CN101072764A - 抑制蛋白酶体的(－)－表没食子儿茶素没食子酸酯衍生物 - Google Patents
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Abstract
(－)－EGCG是最丰富的儿茶素，其被认为是化学预防及抗癌剂。然而，(－)－EGCG具有至少一个局限性：其生物利用度差。本发明提供了具有下列通式的化合物，其中R11、R12、R13、R21、R22、R2、R3和R4均各自独立地选自－H和C1－C10酰氧基；以及R5选自－H、C1－C10烷基、C2－C10烯基、C2－C10炔基、C3－C7环烷基、苯基、苯甲基和C3－C7环烯基，同时，最后提到的7个基团中的每一个都可用1到6个卤素原子的任意组合取代；R11、R12、R13、R21、R22、R2、R3和R4中至少有一个是－H，这些化合物被证实比其用作蛋白酶体抑制剂以减少肿瘤细胞生长的未被保护对应物更有效。
Description
发明领域
本发明涉及(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯的衍生物，尤其是用作蛋白酶体抑制剂和/或用于抑制癌细胞生长。
发明背景
从绿茶提取物中发现的多酚有(-)-表儿茶素(EC)，(-)-表没食子儿茶素(EGC)，(-)-表儿茶素-3-没食子酸酯(ECG)和(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)。尤其是，(-)-EGCG作为最丰富的儿茶素，被认为是绿茶儿茶素(GTCs)中的化学预防及抗癌剂(4.Fujiki，H.J Cancer Res Clin Oncol.1999，125，589-97)。
蛋白酶体是具有多相催化活性的大蛋白复合体，不仅负责老化蛋白和错误折叠蛋白的降解，而且负责与细胞周期和凋亡相关调控蛋白的降解。在蛋白酶体依赖的蛋白水解过程中，泛素先与底物结合，然后底物降解，氨基酸和泛素再循环。泛素/蛋白酶体依赖的降解途径在细胞增殖上调、细胞死亡下调，以及人肿瘤细胞耐药性的发展过程中起着至关重要的作用。因此，蛋白酶体抑制剂显示了作为新型抗癌药物的巨大潜力(Dou，Q.P.；Li，B.Drug Resist Update 1999，2，215-23)。据显示，天然的(-)-EGCG和合成得到的(+)-EGCG都是蛋白酶体糜蛋白酶活性的强效抑制剂，从而引起生长停滞和/或细胞凋亡(Smith，D.M.；Wang，Z.；Kazi，A.；Li，L.；Chan，T.H.；Dou，Q.P.Mol Med 2002，8：382-92.)。美国专利公开20040110790(Zaveri等)描述了合成的绿茶多酚类似物作为化学治疗和化学预防剂，但是该合成方法仅提供了外消旋的化合物，并没有采用从绿茶中得到的天然形成的儿茶素。
P13K/Akt信号转导是广为人知的肿瘤细胞存活途径(Vanhaesebroeck，B.；Alessi，D.R.Biochem J 2000，346，561-76)。阻断这种途径被视为抑制肿瘤生长的重要机制。磷酸化Akt(p-Akt)是Akt的活化形式。一旦被活化，Akt可通过磷酸化和随后抑制周期素依赖性激酶抑制剂p27.24而介导细胞周期进程。最近，已证实(-)-EGCG可通过减弱MMTV-Her-2/neu小鼠乳腺肿瘤NF639细胞中的磷脂酰肌醇3-激酶信号而抑制Akt激酶活性，从而使肿瘤细胞生长受到抑制(Pianetti，S.；Guo，S.；Kavanagh，K.T.；Sonenshein，G.E.Cancer Res2002，62，652-5)。
但是，(-)-EGCG具有至少一个局限性：其生物利用度差。Nakagawa等的一项研究表明，使大鼠口服56mg(-)-EGCG，仅0.012％的(-)-EGCG可被吸收(Nakagawa，K.；Miyazawa，T.Anal Biochem.1997，248，41-9)。这样低的吸收率被认为是由于(-)-EGCG在中性或碱性溶液中稳定性差而造成的。当肠道和体液的pH值为中性或微碱性时，GTCs在人体中不稳定，从而导致生物利用度降低。
发明目的
因此，本发明的目的之一是提供可解决上述至少一个或多个现有技术问题的(-)-EGCG衍生物。至少，本发明的目的之一是给公众提供一种有益的选择。
发明概要
因此，本发明提供抑制蛋白酶体的下式化合物：
其中，
· R11、R12、R13、R21、R22、R2、R3和R4均各自独立地选自-H和C1-C10酰氧基；以及
· R5选自-H、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C3-C7环烷基、苯基、苯甲基和C3-C7环烯基，同时，最后提到的7个基团中的每一个都可用1到6个卤素原子的任意组合取代；
· R11、R12、R13、R21、R22、R2、R3和R4中至少有一个是C1-C10酰氧基；以及
· R11、R12、R13、R21、R22、R2、R3和R4中至少有一个是-H。
优选R11、R2和R4各自均为-H，并且R12、R13、R21、R22和R3各自均为乙酸酯或苯甲酸酯基团。
任选地，R11是-H，并且R12、R13、R21、R22、R2、R3和R4各自均为乙酸酯或苯甲酸酯基团。
另外，R11、R13、R2和R4各自均为-H，并且R12、R21、R22和R3各自均为乙酸酯或苯甲酸酯基团。
任选地，R11和R13各自均为-H，并且R12、R21、R22、R2、R3和R4各自均为乙酸酯或苯甲酸酯基团。
R11、R12和R13各自均可以是-H，并且R21、R22、R2、R3和R4各自都可以是乙酸酯或苯甲酸酯基团。
在本发明上述化合物的一个实施方案中，R5是-H，并且R11、R12、R13、R21和R22各自均为乙酸酯基团。这个特别的实施方案还提供了下列3种变化：
· R2是乙酸酯基团，并且R3和R4各自均为-H；
· R3是乙酸酯基团，并且R2和R4各自均为-H；或者
· R2和R4各自均为乙酸酯基团，并且R3是-H。
本发明的另一方面是提供减少肿瘤细胞生长的方法，包括施用有效量的下式化合物的步骤：
其中，
· R11、R12、R13、R21、R22、R2、R3和R4均各自独立地选自-H和C1-C10酰氧基；以及
· R5选自-H、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C3-C7环烷基、苯基、苯甲基和C3-C7环烯基，同时，最后提到的7个基团中的每一个都可用1到6个卤素原子的任意组合取代；以及
· R11、R12、R13、R21、R22、R2、R3和R4中至少有一个是C1-C10酰氧基。
本发明的又一方面是提供了下式化合物在制造减少肿瘤细胞生长的药物中的应用：
其中，
· R11、R12、R13、R21、R22、R2、R3和R4均各自独立地选自-H和C1-C10酰氧基；以及
· R5选自-H、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C3-C7环烷基、苯基、苯甲基和C3-C7环烯基，同时，最后提到的7个基团中的每一个都可用1到6个卤素原子的任意组合取代；以及
· R11、R12、R13、R21、R22、R2、R3和R4中至少有一个是C1-C10酰氧基。
本发明还提供了抑制蛋白酶体的下式化合物：
其中，
· R1是-H；
· R2、R3和R4均各自独立地选自-H和-OH；以及
· R2、R3和R4中至少有一个是-H。
优选R2可以是-OH，并且R3＝R4＝-H。任选地，R3可以是-OH，并且R2＝R4＝-H；或R3可以是-H，并且R2＝R4＝-OH。
本发明还提供了减少肿瘤细胞生长的方法，包括施用有效量的下式化合物的步骤：
其中，
· R1是-H；
· R2、R3和R4均各自独立地选自-H和-OH；以及
· 如果R2＝R3＝R4，则R2不是-OH。
本发明的另一方面是提供下式化合物在制造减少肿瘤细胞生长的药物中的应用：
其中，
· R1是-H；
· R2、R3和R4均各自独立地选自-H和-OH；以及
· 如果R2＝R3＝R4，则 R2不是-OH。
附图概述
本发明的优选实施方案将通过举例和参考附图进行说明，其中：
图1显示了(-)-EGCG的结构，以及本发明的(-)-EGCG衍生物的实例；
图2显示了(-)-EGCG和1的降解曲线；
图3显示了EGCG过乙酸酯(1)在含有维生素C的培养基中的时程结果(面积∶时间)。化合物1：◆；化合物A(二乙酸酯)：X；化合物B(单乙酸酯)：▲；EGCG：■；
图4显示了EGCG过乙酸酯(1)在含有维生素C并添加有裂解液的培养基中的时程结果(面积∶时间)。化合物1：◆；化合物A(二乙酸酯)：X；化合物B(单乙酸酯)：▲；EGCG：■；
图5显示了1和(-)-EGCG对纯化的20S蛋白酶体的糜蛋白酶样活性的抑制作用；
图6显示了(a)1和(-)-EGCG在体内对蛋白酶体活性的抑制作用；(b)经1和(-)-EGCG处理后的泛素的蛋白质印迹法测定结果；
图7显示了经1和(-)-EGCG处理的p-Akt水平的量；
图8显示了经1和(-)-EGCG处理的Jurkat细胞的存活率；
图9显示了Jurkat细胞用各标明的多酚25μM处理4小时(A)，高至8小时(C)，或24小时(B)，或者LNCaP细胞用标明的化合物25μM处理24小时(D)，然后用泛素、Bax、IκBα、p27和肌动蛋白(Actin)的特异性抗体进行蛋白质印迹分析的结果。箭头所指的带是Bax和IκBα可能的泛素化形式。A.第4道的Ub-IκBα带可能是从第5道溢出的结果。所显示的数据为三次独立实验的代表性数据；
图10显示了Jurkat T细胞(A和B)或VA-13(C和D)细胞用标明的多酚25μM处理24小时的结果。A.台盼蓝掺入法(Trypan blueincorporation)测定结果。数据以死亡细胞占细胞群总数比的平均值±SD表示。B.PARP裂解的蛋白质印迹。C.用与FITC结合的、对p85裂解的PARP片断具有特异性的抗体对细胞凋亡后期进行荧光显微分析的结果。以DAPI复染作为非凋亡细胞对照。采用倒置荧光显微镜(Zeiss，德国)通过AxioVision软件获得图像。D.通过计算同一区域内凋亡细胞占细胞总数比，得到的C中凋亡细胞的量化。数据为两次重复实验的平均值±SD；
图11显示了合成的乙酰化多酚对乳腺和前列腺癌细胞的作用。A.MTT法测定结果。乳腺癌MCF-7细胞用各标明的化合物5或25μM处理24小时。B.形态学变化。前列腺癌LNCaP细胞用25μM(-)-EGCG或一种受保护的类似物处理24小时，然后进行形态学评测。图像通过放大倍数为40X的相差显微镜(Leica，德国)获得。C.软琼脂实验测定结果。LNCaP细胞与溶剂二甲基亚砜(DMSO)或25pM(-)-EGCG或受保护的类似物一起铺板到软琼脂中。培养细胞21天，不再添加药物。所显示的数据为三次重复实验的代表性的检查的孔(scannedwells)。D.用自动计数器量化C中的菌落并以平均值±SD表示；
图12显示了以标明的化合物25μM处理正常的WI-38细胞和SV-40转化的VA-13细胞24小时(A和B)或36小时(C)，或者以各化合物25μM处理白血病Jurkat T细胞和非转化的YT细胞24小时(D)的结果。A.完整细胞中蛋白酶体的糜蛋白酶样活性。B和C.脱落细胞和贴壁细胞在10X(B)或40X(C)放大倍数下的核染色凋亡形态。缺的图板表示没有细胞脱落发生。D.以PARP的特异性抗体进行蛋白质印迹分析的结果；
图13显示了(-)-EGCG的结构，以及本发明的(-)-EGCG过乙酰氧基衍生物的实例。图13a和13b显示了合成本发明的(-)-EGCG过乙酰氧基衍生物时的中间体；
图14显示了Jurkat T细胞经溶剂(DMSO)、图13中的化合物25μM预孵育后的糜蛋白酶样活性；
图15显示了Jurkat T细胞经溶剂(DMSO)，以及图13中的化合物25μM处理后的蛋白酶体靶物和泛素化蛋白的累积；
图16显示了Jurkat T细胞经溶剂(DMSO)，以及图13中的化合物25μM处理后的细胞死亡百分率；
图17显示了Jurkat T细胞经溶剂(DMSO)，以及图13中的化合物25μM处理后的caspase-3的活化；以及
图18显示了Jurkat T细胞和非转化的人自然杀伤(YT)细胞经10和25μM 19*处理，然后用IκB-α、PARP和肌动蛋白(Actin)的特异性抗体进行蛋白质印迹分析后对肿瘤细胞凋亡的诱导。
优选实施方案详细说明
下文中通过与附图相关的实施例对本发明进行描述。
本发明的目的、特征及方面在下面的说明中公开或显而易见。本领域技术人员应该理解，本论述只是对例示性实施方案的描述，并不意味着限制本发明更广泛的方面，那些更广泛的方面体现在例示性结构中。
在本发明中，合成了(-)-EGCG的前药形式以提高其生物利用度。该前药呈现出：[i]在中性pH的生理条件下具有提高的稳定性；[ii]在体内保持无生物活性，直至酶解释放出母药；[iii]以及最后，前药基团(promoiety)具有低的全身毒性。
此外，还合成了3个(-)-EGCG衍生物及其前药形式，并且令人惊讶的是，这些化合物被证实具有比(-)-EGCG自身的天然形式更高的作用强度。
本发明醇形式的(-)-EGCG衍生物具有如下通式：
其中，
· R1是-H；以及
· R2、R3和R4均各自独立地选自-H和-OH。
当然，当R2＝R3＝R4，且R2是-OH时，该化合物为(-)-EGCG，也因此不是本发明的主旨。
本发明酯形式的(-)-EGCG衍生物具有如下通式：
其中，
· R11、R12、R13、R21、R22、R2、R3和R4均各自独立地选自-H和C1-C10酰氧基；以及
· R5选自-H、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C3-C7环烷基、苯基、苯甲基和C3-C7环烯基，同时，最后提到的7个基团中的每一个都可被1到6个卤素原子的任意组合取代；
· R11、R12、R13、R21、R22、R2、R3和R4中至少有一个是C1-C10酰氧基；以及
· R11、R12、R13、R21、R22、R2、R3和R4中至少有一个是-H。
在上述化合物的定义中，用到了集合名词术语，通常表示下列基团：
C1-C6酰基：具有-(CO)-R结构，其中R是氢或具有1-5个碳原子的直链或支链烷基，如甲基、乙基、丙基、1-甲基乙基、丁基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、1，1-二二甲基乙基、戊基、2-甲基丁基。烷基R可以“部分或完全卤化”。术语“部分或完全卤化”的意思是表述这样一种基团，其特征在于其中的氢原子可以部分或全部被相同或不同的卤素原子置换，例如氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氯氟甲基、二氯氟甲基、氯二氟甲基、1-氟乙基、2-氟乙基、2，2-二氟乙基、2，2，2-三氟乙基、2-氯-2-氟乙基、2-氯-2，2-二氟乙基、2，2-二氯-2-氟乙基、2，2，2-三氯乙基和五氟乙基。
