CN116178474B - 一种喜树碱修饰的胆固醇及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种喜树碱修饰的胆固醇。本发明提供的喜树碱修饰的胆固醇能产生明显的靶向作用的同时，产生的不良反应会较少较轻。本发明还提供了一种喜树碱修饰的胆固醇的制备方法。本发明提供的喜树碱修饰的胆固醇的制备方法简单，易于生产制备。本发明还提供了一种所述喜树碱修饰的胆固醇的应用。

Description

一种喜树碱修饰的胆固醇及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种治疗癌症的药物的技术领域，尤其涉及一种喜树碱修饰的胆固醇及其制备方法和包括所述喜树碱修饰的胆固醇的脂质体及其制备方法和应用。
背景技术
喜树碱是一类从中药喜树中分离出具有天然抗肿瘤活性的成分，其抗肿瘤主要机制是通过作用于拓扑异构酶使肿瘤细胞DNA复制阻滞在S期，其在杀死癌细胞的同时，对正常细胞功能也有影响，因此其会产生比较严重的不良反应。因此，如何改善喜树碱的抗癌性能，降低其不良反应，提高其靶向性，成为人们所十分关注的热点之一。
公开号为WO2005/118612Al的发明专利公开了一种胆固醇/胆汁酸/胆汁酸修饰的抗癌药。该发明提供了经过修饰以增加其亲脂性的治疗药物化合物。该化合物包括治疗药物部分和亲脂性部分。其药物部分为喜树碱，亲脂性部分为胆固醇，两者通过琥珀酸连接。该化合物提高了喜树碱的亲脂性，方便了喜树碱的给药，但存在选择性差、半衰期短以及靶向作用差等缺点，易产生全身性的不良反应。
公开号为CN10360556A的发明专利提供了一种包括喜树碱的脂质体，其采用脂质体作为喜树碱的递送系统，提高了其稳定性，方便了喜树碱的给药，延长了其在体内的循环时间。但其靶向性较差，易产生全身性不良反应。
有鉴于此，需要提出一种新的技术方案来解决上述技术问题。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种用于制备高靶向性高稳定性的喜树碱修饰的胆固醇。
本发明的第二个目的在于提供一种所述喜树碱修饰的胆固醇的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供一种所述喜树碱修饰的胆固醇的应用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术手段：
一种喜树碱修饰的胆固醇，所述喜树碱修饰的胆固醇的结构式如下
一种所述的喜树碱修饰的胆固醇的制备方法，包括如下步骤：
将喜树碱与琥珀酸混合，进行酯化反应，得到喜树碱琥珀酸酯；
将化合物Ⅰ中的伯醇羟基与保护基连接，得到化合物Ⅱ；
将化合物Ⅱ卤化后，得到化合物Ⅲ；
将化合物Ⅲ与胆固醇发生取代反应，得到化合物Ⅳ；
将化合物Ⅳ中的保护基脱除后，与喜树碱琥珀酸酯混合并进行酯化反应后，得到所述喜树碱修饰的胆固醇；
所述化合物Ⅰ的结构如下：
所述化合物Ⅱ包括如下结构：
所述化合物Ⅲ包括如下结构：
所述化合物Ⅳ包括如下结构：
所述酯化反应采用的催化剂包括DMAP；
所述酯化反应采用的偶联剂包括DCC；
所述酯化反应采用的溶剂包括二氯甲烷。
所述保护基包括TBS、TIPS、TBDPS。
所述取代反应采用的溶剂包括DMF或DMSO；
所述取代反应采用的碱包括NaH、KH、LDA、LHMDS或NaHMDS。
一种所述的喜树碱修饰的胆固醇的应用，应用于制备脂质体；
所述脂质体包括所述喜树碱修饰的胆固醇、卵磷脂和叶酸；
