CN116162078A - 一种表没食子儿茶素没食子酸酯类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种表没食子儿茶素没食子酸酯类化合物及其制备方法和应用 Download PDF

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CN116162078A CN202211712463.1A CN202211712463A CN116162078A CN 116162078 A CN116162078 A CN 116162078A CN 202211712463 A CN202211712463 A CN 202211712463A CN 116162078 A CN116162078 A CN 116162078A
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Abstract

本发明涉及药物合成技术领域，提供了一种表没食子儿茶素没食子酸酯类化合物及其制备方法和抗肿瘤药物的应用，由于EGCG本身存在的结构中含有大量酚羟基，性质不稳定，易氧化变性，脂溶性差，维持时间短，作用强度有待提高等问题。因此，对EGCG开展脂化结构修饰优化，对不同反应试剂、试剂摩尔比、溶剂、反应温度和时间的探索优化，通过特定位点修饰，得到化学性质稳定、活性更好的化合物。本发明优选的改性化合物F4显示出比原料EGCG更好的抗肿瘤活性效果，且其可通过抑制MDM2蛋白介导P53‑MDM2途径，诱导P53介导的癌细胞死亡，促使癌细胞凋亡死亡，抑制细胞生长周期，通过抑制癌细胞生长增值、迁移、集落的形成等多个方面来杀死癌细胞，可与其他抗癌药物联用，对于开发新型抗肿瘤药物具有重要意义。

Description

一种表没食子儿茶素没食子酸酯类化合物及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及药物合成技术领域，具体涉及一种表没食子儿茶素没食子酸酯类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
恶性肿瘤是造成人类死亡的主要原因之一，根据最新统计，全世界每年新发肝癌患者约六十万，持续增加。因而，寻找一种杀死肝癌细胞的药物是非常必要的。目前，外科手术、化疗和放疗等仍是治疗癌症的常用手段。虽然用于治疗癌症的化疗药物可以缓解症状并延长患者的寿命，但是许多药物都有副作用，包括骨髓抑制、胃肠道反应、心脏损伤、肝肾功能障碍、皮疹、手足综合征等。同时，化疗后期也常出现不同程度的肿瘤耐药，影响药物的治疗效果。
研究发现，天然产物不仅有协同抗肿瘤的效果，还能通过减少放化疗期间的副作用来提高患者生活质量。它们或通过改变癌症的发生发展进程，或阻断如细胞分化、细胞生长、血管生成、凋亡和转移等显示出其有效性。越来越多的研究表明，酚类化合物具有潜在地抑制癌细胞侵袭和转移的作用，如余甘子、初榨橄榄油和茶叶中的儿茶素成分等。其中表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(epigallo-catechin-3-gallate,EGCG)是一类常见的儿茶素类化合物，约占茶叶中儿茶素的50％～80％。EGCG由三个必需的环(A、B和C)和一个含D环的没食子酰基组成。重要的是，B和D环上存在三个邻酚羟基，使其具有很强的抗氧化及清除自由基的能力。除常见的自由基清除能力外，EGCG还被报道具有抑制氧化应激和炎症、降低血脂和血糖作用。最近十几年间，EGCG的抗肿瘤活性逐渐引起科学家的重视，它可以遏制多种肿瘤的产生和发展。EGCG是1个两性分子，具有既亲水又亲脂的特点，此特点使其不仅可在体液环境中充分溶解并广泛分布，而且可使其穿过细胞膜与细胞内的靶点相结合。EGCG这种特有的结构特点赋予了其抗癌特性，使其不仅可在癌变起始阶段发挥预防癌症的作用，而且在控制癌症的进展和转移过程中也具有重要意义，EGCG可作用于多种癌症类型如肝癌、肺癌和前列腺癌等。此外，EGCG还可以作为辅助抗肿瘤药物与其他化疗药物联用，从而起到协同抗癌作用。化疗常引起胃肠毒性、肾毒性、心脏毒性和肺纤维化等不良反应，EGCG联合化疗可减轻抗癌药物的副作用，如顺铂、喃氟啶和阿霉素等。耐药性是癌症治疗的典型的障碍，EGCG在药物联合使用中的另一重要作用是降低癌细胞对药物的耐药性，如三苯氧胺和奥沙利铂等。除此之外，EGCG还可以降低癌症的复发率。
EGCG具有安全性高、易获取、多靶点和多通路的优点，但由于EGCG结构中含有大量酚羟基，性质不稳定，易氧化变性，脂溶性差，生物利用度低、体内代谢快，维持时间短，作用强度有待提高。因此，对EGCG开展结构修饰优化研究是本发明的一个重要方向。
鉴于儿茶素的不稳定性，对儿茶素进行修饰是拓展儿茶素化合物应用前景的必然出路。一般来说，化学修饰产率较高，但其产物成分复杂，分离难度较大。酶法合成这种绿色生物科技反应条件较温和，且反应体系简单，但是酶的提取技术尚不成熟，再加上酶的不稳定性等特点造成酶合成成本较高，不利于工业化生产。因此寻找绿色、高效的儿茶素衍生物的合成途径仍具有很大的研究价值。但是，不少EGCG分子修饰产物由于活性酚羟基的减少也带来了一些活性的丢失，如大部分甲基化和糖苷化EGCG的抗氧化能力均低于EGCG。儿茶素强抗氧化性源于酚羟基，当羟基被取代后，儿茶素衍生物抗氧化性随之减弱，根据不同取代位置，其改变也不尽相同，其中B环羟基被取代的影响最大。