C1-C10酰氧基：具有-O-(CO)-R结构，其中R可以是-H、C1-C9烷基、C2-C9烯基、C2-C9炔基、C3-C7环烷基、苯基、苯甲基和C3-C7环烯基中的任一个，同时，最后提到的7个取代基中的每一个都可被任意的直链或支链烷基取代，所述直链或支链烷基如甲基、乙基、丙基、1-甲基乙基、丁基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、1，1-二甲基乙基、戊基、2-甲基丁基。烷基R可以“部分或完全卤化”。术语“部分或完全卤化”的意思是表述这样一种基团，其特征在于其中的氢原子可以部分或全部被相同或不同的卤素原子置换，例如氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氯氟甲基、二氯氟甲基、氯二氟甲基、1-氟乙基、2-氟乙基、2，2-二氟乙基、2，2，2-三氟乙基、2-氯-2-氟乙基、2-氯-2，2-二氟乙基、2，2-二氯-2-氟乙基、2，2，2-三氯乙基和五氟乙基。烷基R可以被羟基或烷氧基或氨基部分或全部取代，如羟甲基、2-氨基乙基，或3-甲氧基丙基。
根据本发明，合成了(-)-EGCG过乙酸酯，即化合物1(图1)。已证实1比(-)-EGCG稳定。该前药对纯化的20S蛋白酶体无生物活性，但能有效抑制完整肿瘤细胞的蛋白酶体。此外，对完整肿瘤细胞施用该前药而非其母体化合物，导致了磷酸化Akt(p-Akt)的缺失，表明了此癌症相关激酶的失活。最后，用1处理白血病Jurkat T细胞诱导了细胞死亡。
为评价其它过乙酸酯保护的茶多酚是否有比其未受保护的母体更高的生物活性，合成了一些除去没食子酸酯环上的羟基的(-)-EGCG合成类似物。另外，为提高分子的稳定性，这些羟基被转化成乙酸酯或苯甲酸酯基团以制成前药。令人惊讶的是，已发现这些受保护的类似物是比其未受保护的相似物更有效的完整肿瘤细胞的蛋白酶体抑制剂。
本发明化合物的合成方法和特性将在下文中详细说明。
原料及方法
试剂
胎牛血清购自Tissue Culture Biologicals公司(Tulare，CA)。青霉素-链霉素-Glutaxnine混合物、RPMI和DMEM来自Invitrogen公司(Carlsbad，CA)。二甲基亚砜(DMSO)、N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)、Hoechst 33342、3-((4，5)-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)、牛血清白蛋白(B SA)，和(-)-EGCG购自Sigma公司(St.Louis，MO)。Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC(用于蛋白酶体糜蛋白酶样活性)获自Biomol公司(Plymouth Meeting，PA)。纯化的兔20S蛋白酶体获自Boston Biochem公司(Cambridge，MA)。Arnplex Red H202检测试剂盒购自Molecular Probes公司(Eugene，OR)。抗Bax的单克隆抗体(H280)和抗泛素的单克隆抗体(P4D1)，抗IKB-a的多克隆抗体(C15)，抗肌动蛋白的多克隆抗体(C11)和抗羊、抗兔、以及抗鼠IgG-辣根过氧化物酶均购自Santa Cruz Biotechnology公司(SantaCruz，CA)。抗p27的单克隆抗体(554069)购自BD Biosciences公司(San Diego，CA)。含DAPI的Vectashield封片剂(Mounting Medium)购自Vector Laboratories，Inc.公司(Burlingame，CA)。对PARP裂解位点具有特异性、并与FITC结合的多克隆抗体获自Biosource公司(Camarillo，CA)。CaspACE FITC-VAD-FMK标记物购自Promega公司(Madison，WI)。
合成茶多酚类似物的合成。化合物1、2、2a、3、3a、4，和4a的合成(图1)
按照文献操作(Kohri，T.；Nanjo，F.；Suzuki，M.；Seto，R.；Matsumoto，N.；Yamakawa，M.；Hojo，H.；Hara，Y.；Desai，D.；Amin，S.；Conaway，C.C.；Chung，F.L. J Agric Food Chem 2001，49：1042-8)制备1，但这里仍将阐述1的合成。为合成1，以市场上可以买到的(-)-EGCG为原料。用乙酸酐和吡啶过夜处理(-)-EGCG，得到产率为82％的期望产物(图1)。1的结构通过1H NMR和13C NMR、LRMS和HRMS确证。
Mp 157.1℃
LRMSm/z(ESI) 817(MNa+)
HRMS 实测值，817.1544；C38H34O19Na的理论值为817.1592。
1H NMR(CDCl3，500MHz)δ7.62(s，2H)，7.24(s，2H)，6.73(s，1H)，6.61(s，1H)，5.64(brs，1H)，5.18(s，1H)，3.02(m，2H)，2.29(s，3H)，2.28(s，9H)，2.27(s，3H)，2.24(s，3H)，2.23(s，6H)。
13C NMR(CDCl3，100MHz)δ168.89，168.40，167.59，167.43，166.72，166.20，163.51，154.71，149.72，149.64，143.38，143.29，138.93，135.06，134.34，127.41，122.34，118.79，109.42，109.00，108.06，76.46，67.98，25.85，21.06，20.75，20.54，20.11。
(2S*，3R*)-反式-5，7-双(苄氧基)-2-[3，4，5-三(苄氧基)苯基]苯并二氢吡喃-3-醇(5)
该化合物按照文献操作(Li，L.H.；Chan，T.H.Org.Lett.2001，3，739-741)合成。
(2S*，3R*)-反式-5，7-双(苄氧基)-2-[3，4，5-三(苄氧基)苯基]苯并二氢吡喃-3-基3-(苄氧基)苯甲酸酯(2b)
向3-(苄氧基)苯甲酸(0.12g，0.53mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液中加入一定量的(COCl)2(0.68mL)。混合物回流2小时。之后蒸馏除去过量的(COCl)2和溶剂，所得残留物真空干燥过夜。残留物重新溶解在二氯甲烷(5mL)中，在0℃加入到5(0.20g，0.26mmol)和DMAP(0.08g，0.64mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液中。然后混合物室温搅拌过夜。加入饱和碳酸氢钠。分离有机层，水层用乙酸乙酯萃取。合并有机层，干燥(以硫酸钠)，并蒸干。残留物用柱层析法(己烷-乙酸乙酯4∶1)纯化，得到为白色固体的化合物2b(0.22g，88％)。
LRMSm/z(ESI) 989(MNa+)
HRMS 实测值，989.3657；C64H54O9Na的理论值为989.3666
1H NMR(CDCl3，500MHz)δ7.54-7.12(m，30H)，6.72(s，2H)，6.29(d，J＝4.5Hz，2H)，5.50(q，J＝7.0Hz，1H)，5.10(d，J＝6.5Hz，1H)，5.05-4.95(m，12H)，3.04(dd，J＝16.5，6.0Hz，1H)，2.89(dd，J＝16.5，6.5Hz，1H)。
13C NMR(CDCl3，100MHz)δ165.20，158.81，158.51，157.53，154.68，152.73，138.20，137.60，136.76，136.64，136.25，133.24，131.14，129.32，128.49，128.42，128.40，128.29，128.00，127.96，127.91，127.80，127.69，127.62，127.51，127.43，127.38，127.10，122.13，119.93，115.29，106.13，101.23，94.25，93.74，78.38，74.98，71.07，70.02，69.81，24.18。
(2S*，3R*)-反式-5，7-双(羟基)-2-[3，4，5-三(羟基)苯基]苯并二氢吡喃-3-基3-(羟基)苯甲酸酯(2)
将2b(0.23g，0.24mmol)在四氢呋喃/甲醇(28mL/28mL)与Pd(OH)2(0.19g，20％钯/碳)中的悬浮液置于氢气氛中。所得混合物室温搅拌至薄层层析显示反应已完成。然后反应混合物经棉花过滤除去催化剂。蒸干后，残留物用柱层析法(乙酸乙酯-二氯甲烷2∶1)纯化，得到为白色固体的产物2(80mg，79％)。
LRMSm/z(ESI) 449(MNa+)
HRMS 实测值，449.0887；C22H18O9Na的理论值为449.0849.
1H NMR(CD3OD，500MHz)δ7.38-6.97(m，4H)，6.42(s，2H)，5.97(q，J＝2.5Hz，2H)，5.40(q，J＝6.0Hz，1H)，5.03(d，J＝6.0Hz，1H)，2.85(dd，J＝16.5，5.0Hz，1H)，2.74(dd，J＝16.5，6.0Hz，1H)。
13C NMR(CD3OD，100MHz)δ165.87，157.00，156.52，156.03，154.88，145.42，132.50，130.91，129.17，120.29，119.90，115.45，105.00，98.07，95.00，94.12，77.78，70.15，22.71。
(2S*，3R*)-反式-5，7-双(乙酰氧基)-2-[3，4，5-三(乙酰氧基)苯基]苯并二氢吡喃-3-基3-乙酰氧基苯甲酸酯(2a)
将2b(0.1g，0.1mmol)在四氢呋喃/甲醇(12mL/12mL)与Pd(OH)2(0.08g，20％钯/碳)中的悬浮液置于氢气氛中。所得混合物室温搅拌至薄层层析显示反应已完成。然后反应混合物经棉花过滤除去催化剂。滤液蒸干得到脱苄基化合物(2)，该化合物不用纯化，直接用于下一步。所得脱苄基化合物溶解于吡啶(4ml)和醋酐(2ml)中。所得混合物室温搅拌过夜。之后，真空除去醋酐和吡啶。将所得残留物溶于20mL二氯甲烷中，溶液用5×5mL水和5mL盐水洗涤，以Na2SO4干燥，并蒸干。粗品用柱层析法(己烷-乙酸乙酯1∶1)纯化，得到为白色粉末的化合物2a(0.061g，85％)。
Mp 71.6℃
LRMSm/z(ESI) 701(MNa+)
HRMS 实测值，701.1541；C34H30O15Na的理论值为701.1482
1H NMR(CDCl3，500MHz)δ7.79(d，J＝8.0Hz，1H)，7.64(s，1H)，7.42(t，J＝8.0Hz，1H)，7.28(s，1H)，7.17(s，2H)，6.69(s，1H)，6.64(s，1H)，5.46(q，J＝5.5Hz，1H)，5.32(d，J＝5.5Hz，1H)，3.02(dd，J＝17.0，5.0Hz，1H)，2.80(dd，J＝17.0，6.0Hz，1H)，2.32(s，3H)，2.29(s，3H)，2.27(s，3H)，2.26(s，9H)
13C NMR(CDCl3，100MHz)δ169.10，168.81，168.24，167.47，166.61，164.61，154.00，150.42，149.76，149.28，143.47，135.74，134.48，130.72，129.42，127.1 8，126.68，122.79，118.58，109.84，108.81，107.54，69.17，23.65，20.96，20.92，20.65，20.47，20.10
(2S*，3R*)-反式-5，7-双(苄氧基)-2-[3，4，5-三(苄氧基)苯基]苯并二氢吡喃-3-基4-(苄氧基)苯甲酸酯(3b)
标题化合物采用与所述制备2b相同的方式，用5(0.08g，0.1mmol)和4-(苄氧基)苯甲酸(0.049g，0.22mmol)进行制备，得到为白色固体的3b(0.087g，90％)。
LRMSm/z(ESI) 989(MNa+)
HRMS 实测值，989.3666；C64H54O9Na的理论值为989.3666
1H NMR(CDCl3，500MHz)δ7.91(d，J＝9.0Hz，2H)，7.47-7.22(m，30H)，6.95(d，J＝9.0Hz，2H)，6.74(s，2H)，6.31(dd，J＝5.5，2.5Hz，2H)，5.52(q，J＝6.5Hz，1H)，5.14(d，J＝6.5Hz，1H)，5.07-4.97(m，12H)，3.02(dd，J＝17.0，5.5Hz，1H)，2.87(dd，J＝16.5，7.0Hz，1H)
13C NMR(CDCl3，100MHz)δ165.08，162.49，158.76，157.53，154.65，152.69，138.09，137.63，136.79，136.70，136.66，136.00，133.38，131.61，128.55，128.49，128.40，128.29，128.09，127.96，127.91，127.78，127.69，127.62，127.43，127.38，127.30，127.09，122.40，114.33，106.08，101.30，94.22，93.67，78.37，74.98，71.05，69.95，69.79，69.26，24.01
(2S*，3R*)-反式-5，7-双(羟基)-2-[3，4，5-三(羟基)苯基]苯并二氢吡喃-3-基4-(羟基)苯甲酸酯(3)
标题化合物采用与所述制备2相同的方式，用3b(0.24g，0.25mmol)进行制备，得到白色固体3(79mg，75％)。
LRMSm/z(ESI) 449(MNa+)
HRMS 实测值，449.0840；C22H18O9Na的理论值为449.0849
1H NMR(CD3OD，500MHz)δ7.75(d，J＝8.5Hz，2H)，6.77(d，J＝8.5Hz，2H)，6.42(s，2H)，5.95(dd，J＝8.0，2.5Hz，2H)，5.35(q，J＝6.0Hz，1H)，5.00(d，J＝6.0Hz，1H)，2.85(dd，J＝16.5，5.0Hz，1H)，2.71(dd，J＝16.5，6.5Hz，1H)
13C NMR(CD3OD，100MHz)δ165.88，161.99，156.54，156.05，154.95，145.41，132.46，131.31，129.25，120.61，114.57，104.98，98.14，94.91，94.04，78.00，69.81，22.98