所述喜树碱修饰的胆固醇、卵磷脂和叶酸的摩尔比为1：4-6：1-3。
所述卵磷脂包括大豆卵磷脂。
所述脂质体的制备方法包括如下步骤：
将卵磷脂溶于有机溶剂中，加入所述喜树碱修饰的胆固醇后，混合，用保护气体流吹成薄膜后干燥，然后加入叶酸溶液，超声振荡即得。
一种所述的脂质体的应用，应用于制备治疗癌症的药物。
一种所述的脂质体的应用，所述脂质体与CYP1A2的抑制剂联合应用于制备治疗癌症的药物的应用。
相比于现有技术，本发明带来以下技术效果：
本发明提供的喜树碱修饰的胆固醇能产生明显的靶向作用的同时，抗肿瘤效果更好，产生的不良反应会较少较轻。
本发明提供的喜树碱修饰的胆固醇的制备方法简单，易于生产制备。
本发明提供的脂质体通过叶酸的进一步诱导，可提高脂质体的靶向性。
本发明提供的脂质体的可应用于制备治疗癌症的药物，提高其对巨噬细胞的稳定性和靶向性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1示出了实施例5制备得到的脂质体的TEM照片和粒径分析图。
图2示出了实施例5制备得到的脂质体作用48h人肺癌细胞H460显微镜采图；
图3示出了实施例6制备得到的脂质体作用48h人肺癌细胞H460显微镜采图；
图4示出了实施例7制备得到的脂质体作用48h人肺癌细胞H460显微镜采图；
图5示出了实施例8制备得到的脂质体作用48h人肺癌细胞H460显微镜采图；
图6示出了对比例1制备得到的脂质体作用48h人肺癌细胞H460显微镜采图；
图7示出了对比例2制备得到的脂质体作用48h人肺癌细胞H460显微镜采图；
图8示出了喜树碱修饰的胆固醇单独作用48h人肺癌细胞H460显微镜采图；
图9示出了对比例2制备得到的脂质体、喜树碱修饰的胆固醇、实施例8制备得到的脂质体对H460细胞周期分布图；
图10示出了对比例2制备得到的脂质体、喜树碱修饰的胆固醇、实施例8制备得到的脂质体对H460细胞凋亡分布图；
图11示出了对比例2制备得到的脂质体、喜树碱修饰的胆固醇、实施例8制备得到的脂质体对H460细胞克隆形成图；
图12示出了对照组、对比例2制备得到的脂质体、喜树碱修饰的胆固醇、实施例8制备得到的脂质体对H460细胞移植瘤小鼠体质量、肿瘤体积统计图；
图13示出了对照组、对比例2制备得到的脂质体、喜树碱修饰的胆固醇、实施例8制备得到的脂质体对H460细胞移植瘤小鼠肿瘤组织切片TUNEL和Ki67染色图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
本发明提供了一种喜树碱修饰的胆固醇，其通过可通过递送系统进行静脉给药。其在人体中经水解酶多次水解后，最终可以得到喜树碱。
首先，所述喜树碱修饰的胆固醇需在人体内进行多次水解，才能得到喜树碱，而产生抗癌作用。人体内P450酶系中的CYP1族具有氧去烷基化作用，通常，CYP1B1酶在多种肿瘤组织如肺癌组织中高表达，而在正常肺组织中表达量很少，因此，所述喜树碱修饰的胆固醇会在肺癌组织中发生氧去烷基化反应，得到如下化合物：
然后再进一步水解得到喜树碱从而靶向的杀死癌细胞。而在正常细胞中，由于CYP1B1酶的表达很少，因此，所述喜树碱修饰的胆固醇在正常组织中通常难以发生氧去烷基化反应，这使得正常组织受喜树碱的影响较小。因此，所述喜树碱的脂质体能产生明显的靶向作用的同时，产生的不良反应会较少较轻。在其他CYP1B1酶高表达的肿瘤组织中也存在类似的效果。同时，所述喜树碱修饰的胆固醇需多次在人体内进行水解反应，才能得到喜树碱，这会延长喜树碱的半衰期。