而酰基儿茶素抗肿瘤活性和清除自由基能力发现有显著提高，这可能是由于随着脂溶性增强，其透过细胞膜能力也随之增强，生物利用率得到明显提高,。因此，根据不同衍生物药理特性进行有方向的研究，有望得到药理作用更强的衍生物。
近年来关于EGCG酰基化修饰的研究比较系统，但其存在的问题也比较明显。EGCG酰化衍生物的合成路线较为单一，且其酰化位点不明确，很难实现对EGCG的定向修饰，导致反应所得到的酰化产物多为不同酰化程度的EGCG衍生物的混合物，使得后期分离纯化困难；EGCG的修饰造成了酚羟基的损失，使得EGCG的生物活性降低；酰化所用的有毒化学试剂对产物在食品和药品等领域的使用带来了不小的影响。而酶法分子修饰EGCG的成本较高，产物的转化率不高，对于酰化位点的确定也无规律性的结论。所以找寻定向酰基化修饰EGCG的途径还具有很大的研究价值。
目前利用氧化应激应对癌症的策略主要包括：在预防癌症发生的阶段增强内源性抗氧化能力，在癌症治疗的阶段提高ROS水平致使癌细胞死亡，具有抗氧化性及促氧化性的EGCG较好地适配了此策略，高浓度的EGCG治疗癌症是目前存在的一种趋势。
EGCG也可通过一些细胞信号传导通路发挥其诱导癌细胞凋亡的作用。如p53信号通路，在正常的细胞周期中，p53蛋白通过阻止细胞从G1期进入S期而使得受损的DNA或染色体得以修复；而当DNA或染色体的损伤过于严重时，p53可触发凋亡机制清除受损细胞，最终发挥调节作用。EGCG通过诱导p53的活性并调节p53下游靶点如Bax蛋白等，诱导p53介导的细胞死亡。
有研究发现通过表面等离子体共振(surface plasmon resonance,SPR)和核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)技术观察到了EGCG可以结合在p53蛋白结构域上，从而干扰p53与其调节性E3连接酶MDM2的相互作用，抑制MDM2对p53的泛素化，稳定p53的抗肿瘤活性，p53功能结构域可能成为癌症药物的重要靶点。研究发现MDM2小分子拮抗剂激活P53信号通路并逆转临床前肿瘤模型中的肿瘤，由于MDM2负向调节p53的稳定性，许多人类肿瘤过度产生MDM2作为限制p53功能的一种机制。因此，能够重新激活癌细胞中p53的p53-MDM2结合的抑制剂可能提供一种有效的癌症治疗方法。EGCG诱导细胞凋亡的方式复杂而多样，许多机制仍不清楚。未来癌症研究的主要方向之一便是研究肿瘤细胞凋亡的分子机制，以便更有效地诱导该过程。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种表没食子儿茶素没食子酸酯类化合物及其制备方法和应用，解决EGCG本身存在的结构中含有大量酚羟基，性质不稳定，易氧化变性，脂溶性差，体内代谢快，维持时间短，作用强度有待提高等问题。因此，对EGCG开展脂化结构修饰优化，通过对不同反应试剂、试剂摩尔比、溶剂、反应温度和时间的探索优化，希望得到一个特定位点修饰，性质较稳定，脂溶性有所提高以及活性更好的化合物是本发明的一个重要方向。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种表没食子儿茶素没食子酸酯类化合物，，具有如下结构：
Figure SMS_1
其中，R1、R2各自独立的为H、OH、
Figure SMS_2
R1、R2不同时为OH；
R3为直链、支链或环状的、饱和或不饱和的脂肪烃时，R3为C1-C30基团；R3为nPEG，n＝200-20000。
优选的，所述化合物包括化合物F1、化合物F2、化合物F3、化合物F4、化合物F5、化合物F6中的一种；
当所述化合物为所述化合物F1时，R1＝C15H31O2，R2＝OH，所述化合物F1具有如下结构：
Figure SMS_3
当所述化合物为所述化合物F2时，R1＝CH3O.(C2H4O)5..HC3H4O2，R2＝OH，所述化合物F2具有如下结构：
Figure SMS_4
当所述化合物为所述化合物F3时，R1＝C5H11O2，R2＝OH，所述化合物F3具有如下结构：
Figure SMS_5
当所述化合物为所述化合物F4时，R1＝C12H23O2，R2＝OH，所述化合物F4具有如下结构：
Figure SMS_6
当所述化合物为所述化合物F5时，R1＝C8H17O2，R2＝OH，所述化合物F5具有如下结构：
Figure SMS_7
当所述化合物为所述化合物F6时，R1＝C12H23O2，R2＝C12H23O2，所述化合物F6具有如下结构：
Figure SMS_8
优选的，所述化合物为所述化合物F4。
实验表明，化合物F4的抗肿瘤效果最好。
化学实验：
Figure SMS_9
R1、R2各自独立的为H、OH、
Figure SMS_10
(注：R1和R2不同时为OH)；
其中，R3为直链、支链或环状的、饱和或不饱和的脂肪烃时，R3为C1-C30基团，其中R3为环状时，R3为C3-C30基团，或R3为nPEG(200-20000)。
一种如上所述化合物的制备方法，包括：
当所述化合物为所述化合物F1时，制备步骤包括：将EGCG添加到的THF中，加热溶解完全后，加入碳酸钠，随后，将十五烷酰氯滴加到溶液中，并搅拌，转移到加塞烧瓶中进行反应，在水浴条件下反应，过滤反应液，转移至分液漏斗中，加入去离子水，震荡后，萃取、分液，使用无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂，粗产物使用异丙醇重结晶，离心，冷冻干燥，获得所述化合物F1；