(2S*，3R*)-反式-5，7-双(乙酰氧基)-2-[3，4，5-三(乙酰氧基)苯基]苯并二氢吡喃-3-基4-(乙酰氧基)苯甲酸酯(3a)
标题化合物采用与所述制备2a相同的方式，用3b(0.15g，0.16mmol)进行制备，得到白色固体3a(92.6mg，88％)。
Mp 189.4℃
LRMSm/z(ESI) 701(MNa+)
HRMS 实测值，701.1467；C34H30O15Na的理论值为701.1482
1H NMR(CDCl3，500MHz)δ7.94(d，J＝9.0Hz，2H)，7.17(s，2H)，7.13(d，J＝9.0Hz，2H)，6.69(d，J＝2.0Hz，1H)，6.63(d，J＝2.0Hz，1H)，5.45(q，J＝6.0Hz，1H)，5.32(d，J＝6.0Hz，1H)，3.01(dd，J＝16.5，5.0Hz，1H)，2.79(dd，J＝16.5，6.0Hz，1H)，2.31(s，3H)，2.29(s，3H)，2.27(s，3H)，2.26(s，9H)
13C NMR(CDCl3，100MHz)δ168.81，168.64，168.26，167.49，166.62，164.74，154.48，154.02，149.76，149.30，143.49，135.82，134.50，131.28，126.76，121.60，118.59，109.90，108.80，107.51，69.01，23.64，20.97，20.63，20.46，20.00
(2S*，3R*)-反式-5，7-双(苄氧基)-2-[3，4，5-三(苄氧基)苯基]苯并二氢吡喃-3-基3，5-双(苄氧基)苯甲酸酯(4b)
标题化合物采用与所述制备2b相同的方式，用5(0.3g，0.4mmol)和3，5-双(苄氧基)苯甲酸(0.27g，0.81mmol)制备，得到白色固体4b(0.36g，85％)。
LRMSm/z(ESI) 1095(MNa+)
HRMS 实测值，1095.4059；C71H60O10Na的理论值为1095.4084
1H NMR(CDCl3，500MHz)δ7.47-7.17(m，35H)，6.76(s，1H)，6.73(s，1H)，6.30(d，J＝4.5Hz，2H)，5.48(q，J＝7.0Hz，1H)，5.08(d，J＝7.0Hz，1H)，5.04-4.92(m，14H)，3.07(dd，J＝17.0，5.5Hz，1H)，2.85(dd，J＝17.0，7.0Hz，1H)
13C NMR(CDCl3，100MHz)δ165.14，159.73，158.98，157.67，154.88，152.87，137.77，136.91，136.82，136.78，136.29，133.35，131.86，128.61，128.56，128.52，128.41，128.15，128.10，128.02，127.94，127.81，127.76，127.67，127.51，127.24，108.52，106.93，106.30，101.38，94.43，93.93，78.57，75.12，71.17，70.26，70.15，70.11，69.92，24.58
(2S*，3R*)-反式-5，7-双(羟基)-2-[3，4，5-三(羟基)苯基]苯并二氢吡喃-3-基-3，5双(羟基)苯甲酸酯(4)
标题化合物采用与所述制备2相同的方式，用4b(0.17g，0.16mmol)制备，得到白色固体4(50mg，71％)。
LRMSm/z(ESI) 465(MNa+)
HRMS 理论值，465.0844；C22H18O9Na的实测值为465.0798
1H NMR(CD3OD，500MHz)δ6.85(d，J＝2.0Hz，2H)，6.44(t，J＝2.0Hz，1H)，6.41(s，2H)，5.96(s，2H)，5.40(dd，J＝10.5，5.0Hz，1H)，5.05(d，J＝5.0Hz，1H)，2.80(dd，J＝16.5，5.0Hz，1H)，2.73(dd，J＝16.5，5.0Hz，1H)
13C NMR(CD3OD，100MHz)δ165.81，158.10，156.56，156.06，154.83，145.43，132.44，131.49，129.28，107.34，106.86，104.81，97.93，94.88，94.06，77.60，69.95，22.28
(2S*，3R*)-反式-5，7-双(乙酰氧基)-2-[3，4，5-三(乙酰氧基)苯基]苯并二氢吡喃-3-基3，5-双(乙酰氧基)苯甲酸酯(4a)
标题化合物采用与所述制备2a相同的方式，用4b(0.15g，0.14mmol)制备，得到白色固体4a(72mg，70％)。
Mp 105.5℃
LRMSm/z(ESI) 759(MNa+)
HRMS 实测值，759.1530；C36H32O17Na的理论值为759.1537
1H NMR(CDCl3，500MHz)δ7.54(d，J＝2.0Hz，2H)，7.17(s，2H)，7.13(t，J＝2.0Hz，1H)，6.69(d，J＝2.0Hz，1H)，6.64(d，J＝2.0Hz，1H)，5.45(q，J＝6.0Hz，1H)，5.29(d，J＝6.5Hz，1H)，3.01(dd，J＝17.0，5.0Hz，1H)，2.79(dd，J＝17.0，6.5Hz，1H)，2.30(s，6H)，2.28(s，3H)，2.27(s，3H)，2.26(s，3H)，2.25(s，6H)
13C NMR(CDCl3，100MHz)δ168.80，168.62，168.21，167.45，166.60，163.78，153.96，150.78，149.77，149.27，143.46，135.55，134.48，131.26，120.57，120.29，118.56，109.79，108.86，107.57，69.48，23.77，20.94，20.86，20.64，20.45，19.99
由于化合物1，2，3和4的羧酸酯基或羟基易于发生酰基互换，本领域技术人员应该能够将这些化合物上的羧酸酯基替换为酰基。
合成茶多酚类似物的合成
概要
购自供货商的原料和试剂未经进一步纯化直接使用。采用文献操作制备(2R，3S)反式和(2R，3R)-顺式-5，7-双(苄氧基)-2-(4-苄氧基苯基)苯并二氢吡喃-3-醇，(2R，3S)反式和(2R，3R)-顺式-5，7-双(苄氧基)-2-[3，4-双(苄氧基)-苯基]苯并二氢吡喃-3-醇，(2R，3R)-顺式-5，7-双(羟基)-2-(4-羟基苯基)苯并二氢吡喃-3-基3，4，5-三羟基苯甲酸酯(Sheng Biao Wang；Tak Hang Chan.Tetrahedron，2004，60，8207)。
无水四氢呋喃在氮气下从二苯甲酮羰游基钠(sodiumbenzophenone ketyl)中蒸馏得到。无水二氯甲烷在氮气下从CaH2中蒸馏得到。无水DMF在真空下从CaH2中蒸馏得到。反应瓶在氮气流下热干(flame-dried)。所有对水分敏感的反应都在氮气氛中进行。用硅胶60(70-230目)完成快速层析(flash chromatography)。熔点未校正。用CDCl3和丙酮-d6作溶剂测量以TMS为内标的1H NMR和13C NMR(400MHz)光谱。高分辩(ESI)MS光谱用QTOF-2 Micromass光谱仪记录。
(+)-(2R，3S)-5，7-双(苄氧基)-2-[3，4-双(苄氧基)苯基]苯并二氢吡喃-3-基4-苄氧基苯甲酸酯(102)
在氮气氛下，4-苄氧基苯甲酸(140mg，0.61mmol)的溶液与草酰氯(oxally chloride)(1mL)的干二氯甲烷(10mL)溶液和一滴DMF一起回流3小时。蒸馏除去过量的草酰氯和溶剂，残留物真空干燥3小时后重新溶解于二氯甲烷(2mL)中。将该溶液在0℃下逐滴加入至(2R，3S)-反式-5，7-双(苄氧基)-2-[3，4-双(苄氧基)苯基]苯并二氢吡喃-3-醇(195mg，0.3mmol)和DMAP(75mg，0.62mmol)在CH2Cl2(15mL)的溶液中。混合物室温搅拌过夜，然后加入饱和碳酸氢钠水溶液。分离有机层，水层用二氯甲烷萃取。合并有机相，干燥(硫酸镁)，并蒸干。残留物用硅胶快速层析法(flash chromatography)(乙酸乙酯/正己烷＝1/4，v/v)纯化，得到目的化合物(220mg，85.0％)。在乙酸乙酯和正己烷中重结晶，得到白色粉末：mp 148-150℃；[α]D＝+18.3(c＝1，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ7.88(d，J＝8.6Hz，2H)，7.43-7.28(m，25H)，7.01(s，1H)，6.93-6.88(m，4H)，6.28(s，2H)，5.53-5.50(m，1H)，5.14(d，J＝6.4Hz，1H)，5.11(s，2H)，5.07(s，2H)，5.04(s，2H)，5.02(s，2H)，5.01(s，2H)，3.04(Aof ABq，J＝16.8，4.6Hz，1H)，2.87(B of ABq，J＝16.8，6.3Hz，1H)；13CNMR(CDCl3，400MHz)：δ165.0，162.3，158.6，157.4，154.6，148.5，136.9，136.6，136.5，13 5.9，131.4，130.9，128.4，128.3，128.2，128.1，127.9，127.7，127.6，127.5，127.3，127.1，126.9，122.3，119.5，114.6，114.1，113.1，101.1，94.1，93.4，78.0，71.0，70.9，69.9，69.8，69.6，69.1，23.8；HRMS(ESI)：C57H48O8Na(M+Na)的计算值为883.3247，实测值为883.3241。
(-)-(2R，3R)-5，7-双(苄氧基)-2-[3，4-双(苄氧基)苯基]苯并二氢吡喃-3-基4-苄氧基苯甲酸酯(104)
按照102的制备操作，(2R，3R)-顺式-5，7-双(苄氧基)-2-[3，4-双(苄氧基)苯基]苯并二氢吡喃-3-醇用4-苄氧基苯甲酸进行酯化，以86％的产率得到104。mp149-151℃；[α]D＝-3.1(c＝1.5，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ7.92(d，J＝8.8Hz，2H)，7.44-7.26(m，25H)，7.15(d，J＝1.6Hz，1H)，6.91-6.87(m，4H)，6.32(d，J＝2.1Hz，1H)，6.28(d，J＝2.1Hz，1H)，5.63(bs，1H)，5.08(9s，2H)，5.06(s，1H)，5.03-5.00(m，6H)，4.92(AB，J＝11.6Hz，2H)，3.08(bs，2H)；13C NMR(CDCl3，400MHz)：δ165.1，162.5，158.6，157.9，155.6，148.9，148.7，137.1，137.0，136.8，136.7，136.0，131.8，131.1，128.6，128.5，128.4，128.3，128.1，127.9，127.8，127.6，127.5，127.4，127.3，127.2，127.1，122.5，119.9，114.6，114.3，113.5，100.9，94.6，93.7；HRMS(ESI)：C57H48O8Na(M+Na)的计算值为883.3244，实测值为883.3241。
(+)-(2R，3S)-5，7-双(苄氧基)-2-(4-苄氧基苯基)苯并二氢吡喃-3-基4-苄氧基苯甲酸酯(110)
按照102的制备操作，(2R，3S)-5，7-双(苄氧基)-2-(4-苄氧基苯基)苯并二氢吡喃-3-醇用4-苄氧基苯甲酸进行酯化，以86％的产率得到110。mp117-119℃；[α]D＝+24.5(c＝1.2，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ7.86(d，J＝8.8Hz，2H)，7.42-7.26(m，22H)，6.92(AB，J＝2.6Hz，4H)，6.29(AB，J＝1.9Hz，2H)，5.56-5.51(m，1H)，5.17(d，J＝6.5Hz，1H)，5.05(s，2H)，4.98(s，4H)，4.97(s，2H)，3.10(A of ABq，J＝16.8，5.4Hz，1H)，2.88(B of ABq，J＝16.8，6.6Hz，1H)；13C NMR(CDCl3，400MHz)：δ165.2，162.4，158.8，158.6，157.6，155.0，136.8，136.7，136.1，131.6，130.3，128.6，128.5，128.4，128.1，127.9，127.8，127.5，127.3，127.1，122.5，114.8，114.3，101.4，94.3，93.6，78.3，70.0，69.9，69.8，69.4，24.2；HRMS(ESI)：C50H42O7Na(M+Na)的计算值为777.2828，实测值为777.2840。
(-)-(2R，3R)-5，7-双(苄氧基)-2-(4-苄氧基苯基)苯并二氢吡喃-3-基4-苄氧基苯甲酸酯(111)
按照102的制备操作，(2R，3R)-5，7-双(苄氧基)-2-(4-苄氧基苯基)苯并二氢吡喃-3-醇用4-苄氧基苯甲酸进行酯化，以88％的产率得到111。mp 129-131℃；[α]D＝-51.8(c＝3.9，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ7.88(d，J＝8.8Hz，2H)，7.43-7.27(m，22H)，6.91(s，2H)，6.89(s，2H)，6.33(d，J＝2.0Hz，1H)，6.27(d，J＝2.0Hz，1 H)，5.62(bs，1H)，5.11(bs，1H)，5.05(s，2H)，5.01(s，2H)，4.98(s，4H)，3.09(d，J＝2.9Hz，2H)；13CNMR(CDCl3，400MHz)：δ165.3，162.4，158.6，1584，157.9，155.6，136.8，136.7，136.1，131.7，130.1，128.6，128.5，128.4，128.1，127.9，127.8，127.7，127.5，127.4，127.3，127.1，122.5，114.5，114.3，100.9，94.6，93.7，77.4，70.0，69.9，69.8，68.1，26.0；HRMS(ESI)：C50H42O7Na(M+Na)的计算值为777.2828，实测值为777.2815。
(+)-(2R，3S)-5，7-二羟基-2-(3，4-二羟基苯基)苯并二氢吡喃-3-基4-羟基苯甲酸酯(11)