将喜树碱与胆固醇进行连接可方便喜树碱的递送。喜树碱是一种水溶性很差的物质，而且，其在其他生物相容性溶剂中的溶解性也差，因此，将喜树碱与胆固醇连接可提高其与其他生物相容性溶剂中的溶解性，这使得所述喜树碱修饰的胆固醇可采用多种递送系统进行递送。而且，意外的，采用化合物Ⅰ作为连接基团得到的喜树碱修饰的胆固醇对补体C3b的亲合性差，这可以降低巨噬细胞对其吞噬，而提高包括所述喜树碱修饰的胆固醇的脂质体在血液中的稳定性。
采用琥珀酸与化合物Ⅰ将喜树碱与胆固醇连接，使得水解喜树碱修饰的胆固醇需要多种酶的参与，这会延长喜树碱的半衰期。而且，肿癌组织中的水解酶的表达高于正常组织，因此，所述喜树碱的脂质体会更多的在肿癌组织中富集而产生靶向作用。
具体的，所述的喜树碱修饰的胆固醇可以如下方法来进行制备：
首先将喜树碱与琥珀酸进行酯化反应，得到喜树碱琥珀酸酯；
将化合物Ⅰ中的伯醇羟基与保护基连接(以TBS为例)，得到化合物Ⅱ；
将化合物Ⅱ卤化后，得到化合物Ⅲ；
将化合物Ⅲ与胆固醇发生取代反应，得到化合物Ⅳ；
将化合物Ⅳ中的保护基脱除后，与喜树碱琥珀酸酯混合并进行酯化反应后，得到所述喜树碱修饰的胆固醇；
具体的，胆固醇与化合物Ⅲ的成醚反应可采用Williamson醚合成反应。胆固醇与化合物Ⅲ在碱和催化剂的作用下两者会发生Williamson醚合成反应。
具体的，喜树碱与琥珀酸的酯化反应可采用Steglich反应。两者在偶联试剂和催化剂的作用下两者发生酯化反应。
具体的，所述酯化反应采用的催化剂包括DMAP；所述酯化反应采用的偶联剂包括DCC；所述酯化反应采用的溶剂包括二氯甲烷。
作为优选的，所述喜树碱修饰的胆固醇的递送系统可以采用脂质体。脂质体的的制备方法简单、高效，辅料成分安全无毒性。进一步的，所述脂质体可通过偶联叶酸，来诱导肿瘤细胞对喜树碱摄入率。这是因为多数肿瘤细胞表面上的叶酸受体活性和数量显著高于一般正常细胞，并且叶酸对叶酸受体具有高度亲和性。而吸收后的叶酸在体内存于肠壁、肝、骨髓等组织中，在NADPH参与下被叶酸还原酶还原成具有生理活性的四氢叶酸，参与嘌呤、嘧啶的合成。而喜树碱为一种DNA拓扑异构酶抑制剂，其能直接破坏DNA结构与DNA结合而使DNA易受内切酶的攻击，同时抑制DNA聚合酶而影响DNA的复制。由于叶酸可促进DNA的合成，而喜树碱抑制DNA的复制，两者协同，可提高喜树碱对肿瘤细胞的抑制作用。
由于在正常细胞中，比如肺中CYP1A2的表达较高，而CYP1A2也具有氧脱烷基作用，因此，在肺癌患者合并有肺部感染时，合并使用氟喹诺酮类、氟喹诺酮类和/或大环内脂类抗生素来抑制CYP1A2，可保护肺部正常组织，减少喜树碱对肺部正常组织的破坏，而减少不良反应。
以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1
在50mL的圆底烧瓶中加入DMF(2.5mmol,2.5eq)、咪唑(1.5mmol,1.5eq)和化合物Ⅰ(1.5mmol,1.5eq.)(来源依CN115611916A公开的方法制备)，再加入TBSCl(1.5mmol,1.5eq.)，加热至70℃后反应5小时，然后用Et2O(50mL)稀释。用饱和CuSO4、水和盐水洗涤有机层，然后用MgSO4干燥并真空浓缩。残留物用石油醚作为洗脱剂在硅胶上纯化，得到化合物Ⅱ，收率71％。
所述化合物Ⅰ的结构如下：
所述化合物Ⅱ的结构如下：