当所述化合物为所述化合物F2时，制备步骤包括：称取PEG-COOH，加入THF作为溶剂，加入氯化亚砜，加催化剂N,N-二甲基甲酰胺，N2气保护，搅拌反应，旋蒸除去溶剂，得到淡黄色稠状产物；再将EGCG溶解于THF，加入碳酸钠，搅拌，再将所述淡黄色稠状产物用THF溶解后，转移至恒压滴定漏斗，缓慢滴加至溶解有EGCG的THF溶液中，室温反应搅拌过夜，之后静置，有沉淀析出，去除沉淀，液体旋干，柱层析纯化，获得所述化合物F2；
当所述化合物为所述化合物F3时，制备步骤包括：将EGCG溶解于15％的氢氧化钠溶液中，搅拌溶解制成酚钠溶液，加入戊酸酐反应，所得产物依次用水、5％氢氧化钠溶液、水洗涤，经氯化钙干燥后，蒸馏分离，获得所述化合物F3；
当所述化合物为所述化合物F4时，制备步骤包括：将EDCI、HOBT和月桂酸溶解在干燥的二甲基甲酰胺溶剂中，搅拌活化，再向混合溶液中加入EGCG，然后将反应混合物在室温过夜反应，之后加入适量饱和氯化铵溶液淬灭，DCM萃取三次，干燥，旋干溶剂，柱层析纯化，获得所述化合物F4，收集第六次洗脱流分，获得所述化合物F4；
当所述化合物为所述化合物F5时，制备步骤包括：将EGCG溶解于15％的氢氧化钠溶液中，搅拌溶解制成酚钠溶液，加入辛酸酐反应，所得产物依次用水、5％氢氧化钠溶液、水洗涤，经氯化钙干燥后，蒸馏分离，获得所述化合物F5；
当所述化合物为所述化合物F6时，制备步骤包括：将EDCI、HOBT和月桂酸溶解在干燥的二甲基甲酰胺溶剂中，搅拌活化，再向混合溶液中加入EGCG，然后将反应混合物在室温过夜反应，之后加入适量饱和氯化铵溶液淬灭，DCM萃取三次，干燥，旋干溶剂，柱层析纯化，获得所述化合物F6，收集第四次洗脱流分，获得所述化合物F6。
本发明通过方法优化可控制得到单取代或者二取代产物，其结构活性更优，保持原有水溶性的同时提高其脂溶性。此外，我们的方法中除了酰氯化反应外，经过优化方法，可通过缩合酯化等反应得到，提供了更多的方法。
优选的，包括：
当所述化合物为所述化合物F1时，EGCG、碳酸钠、十五烷酰氯的摩尔比为1:2:2，EGCG与THF的摩尔体积比为1mmol：10mL，加热到40℃使其溶解完全，反应的条件为水浴40℃反应6-12h；
当所述化合物为所述化合物F2时，PEG-COOH、THF、氯化亚砜、N,N-二甲基甲酰胺的质量体积比为250mg：8mL：0.3ml：1ml，PEG-COOH的分子量为324，搅拌反应的条件为37℃反应2-6小时；那之后，EGCG、THF、碳酸钠的摩尔比为1.2：1：2mol，与用THF溶解的所述淡黄色稠状产物进行反应，柱层析纯化的流动相为DCM:MeOH按体积比10:1混合而成；
当所述化合物为所述化合物F3时，EGCG与15％的氢氧化钠溶液的质量比为1-10:1，加入戊酸酐后反应条件为30-40℃反应4-20h；
当所述化合物为所述化合物F4时，EDCI、HOBT、月桂酸、EGCG的摩尔比为1.38：2.3：0.046：2.3，搅拌活化的温度为室温，时间为2h；柱层析纯化的流动相为DCM:MeOH按体积比5-10:1混合而成
当所述化合物为所述化合物F5时，EGCG与15％的氢氧化钠溶液的质量比为1-10:1，加入辛酸酐后反应条件为30-40℃反应3-24h；
当所述化合物为所述化合物F6时，EDCI、HOBT、月桂酸、EGCG的摩尔比为1.38：2.3：0.046：2.3，搅拌活化的温度为室温，时间为2h；柱层析纯化的流动相为DCM:MeOH按体积比5-10:1混合而成。
一种如上所述化合物的应用，用于制备抗肿瘤细胞药物。
经过研究发现，本发明获得的改性EGCG化合物可通过抑制MDM2蛋白介导P53-MDM2途径，抑制MDM2对p53的泛素化，稳定p53的抗肿瘤活性，诱导P53介导的癌细胞死亡，同时也可通过促进ROS的产生，促使癌细胞凋亡死亡，抑制细胞生长周期，抑制癌细胞生长、集落的形成等多个方面来杀死癌细胞，可做为一种新型抗肿瘤药物。
将本发明获得的改性EGCG化合物，与常规的制药中可接受的药物辅料混合制成药学上可接受的药物形式用于抗肿瘤。
优选的，所述肿瘤细胞包括肝癌细胞、结肠癌细胞、乳腺癌细胞、胃癌细胞中的一种或多种。
优选的，所述肿瘤细胞为肝癌细胞。
优选的，所述药物包括所述化合物与五氟尿嘧啶联合使用。
改性EGCG化合物可单独、或与其他抗肝癌药物联合使用。用于治疗肝癌时，可以与例如五氟尿嘧啶(5-FU)和/或其他抗肝癌药物联合使用。
优选的，所述药物中，所述化合物的浓度为10-1000μM。
与现有技术相比较，实施本发明，具有如下有益效果：
1、原料EGCG简单易得，来源广，成本低，EGCG具有安全性高、多靶点和多通路，药物结构简单，易于工业化生产；相比于现有提取的EGCG，改性EGCG增加EGCG脂溶性，得到一个特定位点修饰，性质更稳定，不易氧化变性，维持时间增长，其活性更好，效果显著的改性化合物。
2、改性EGCG显示出比原料EGCG更好的抗肿瘤活性效果，且相比于现有的化疗药物，EGCG安全性好，对人体无毒副作用，其可通过抑制MDM2蛋白介导P53-MDM2途径，抑制MDM2对p53的泛素化，稳定p53的抗肿瘤活性，诱导P53介导的癌细胞死亡，同时也可通过促进ROS的产生，促使癌细胞凋亡死亡，抑制细胞生长周期，抑制癌细胞生长、迁移、集落的形成等多个方面来杀死癌细胞，可做为一种新型抗肿瘤药物。同时改性EGCG可以与其他化疗药物联用，可以增强其他化疗药物的抗癌效果，从而起到协同抗癌作用。化疗常引起胃肠毒性、肾毒性、心脏毒性和肺纤维化等不良反应，EGCG联合化疗可减少化疗药物用量，从而可以减轻由于大剂量使用化疗抗癌药物所产生的副作用。
附图说明
图1为实施例1中EGCG、化合物F4以及5-FU单用及联用对体外抗肝癌作用结果；