在氢气氛下将Pd(OH)2/C(20％，100mg)加入至102(200mg，0.23mmol)在四氢呋喃/甲醇(1∶1，v/v，20mL)混和溶剂的溶液中。所得反应混合物在氢气下室温搅拌6小时，薄层层析显示反应已完成。反应混和物过滤除去催化剂。滤液蒸干，残留物用硅胶快速层析法(先10％甲醇/二氯甲烷，然后20％甲醇/二氯甲烷)迅速纯化，得到11(82mg，产率87％)：mp220-222℃(已分解)；[α]D＝+87.2(c＝2.0，EtOH)；1H NMR(丙酮-d6，400MHz)：δ7.98(d，J＝8.8Hz，2H)，7.13(s，1H)，7.04(d，J＝8.8Hz，2H)，6.99-6.96(m，2H)，6.27(d，J＝2.2Hz，1H)，6.19(d，J＝2.2Hz，1H)，5.62(dd，J＝11.8，6.3Hz，1H)，5.34(d，J＝6.3Hz)，3.15(A of ABq，J＝16.5，5.2Hz，1H)，3.00(B of ABq，J＝16.5，6.4Hz，1H)；13C NMR(丙酮-d6，400MHz)：δ163.3，160.0，155.2，154.5，153.6，143.1，129.9，128.7，119.6，116.6，113.4，113.3，111.8，111.7，96.7，93.8，93.0，76.2，67.9，21.9；HRMS(ESI)：C22H18O8Na(M+Na)的计算值为433.0899，实测值为433.0909。
(-)-(2R，3R)-5，7-二羟基-2-(3，4-二羟基苯基)苯并二氢吡喃-3-基4-羟基苯甲酸酯(12)
按照11的制备操作氢解104，得到产率为85％的12。mp241-243℃(已分解)；[α]D＝-145.2(c＝0.5，EtOH)，(文献值-144.4，c＝1，Me2CO)；4 1H NMR(丙酮-d6，400MHz)：δ7.89(d，J＝8.8Hz，2H)，7.19(d，J＝1.9Hz，1H)，7.01(A of ABq，J＝8.2，1.9Hz，1H)，6.97(d，J＝8.8Hz，2H)，6.89(B of AB，J＝8.2Hz，1H)，6.17(d，J＝2.3Hz，1H)，6.14(d，J＝2.3Hz，1H)，5.65(m，1H)，5.24(bs，1H)，3.19(A of ABq，J＝17.4，4.5Hz，1H)，3.07(B ofAB，J＝17.4，2.0Hz，1H)；13C NMR(丙酮-d6，400MHz)：δ164.8，161.6，156.8，156.4，156.0，144.6，144.5，131.5，130.3，121.4，118.0，114.9，114.6，113.8，97.8，95.4，94.7，76.9，68.5，25.5；HRMS(ESI)：C22H18O8Na(M+Na)的计算值为433.0899，实测值为433.0895。
(+)-(2R，3S)-5，7-二羟基-2-(4-羟基苯基)苯并二氢吡喃-3-基4-羟基苯甲酸酯(112)
按照11的制备操作氢解110，得到产率为90％的112。mp253-255℃(已分解)；[α]D＝+45.9(c＝3.5，EtOH)；1H NMR(丙酮-d6，400MHz)：δ7.74(d，J＝8.7Hz，2H)，7.26(d，J＝8.5Hz，2H)，6.81(d，J＝8.7Hz，2H)，6.769d，J＝8.5Hz，2H)，6.04(d，J＝2.2Hz，1H)，5.95(d，J＝2.2Hz，1H)，5.39(dd，J＝12.4，6.9Hz，1H)，5.11(d，J＝6.9Hz，1H)，3.21(A of ABq，J＝16.3，5.3Hz，1H)，2.98(B of ABq，J＝16.3，7.0Hz，1H)；13C NMR(丙酮-d6，400MHz)：δ163.7，160.6，156.0，155.9，155.1，154.3，130.4，128.3，126.8，120.1，113.9，97.3，94.4，93.5，77.0，68.5，23.0；HRMS(ESI)：C22H18O7Na(M+Na)的计算值为417.0950，实测值为417.0946。
(-)-(2R，3R)-5，7-二羟基-2-(4-羟基苯基)苯并二氢吡喃-3-基4-羟基苯甲酸酯(10)
按照11的制备操作，氢解111，得到产率为89％的10。mp214-216℃(已分解)；[α]D＝-116.1(c＝2.0，EtOH)；1H NMR(丙酮-d6，400MHz)：δ7.94(d，J＝8.6Hz，2H)，7.56(d，J＝8.6Hz，2H)，7.01(d，J＝6.8Hz，2H)，6.95(d，J＝6.8Hz，2H)，6.22(d，J＝2.2Hz，1H)，6.20(d，J＝2.2Hz，1H)，5.73(bs，1H)，5.37(bs，1H)，3.26(A of ABq，J＝17.4，4.5Hz，1H)，3.14(B ofABq，J＝17.4，2.2Hz，1H)；13C NMR(丙酮-d6，400MHz)：δ164.5，161.3，156.6，156.5，155.8，131.2，129.3，127.5，121.1，114.7，114.4，97.5，95.2，94.5，76.7，68.2，25.2；HRMS(ESI)：C22H18O7Na(M+Na)的计算值为417.0950，实测值为417.0946。
(+)-(2R，3S)-5，7-二羟基-2-(3，4-二羟基苯基)苯并二氢吡喃-3-基4-羟基苯甲酸酯五乙酸酯(22*)
在氮气氛下于0℃将乙酸酐(0.2ml)逐滴加入至(+)-(2R，3S)-5，7-二羟基-2-(3，4-二羟基苯基)苯并二氢吡喃-3-基4-羟基苯甲酸酯(11)(20mg，0.048mmol)的吡啶(1ml)溶液中。反应混合物室温搅拌过夜。真空蒸馏除去多余的吡啶。残留物用硅胶快速层析法(乙酸乙酯/正己烷＝1/1，v/v)纯化，得到22*(34mg，产率95％)。Mp：149-151℃；[α]D＝+42.5(c＝1.2，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ7.96(9d，J＝8.7Hz，2H)，7.31(AofABq，J＝8.4，1.8Hz，1H)，7.26(d，J＝1.8Hz，1H)，7.21(B of AB，J＝8.4Hz，1H)，7.15(d，J＝8.7Hz，2H)，6.70(d，J＝2.2Hz，1H)，6.63(d，J＝2.2Hz，1H)，5.51(dd，J＝11.2，6.0Hz，1H)，5.33(d，J＝6.0Hz，1H)，3.04(A of ABq，J＝16.8，5.0Hz，1H)，2.83(B of ABq，J＝16.8，6.0Hz，1H)，2.31(s，3H)，2.29(s，3H)，2.28(s，3H)，2.27(s，6H)；13C NMR(CDCl3，400MHz)：δ168.8，168.7，168.3，167.9，164.8，154.5，154.3，149.8，149.4，142.2，142.1，136.1，131.3，126.9，124.3，123.7，122.0，121.6，121.3，110.0，108.7，107.6，77.7，69.1，23.9，21.0，20.7，20.5；HRMS(ESI)：C32H28O13Na(M+Na)的计算值为643.1428，实测值为643.1437。
(-)-(2R，3R)-5，7-二羟基-2-(3，4-二羟基苯基)苯并二氢吡喃-3-基4-羟基苯甲酸酯五乙酸酯(23*)
按照22*的制备操作，将12乙酰化，得到产率为96％的23*。mp91-93℃；[α]D＝-26.5(c＝0.5，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ7.89(d，J＝8.7Hz，2H)，7.37(d，J＝1.9Hz，1H)，7.34(A of ABq，J＝8.4，1.9Hz，1H)，7.21(B of AB，J＝8.4Hz，1 H)，7.10(d，J＝8.7Hz，2H)，6.74(d，J＝2.2Hz，1H)，6.59(d，J＝2.2Hz，1H)，5.64(bs，1H)，5.22(bs，1H)，3.11(A of ABq，J＝18.0，4.5Hz，1H)，3.04(B of ABq，J＝18.0，2.4Hz，1H)，2.29(s，3H)，2.28(s，6H)，2.26(s，3H)，2.25(s，3H)；13C NMR(CDCl3，400MHz)：δ168.8，168.6，168.3，167.9，167.8，164.9，154.9，154.4，149.7，142.0，141.8，135.7，131.3，126.9，124.2，123.4，121.7，121.5，109.5，108.8，108.0，67.5，26.0，21.0，20.7，20.5；HRMS(ESI)：C32H28O13Na(M+Na)的计算值为643.1428，实测值为643.1420。
(+)-(2R，3S)-5，7-二羟基-2-(3，4-二羟基苯基)苯并二氢吡喃-3-基3，4，5-三羟基苯甲酸酯七乙酸酯(24*)
按照22*的制备操作，将(+)-(2R，3S)-5，7-二羟基-2-(3，4-二羟基苯基)苯并二氢吡喃-3-基3，4，5-三羟基苯甲酸酯(Sheng Biao Wan；Di Chen；Q.Ping Dou和Tak Hang Chan.Bioorganic & Medicinal Chemistry，2004，12，3521)乙酰化得到产率为95％的24*。mp 140-142℃；[α]D＝+35.3(c＝3.0，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ7.67(s，2H)，7.28-7.26(m，2H)，7.20(d，J＝8.3Hz，1H)，6.68(d，J＝2.2Hz，1H)，6.62(d，J＝2.2Hz，1H)，5.47(dd，J＝11.8，6.2Hz，1H)，5.27(d，J＝6.2Hz，1H)，3.02(A of ABq，J＝16.8，5.2Hz，1H)，2.81(B of ABq，J＝16.8，6.6Hz，1H)，2.29(m，9H)，2.27(s，3H)，2.26(s，3H)，2.25(s，6H)；13C NMR(CDCl3，400MHz)：δ168.8，168.2，167.8，167.5，166.2，163.3，154.2，149.8，149.3，143.3，142.1，138.9，135.7，127.5，124.2，123.7，122.2，121.6，109.9，108.8，107.6，77.5，69.7，24.0，21.0，20.7，20.5，20.0；HRMS(ESI)：C36H32O17Na(M+Na)的计算值为759.1537，实测值为759.1552。
(-)-(2R，3R)-5，7-二羟基-2-(3，4-二羟基苯基)苯并二氢吡喃-3-基3，4，5-三羟基苯甲酸酯七乙酸酯(25*)
按照22*的制备操作，将(-)-(2R，3R)-5，7-二羟基-2-(3，4-二羟基苯基)苯并二氢吡喃-3-基3，4，5-三羟基苯甲酸酯(Sheng Biao Wan；Di Chen；Q.Ping Dou和Tak Hang Chan.Bioorganic & Medicinal Chemistry，2004，12，3521)乙酰化得到产率为93％的25*。mp105-107℃；[α]D＝-14.5(c＝1.2，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ7.62(s，2H)，7.33(d，J＝1.2Hz，1H)，7.31(A of AB，J＝8.4Hz，1H)，7.20(B of AB，J＝8.4Hz，1H)，6.73(d，J＝2.0Hz，1H)，6.60(d，J＝2.0Hz，1H)，5.63(bs，1H)，5.20(bs，1H)，3.10(A ofABq，J＝18.0，4.5Hz，1H)，3.00(B of AB，J＝18.0，1H)，2.28-2.27(m，15H)，2.25(s，3H)，2.23(s，3H)；13C NMR(CDCl3，400MHz)：δ168.8，168.3，167.9，167.4，166.2，163.5，154.9，149.7，143.3，142.0，141.9，138.9，135.3，127.4，124.3，123.5，122.2，121.8，109.4，108.9，108.0，68.1，25.9，21.0，20.7，20.5，20.1；HRMS(ESI)：C36H32O17Na(M+Na)的计算值为759.1537，实测值为759.1571。
(+)-(2R，3S)-5，7-二羟基-2-(4-羟基苯基)苯并二氢吡喃-3-基4-羟基苯甲酸酯四乙酸酯(114)
按照22*的制备操作，将112乙酰化后得到产率为91％的114。mp 167-169℃；[α]D＝+3.2(c＝1.0，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ7.94(d，J＝8.7Hz，2H)，7.42(d，J＝8.5Hz，2H)，7.14(d，J＝8.7Hz，2H)，7.09(d，J＝8.5Hz，2H)，6.69(d，J＝2.2Hz，2H)，6.6 1(d，J＝2.2Hz，2H)，5.53(dd，J＝11.5，6.3Hz，1H)，5.31(d，J＝6.3Hz，2H)，3.01(A of ABq，J＝16.7，5.1Hz，1H)，2.81(B of ABq，J＝16.7，6.3Hz，1H)，2.30(s，3H)，2.28(s，3H)，2.27(s，3H)，2.25(s，3H)；13C NMR(CDCl3，400MHz)：δ169.1，168.8，168.7，168.3，164.7，154.6，154.5，150.7，149.8，149.4，134.8，131.2，127.5，127.0，121.8，121.6，110.2，108.6，107.6，78.1，69.1，24.1，21.0，20.7；HRMS(ESI)：C30H27O11(M+H)的计算值为563.1553，实测值为563.1567；C30H26O11Na(M+Na)的计算值为585.1373，实测值为585.1387。
(-)-(2R，3R)-5，7-二羟基-2-(4-羟基苯基)苯并二氢吡喃-3-基4-羟基苯甲酸酯四乙酸酯(21*)
按照22*的制备过程，将10乙酰化后得到产率为89％的21*。mp144-145℃；[α]D＝-30.7(c＝2.5，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ7.90(d，J＝8.7Hz，2H)，7.49(d，J＝8.5Hz，2H)，7.1 0(d，J＝8.5Hz，2H)，7.08(d，J＝8.7Hz，2H)，6.74(d，J＝2.2Hz，2H)，6.59(d，J＝2.2Hz，2H)，5.64(bs，1H)，5.22(s，1H)，3.12(A of ABq，J＝17.7，4.4Hz，1H)，3.02(B of ABq，J＝17.7，1.8Hz，1H)，2.28(s，6H)，2.27(s，3H)，2.25(s，3H)；13C NMR(CDCl3，400MHz)：δ169.1，168.9，168.7，168.4，164.8，155.2，154.4，150.5，149.7，134.5，131.2，127.4，126.9，121.6，109.7，108.7，108.0，67.7，26.2，21.0，20.7；HRMS(ESI)：C30H26O11Na(M+Na)的计算值为585.1373，实测值为585.1371。