在50mL的圆底烧瓶中加入化合物Ⅱ(1.0mmol,1.0eq.)和浓盐酸70mL，ZnCl21mmol，加热至50℃后进行反应，即得化合物Ⅲ。所述化合物Ⅲ的结构如下：
在50mL的圆底烧瓶中依次加入DMSO50mL，胆固醇(1mmol,1eq)、化合物Ⅲ(1.5mmol,1.5eq.)、NaH(1.5mmol,1.5eq)，90℃下反应约6h，反应完毕后，使用石油醚、乙酸乙酯、丙酮洗涤后，干燥，即得化合物Ⅳ。
所得化合物Ⅳ：白色晶体，收率75.1％。
实施例1中TBSCl也可被替换为TIPSCl或TBDPSCl，反应条件类似。
实施例2
在50mL的圆底烧瓶中依次加入实施例1制备得到的化合物Ⅳ(1mmol,1eq)溶于甲醇，加入5mmol TBAF，25℃搅拌4小时，常温下反应约6h，反应完毕后得化合物Ⅴ。
化合物Ⅴ的结构如下：
所得化合物Ⅴ：白色晶体，收率96.2％。
实施例3
在50mL的圆底烧瓶中依次加入喜树碱(1mmol,1eq)、琥珀酸(1.5mmol,1.5eq.)、DCC(1.5mmol,1.5eq)和DMAP(0.5mmol,0.5eq)，然后在N2的保护下，加入二氯甲烷(10.0mL)，常温下反应约6h，抽滤，将滤饼依次使用石油醚、乙酸乙酯、丙酮洗涤后，干燥，即得喜树碱琥珀酸酯。
所得喜树碱琥珀酸酯：白色晶体，收率96.5％；
实施例4
在50mL的圆底烧瓶中依次加入实施例3制备得到的喜树碱琥珀酸酯(1mmol,1eq)、化合物Ⅴ(1.5mmol,1.5eq.)、DCC(1.5mmol,1.5eq)，和DMAP(0.5mmol,0.5eq)氮气排空3次常温下反应约6h，抽滤，将滤饼依次使用石油醚、乙酸乙酯、丙酮洗涤后，干燥，即得所述喜树碱修饰的胆固醇。
所得喜树碱修饰的胆固醇：白色晶体，收率95.7％；
实施例5
称取大豆卵磷脂溶于氯仿中(1mg/1mL)，加入实施例4制备得到的喜树碱修饰的胆固醇(大豆卵磷脂与喜树碱修饰的胆固醇摩尔比为1:1)，震荡使其充分混合均匀。用氮气流吹干形成均匀薄膜，然后加入无水乙醇和双蒸水(比例为2：8)浸泡约2h，在55℃下反复超声振荡使膜溶解至澄清，加入叶酸使溶液中叶酸的终浓度为10μg/mL，在常温下超声振荡至澄清，制得叶酸靶向性修饰的药物脂质体。图3示出了实施例5制备得到的脂质体的TEM照片。从图中可以看出实施例5制备得到的脂质体粒径均匀，球形度高。图1示出了用纳米颗粒跟踪分析仪测定脂质体的粒径分布，直径主要在100nm处。
实施例6
称取大豆卵磷脂溶于氯仿中(1mg/1mL)，加入实施例4制备得到的喜树碱修饰的胆固醇(大豆卵磷脂与喜树碱修饰的胆固醇摩尔比为1:1)，震荡使其充分混合均匀。用氮气流吹干形成均匀薄膜，然后加入无水乙醇和双蒸水(比例为2：8)浸泡约2h，在55℃下反复超声振荡使膜溶解至澄清，加入叶酸使溶液中叶酸的终浓度为20μg/mL，在常温下超声振荡至澄清，制得叶酸靶向性修饰的药物脂质体。
实施例7
称取大豆卵磷脂溶于氯仿中(1mg/1mL)，加入实施例4制备得到的喜树碱修饰的胆固醇(大豆卵磷脂与喜树碱修饰的胆固醇摩尔比为1:1)，震荡使其充分混合均匀。用氮气流吹干形成均匀薄膜，然后加入无水乙醇和双蒸水(比例为2：8)浸泡约2h，在55℃下反复超声振荡使膜溶解至澄清，加入叶酸使溶液中叶酸的终浓度为30μg/mL，在常温下超声振荡至澄清，制得叶酸靶向性修饰的药物脂质体。
实施例8