图2-1为实施例2中测定的化合物EGCG、化合物F4以及5-FU单用及联用对体外抗HepG2细胞凋亡实验流式细胞仪结果图；
图2-2为实施例2中测定的化合物EGCG、化合物F4以及5-FU单用及联用对体外抗HepG2细胞总凋亡比例柱状图；
图3为实施例3中测定的化合物EGCG、化合物F4以及5-FU联用对体外HepG2细胞细胞凋亡周期实验结果；
图4为实施例4中测定的化合物EGCG、化合物F4以及5-FU单用及联用对HepG2细胞活性氧实验结果；
图5为实施例5中测定的化合物EGCG、化合物F4对P53-MDM2介导的凋亡机制的计算对接模拟结果；
图6为实施例6中测定的化合物EGCG和化合物F4的水溶液稳定性实验结果。
图7为实施例7中测定的化合物EGCG、化合物F4以及5-FU单用及联用来抑制HepG2细胞集落形成的实验结果；
图8为实施例8中测定的化合物EGCG、化合物F4以及5-FU单用及联用来抑制HepG2细胞迁移的实验结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例1
首先，将EGCG和不同的酰率试剂、酸以及酸酐按1：1-1：20摩尔比例，在不同溶剂(四氢呋喃、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等)中，将其置于室温或者加入30-90℃环境中，通过不同的反应时间2-24h来观察检测所得到的不同的取代酯化产物。由于反应往往伴随着多取代或副产物出现，整个反应复杂且难以控制，需要不断地探索研究。通过对不同反应试剂、试剂摩尔比、溶剂、反应温度和时间以及反应物料滴加顺序和快慢的探索优化，惊喜地发现，在控制试剂摩尔比等最佳条件的情况下，通过调控优化反应物料滴加顺序和快慢，能够成功地获取所需要的特定位置的取代产物，再通过重结晶、冷冻干燥、蒸馏或者柱层析等后处理纯化方法，得到较纯一取代或者二取代产物。具体最优实验条件如下：
化合物F1:
将1mmol EGCG(458.37mg)添加到10mL的THF中，在40℃的加热。溶解完全后，加入2mmol(164mg)碳酸钠。随后，将2mmol(549.74mg)的十五烷酰氯滴加到溶液中，并搅拌。反应在加塞烧瓶中进行，在水浴40℃条件下，反应6-12h。过滤反应液，转移至分液漏斗中，加入去离子水，震荡后，萃取、分液。使用无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂。粗产物使用异丙醇重结晶，离心，冷冻干燥得。
化合物F1:1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.87(s,1H),9.05(s,2H),8.76(s,2H),8.46(s,1H),7.05–7.01(m,4H),6.07(d,J＝2.0Hz,1H),6.02(d,J＝2.0Hz,1H),5.40(s,1H),5.11(t,J＝1.0Hz,1H),2.99(d,J＝3.3Hz,2H),2.48(d,J＝12.4Hz,1H),2.43(d,J＝12.4Hz,1H),1.50(s,2H),1.27–1.20(m,10H),1.22(s,12H),0.89(s,2H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ171.47,165.76,157.89,157.59,156.90,149.53,145.41,140.26,138.90,130.89,120.26,108.98,108.81,99.29,96.90,96.08,78.11,69.44,33.52,31.63,29.30,29.24,29.19,29.17,29.04,29.02,28.94,26.76,24.47,22.09,13.91.
MS(ESI)m/z:682.29([M+1]+)
化合物F2:
(1)称取250mg PEG-COOH(分子量为324)，加入8ml THF作为溶剂，加入0.3ml氯化亚砜，加少量催化剂，N2气保护，37℃搅拌反应2-6小时，旋蒸除去溶剂，得到淡黄色稠状。
(2)称取EGCG溶解于4ml THF，加入碳酸钠，搅拌5-10min，再将新制备的上述PEG-COCl用THF溶解后，转移至恒压滴定漏斗，缓慢滴加至溶解有EGCG的THF溶液中，室温反应搅拌过夜。后处理：静止，有沉淀析出，去除沉淀，液体旋干，柱层析纯化(DCM:MeOH＝10:1)得产物。
化合物F2(MW 324)：1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.65(s,1H),9.33(s,2H),9.06(s,2H),8.71(s,1H),6.99–6.94(m,4H),6.07(d,J＝2.0Hz,1H),6.02(d,J＝2.0Hz,1H),5.45(s,1H),5.13(t,J＝1.0Hz,1H),4.00–3.87(m,2H),3.67(s,2H),3.60(d,J＝4.4Hz,4H),3.58(s,13H),3.55(s,2H),3.35(s,3H),2.99(s,1H),2.95(s,1H),2.85(s,2H).
13C NMR(125MHz,Chloroform-d)δ170.84,165.80,157.92,157.45,156.92,149.75,146.01,139.42,139.17,130.89,121.35,109.94,109.42,99.29,96.90,96.03,77.56,71.90,71.09,70.96,69.95,69.31,68.87,65.85,59.31,35.99,26.64.