(+)-(2R，3S)-5，7-二羟基-2-(4-羟基苯基)苯并二氢吡喃-3-基3，4，5-三羟基苯甲酸酯六乙酸酯(16*)
按照22*的制备操作，将(+)-(2R，3S)-5，7-二羟基-2-(4-羟基苯基)苯并二氢吡喃-3-基3，4，5-三羟基苯甲酸酯(Sheng Biao Wan；Tak HangChan.Tetrahedron，2004，60，8207)乙酰化得到产率为93％的16*。mp96-98℃；[α]D＝+17.7(c＝1.0，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ7.76(s，2H)，7.41(d，J＝8.5Hz，2H)，7.10(d，J＝8.5Hz，2H)，6.68(d，J＝2.2Hz，2H)，6.62(d，J＝2.2Hz，2H)，5.51(dd，J＝12.2，6.7Hz，1H)，5.26(d，J＝6.7Hz，1H)，3.02(A of ABq，J＝16.7，5.3Hz，1H)，2.81(B of ABq，J＝16.7，6.6Hz，1H)，2.30(s，6H)，2.29(s，3H)，2.28(s，3H)，2.27(s，6H)；13C NMR(CDCl3，400MHz)：δ169.1，168.8，168.3，167.5，166.2，163.3，154.5，150.7，149.9，149.4，143.4，138.9，134.5，127.5，122.2，121.8，110.1，108.7，107.7，78.0，69.8，24.3，21.0，20.7，20.5，20.1；HRMS(ESI)：C34H30O15Na(M+Na)的计算值为701.1482，实测值为701.1490。
(-)-(2R，3R)-5，7-二羟基-2-(4-羟基苯基)苯并二氢吡喃-3-基3，4，5-三羟基苯甲酸酯六乙酸酯(19*)
按照22*的制备操作，将(-)-(2R，3R)-5，7-二羟基-2-(4-羟基苯基)苯并二氢吡喃-3-基3，4，5-三羟基苯甲酸酯(Sheng Biao Wan；Tak HangChan.Tetrahedron，2004，60，8207)乙酰化得到产率为91％的19*。mp152-154℃；[α]D＝-35.5(c＝2.5，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ7.62(s，2H)，7.46(d，J＝8.5Hz，2H)，7.11(d，J＝8.5Hz，2H)，6.73(d，J＝2.1Hz，1H)，6.60(d，J＝2.1Hz，1H)，5.60(bs，1H)，5.21(s，1H)，3.10(A of ABq，J＝17.8，4.5Hz，1H)，3.00(B of ABq，J＝17.8，1.8Hz，1H)，2.28-2.26(m，18H)；13C NMR(CDCl3，400MHz)：δ169.1，168.8，168.3，167.4，166.2，163.5，155.1，150.6，149.7，143.3，138.8，134.2，127.5，127.4，122.2，121.7，109.5，108.8，108.0，77.2，68.3，26.0，21.0，20.7，20.5，20.1；HRMS(ESI)：C34H30O15Na(M+Na)的计算值为701.1482，实测值为701.1452。
(E)-3-[2，4-双(苄氧基)-6-羟基苯基]-1-苯基-丙烯(#a)
按照文献操作(Li，L.；Chan，T.H.Org.Lett.2001，5，739)，肉桂醇与3，5-二苄氧基苯酚反应产生为白色固体的(#a)(产率为62％)；mp76-78℃；1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ7.40-7.24(m，15H)，6.48(A ofAB，J＝15.9Hz，1H)，6.35(B of ABt，J＝15.9，5.5Hz，1H)，6.27(d，J＝2.1Hz，1H)，6.16(d，J＝2.1Hz，1H)，5.07(s，1H)，5.02(s，2H)，4.99(s，2H)，3.59-3.57(d，J＝5.5Hz，2H)；13C NMR(CDCl3，400MHz)：δ158.5，157.6，155.4，137.0，136.8，136.6，130.2，128.3，128.2，128.1，128.0，127.8，127.6，127.3，127.0，126.8，125.8，106.6，94.8，93.4，70.1，69.9，26.2；HRMS(ESI)：C29H26O3Na(M+Na)的计算值为445.1780，实测值为445.1793。
(+)-(1S，2S)-3-[2，4-双(苄氧基)-6-羟基苯基]-1-苯基丙烷-1，2-二醇((+)-#b)
按照文献操作(Li，L.；Chan，T.H.Org.Lett.2001，5，739)，但是以(#a)为原料，以AD-mix-α为二羟基化试剂，获得为白色固体的(+)-#b(产率47％)；mp 121-123℃；[α]D＝+4.7(c＝0.6，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ7.38-7.19(m，13H)，7.10(m，2H)，6.23(d，J＝2.3Hz，1H)，6.17(d，J＝2.3Hz，1H)，4.94(s，2H)，4.82(AB，J＝11.7Hz，2H)，4.47(d，J＝6.6Hz，1H)，3.97(m，1H)，2.88(A of ABt，J＝14.6，3.6Hz，1H)，2.72(b of ABt，J＝14.6，8.6Hz，1H)；13C NMR(CDCl3，400MHz)：δ158.8，157.6，157.0，140.0，136.6，136.5，128.3，128.2，128.1，128.0，127.7，127.4，127.3，126.8，126.5，105.9，95.6，93.2，76.6，69.8，69.7，26.2；HRMS(ESI)：C29H28O5Na(M+Na)的计算值为479.1834，实测值为479.1841。
(+)-(2S，2S)-顺式-5，7-双(苄氧基)-2-苯基苯并二氢吡喃-3-醇((+)-#c)
按照文献操作(Li，L.；Chan，T.H.Org.Lett.2001，5，739)，但是以(+)-#b为原料，获得为白色固体的(+)-#c(产率47％)；mp60-62℃；[α]D＝+0.9(c＝1.0，乙酸乙酯)；1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ7.49-7.30(m，15H)，6.29(d，J＝2.2Hz，1H)，6.27(d，J＝2.2Hz，1H)，5.02(bs，1H)，4.99(s，4H)，4.25(bs，1H)，3.03(A of ABt，J＝17.2，1.4Hz，1H)，2.96(B of ABt，J＝17.2，4.2Hz，1H)；13C NMR(CDCl3，400MHz)：δ158.7，158.2，155.2，138.1，136.9，136.8，128.5，128.4，128.0，127.9，127.8，127.4，127.1，126.2，100.9，94.6，94.0，78.6，70.0，69.8，66.2，28.2；HRMS(ESI)：C29H26O4Na(M+Na)的计算值为461.1729，实测值为461.1741。
(+)-(2S，2S)-5，7-二羟基-2-苯基苯并二氢吡喃-3-基3，4，5-三羟基苯甲酸酯((+)-15)
按照文献操作(Li，L.；Chan，T.H.Org.Lett.2001，5，739)，但是以(+)-#c为原料，得到化合物(+)-15(产率90％)；mp 258-260℃(已分解)；[α]D＝+13.9(c＝3.5，乙醇)；1H NMR(丙酮-d6，400MHz)：δ7.73-7.71(m，2H)，7.49-7.45(m，2H)，7.41-7.38(m，1H)，7.17(s，2H)，6.24(d，J＝2.2Hz，1H)，6.23(d，J＝2.2Hz，1H)，5.76(bs，1H)，5.44(bs，1H)，3.27(A of ABt，J＝17.4，4.5Hz，1H)，3.14(B of ABt，J＝17.4，1.4Hz，1H)；13C NMR(丙酮-d6，400MHz)：δ164.7，156.6，156.3，155.7，144.7，138.5，137.6，127.6，127.3，126.3，120.4，108.7，97.7，95.4，94.6，77.0，68.1，25.3；HRMS(ESI)：C22H18O8Na(M+Na)的计算值为433.0899，实测值为433.0904。
2-苄基-3，5-双(苄氧基)苯酚(#d)
在0℃将乙硫醇(10g，216mmol)逐滴加入至氢化钠(分散于矿物油中的60％分散体，2.4g，100mmol)在干燥DMF(120ml)的搅拌悬浮液中。1小时后，分10次加入1，3，5-三苄氧基苯(24g，60mmol)，并将混合物加热至150℃保持1.5小时。待反应冷却后，加入500mL水，混合物用乙酸乙酯萃取。合并的有机层用硫酸镁干燥，蒸干。残留物经硅胶快速层析法(苯)纯化，用四氯化碳重结晶后得到为白色固体的3，5-二苄氧基苯酚(11％)，用乙酸乙酯和己烷重结晶后得到为白色固体的产物#d(56％)。化合物#d鉴定如下：mp107-109℃；1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ7.36-7.23(m，15H)，6.25(d，J＝2.2Hz，1H)，6.07(d，J＝2.2Hz，1H)，4.96(s，2H)，4.92(s，2H)，3.99(s，2H)；13C NMR(CDCl3，400MHz)：δ158.4，157.9，154.9，140.7，136.7，136.6，128.4，128.2，128.1，127.8，127.5，127.3，127.0，125.6，108.5，94.7，93.3，70.2，69.9，28.3；HRMS(ESI)：C27H24O3Na(M+Na)的计算值为419.1623，实测值为419.1645。
(E)-3-[2，4-双(苄氧基)-5-苄基-6-羟基苯基]-1-[3，4-双(苄氧基)苯基]-丙烯(#e)
在室温下于氮气氛中将25％H2SO4/SiO2(1.6g，4mmol)一次加入至2-苄基-3，5-双(苄氧基)苯酚(3.96g，10mmol)和(E)-3，4-双(苄氧基)肉桂醇(3.46g，10mmol)在干燥CH2Cl2(80mL)的搅拌混合物中。所得混合物室温搅拌过夜。过滤，蒸干之后，残留物用硅胶柱层析(乙酸乙酯/正己烷＝1/7，v/v)纯化，用乙酸乙酯和正己烷重结晶，得到白色固体(3.4g，产率46.0％)：mp93-95℃；1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ7.41-7.22(m，30H)，6.92(s，1H)，6.79(s，1H)，6.78(d，J＝4.0Hz，1H)，6.35(A of AB，J＝15.8，1H)，6.26(s，1H)，6.13-6.07(B of ABt，J＝15.8，5.0Hz，1H)，5.08(s，2H)，5.07(s，2H)，4.99(s，4H)，4.02(s，2H)，3.55(d，J＝5.0Hz，2H)；13C NMR(CDCl3，400MHz)：δ156.1，155.6，154.0，148.9，148.2，141.1，137.2，137.1，131.0，130.1，128.5，128.4，128.2，127.8，127.7，127.6，127.3，127.2，127.1，126.5，125.7，119.7，114.9，112.4，109.6，107.3，91.4，71.1，70.5，70.3，28.8，26.6；HRMS(ESI)：C50H44O5Na(M+Na)的计算为747.3086，实测值为747.3096。
(-)-(1R，2R)-3-[2，4-双(苄氧基)-5-苄基-6-羟基-苯基]-1-[3，4-双(苄氧基)苯基]丙-1，2-二醇((-)-#f)
丙烯(#e)(3.4g，4.6mmol)用干燥DMF(30mL)溶解，向该溶液中连续加入咪唑(1.03g，15.2mmol)和TBSC1(1.2g，7.8mmol)。所得混合物室温搅拌3天，然后加入饱和碳酸钠溶液淬灭反应。混合物用乙酸乙酯萃取。合并有机层，用硫酸镁干燥，蒸干。残留物用硅胶快速层析法(正己烷/乙酸乙酯＝9/1，v/v)纯化，得到[3，5-双(苄氧基)-6-苄基-2-[3-[3，4-双(苄氧基)苯基]烯丙基]苯氧基]-叔丁基二甲基硅烷。该物质未经进一步纯化直接用于下一步。
将AD-mix-β(13.0g)和甲磺酰胺(0.87g)溶解在叔丁醇(50mL)和水(50mL)的混合溶剂中。所得混合物室温搅拌5分钟，然后将混合物冷却至0℃，并加入[3，5-双(苄氧基)-6-苄基-2-[3-[3，4-双(苄氧基)苯基]-烯丙基]苯氧基]-叔丁基二甲基硅烷的二氯甲烷(50mL)溶液。混合物搅拌过夜后，每24小时时间间隔加入两次以上AD-mix-β(每次13.0g)和甲磺酰胺(每次0.87g)。再次于0℃搅拌24小时后，薄层层析显示反应已完成。然后加入10％Na2S2O3溶液淬灭反应。混合物用乙酸乙酯萃取。合并有机相，用硫酸镁干燥，蒸干。残留物用硅胶快速层析法(正己烷/乙酸乙酯＝4/1，v/v)纯化，得到[3，5-双(苄氧基)-6-苄基-2-[3-[3，4-双(苄氧基)苯基]-1，2-二羟基-丙基]苯氧基]-叔丁基二甲基硅烷。所得化合物溶解于四氢呋喃(75mL)中，加入TBAF(10mL，1M在四氢呋喃中的溶液)。所得混合物室温搅拌4小时，加入饱和碳酸氢钠溶液。混合物用乙酸乙酯萃取，合并有机层，用硫酸镁干燥，蒸干。残留物用硅胶快速层析法(乙酸乙酯/己烷＝1/2，v/v)纯化，然后用乙酸乙酯和己烷重结晶后得到白色固体(2.4g，产率67％)(-)-#f：mp157-159℃；[α]D＝-5.5(c＝1.1，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ7.41-7.09(m，25H)，6.91(d，J＝1.6Hz，1H)，6.77(m，2H)，6.17(s，1H)，5.06(s，4H)，4.98(s，2H)，4.82(AB，J＝11.9Hz，2H)，4.42(d，J＝6.6Hz，1H)，4.05(s，2H)，3.91(b，1H)，2.93(A ofABt，J＝14.5，3.2Hz，1H)，2.72(B of ABt，J＝14.5，8.5Hz，1H)；13C NMR(CDCl3，400MHz)：δ156.4，155.6，155.3，148.9，148.8，142.1，137.2，137.1，137.0，133.5，128.6，128.5，128.4，128.0，127.8，127.7，127.6，127.3，127.2，127.1，126.7，125.3，119.9，114.5，113.6，112.1，111.2，106.7，90.9，77.2，76.7，71.1，70.9，70.3，70.2，29.1，26.8；HRMS(ESI)：C50H46O7Na(M+Na)的计算值为781.3141，实测值为781.3110。