称取大豆卵磷脂溶于氯仿中(1mg/1mL)，加入实施例4制备得到的喜树碱修饰的胆固醇(大豆卵磷脂与喜树碱修饰的胆固醇摩尔比为1:1)，震荡使其充分混合均匀。用氮气流吹干形成均匀薄膜，然后加入无水乙醇和双蒸水(比例为2：8)浸泡约2h，在55℃下反复超声振荡使膜溶解至澄清，加入叶酸使溶液中叶酸的终浓度为40μg/mL，在常温下超声振荡至澄清，制得叶酸靶向性修饰的药物脂质体。
对比例1
称取大豆卵磷脂溶于氯仿中(1mg/1mL)，加入实施例4制备得到的喜树碱修饰的胆固醇(大豆卵磷脂与喜树碱修饰的胆固醇摩尔比为1:1)，震荡使其充分混合均匀。用氮气流吹干形成均匀薄膜，然后加入无水乙醇和双蒸水(比例为2：8)浸泡约2h，在55℃下反复超声振荡使膜溶解至澄清，在常温下超声振荡至澄清，制得无叶酸靶向性修饰的脂质体。
对比例2
称取大豆卵磷脂溶于氯仿中(1mg/1mL)，加入胆固醇(大豆卵磷脂与胆固醇摩尔比为1:1)，震荡使其充分混合均匀。用氮气流吹干形成均匀薄膜，然后加入无水乙醇和双蒸水(比例为2：8)浸泡约2h，在55℃下反复超声振荡使膜溶解至澄清，在常温下超声振荡至澄清，制得无叶酸靶向性修饰的空白的药物脂质体。
对比例3
在50mL的圆底烧瓶中依次加入实施例3制备得到的喜树碱琥珀酸酯(1mmol,1eq)、胆固醇(1.0mmol,1.0eq.)、DCC(1.5mmol,1.5eq)和DMAP(0.5mmol,0.5eq)，然后在N2的保护下，加入二氯甲烷(10.0mL)，常温下反应约6h，抽滤，将滤饼依次使用石油醚、乙酸乙酯、丙酮洗涤后，干燥，即得化合物Ⅵ。
化合物Ⅵ的结构如下：
所得化合物Ⅵ：白色晶体，收率90.3％。
对比例4
称取大豆卵磷脂溶于氯仿中(1mg/1mL)，加入对比例3制备得到的化合物Ⅵ(大豆卵磷脂与化合物Ⅵ摩尔比为1:1)，震荡使其充分混合均匀。用氮气流吹干形成均匀薄膜，然后加入无水乙醇和双蒸水(比例为2：8)浸泡约2h，在55℃下反复超声振荡使膜溶解至澄清，加入叶酸使溶液中叶酸的终浓度为40μg/mL，在常温下超声振荡至澄清，制得叶酸靶向性修饰的药物脂质体。
实施例9体外培养的人肿瘤细胞增殖抑制相关实验(MTT法)
将叶酸受体(FR)阳性表达率较高的人非小细胞肺癌细胞系(H460)细胞种植于96孔细胞培养板中，每孔种植约0.5×105个细胞，使用RPMI-1640培养液(加血清和双抗)总体积100μL，将细胞放置在37℃，5％CO2培养箱中常规培养16～24h，细胞密度约80～90％时移去生长培养基，用等量(100μL)无血清RPMI-1640培养基清洗一次，再用50μL无血清RPMI-1640培养液替换。
将实施例5-8和对比例1-2制备的脂质体以及实施例4制备得到的喜树碱修饰的胆固醇的空白稀释到50μL无血清RPMI-1640培养液中，分别加入96孔细胞培养板孔中，轻轻混匀，并设有空白细胞对照，以及空白脂质体和Rg3溶液作为对照组，置于37℃，5％CO2孵育24h，每孔细胞中加入20μL MTT(Sigma，5mg/mL)，37℃，5％CO2孵育培养4h。小心弃去所有培养液，晾干，加入150μL二甲基亚砜，将96孔细胞培养板放入SUNRISE酶标仪中设置震荡10min，使结晶物溶解，然后继续在SUNRISE酶标仪中测定各孔在570nm处的吸光值，读出原始数据。
基于MTT比色法的检测原理为：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲攒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能，二甲基亚砜能溶解细胞中的甲攒，用酶标仪在570nm波长处测定其吸光值，可间接反映活细胞数量。故此，以空白对照(未转染细胞)的吸光值为100％，计算转染后细胞存活的百分率(％)。计算公式为：