MS(ESI)m/z:764.24([M+1]+)
化合物F3、化合物F5:
称取一定量的EGCG溶解于15％的氢氧化钠溶液(eq:1:1-10:1)中，搅拌溶解制成酚钠溶液，加入相应的戊酸酐或辛酸酐，于30-40℃反应，化合物F3的反应时间为4-20h，化合物F5的反应时间为3-24h。所得产物依次用水、5％氢氧化钠溶液、水洗涤，经氯化钙干燥后，蒸馏分离得。
化合物F4、化合物F6:
将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)(1.38mmol)、1-羟基苯并三唑(HOBT)(2.3mmol)和月桂酸(0.046mmol)溶解在干燥的二甲基甲酰胺溶剂中，室温搅拌活化2h，再向混合溶液中加入EGCG(2.3mmol)，然后将反应混合物在室温过夜反应。
后处理：加入适量饱和氯化铵溶液淬灭，DCM萃取三次，干燥，旋干溶剂,乙酸乙酯/石油醚重结晶，或进一步通过柱层析纯化(DCM:MeOH＝5:1-10:1)，收集第四次洗脱流分获得化合物F6，收集第六次洗脱流分获得化合物F4。
化合物F3：1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.96(s,1H),9.05(s,2H),8.90(s,2H),8.59(s,1H),7.04(s,2H),7.01(d,J＝0.9Hz,2H),6.07(d,J＝2.0Hz,1H),6.02(d,J＝2.0Hz,1H),5.45(s,1H),5.12(t,J＝1.0Hz,1H),2.99(d,J＝3.3Hz,2H),2.44(d,J＝2.0Hz,2H),1.59(d,J＝2.4Hz,2H),1.36(s,2H),0.90(s,3H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ171.47,166.11,157.86,157.47,156.88,149.95,146.51,139.42,139.28,130.88,121.84,110.02,106.76,99.11,96.51,96.14,78.25,69.70,33.50,26.56,25.92,22.60,13.60.
MS(ESI)m/z:542.13([M+1]+)
化合物F4:1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.87(s,1H),9.05(s,2H),8.76(s,2H),8.46(s,1H),7.06–7.01(m,5H),6.07(d,J＝2.0Hz,1H),6.02(d,J＝2.0Hz,1H),5.40(s,1H),5.11(t,J＝1.0Hz,1H),2.99(d,J＝3.3Hz,2H),2.51–2.40(m,2H),1.50(s,2H),1.27–1.20(m,19H),0.89(s,3H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ171.47,165.95,157.87,157.59,156.92,149.53,145.41,140.26,138.73,130.89,121.42,108.81,106.81,99.29,96.57,96.06,78.09,69.44,33.52,31.30,29.36,29.17,29.10,29.01,28.99,28.32,26.76,24.44,22.09,13.94.
MS(ESI)m/z:640.24([M+1]+)
化合物F5 1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.96(s,1H),9.05(s,2H),8.76(s,2H),8.46(s,1H),7.06–6.99(m,4H),6.07(d,J＝2.0Hz,1H),6.03(d,J＝2.0Hz,1H),5.45(s,1H),5.12(t,J＝1.0Hz,1H),2.99(d,J＝3.3Hz,2H),2.51–2.40(m,2H),1.51(d,J＝1.6Hz,2H),1.30–1.21(m,8H),0.89(s,3H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ171.41,166.14,157.78,157.47,156.88,149.53,145.21,139.42,138.25,130.88,121.81,108.89,106.81,99.13,96.50,96.10,78.25,69.67,33.56,31.39,29.54,28.89,26.71,24.44,22.11,13.95.
MS(ESI)m/z:584.19([M+1]+)
化合物F6：1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.87(s,1H),8.76(d,J＝2.6Hz,4H),7.12(s,2H),7.04(d,J＝1.0Hz,2H),6.07(d,J＝2.0Hz,1H),6.02(d,J＝2.0Hz,1H),5.48(s,1H),5.12(t,J＝1.0Hz,1H),2.99(d,J＝3.3Hz,2H),2.48–2.39(m,4H),1.50(s,3H),1.29–1.20(m,30H),0.89(s,5H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ171.52,165.88,157.89,157.47,156.90,148.97,147.71,140.26,130.89,120.27,110.01,109.44,99.29,96.94,96.03,77.68,69.23,33.56,31.26,29.37,29.28,29.21,29.17,29.12,28.88,26.76,24.43,22.08,13.91.