(-)-(2S，3R)-反式-5，7-双(苄氧基)-8-苄基-2-[3，4-双(苄氧基)苯基]苯并二氢吡喃-3-醇((-)-#g)
向(-)-#f(2.4g，3.1mmol)的1，2-二氯乙烷(50mL)悬浮液中加入原甲酸三乙酯(1mL)，随后加入PPTS(450mg，1.8mmol)。混合物室温搅拌20分钟至固体溶解。然后将混合物加热至55℃ 5小时至薄层层析显示反应已完成。蒸干溶剂后，残留物溶解于DME(30mL)和甲醇(30mL)，加入碳酸钾(450mg)。混合物室温搅拌过夜。蒸干溶剂后，残留物用硅胶快速层析法(乙酸乙酯/己烷＝1/3，v/v)纯化，得到目的产物为白色固体(1.8g，产率77％)：mp 145-146℃；[α]D＝-20.1(c＝1.3，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ7.42-7.15(m，25H)，6.93(d，J＝1.6Hz，1H)，6.88(A ofAB，J＝8.3Hz，1H)，6.82(B of ABt，J＝8.3，1.6Hz，1H)，6.24(s，1H)，5.13(s，2H)，5.02(s，2H)，5.00(s，2H)，4.98(s，2H)，4.63(d，J＝8.1Hz，1H)，4.04(AB，J＝14.2Hz，2H)，3.86(m，1H)，3.10(A of ABt，J＝5.6，16.4Hz，1H)，2.67(B ofABt，J＝9.0，16.4Hz，1H)；13C NMR(CDCl3，400MHz)：δ155.8，155.5，152.9，148.9，148.8，142.2，137.2，137.1，137.0，136.9，131.2，128.7，128.5，128.4，128.3，127.9，127.8，127.7，127.4，127.2，127.1，127.0，125.2，120.2，114.5，113.2，110.2，102.4，91.1，81.2，71.1，70.9，70.4，69.9，68.2，28.6，27.6；HRMS(ESI)：C50H44O6Na(M+Na)的计算值为763.3036，实测值为763.3032。
(+)-(2R)-5，7-双(苄氧基)-8-苄基-2-[3，4-双(苄氧基)-苯基]苯并二氢吡喃-3-酮((-)-#h)
在氮气氛下将戴斯-马丁试剂(Dess-Martin periodinane)(6.3mL，15％g/mL在CH2Cl2中的溶液，2.2mmol)一次加入至(-)-#g(900mg，1.2mmol)的CH2Cl2(30mL)搅拌溶液中。混合物室温搅拌约2小时至薄层层析显示原料消失。随后加入饱和碳酸氢钠溶液(15mL)和10％Na2S2O3水溶液(15mL)淬灭反应。分离有机层，水层用二氯甲烷萃取。合并有机相，用硫酸镁干燥，并蒸干。残留物用硅胶快速层析法(苯)纯化，然后在CHCl3和醚中重结晶得到目的化合物(770mg，86％)：mp143-145℃；[α]D＝-17.1(c＝1.1，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ7.43-7.07(m，25H)，6.89(s，1H)，6.84(AB，J＝8.5Hz，2H)，6.33(s，1H)，5.13-5.04(m，6H)，5.02(s，1H)，4.99(s，2H)，4.05(AB，J＝14.2Hz，2H)，3.67(AB，J＝20.8Hz，2H)；13C NMR(CDCl3，400MHz)：δ205.8，156.5，154.8，152.5，149.0，148.7，141.7，137.1，136.9，136.8，136.5，128.6，128.5，128.4，128.1，128.0，127.8，127.7，127.3，127.1，125.4，120.0，114.5，113.2，111.9，102.4，92.6，82.9，71.0，70.5，70.2，34.0，28.8；HRMS(ESI)：C50H42O6Na(M+Na)的计算值为761.2879，实测值为761.2843。
(+)-(2S，3S)-顺式-5，7-双(苄氧基)-8-苄基-2-[3，4-双(苄氧基)苯基]苯并二氢吡喃-3-醇((+)-#i)
在氮气氛下将酮(-)-#h(700mg，0.95mmol)溶解在干燥四氢呋喃(15mL)中，冷却该溶液至-78℃。然后逐滴加入L-selectride(1.5mL，1M在四氢呋喃中的溶液，1.5mmol)。所得溶液在-78℃搅拌8小时。当薄层层析显示反应完成，加入饱和碳酸氢钠水溶液(10mL)淬灭反应。分离有机层，水层用乙酸乙酯萃取。合并的有机相用硫酸镁干燥，蒸干。残留物用硅胶快速层析法(5％乙酸乙酯/苯)纯化，然后用乙醇和乙酸乙酯重结晶，得到目的产物(630mg，90％)为白色固体：mp129-131℃；[α]D＝+5.3(c＝1.2，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ7.44-7.07(m，25H)，7.05(s，1H)，6.93(AB，J＝8.4Hz，2H)，6.26(s，1H)，5.15(s，2H)，5.02(s，2H)，5.00(s，4H)，4.92(bs，1H)，4.20(bs，1H)，4.10(AB，J＝14.5Hz，2H)，3.07(A of AB，J＝17.2Hz，1H)，2.92(B of ABt，J＝17.2，4.2Hz，1H)；13CNMR(CDCl3，400MHz)：δ156.2，155.9，152.8，148.9，148.5，142.1，137.2，137.1，137.0，131.6，128.5，128.4，128.0，127.8，127.7，127.4，127.2，125.2，118.9，114.9，112.9，110.2，101.1，91.4，78.0，71.2，71.0，70.5，70.0，66.1，28.6，28.2；HRMS(ESI)：C50H44O6Na(M+Na)的计算值为763.3036，实测值为763.3024。
(+)-(2S，3S)-5，7-双(苄氧基)-8-苄基-2-[3，4-双(苄氧基)-苯基]苯并二氢吡喃-3-基3，4，5-三(苄氧基)-苯甲酸酯((+)-#j)
在氮气氛下，3，4，5-三(苄氧基)苯甲酸(170mg，0.39mmol)的溶液与草酰氯(1mL)的干燥二氯甲烷(10mL)溶液和一滴DMF一起回流3小时。蒸馏除去多余的草酰氯和溶剂，残留物真空干燥3小时，溶解于二氯甲烷(2mL)中。在0℃将该溶液逐滴加入至(+)-#i(150mg，0.20mmol)和DMAP(75mg，0.62mmol)的二氯甲烷(15mL)溶液中。混合物室温搅拌过夜，然后加入饱和碳酸氢钠水溶液。分离有机层，水层用二氯甲烷萃取。合并有机相，用硫酸镁干燥，蒸干。残留物用硅胶快速层析法(5％乙酸乙酯/苯)纯化，得到目的化合物(215mg，91％)。在CHCl3和醚中重结晶，得到白色粉末：mp52-54℃；[α]D＝+37.5(c＝1.0，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ7.39-7.10(m，42H)，6.99(t，J＝7.4Hz，1H)，6.93(AB，J＝8.3Hz，2H)，6.31(s，1H)，5.65(bs，1H)，5.13(bs，1H)，5.07(s，2H)，5.02(s，4H)，5.00(s，2H)，4.92(s，4H)，4.83(AB，J＝11.8Hz，2H)，4.11(s，1H)，3.15(bs，1H)；13C NMR(CDCl3，400MHz)：δ165.2，156.0，155.9，153.2，152.3，148.8，148.6，142.6，142.2，137.4，137.2，137.0，136.5，131.4，128.7，128.6，128.5，128.4，128.2，128.0，127.9，127.7，127.3，127.2，125.4，125.1，119.4，114.6，113.2，110.3，109.2，101.0，91.2，75.1，71.1，70.5，70.0，68.6，28.7，26.2；HRMS(ESI)：C78H66O10Na(M+Na)的计算值为1185.4554，实测值为1185.4542。
(-)-(2S，3R)-5，7-双(苄氧基)-8-苄基-2-[3，4-双(苄氧基)-苯基]苯并二氢吡喃-3-基3，4，5-三(苄氧基)-苯甲酸酯((-)-#k)
按照用于制备(-)-#j的操作，但以(-)-#g为原料，得到为白色固体的(-)-(2S，3R)-5，7-双(苄氧基)-8-苄基-2-[3，4-双(苄氧基)苯基]-苯并二氢吡喃-3-基3，4，5-三(苄氧基)苯甲酸酯(产率90％)：mp103-105℃；[α]D＝-9.8(c＝1.3，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ7.37-7.11(m，42H)，6.90(s，1H)，6.77(m，2H)，6.27(s，1H)，5.42(m，1H)，5.18(d，J＝6.3Hz，1H)，5.06(s，4H)，5.05-4.99(m，4H)，4.97(s，4H)，4.88(s，2H)，4.12(AB，J＝14.1Hz，2H)，3.01(a of ABt，J＝16.8，5.0Hz，1H)，2.89(B of ABt，J＝16.8，6.4Hz，1H)；13C NMR(CDCl3，400MHz)：δ156.0，155.9，155.4，152.5，152.3，148.8，148.6，142.3，142.1，137.3，137.1，137.0，136.9，136.5，131.3，128.7，128.5，128.4，128.3，128.1，128.0，127.9，127.8，127.7，127.5，127.3，127.2，127.1，125.3，124.9，114.6，112.8，110.2，108.9，101.5，91.0，78.0，75.0，71.2，71.1，71.0，70.4，70.0，69.9，28.6，24.0；HRMS(ESI)：C78H66O10Na(M+Na)的计算值为1185.4554，实测值为1185.4573。
(+)-(2S，3S)-5，7-二羟基-8-苄基-2-[3，4-二羟基-苯基]苯并二氢吡喃-3-基3，4，5-三羟基苯甲酸酯((+)-#1)
在氢气氛下将Pd(OH)2/C(20％，400mg)加至(+)-#j(200mg，0.17mmol)在四氢呋喃/甲醇(1∶1v/v，20ml)混合溶剂的溶液中。反应混合物在氢气下室温搅拌6小时至薄层层析显示反应已完成。反应混合物过滤除去催化剂。滤液蒸干，残留物迅速用硅胶快速层析法(先10％甲醇/二氯甲烷，后20％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到(+)-8-苄基儿茶素没食子酸酯((+)-#1)(82mg，产率90％)：mp 243-245℃(已分解)；[α]D＝+123(c＝1.8，丙酮)；1H NMR(丙酮-d6，400MHz)：δ7.53(d，J＝7.4Hz，2H)，7.42(t，J＝7.6Hz，2H)，7.26-7.21(m，4H)，7.04(AB，J＝8.2Hz，2H)，6.31(s，1H)，5.75(bs，1H)，5.32(bs，1H)，4.22(AB，J＝14.3Hz，2H)，3.29(a of ABt，J＝17.4，4.4Hz，1H)，3.17(b of AB，J＝17.4Hz，1H)；13C NMR(丙酮-d6，400MHz)：δ165.2，154.2，154.1，153.6，144.9，144.6，144.3，142.6，137.9，130.6，128.4，127.8，125.0，120.9，118.1，114.7，113.7，109.1，106.7，98.0，95.3，77.1，68.3，25.9；HRMS(ESI)：C29H24O10Na(M+Na)的计算值为555.1267，实测值为555.1279。
(-)-(2S，3R)-5，7-二羟基-8-苄基-2-[3，4-二羟基-苯基]苯并二氢吡喃-3-基3，4，5-三羟基苯甲酸酯((-)-16)
按照制备(+)-#1的操作，但以(-)-#k为原料，得到(-)-8-苄基儿茶素没食子酸酯((-)-16)(产率91％)：mp239-241℃(已分解)；[α]D＝-35(c＝2.0，丙酮)；1H NMR(丙酮-d6，400MHz)：δ7.44(d，J＝7.1Hz，2H)，7.33(t，J＝7.5Hz，2H)，7.23(s，2H)，7.21(t，J＝7.3Hz，1H)，6.92-6.86(m，2H)，6.34(s，1H)，5.56(m，1H)，5.35(d，J＝6.2Hz，1H)，4.17(AB，J＝14.3Hz，2H)，3.12(Aof ABt，J＝16.5，5.2Hz，1H)，2.98(b of ABt，J＝16.5，6.2Hz，1H)；13C NMR(丙酮-d6，400MHz)：δ165.0，154.1，153.7，152.8，144.9，144.7，144.6，142.2，137.8，130.2，128.3，127.5，124.8，120.5，117.9，114.8，113.2，108.8，106.2，98.2，95.1，77.7，69.4，23.5；HRMS(ESI)：C29H24O10Na的计算值为555.1267，实测值为555.1285。
(-)-EGCG和1的稳定性试验
(-)-EGCG或1(0.1mM)与RPMI1640培养基一起在37℃孵育。于不同时间点取培养基15μL注入装有C-18反相柱(CAPCELL PAK C18UG 120，Shiseido Co.，Ltd.，4.6mm内径×250mm)的高效液相色谱仪中；流速为1ml/min；在UV 280nm处检测；对于(-)-EGCG，取样时间点为0，10，20，40，60，90，120分钟，流动相为20％乙腈水溶液和0.01％TFA；对于前药1，取样时间点为0，30，60，90，120分钟，流动相为50％乙腈水溶液和0.01％TFA。