细胞存活率(％)＝[A]样品/[A]对照×100％
[A]样品为测试孔的吸光值，[A]对照为阴性空白对照孔的吸光值。
实验结果如表1所示。
表1
样品 吸光度(％)
实施例5 20-25
实施例6 15-18
实施例7 10-13
实施例8 2-9
对比例1 32-42
对比例2 90-95
喜树碱修饰的胆固醇 38-46
结果表明，对比例2制备得到的空白脂质体对细胞存活率影响较小，在90％-95％之间，证明了脂质体是一种安全、可靠的载体。实施例5-8制备的脂质体作用于H460细胞时，随浓度的增加细胞存活率下降，在相同浓度下，实施例5制备的脂质体作用下的细胞存活率低于喜树碱修饰的胆固醇单独作用下的细胞存活率，说明将喜树碱修饰的胆固醇制备成脂质体药物后，能有效提高基对细胞的靶向性。对比例1制备的不复合叶酸的脂质体，癌细胞存活率升高，说明复合叶酸能够有效提高脂质体对癌细胞的靶向性，增强药物疗效，具有实际意义。
实施例10体外培养的人正常细胞增殖抑制相关实验(MTT法)
分别将人肾小管上皮细胞HK-2、人支气管上皮细胞BEAS-2B细胞、人肠上皮细胞NCM460种植于96孔细胞培养板中，每孔种植约0.5×105个细胞，使用RPMI-1640培养液(加血清和双抗)总体积100μL，将细胞放置在37℃，5％CO2培养箱中常规培养16～24h，将实施例5-8和对比例1-2制备的脂质体以及实施例4制备得到的喜树碱修饰的胆固醇的空白稀释到50μL无血清RPMI-1640培养液中，分别加入96孔细胞培养板孔中，轻轻混匀，并设有空白细胞对照，以及空白脂质体和Rg3溶液作为对照组，置于37℃，5％CO2孵育24h，每孔细胞中加入20μL MTT(Sigma，5mg/mL)，37℃，5％CO2孵育培养4h。小心弃去所有培养液，晾干，加入150μL二甲基亚砜，将96孔细胞培养板放入SUNRISE酶标仪中设置震荡10min，使结晶物溶解，然后继续在SUNRISE酶标仪中测定各孔在570nm处的吸光值，读出原始数据。
实验结果如表2所示。
表2
结果表明，对比例2制备得到的空白脂质体对正常细胞存活率影响较小，在89％-97％之间，证明了脂质体是一种安全、可靠的载体。实施例5-8制备的脂质体作用于人肾小管上皮细胞HK-2、人支气管上皮细胞BEAS-2B细胞、人肠上皮细胞NCM460细胞时，细胞吸光度在85％-96％之间，说明对正常细胞毒性很小，喜树碱修饰的胆固醇单独作用下，细胞吸光度在80％-88％，对比对肺癌H460细胞的毒性作用(38％-46％)大大减少，说明喜树碱修饰的胆固醇对癌细胞有一定的靶向性，对正常细胞损伤较小。
实施例11细胞周期分布实验
将对比例2制备的脂质体(A组)、实施例4制备得到的喜树碱修饰的胆固醇(B组)、实施例8叶酸靶向性修饰的药物脂质体(C组)分别处理人非小细胞肺癌细胞系H460细胞48h，收集各组细胞进行流式细胞术周期检测，结果图9，H460细胞周期分布图统计结果如表3所示，可以看出，与对比例2(A组)比较，实施例4(B组)和实施例8(C组)中分布于G1期的细胞数减少(P<0.05)；S期细胞数增加(P<0.01)，因此实施例4制备得到的喜树碱修饰的胆固醇(B组)、实施例8叶酸靶向性修饰的药物脂质体(C组)主要阻滞H460细胞于S期。
表3各组H460细胞周期分布的影响(x±s，n＝3)
实施例12细胞凋亡实验