MS(ESI)m/z:822.41([M+1]+)
效果例1
细胞存活率实验(CCK-8):
将HepG2细胞消化并培养基稀释，计数板计数为5*104个/ml，用5％FBS培养基进行培养，第二天分别加入不同浓度25umol/L、50umol/L、100umol/L、200umol/L、300umol/L的改性EGCG和5-FU，培养24小时。吸弃含药细胞培养上清液，PBS洗两次，排除药物的干扰，加入100uL DMEM(不含蛋白，排除蛋白的影响)及10uL Cck8,37℃5％CO2，饱和湿度培养箱培养2h，在450nm波长处检测每孔吸光度A值。
细胞存活率＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100％
抑制率＝[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100％
As：实验孔(含有细胞的培养基、CCK-8、待测药物)的吸光度
Ac：对照孔(含有细胞的培养基、CCK-8、没有待测药物)的吸光度
Ab：空白孔(不含细胞和待测药物的培养基、CCK-8)的吸光度
(1)、筛选出抑制肝癌细胞增殖作用较强的改性EGCG化合物：
利用CCK-8方法分别测定化合物N1-N5对肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用，初步筛选有效的改性EGCG化合物。结果显示化合物F1-F6中，化合物F4表现出最好的抑制肝癌活性，IC50为53.22±0.05，EGCG的IC50:约为216521±0.26，其他化合物介于两者之间。
(2)、化合物F4与5-FU联用对体外抗肝癌作用具有协同作用，增加肿瘤细胞对药物敏感性，增强效果：
利用CCK-8方法分别测定活性最好的化合物F4与5-FU联用对肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用，同时与原料EGCG对比。
结果如图1所示，EGCG和化合物F4抑制肝癌细胞增殖具有浓度依赖性，随着浓度增加，抑制作用也增加，且化合物F4抑制活性高于EGCG，同时抑制活性化合物F4>5-FU。联用也可以发现化合物F4与5FU效果显著优于EGCG与5-FU联用效果，100umol/L的化合物F4与50ug/L的5-FU联用对肝癌细胞HepG2增殖抑制率高达95.17％，因此化合物F4与5-FU联用对体外抗肝癌作用具有协同作用，增加肿瘤细胞对药物敏感性，增强效果。
效果例2
细胞凋亡：
Annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡实验原理：AnnexinⅤ(膜联蛋白V)能与PS高亲和力结合，将Annexin V进行荧光素FITC标记，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(Propidium,PI)为一种可与DNA结合的染料，其不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但可以在凋亡中晚期的细胞和死细胞透过细胞膜而使细胞核红染。
具体方法：
1.根据实验要求诱导细胞凋亡。检测样品中应包含未经处理的细胞样品，作为阴性对照。此外，设定一组样品做单染，用于调节补偿。
2.沉淀细胞
贴壁细胞：用不含EDTA的胰酶消化细胞，1000rpm，4℃离心5min沉淀细胞，胰酶消化时间不宜过长，以防引起假阳性。对于特定的细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50μL左右的培养液，以避免吸走细胞。
注：用胰蛋白酶消化然后使细胞在最佳细胞培养条件和培养基中恢复约30min，然后在染色。胰蛋白酶消化会暂时破坏质膜，允许Annexin V结合磷脂酰丝氨酸在细胞膜的细胞质表面上，从而导致假阳性染色。
3.加入约1mL 4℃预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。
4.用适当的缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度1-5×10^6/mL
(缓冲液可选择终浓度为2mM Hepes/NaOH,pH 7.4，28mM NaCl，0.5mM CaCl2溶液)。
5.取100μL的细胞悬液于5mL流式管中，加入5μL Annexin V-PE混匀后于室温避光孵育5min。
6.加入10μL 20μg/mL的7-AAD或PI，并加400μL PBS，立刻进行流式检测。
结果：如图所示：Q1：左上象限(Annexin V-/PI+)可能是细胞碎片或其他原因导致的死亡细胞；Q2：右上象限(Annexin V+/PI+)为晚期凋亡细胞；Q3：右下象限(Annexin V+/PI-)为早期凋亡细胞；Q4：左下象限(Annexin V-/PI-)为正常活细胞。凋亡实验流式细胞结果如图2-1所示，图2-1看出，经化合物F4处理48h后，Q2和Q3区域的细胞明显增加；总凋亡率结果如图2-2所示，单用或与5-FU联用效果均优于EGCG组，且联用显示出更优的效果，表明化合物F4可以显著增加肝癌细胞HepG2细胞凋亡。
效果例3
细胞周期：
PI染色检测细胞周期实验具体方法：用胰酶消化Hepg2细胞后制备成均匀的单细胞悬液，接种15w个/孔接种到6孔板中，放入含5％CO2的37℃培养箱中培养。24h后，细胞贴壁，加入化合物F4、化合物F4+5-FU药物工作液后给药，处理24h。收集上清和细胞到离心管中，离心后用PBS重悬清洗一遍，离心后去上清，加入75％预冷的乙醇重悬，4℃固定过夜，次日离心弃乙醇，PBS重悬清洗一遍，离心后去上清，后每个样品加入500μL的染色缓冲液和10μL的RNaseA以及25μL的PI染料重悬，37℃避光孵育0.5-1h，用流式细胞仪检测细胞周期。细胞周期结果图如图3所示，结果显示化合物F4和化合物F4-5-FU联用可以在作用24h后引起HepG2细胞周期阻滞在G2/M期。
效果例4
ROS：
