪酶(来源于Candida cylindracea)进行酶法水解反应，在36℃反应不同时间后4h，分离出水和脂肪酶后，取样分析粗产物中甘油二酯的含量。粗产物经分子蒸馏后，分析其单甘酯含量和过氧化值，结果见表9所示。
表9水添加量对水解粗产物中甘油二酯含量、纯化产物单甘酯和过氧化值的影响
由表9结果可知，随着水添加量从10％增加到30％，粗产物中甘油二酯含量从30.2％增加到37.9％，随后水量继续从30％增加到50％，含量降低至34％。继续增加水量至50％以上已无必要，反而导致粗产物甘二酯含量显著降低。
本发明以富含n-3多不饱和脂肪酸的油脂为原料，选择性酶促水解法制备甘油二酯油，在酶法反应前，先对反应原料进行均质处理，以提高脂肪酶在水解混合反应体系中的催化效率，最终达到了降低反应时间，降低脂肪酶添加量的目的，从而达到了降低工业化制备成本的目的。本发明提供了一种有效、温和、低成本的酶法制备富含n-3多不饱和脂肪酸甘油二酯的方法，大大降低了酶促反应制备甘油二酯的成本，具有一定工业化应用前景。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种酶法制备n-3多不饱和脂肪酸甘油二酯的方法，其特征在于：包括，
向反应器中加入油脂和水，高压均质后，加入脂肪酶反应，反应结束后，去除水和脂肪酶，再分离出游离脂肪酸，得到甘油二酯油；
其中，所述油脂为富含n-3多不饱和脂肪酸的油脂，所述油脂中n-3多不饱和脂肪酸含量在30～70％；
所述高压均质，均质压力为10MPa以上，均质时间至少1min。
2.如权利要求1所述的酶法制备n-3多不饱和脂肪酸甘油二酯的方法，其特征在于：所述高压均质，均质压力为35～75MPa，均质时间为3～12min。
3.如权利要求1或2所述的酶法制备n-3多不饱和脂肪酸甘油二酯的方法，其特征在于：所述脂肪酶包括来源于Candida cylindracea的脂肪酶。
4.如权利要求3所述的酶法制备n-3多不饱和脂肪酸甘油二酯的方法，其特征在于：所述脂肪酶的添加量不超过所述油脂重量的0.2wt％。
5.如权利要求1、2、4中任一项所述的酶法制备n-3多不饱和脂肪酸甘油二酯的方法，其特征在于：所述水的添加量为所述油脂重量的20％～50％。
6.如权利要求5所述的酶法制备n-3多不饱和脂肪酸甘油二酯的方法，其特征在于：所述加入脂肪酶反应，反应温度为20～50℃，反应时间为3～8h。
7.如权利要求1、2、4、6中任一项所述的酶法制备n-3多不饱和脂肪酸甘油二酯的方法，其特征在于：还包括，高压均质前向反应底物中加入乳化剂。
8.如权利要求7所述的酶法制备n-3多不饱和脂肪酸甘油二酯的方法，其特征在于：所述乳化剂包括不饱和脂肪酸单甘酯和/或中链脂肪酸单甘酯。
9.如权利要求8所述的酶法制备n-3多不饱和脂肪酸甘油二酯的方法，其特征在于：所述乳化剂的添加量为所述油脂重量的0.2％以上。
10.如权利要求1～9中任一项所述的酶法制备n-3多不饱和脂肪酸甘油二酯的方法在食品和医药品领域中的应用。
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