将对比例2制备的脂质体(A组)、实施例4制备得到的喜树碱修饰的胆固醇(B组)、实施例8叶酸靶向性修饰的药物脂质体(C组)分别处理人非小H460细胞48h，收集各组细胞进行流式细胞术凋亡检测，结果图10，统计结果如表4所示，可以看出，与对比例2(A组)比较，实施例4(B组)和实施例8(C组)中分布于G1期的细胞数减少(P<0.05)；S期细胞数增加(P<0.01)，因此实施例4制备得到的喜树碱修饰的胆固醇(B组)、实施例8叶酸靶向性修饰的药物脂质体(C组)主要阻滞H460细胞于S期。
表4各组H460细胞凋亡率情况(n＝3)
实施例13细胞克隆形成实验
将对比例2制备的脂质体(A组)、实施例4制备得到的喜树碱修饰的胆固醇(B组)、实施例8叶酸靶向性修饰的药物脂质体(C组)分别处理人非小H460细胞，取对指数生长期各组细胞，用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，将细胞悬液每组细胞以每孔200个细胞分别接种于含1ml恢复到室温的培养液的6孔板中，培养2～3周，期间适当换液；经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养；弃去培养液，PBS液小心浸洗2次，每孔加入1ml 4％多聚甲醛固定细胞，固定15min；去固定液，加1ml结染液工作液室温染色30min；流水缓慢洗去染色液，空气干燥。细胞拍照。细胞克隆形成实验通过对细胞处理后在细胞培养板上的克隆形成能力来提示处理后细胞的增殖能力。结果图11，统计结果如表5所示，可以看出，与对比例2(A组)比较，实施例4(B组)和实施例8(C组)中克隆形成数明显减少(P<0.01)，因此实施例4制备得到的喜树碱修饰的胆固醇(B组)、实施例8叶酸靶向性修饰的药物脂质体(C组)能显著降低肿瘤细胞增殖生长能力。
表5 各组H460细胞克隆形成情况(n＝3)
实施例14体内动物实验
将对比例2制备的脂质体(A组)、实施例4制备得到的喜树碱修饰的胆固醇(B组)、实施例8叶酸靶向性修饰的药物脂质体(C组)分别给药给H460细胞移植瘤小鼠，设立不处理组作为对照组，治疗后14天内小鼠体质量、肿瘤体积，对肿瘤组织切片进行TUNEL和Ki67染色。结果见图12，14天内小鼠体质量、肿瘤体积等数据进行统计分析，发现对照组和A组B组体质量有所下降，对照组第14天小鼠体质量明显下降至85％，对照组和对比例2制备的脂质体(A组)的肿瘤大小在14天内迅速发展，而实施例4制备得到的喜树碱修饰的胆固醇(B组)、实施例8叶酸靶向性修饰的药物脂质体(C组)显著延缓了肿瘤的生长趋势，C组在治疗14天内降低了瘤体体积。肿瘤组织切片TUNEL和Ki67染色，结果(图13)表明与对照组相比，实施例4制备得到的喜树碱修饰的胆固醇(B组)、实施例8叶酸靶向性修饰的药物脂质体(C组)凋亡细胞的百分比均升高，Ki67阳性肿瘤细胞的数量降低，C组抑制肿瘤效果最佳。表明了叶酸靶向性修饰的喜树碱修饰的胆固醇脂质体在抑制肿瘤效果强和毒副作用小方面更具有优越性。
实施例15脂质体体外抗吞噬实验
喜树碱与胆固醇的连接基团，可有效避免胆固醇被血液中调理素蛋白吸附，进而避免被免疫系统中吞噬细胞清除，可在体内实现长循环。
将脂质体、C3b补体(上海晶抗生物有限公司)与单核巨噬细胞RAW264.7(中国科学院细胞库)共孵育后检测细胞荧光信号。