1的酶水解
将裂解缓冲液(PH5)(0.25 mL)加至2×106 Jurkat T细胞中。这可以使Jurkat T细胞的细胞膜破裂，从而释放出胞质酶。加入PBS(0.75mL)中和培养基至酶最适宜的pH值(pH7)。将前药1(0.25mM)加入反应混合物中，于37℃孵育。在不同时间点(0，30，60，90，120，150，180，210，240，300和360分钟)取定量(0.06mL)反应混合物，过滤，注入高效液相色谱仪，按上述条件分析。
在含维生素C的培养基中，有或无溶菌液(lysate)时1的水解
化合物1(35μM)在DMEM培养基(dulbecco′s modified eaglemedium)(1mL，含1.67mg/mL维生素C)中于37℃孵育。在不同时间点取溶液10μL注入装有C-18反相柱的HPLC中；流速为1mL/min；在UV 280nm处检测；流动相为：0-8分钟(20％乙腈水溶液和0.016％TFA)，8-13分钟(从含0.016％TFA的20％乙腈水溶液变至含0.008％TFA的60％乙腈水溶液)。
为研究溶菌液存在下1的水解，将相同浓度的1与DMEM(2mL，含1.67mg/mL维生素C)在溶菌液(5×105乳腺癌细胞和0.15mL裂解缓冲液)存在下进行孵育。在不同时间点取定量(0.06mL)反应混合物，过滤，注入高效液相色谱仪，按上述条件分析。
细胞培养
人Jurkat T细胞和LNCaP细胞在添有10％(v/v)胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI培养基中培养。非转化的自然杀伤细胞(YT系)在含10％(v/v)胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，1mM MEM丙酮酸钠和0.1mM MEM非必需氨基酸溶液的RPMI培养基中生长。人乳腺癌MCF-7细胞，正常(WI-38)和猴病毒转化(VA-13)人成纤维细胞在添有10％(v/v)胎牛血清，100U/ml青霉素，100pg/ml链霉素的DMEM培养基(dulbecco′s modified eagle medium)中生长。所有细胞培养保持在37℃的5％二氧化碳气氛中。
细胞提取物的制备和蛋白质印迹分析
所有细胞提取物均以先前描述的方法制备(An B，Goldfarb RH，Siman R，Dou QP.Novel dipeptidyl proteasome inhibitors overcomeBc1-2 protective function and selectively accumulate the cyclin-dependentkinase inhibitor p27 and induce apoptosis in transformed，but not normal，human fibroblasts.cell Death Differ 1998；5：1062-75)。Bax，IKBa，p27，PAW和泛素化蛋白表达的分析用单克隆或多克隆抗体按照先前报道的方案(An B等)完成。
(-)-EGCG或合成茶多酚对纯化的20s蛋白酶体活性的抑制作用
将0.5μg纯化的兔20s蛋白酶体在40μM荧光肽底物Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC中，加入或不加入各种浓度的天然和合成茶多酚进行孵育，按照先前描述的方法(Nam S等)进行20s蛋白酶体的糜蛋白酶样活性的测定。
天然/合成茶多酚对完整细胞蛋白酶体活性的抑制作用
VA-13或WI-38细胞在24孔板(2ml/孔)中生长至70-80％覆盖度(confluency)，然后用25pM(-)-EGCG，2，或2a处理24小时。随后加入40pM Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC底物于37℃培养2.5小时，照上述方法测定糜蛋白酶样活性。或者，将细胞用25μM的各个化合物处理4或24小时，将细胞收获并裂解。然后将Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC(40μM)与制备好的细胞裂解液一起孵育2.5小时，照上述方法测定糜蛋白酶样活性。
与FITC结合的抗裂解PARP抗体对凋亡细胞的免疫染色
凋亡细胞的免疫染色通过加入识别裂解的聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的FITC结合多克隆抗体来完成，并在Axiovert 25(Zeiss；Thornwood，纽约)显微镜上观察。细胞在60mm皿中生长至约80％覆盖度(confluency)。然后VA-13细胞用VP-16，2或2a(25μM)处理24小时。处理之后，收集悬浮和贴壁细胞，在pH 7.4的PBS中洗涤两次。在下列所有步骤之间均需洗涤细胞，并且所有洗涤均为PBS洗涤1分钟。然后将细胞固定在冰冷的70％乙醇中，在0.1％Triton-X-100中使细胞透化，并在室温下于1％牛血清白蛋白(BSA)中阻断30分钟。在4℃于暗处以FITC结合的p85/PARP第一抗体轻摇孵育30分钟。随后将细胞悬浮液转移至有Vector Shield封片剂和DAPI的载玻片上。用AxioVision 4.1捕捉图像，并用Adobe Photoshop 6.0软件调整。通过计算凋亡细胞数占同一区域内总细胞数的比来对细胞死亡进行定量。数据为两次重复试验的平均值±SD。
台盼蓝染色分析
用台盼蓝染色分析确定以所指天然和合成多酚处理过的Jurkat T细胞中的死亡细胞。细胞凋亡形态学用相差显微镜依照先前描述的方法评价(Kazi A，Hill R，Long TE，Kuhn DJ，Twos E，Dou QP.NovelN-thiolated beta-lactam antibiotics selectively induce apoptosis in humantumor and transformed，but not normal or nontransformed，cells.BiochemPharmacol 2004；67：365-74；Kuhn DJ，Smith DM，Pross S，Whiteside TL，Dou QP.Overexpression of interleukin-2 receptor alpha in a humansquamous cell carcinoma of the head and neck cell line is associated withincreased proliferation，drug resistance，and transforming ability.J CellBiochem 2003；89：824-36)。
MTT分析法
用MTT确定茶多酚对肿瘤细胞全面增殖的影响。人乳腺MCF-7细胞铺板于96孔板中，生长至70-80％覆盖度，然后加入类似物培养24小时。随后将MTT(1mg/ml)的PBS溶液加入孔内，在37℃孵育4小时，以使代谢旺盛的细胞完全裂解四唑盐。接着，去除MTT，加入100μL DMSO，用多标记微孔板测读仪在560nm处进行比色分析(Victor3；Perkin Elmer)。标示的吸收值为三次重复试验的平均值。
软琼脂分析
在(-)-EGCG或保护的茶类似物(25 pM)或DMSO(对照)存在下，将LNCaP细胞(2×104)铺板于6孔板上的软琼脂中，照先前描述的方法确定细胞转化活性(Kazi A等)。
核染色
用各药品处理之后，所有漂浮和贴壁VA-13和WI-38细胞都用Hoechst 33342染色以评价细胞凋亡。简单地说，细胞在PBS中洗涤2次，在4℃用70％乙醇固定1小时，在PBS中洗涤3次，在暗处于室温下用50pM Hoechst染色30分钟。漂浮细胞铺于载玻片上，贴壁细胞在板上用荧光显微镜(Zeiss，德国)在10倍或40倍分辨率下观察。Digital Scientific用AxioVision 4.1获得图像并用Adobe Photoshop 6.0进行调整。
合成茶多酚对Caspase-3活性的诱导
细胞用各化合物25μM处理4或24小时，然后收获并裂解。将Ac-DEVD-AMC(40μM)加入至细胞裂解液中2.5小时，测定Caspase-3活性。
实验结果
(-)-EGCG过乙酸酯(1)的化学稳定性和酶水解
对比了1和(-)-EGCG在培养基(RMPI)中的稳定性，该培养基模拟体液，pH值在8左右。将0.1mM(-)-EGCG或1在1mL RMPI中于37℃孵育至指示的时间。在不同时间点用HPLC分析培养基中剩余试验化合物的量。降解曲线见图2。
当(-)-EGCG在培养基中溶解后，其在20分钟内迅速降解，表明了(-)-EGCG在培养基中稳定性差。尽管1也在培养基中降解，但如图2所示，与(-)-EGCG相比，其降解速率慢得多。1在2个小时后才完全消失，表明它在该培养基中比(-)-EGCG稳定6倍。因此，过乙酸酯化保护(-)-EGCG的酚基有助于使1在培养(接近生理)条件下稳定。
为了确定1是否在培养基条件下分解为EGCG，重复实验但这次加入维生素C(1.67mg/mL)以阻止生成的EGCG的迅速降解。当1消失时，HPLC观察到一个新的峰A随着时间变化其强度先增加后降低。然后出现另一个HPLC峰B，其同样最终消失了。最后，检测到与EGCG保留时间相同的HPLC峰形成。这些组份的时程结果见图3。EGCG的鉴定由UV光谱和质谱确认。另外，对峰A和B的质谱分析表明，A和B分别为EGCG的二乙酸酯和单乙酸酯。这些结果提示化合物1在培养基条件下首先分解为二乙酸酯，然后分解为单乙酸酯，最后分解为EGCG。
在细胞条件下从化合物1生成(-)-EGCG可以由加入维生素C阻止(-)-EGCG快速消失来更清楚地证明。在这种情况下，发明人在含有乳腺癌细胞裂解液的培养基中进行实验。HPLC分析显示了1的消失伴随着A(二乙酸酯)，B(单乙酸酯)，然后是(-)-EGCG的瞬间生成，其时程结果(图4)与图3相似。因此相信，在加有细胞裂解液的培养基中，化合物1历经水解而先形成EGCG二乙酸酯，然后形成EGCG单乙酸酯，接着形成EGCG，最后形成没食子酸(流程图1)。
1和(-)-EGCG在体内和体外对蛋白酶体活性的抑制作用
如果1有(-)-EGCG前药的作用，那么它应该保持无生物活性直至在细胞内去乙酰化，在该细胞内它被转化为其母体化合物。为证实这一假设，以1或(-)-EGCG(作为阳性对照)测定体外和完整Jurkat T细胞中的蛋白酶体活性。首先，将1和购买的(-)-EGCG溶解在DMSO中，测定它们对纯化的20S蛋白酶体的糜蛋白酶样活性的影响。10μM的1在抑制纯化的20S蛋白酶体的糜蛋白酶样活性方面完全没有作用(图5)。与此相反，10μM的(-)-EGCG抑制了80-90％的蛋白酶体糜蛋白酶样活性。因此，象预计的那样，1在细胞系统外不是蛋白酶体抑制剂。
如果1在细胞内转化成(-)-EGCG，则应该能检测到体内的蛋白酶体抑制作用。为考察这种可能性，将人Jurkat细胞用25μM的1或(-)-EGCG处理12或24小时，然后用糜蛋白酶样特异荧光底物测定完整细胞内的蛋白酶体活性(图6a)，或者用泛素化蛋白的蛋白质印迹法进行测定(图6b)。用(-)-EGCG处理Jurkat T细胞24小时后，蛋白酶体活性的抑制率为31％，与此相对，用1处理时的抑制率为42％(图6a)。为了分析胞内多泛素化蛋白的水平，细胞在孵育12小时后被裂解并进行蛋白质印迹分析。1显示出与天然(-)-EGCG可比的泛素化蛋白水平(图6b)。因此，1在抑制完整细胞内的蛋白酶体活性方面强度与(-)-EGCG相同，甚至更强。另一方面，虽然1比EGCG稳定6倍，但其在细胞内的生物活性强度并没有增加到类似的程度。这可能是因为由1产生的EGCG的量及其在细胞内的生物活性依赖于多个因素的组合：1对细胞的相对渗透性，酯酶的量和任何时候都存在于细胞内的抗氧化剂的量。
1和(-)-EGCG对Jurkat细胞内Akt的去磷酸化作用
5，10和25μM的(-)-EGCG和1与Jurkat T细胞一起孵育24小时，然后用磷酸化Akt的特异抗体进行蛋白质印迹分析(图7)。光密度分析结果表明，25μM的(-)-EGCG能降低32％的p-Akt水平，与之相比，用25μM的1处理后能减少73％的活化Akt(图7)。以肌动蛋白作为负载对照。
1和(-)-EGCG诱导的细胞死亡
同样在经10μM(-)-EGCG和1处理24小时的Jurkat T细胞内评价(-)-EGCG和1诱导细胞死亡的能力。(-)-EGCG对细胞死亡的作用极小(5％)，而同样浓度的1能诱导高至15％的细胞死亡(图8)。因此，1抑制细胞蛋白酶体活性(图6)和使Akt失活(图7)的较强能力与其诱导细胞死亡活性的增加有关(图8)。
乙酰化合成茶多酚不抑制纯化的20S蛋白酶体活性
将高至25μM的所有被保护和未被保护化合物与纯化的20S蛋白酶体以及糜蛋白酶活性荧光底物一起孵育30分钟。然后测定半数最大抑制浓度或IC50。(-)-EGCG显示出最强的抑制作用，其IC50为0.2μM，其次是2(IC50约9.9μM)。化合物3或4的IC50值为14-15μM。相比之下，被保护的类似物活性低得多：25μM时的抑制率＜35％。这与上述结果一致。
被保护的茶类似物在完整肿瘤细胞内表现出更强的蛋白酶体抑制能力
为确定合成的茶类似物在体内对蛋白酶体有何作用，将Jurkat细胞用25μM的各合成化合物处理4或24小时，以(-)-EGCG为对照(图9A和9B)。处理4小时后，蛋白质印迹分析显示，乙酸酯保护的类似物诱导了更大量的泛素化蛋白(图9A，第5，7和9道)，表明蛋白酶体活性被阻止。根据上述数据，以1为对照，显示过乙酸酯保护的(-)-EGCG比天然(-)-EGCG更强效(图9A，第3道对第2道)。另外，对被认为是两种蛋白酶体靶物的Bax和IκBα的蛋白质印迹分析显示这些蛋白质消失并出现了一个更高分子量的带，其被推测为蛋白质的多泛素化形式(图9A，3，5，7和9道)。然而，在处理24小时后，(-)-EGCG及其未被保护的类似物表现出更大量的泛素化蛋白(图9B，2，4，6和8道)。这与被保护的类似物在较早时间点时为蛋白酶体有效抑制剂，在处理24小时之后，泛素化蛋白被去泛素酶耗尽的想法是一致的。在经被保护的类似物2a，3a和4a处理的Jurkat细胞中还发现了另一种蛋白酶体靶物p27的聚集(图9B，第9，5，7道)。在经2a，3a和4a处理的细胞中仍然发现了被推定为泛素化IκBα的带(图9B，第9，5，7道)。经过24小时处理后，被推定为泛素化IκBα的带的缺乏可能是由于去泛素化作用(图9B)。本实验采用肌动蛋白作为负载对照。