活性氧族物质(Reactive Oxygen Species,ROS)是细胞线粒体氧化呼吸中产生的自由基活性的物质，参与细胞多种生理和病理形成机制。本ROS荧光探针－二氢乙啶(Dihydroethidium,DHE)，可自由透过活细胞膜进入细胞内，并被细胞内的ROS氧化，形成氧化乙啶；氧化乙啶可掺入染色体DNA中，产生红色荧光。根据活细胞中红色荧光的产生，可以判断细胞ROS含量的多少和变化。二氢乙啶在细胞内主要被超氧阴离子型ROS氧化，用流式细胞仪或荧光显微镜可直接观察，
操作方法：
1)探针溶液可在新鲜培养液、缓冲盐溶液或组织灌流液中稀释到所需浓度，以此染色液更换细胞培养液或灌流液；也可直接向细胞孵育液体或灌流液中加入探针溶液至所需浓度。
2)依据细胞ROS含量的不同，二氢乙啶终浓度可选择在1μM～100μM的范围，孵育时间可选择10～90min。孵育可在37℃或室温进行，要求避光。
3)孵育结束后，用新鲜溶液清洗细胞或组织。
4)对贴壁生长细胞或活组织，可直接在荧光显微镜下观察，结果如图4所示。结果显示单用时，EGCG、化合物F4以及5-FU均较阴性产生较多ROS，即均能促进ROS的产生，且化合物F4>5-FU>EGCG。更重要的是联用时产生的ROS比单用时ROS更多,EGCG与5-FU联用相比于单用5-FU，能显著增加5-FU效果，而化合物F4与5-FU联用效果更显著、更好，明显促进ROS的产生，进一步诱导癌细胞凋亡死亡，联用具有协同增强抗癌作用。
效果例5
计算对接:
利用Sybyl 2.0计算对接软件对改性EGCG和VSV蛋白进行分子对接模拟，得到表2计算对接模拟打分，分数较高者表面对蛋白的结合作用越强，再利用PyMol软件进行蛋白处理，得到氢键相互作用，如图6。
表2：计算对接模拟打分结果
Name Total Score Crash Polar
F4 8.59 -0.94 2.88
EGCG 5.07 -0.41 4.44
结果显示Total Score分数越高越好，即化合物F4>EGCG,且分子与蛋白结合部位(对接口袋)的氨基酸氢键连接显示,化合物F4的D环酚羟基与LEU-50、TYR-51氨基酸形成氢键作用，距离分别为
Figure SMS_11
A环上的酚羟基上的羟基与氨基酸GLN-68形成2个氢键相互作用，距离为
Figure SMS_12
疏水侧链促使F4的进入疏水裂缝口袋，与蛋白紧密结合，形成相互作用，亲和力更高，该小分子在MDM2的p53口袋中结合，模仿了关键p53氨基酸残基的相互作用。
分子与蛋白结合部位(对接口袋)的氨基酸氢键连接显示，EGCG酚羟基上的几个羟基与氨基酸TYR-51、GLN-55、VAL-89以及LYS-90形成氢键相互作用，距离
Figure SMS_13
由于没有和口袋有较深入的结合，可能致使活性相对较弱，且活性与抗肿瘤实验结果相一致。见图5，由图5可知，新型改性EGCG可通过结合作用于MDM2蛋白，干扰p53与其调节性E3连接酶MDM2的相互作用，抑制MDM2对p53的泛素化，稳定上调p53，进一步导致活性氧(ROS)产生，诱导更广泛的细胞凋亡，达到抗肿瘤活性，促使肿瘤细胞死亡。
效果例6
稳定性实验：
将EGCG、化合物F4配成相同浓度、相同体积的水溶液，室温放置，观察颜色变化。结果如图6所示，放置6个月后，EGCG组颜色有白色澄清溶液变成黄色浑浊溶液，部分发生氧化，有沉淀析出，而化合物F4水溶液则无颜色变化，依旧保持白色澄清溶液，保持稳定不被氧化，即化合物F4的稳定性优于EGCG的稳定性。
效果例7
EGCG衍生物抑制肝癌细胞的集落形成实验：
结晶紫又名龙胆紫，是一种碱性染料，其溶解后能够被活细胞摄取，使细胞的DNA、蛋白质和脂肪等染色。结晶紫染色后，肉眼可以观察到细胞呈现为深蓝色，在显微镜下能够区分开呈现不同颜色的核和胞质。
本实验采用结晶紫染色法探究EGCG及其衍生物对HepG2肿瘤细胞集落形成的影响。结果如图7所示，EGCG、化合物F4和5FU能够有效地抑制肝癌细胞的集落形成，其中化合物F4和5FU(50ug/ml)联用对肝癌细胞的作用效果等同于5FU(50ug/ml)的效果，说明化合物F4与一线化疗药联用，可以降低化疗药用药剂量，降低不良反应。因此，本实验说明化合物F4有明显肝癌细胞毒毒性，以及与化疗药5FU联用效果明显。
效果例8
细胞迁移能力检测：
转移在恶性肿瘤的发展中起着重要的作用，癌细胞的迁移和侵袭参与了肿瘤的转移，肝癌是最具有侵袭性的恶性肿瘤之一。本发明通过细胞划痕实验考察改性EGCG单用和联用对HepG2细胞迁移能力的影响。将生长至对数生长期的HepG2细胞以1X106个细胞每孔的数量铺于6孔板上，培养至细胞贴壁生长。当细胞贴壁至80％以上时，用小号枪头在孔板内画“+”号，并用PBS冲洗3次，洗掉残余细胞。向6孔板中加入空白、F4(100uM)、EGCG(100uM)、5FU(50ug)、F4(100uM)+5FU(25ug)、F4(100uM)+5FU(50ug)，每个浓度设置2个复孔，培养24～48h。培养结束后，弃去上层液体，并用PBS清洗3次。每孔加入200uL PBS溶液，在显微镜下观察并拍摄。
结果如图8所示，空白对照组的细胞在培养24h后，划痕间距离明显减小，说明癌细胞发生了迁移，使得人为产生的创面有逐渐愈合趋势。然而100μM的EGCG和化合物F4或5-FU给药后，与空白对照组相比，划痕间距离大于空白对照组，划痕面积显著增加，且化合物F4与5-FU联用效果强于单独给药，联合用药可以降低5-FU用量，且效果更佳，说明改性EGCG单用或联用能够显著抑制HepG2细胞的迁移能力。
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，不可以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (10)

1.一种表没食子儿茶素没食子酸酯类化合物，其特征在于，具有如下结构：
Figure FDA0004019573320000011
其中，R1、R2各自独立的为H、OH、
Figure FDA0004019573320000012
R1、R2不同时为OH；
R3为直链、支链或环状的、饱和或不饱和的脂肪烃时，，R3为C1-C30基团；