具体操作如下：在12孔板中接种RAW264.7细胞和C3b补体，放置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h，将浓度为45μg/mL的实施例5-8制备得到的四种脂质体、对比例4制备得到的脂质体与RAW264.7细胞孵育，孵育12h后，移去培养液，用磷酸盐缓冲溶液(PBS 0.01M，pH7.4)洗3次，用4％的多聚甲醛进行固定，30min后用PBS洗涤细胞，加入普鲁士蓝染液对细胞内旨质体进行染色，30min后用PBS冲洗多余普鲁士蓝，加入核固红染液对细胞核进行染色，20min后用PBS冲洗多余染液，将细胞置于光学显微镜下观察记录。
经普鲁士蓝染色和核固红染色后，在5-8制备得到的四种脂质体作用组的细胞内几乎未见蓝色斑点；在对比例4制备得到的脂质体作用组的细胞内出现大量蓝色斑点，脂质体被巨噬细胞大量的吞噬，这一现象充分说明了连接基团的存在可有效抵御吞噬细胞吞噬。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍属于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种喜树碱修饰的胆固醇，其特征在于：
所述喜树碱修饰的胆固醇的结构式如下；
。
2.一种如权利要求1所述的喜树碱修饰的胆固醇的制备方法，其特征在于：
包括如下步骤：
将喜树碱与琥珀酸混合，进行第一酯化反应，得到喜树碱琥珀酸酯；
将化合物Ⅰ中的伯醇羟基与保护基连接，得到化合物Ⅱ；
将化合物Ⅱ卤化后，得到化合物Ⅲ；
将化合物Ⅲ与胆固醇发生取代反应，得到化合物Ⅳ；
将化合物Ⅳ中的保护基脱除后，与喜树碱琥珀酸酯混合并进行第二酯化反应后，得到所述喜树碱修饰的胆固醇；
所述化合物Ⅰ的结构如下：
；
所述化合物Ⅱ选自如下结构：
、或；
所述化合物Ⅲ选自如下结构：
、或；
所述化合物Ⅳ选自如下结构：
、或。
3.如权利要求2所述的喜树碱修饰的胆固醇的制备方法，其特征在于：
所述第一酯化反应采用的催化剂选自DMAP；
所述第一酯化反应采用的偶联剂选自DCC；
所述第一酯化反应采用的溶剂选自二氯甲烷；
所述第二酯化反应采用的催化剂选自DMAP；
所述第二酯化反应采用的偶联剂选自DCC；
所述第二酯化反应采用的溶剂选自二氯甲烷。
4.如权利要求2所述的喜树碱修饰的胆固醇的制备方法，其特征在于：
所述保护基选自TBS、TIPS或TBDPS。
5.如权利要求2所述的喜树碱修饰的胆固醇的制备方法，其特征在于：
所述取代反应采用的溶剂选自DMF或DMSO；
所述取代反应采用的碱选自NaH、KH、LDA、LHMDS或NaHMDS。
6.一种如权利要求1所述的喜树碱修饰的胆固醇的应用，其特征在于：
应用于制备脂质体；
所述脂质体由所述喜树碱修饰的胆固醇、卵磷脂和叶酸组成；所述喜树碱修饰的胆固醇、卵磷脂和叶酸的摩尔比为1：4-6：1-3。
7.如权利要求6所述的喜树碱修饰的胆固醇的应用，其特征在于：
所述卵磷脂选自大豆卵磷脂。
8.如权利要求6或7所述的喜树碱修饰的胆固醇的应用，其特征在于：
所述脂质体的制备方法包括如下步骤：
将卵磷脂溶于有机溶剂中，加入所述喜树碱修饰的胆固醇后，混合，用保护气体流吹成薄膜后干燥，然后加入叶酸溶液，超声振荡即得。
9.一种如权利要求6所述的脂质体的应用，其特征在于：
应用于制备治疗肺癌的药物。
10.一种如权利要求6所述的脂质体的应用，其特征在于：
所述脂质体与CYP1A2的抑制剂联合应用于制备治疗肺癌的药物的应用。
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