R3为nPEG，n＝200-20000。
2.如权利要求1所述化合物，其特征在于，所述化合物包括化合物F1、化合物F2、化合物F3、化合物F4、化合物F5、化合物F6中的一种；
当所述化合物为所述化合物F1时，R1＝C15H31O2，R2＝OH，所述化合物F1具有如下结构：
Figure FDA0004019573320000013
当所述化合物为所述化合物F2时，R1＝CH3O.(C2H4O)5..HC3H4O2，R2＝OH，所述化合物F2具有如下结构：
Figure FDA0004019573320000021
当所述化合物为所述化合物F3时，R1＝C5H11O2，R2＝OH，所述化合物F3具有如下结构：
Figure FDA0004019573320000022
当所述化合物为所述化合物F4时，R1＝C12H23O2，R2＝OH，所述化合物F4具有如下结构：
Figure FDA0004019573320000023
当所述化合物为所述化合物F5时，R1＝C8H17O2，R2＝OH，所述化合物F5具有如下结构：
Figure FDA0004019573320000031
当所述化合物为所述化合物F6时，R1＝C12H23O2，R2＝C12H23O2，所述化合物F6具有如下结构：
Figure FDA0004019573320000032
3.如权利要求1所述化合物，其特征在于，所述化合物优选为化合物F4。
4.一种如权利要求2所述化合物的制备方法，其特征在于，包括：
当所述化合物为所述化合物F1时，制备步骤包括：将EGCG添加到的THF中，加热溶解完全后，加入碳酸钠，随后，将十五烷酰氯滴加到溶液中，并搅拌，转移到加塞烧瓶中进行反应，在水浴条件下反应，过滤反应液，转移至分液漏斗中，加入去离子水，震荡后，萃取、分液，使用无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂，粗产物使用异丙醇重结晶，离心，冷冻干燥，获得所述化合物F1；
当所述化合物为所述化合物F2时，制备步骤包括：称取PEG-COOH，加入THF作为溶剂，加入氯化亚砜，加催化剂N,N-二甲基甲酰胺，N2气保护，搅拌反应，旋蒸除去溶剂，得到淡黄色稠状产物；再将EGCG溶解于THF，加入碳酸钠，搅拌，再将所述淡黄色稠状产物用THF溶解后，转移至恒压滴定漏斗，缓慢滴加至溶解有EGCG的THF溶液中，室温反应搅拌过夜，之后静置，有沉淀析出，去除沉淀，液体旋干，柱层析纯化，获得所述化合物F2；
当所述化合物为所述化合物F3时，制备步骤包括：将EGCG溶解于15％的氢氧化钠溶液中，搅拌溶解制成酚钠溶液，加入戊酸酐反应，所得产物依次用水、5％氢氧化钠溶液、水洗涤，经氯化钙干燥后，蒸馏分离，获得所述化合物F3；
当所述化合物为所述化合物F4时，制备步骤包括：将EDCI、HOBT和月桂酸溶解在干燥的二甲基甲酰胺溶剂中，搅拌活化，再向混合溶液中加入EGCG，然后将反应混合物在室温过夜反应，之后加入适量饱和氯化铵溶液淬灭，DCM萃取三次，干燥，旋干溶剂，柱层析纯化，获得所述化合物F4；
当所述化合物为所述化合物F5时，制备步骤包括：将EGCG溶解于15％的氢氧化钠溶液中，搅拌溶解制成酚钠溶液，加入辛酸酐反应，所得产物依次用水、5％氢氧化钠溶液、水洗涤，经氯化钙干燥后，蒸馏分离，获得所述化合物F5；
当所述化合物为所述化合物F6时，制备步骤包括：将EDCI、HOBT和月桂酸溶解在干燥的二甲基甲酰胺溶剂中，搅拌活化，再向混合溶液中加入EGCG，然后将反应混合物在室温过夜反应，之后加入适量饱和氯化铵溶液淬灭，DCM萃取三次，干燥，旋干溶剂，柱层析纯化，获得所述化合物F6。
5.如权利要求4所述制备方法，其特征在于，包括：
当所述化合物为所述化合物F1时，EGCG、碳酸钠、十五烷酰氯的摩尔比为1:2:2，EGCG与THF的摩尔体积比为1mmol：10mL，加热到40℃使其溶解完全，反应的条件为水浴40℃反应6-12h；
当所述化合物为所述化合物F2时，PEG-COOH、THF、氯化亚砜、N,N-二甲基甲酰胺的质量体积比为250mg：8mL：0.3ml：1ml，PEG-COOH的分子量为324，搅拌反应的条件为37℃反应2-6小时；那之后，EGCG、THF、碳酸钠的摩尔比为1.2：1：2mol，与用THF溶解的所述淡黄色稠状产物进行反应，柱层析纯化的流动相为DCM:MeOH按体积比10:1混合而成；
当所述化合物为所述化合物F3时，EGCG与15％的氢氧化钠溶液的质量比为1-10:1，加入戊酸酐后反应条件为30-40℃反应4-20h；
当所述化合物为所述化合物F4时，EDCI、HOBT、月桂酸、EGCG的摩尔比为1.38：2.3：0.046：2.3，搅拌活化的温度为室温，时间为2h；柱层析纯化的流动相为DCM:MeOH按体积比5-10:1混合而成，收集第六次洗脱流分，获得所述化合物F4；
当所述化合物为所述化合物F5时，EGCG与15％的氢氧化钠溶液的质量比为1-10:1，加入辛酸酐后反应条件为30-40℃反应3-24h；
当所述化合物为所述化合物F6时，EDCI、HOBT、月桂酸、EGCG的摩尔比为1.38：2.3：0.046：2.3，搅拌活化的温度为室温，时间为2h；柱层析纯化的流动相为DCM:MeOH按体积比5-10:1混合而成，收集第四次洗脱流分，获得所述化合物F6。
6.一种如权利要求1所述化合物的应用，其特征在于，用于制备抗肿瘤细胞药物。
7.如权利要求6所述化合物的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞包括肝癌细胞、结肠癌细胞、乳腺癌细胞、胃癌细胞中的一种或多种。
8.如权利要求7所述化合物的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞为肝癌细胞。
9.如权利要求8所述化合物的应用，其特征在于，所述药物包括所述化合物与五氟尿嘧啶、伊立替康等化疗药物联合使用。
10.如权利要求6所述化合物的应用，其特征在于，所述药物中，所述化合物的浓度为10-1000μM。
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