被保护的类似物诱导更大量白血病细胞死亡
用一对类似物4和4a进行的动力学实验显示，经过多酚处理8小时后，未被保护的类似物4以最高表达量诱导了泛素化蛋白的聚集(图9C)。相反地，被保护的4a早在2小时时就表现出增加的泛素化蛋白聚集，并持续至8小时(图9C)。为确定乙酸酯保护的类似物在其他癌细胞系统中是否为有效蛋白酶体抑制剂，以DMSO为对照，将前列腺癌LNCaP细胞用25μM的(-)-EGCG，1，2a或3a处理24小时。结果的确检测到了泛素结合蛋白，并且在经2a和3a处理的细胞中泛素结合蛋白的增加量最大(图9D)。
被保护的类似物是更有效的细胞凋亡诱导剂
已证实蛋白酶体抑制作用可诱导多种癌细胞凋亡，而不诱导正常非转化细胞凋亡(An B等)。将Jurkat T细胞用各选定的多酚及其受保护的类似物25μM处理24小时，以研究其诱导凋亡性细胞死亡的能力。台盼蓝掺入实验显示，2a，3a和4a，而不是其它的化合物，分别诱导了99％，57％和83％的Jurkat细胞死亡(图10A)。同样地，蛋白质印迹分析显示，只有2a，3a和4a在24小时后诱导了凋亡特异性的PARP裂解(图10B)。仅检测PARP裂解片断(p85；绿色)的免疫荧光染色结果显示，SV40转化的VA-13细胞对2a诱导的凋亡高度敏感，其经2a处理24小时后凋亡细胞达73％(图10C和10D)。未被保护的2诱导的细胞凋亡较少(21％)，而用作阳性对照的25μM的VP-1 6诱导了92％的细胞凋亡(图10C和10D)。凋亡细胞内，与DNA的A-T富集区小沟结合的DAPI复染急剧减少(图10C)，这与细胞凋亡后期的DNA片段是一致的。
被保护的多酚对肿瘤细胞增殖的抑制作用
处理过的乳腺癌(MCF-7)细胞接着用5或25μM过乙酸酯保护的类似物处理24小时，然后进行MTT分析以确定其对细胞增殖的影响。化合物1在25μM时抑制40％的细胞增殖(图11A)。被保护的化合物2a，3a和4a在5μM和25μM时导致的抑制率分别为50％和70％(图11A)。
将人前列腺癌LNCaP细胞分别用选定的、被保护的茶多酚类似物1，2a，3a和4a各25μM处理24小时，然后确定细胞凋亡形态学的变化。被保护的类似物2a，3a和4a又一次导致了戏剧性的聚拢、脱落和细胞破裂(图11B)。1引发了轻微的形态学变化，而用(-)-EGCG处理则导致了细胞变大，变平，表明细胞生长停滞。
用软琼脂分析来确定肿瘤细胞的转化活性。集落形成的消失与GI期阻滞和/或细胞凋亡有关。将LNCaP细胞加入至6孔板的软琼脂中，然后在最初铺板时用25μM的(-)EGCG或被保护的类似物处理一次(图11C)。21天后评价集落形成。与用DMSO处理的对照组相比，用(-)EGCG处理的细胞显示集落形成明显减少(图11C和11D)。被保护的多酚也抑制了肿瘤细胞的转化活性，其中2a和4a是最有效的集落形成抑制剂(图11D)。
被保护的类似物对肿瘤细胞凋亡的优先诱导
诱导肿瘤细胞凋亡而不诱导正常细胞凋亡的能力是新型抗癌药物的重要评估标准。为确定被保护的化合物是否也影响正常细胞，将VA-13和WI-38细胞用25μM的(-)-EGCG，2或2a处理24小时，测定蛋白酶体活性，核形态学变化和细胞脱落。结果发现VA-13细胞内的蛋白酶体糜蛋白酶样活性的降低程度与正常WI-38细胞内的不同(图12A)。用(-)-EGCG和2处理VA-13细胞，其蛋白酶体活性下降了42-48％，而2a则抑制了92％的蛋白酶体活性。相反地，用所有三种多酚处理的WI-38细胞的蛋白酶体活性均仅下降了5％。
接下来检查经天然(-)-EGCG，2和2a处理后的凋亡细胞核形态学(图12B)。(-)-EGCG和2表现出少量或无细胞凋亡，2a则显著地诱导了SV-40转化VA-13细胞的凋亡。与之相反，用所有化合物处理的正常WI-38成纤维细胞均没有凋亡，并且仅可见极少量脱落。接着用所有被保护的类似物各25μM处理24小时进行对比实验。36小时后，(-)-EGCG引发了VA-13细胞凋亡(图12C)。所有被保护的类似物均诱导了转化VA-13细胞的凋亡，但对正常WI-38细胞无作用(图12B和12C)。同样地，用(-)-EGCG和2a处理白血病(Jurkat T)细胞和正常非转化自然杀伤(YT)细胞时，经PAW裂解证明，仅Jurkat细胞发生了细胞凋亡(图12D)。
新型合成茶多酚类似物对纯化的20S蛋白酶体的活性抑制作用
绿茶多酚(-)-EGCG包括带有3个-OH基的B环(图1)，对纯化的20S蛋白酶体的IC50值是0.3μM(表1)。
表1合成茶多酚对蛋白酶体活性的抑制作用1，2
| 未保护的 | IC50(μM) | 被保护的 | IC50(μM) |
| (-)-EGCG | 0.30？0.02 | ||
| No 16 | 0.59？0.17 | No 24* | n.a.3 |
| No 6 | 2.69？1.07 | NO 19* | n.a.3 |
| No 15 | 4.56？1.20 | ||
| No 12 | 5.99？0.13 | NO 23* | n.a.3 |
| No 11 | 7.70？0.14 | N0 22* | n.a.3 |
| No 10 | 8.51？0.47 | No 21* | n.a.3 |
1对纯化的20S蛋白酶体的抑制作用通过糜蛋白酶样特异荧光底物
(Suc-Leu-Leu-Val—Tyr-AMC)评价。20S蛋白酶体与多酚一起孵育2小时。
2实验结果获自3次独立的重复实验。
3.n.a.表示25μM时对纯化的20S蛋白酶体的抑制活性＜20％。
从(-)-EGCG的B环上去掉-OH后生成的(-)-ECG具有下降的体外蛋白酶体抑制效力(0.58μM)。为了进一步考察B环上-OH基的去除对蛋白酶体抑制作用和诱导细胞死亡能力的影响，发明人合成了几个新的B环上-OH基减少的EGCG类似物，及其推定的前药、过乙酸酯保护的对应物。用纯化的20S蛋白酶体和糜蛋白酶样荧光底物确定了下列未被保护的多酚类似物的蛋白酶体抑制作用：
| 化合物 | IC50(μM) | 参考文献 |
| (-)-EGCG | 0.30 | 本文 |
| (-)-ECG，8 | 0.58 | 参考文献a |
| (+)-CG，7 | 0.73 | 参考文献a |
| (-)-EZG，6 | 2.69 | 本文 |
| (+)-ZG，#m | 4.56 | 本文 |
| #n | 0.84 | 本文 |
| #o | 1.22 | 本文 |
| 15 | 4.56 | 本文 |
| (+)-ECG | 0.73 | 参考文献a |
| #1 | 0.39 | 本文 |
| (-)-CG | 0.75 | 参考文献a |
| 16 | 0.59 | 本文 |
表2天然和合成茶多酚对20S原核蛋白酶体活性的影响
参考文献a是：Smith，D.M.；Daniel，K.G.；Wang，Z.；Guida，W.C.；Chan，T.H.；Dou，Q.P.Proteins：Structure，Function，andBioinformatics，2004，54，58。
结果观察到，蛋白酶体抑制活性与B环和D环上-OH基数目之间存在良好的关联。当-OH逐个从B环上去除，其IC50值逐步增加，观察到的效力顺序为：(-)-EGCG(IC50 0.30μM)＞(-)-ECG(0.58μM)＞6(2.69μM)＞#m(4.56μM)(图13和表1)。与此一致地，在D环上含一个-OH的一系列化合物12，11(12的差向异构体)和10(图13)中，B环上有两个-OH基的12和11比B环上只有一个-OH基的10作用更强(分别是5.99，7.70和8.51μM，表1)。
另外SAR分析也显示，当更多-OH基从D环上去掉时，其抑制作用强度比仅去除B环上-OH时进一步降低。例如，6比10作用更强(2.69μM对8.51μM)，(-)-ECG和(-)-CG比No 12作用更强(0.58μM和0.75μM，对5.99μM)。最后，发明人纳入化合物16以探讨A环的疏水作用。实际上，化合物16比其对应物(-)-CG活性更强(0.59μM对0.75μM；图13，表1和2)。
作为对比，同时确定了被保护的多酚类似物对纯化的蛋白酶体的抑制活性。和预期的一样，与其未被保护的类似物相比，过乙酸酯保护的类似物(标示以*)不是纯化的20S蛋白酶体糜蛋白酶样活性的强效抑制剂，这可能是由于缺少转化所需的细胞酯酶。所有被保护的类似物在25μM时均抑制了纯化的20S蛋白酶体的＜20％活性。
合成茶多酚对细胞蛋白酶体活性的抑制作用
为确定未被保护和被保护的多酚类似物是否能抑制完整细胞的蛋白酶体活性，将白血病Jurkat T细胞用25μM的各化合物处理4和24小时，然后收集细胞团，测定制备好的细胞裂解液中的蛋白酶体糜蛋白酶样活性。未被保护的化合物显示出对完整Jurkat T细胞有限的蛋白酶体抑制作用，尽管10和15表现为中等强度(图14)。这些数据提示，大多数甚至所有未被保护的化合物与(-)-EGCG相似，在细胞环境下仅有中等活性，这可能是由于它们在细胞内的不稳定性。
重要的是，经过24小时的处理后，所有试验的过酰氧基保护的、尤其是过乙酸酯保护的多酚均为比其未被保护的对应物更有效的蛋白酶体糜蛋白酶样活性抑制剂(图14)。尤其是19*，其在处理24小时后抑制了97％的糜蛋白酶样活性，而其未被保护的多酚对应物6仅抑制了30％的糜蛋白酶样活性。
促凋亡蛋白Bax和周期依赖性激酶抑制剂p27是天然的蛋白酶体靶物。如果过乙酸酯保护的多酚抑制完整细胞的蛋白酶体活性，则预期在这些细胞中能观测到Bax和p27的聚积。为了试验这一设想，将Jurkat T细胞用被保护和未被保护的化合物进行处理，细胞裂解液用Bax和p27的特异性抗体采用蛋白质印迹法进行分析(图15)。处理4小时后，过乙酸酯保护的类似物24*和19*，而不是其它未被保护的类似物，能增加Bax(分别为3倍和2.5倍)和p27(分别为6倍和11倍)的聚积(图15A)。处理24小时后，所有以过乙酸酯保护的化合物处理过的细胞中Bax水平均增加(24*，19*，21*和23*分别为13倍，12倍，40倍和36倍)。然而，24小时后的p27增加主要在经21*(2倍)和23*(2倍)处理的细胞中观察到。另外，作为蛋白酶体抑制作用指示剂的泛素化蛋白的水平，在用被保护的化合物22*处理4小时后有了显著增加，而用其相应未被保护的化合物11处理后无显著增加(图15C)。这些数据与这些化合物的蛋白酶体抑制活性的特性是一致的(图14)。这就暗示了，被保护的类似物能在培养的肿瘤细胞内转化为活性蛋白酶体抑制剂。
合成茶多酚类似物对凋亡性细胞死亡的诱导
先前已证实蛋白酶体抑制作用与诱导细胞凋亡有关。为确定B环/D环保护的类似物是否能诱导细胞死亡，将Jurkat T细胞先用25μM的所有被保护和未被保护类似物处理24小时，然后进行台盼蓝排除分析(图16)。处理4小时后观察到所有用被保护和未被保护类似物处理的细胞均发生了细胞形态学变化(细胞萎缩和特征性的凋亡性泡状化)，并且这些变化在用被保护化合物处理24小时后大大增加(数据未列出)。另外，过乙酸酯保护的类似物在孵育4小时后导致了细胞死亡增加5到10倍，到24小时时增加高至20倍(图16)。相对之下，未被保护的多酚引起的细胞死亡少得多，即便经过24小时的处理，也只增加了3到5倍(图16)。
为了确定观察到的细胞死亡(图16)是否是因为诱导了细胞凋亡，在Jurkat T细胞中进行了相同的实验，然后测定Caspase-3活化和PARP裂解。过乙酸酯保护的多酚诱导了最高水平的Caspase-3活性(图17A)：用24*处理4小时导致了约16倍的增加，而未被保护的16仅导致了4倍的增加。此外，用被保护的19*处理使Caspase-3的活性提高了16倍，而其未被保护的对应物6作用弱得多(4倍)。与此相一致，在经24*和19*处理的细胞中检测到了PARP裂解，但在经其未被保护的对应物16和6处理的细胞中则未发现(图17B)。而且，被保护的化合物22*能在处理细胞4小时后导致细胞PARP裂解，而其未被保护的对应物11则不能(图17C)。
过乙酸酯保护的(-)-EGCG类似物对肿瘤细胞凋亡的优先诱导
诱导肿瘤细胞凋亡而不诱导正常细胞凋亡是抗癌药物的一个重要方面。为确定过乙酸酯保护的类似物是否影响正常细胞，发明人用看起来最有效的过乙酸酯保护的类似物19*处理白血病Jurkat T细胞和非转化永生化自然杀伤(YT)细胞。白血病Jurkat T细胞中的蛋白酶体靶蛋白Bax，p27(数据未列出)和IκB-α(图18)的水平再一次增加。然而，这些蛋白的水平在非转化永生化自然杀伤(YT)细胞中没有增加。另外，泛素化蛋白水平在Jurkat T细胞中以剂量依赖性方式聚集。相比之下，泛素化蛋白水平在YT细胞中仅检测到轻微而短暂的增加。与选择性抑制蛋白酶体活性一致的是，仅在Jurkat T中发现了凋亡特异性PARP裂解，在YT细胞中则没有。因此，有效的过乙酸酯保护的多酚显然没有诱导非转化YT细胞的蛋白酶体抑制及随后的细胞凋亡。
讨论
绿茶中的天然(-)-EGCG被转化成其过乙酸酯化合物1。另外，合成了多个没食子酸酯环上缺失羟基的(-)-EGCG合成类似物。此外，羟基被转化为乙酸酯基以生成前药，该前药可以在细胞内通过酯酶裂解转化为其母体药物。令人惊讶的是，被保护的类似物是比其未被保护的对应物更有效的完整肿瘤细胞蛋白酶体抑制剂。与此相一致地，在白血病(Jurkat)，实体瘤和转化细胞系中试验时，被保护的类似物同样是比其未被保护的对应物更有效的细胞凋亡诱导剂。对被保护类似物的SAR分析表明其活性强度的顺序如下：2a＝4a＞3a＞1＞(-)-EGCG。
设计和合成了(-)-EGCG的被保护类似物。出乎意料的是，这些化合物在体内表现出蛋白酶体抑制活性。
过酰氧基，尤其是过乙酸酯保护的类似物同样是比其未被保护的羟基化对应物更有效的蛋白酶体抑制剂。已有观点认为，是蛋白酶体糜蛋白酶样亚基(β5)的N端Thr对(-)-EGCG的酯键碳发起的亲核攻击引起了β5亚基的不可逆酰化，从而抑制了其蛋白酶活性(Nam S，SmithDM and Dou QP：J Biol Chem 276：13322-13330，2001)。但是，过乙酸酯部分的加入降低了酯键碳的亲电子特性，从而导致了对纯化的20S蛋白酶体的抑制作用大大降低。不出人意料的是，本文中测定的被保护多酚同样对纯化的20S蛋白酶体糜蛋白酶样活性表现出有限的抑制作用(表1)。
揭示了B环上的-OH基数和蛋白酶体抑制活性之间的关系(表2)。未被保护类似物的IC50值随着-OH基的逐个去除而逐步增加(表1)。尽管16含有一个在(-)-CG的A环C8碳上没有的额外的苯环，但其蛋白酶体抑制作用强度与(-)-CG相比有轻微增加(0.59μM对0.75μM)。
发现的另一个重要的SAR是，进一步从D环上去除-OH可导致体外蛋白酶体抑制作用强度进一步降低(表1)。
如图14所示，过乙酸酯保护的多酚是比未被保护的多酚更有效的蛋白酶体糜蛋白酶样活性抑制剂。24小时时细胞蛋白酶体糜蛋白酶样活性的降低证明，过乙酸酯保护的类似物表现出较长时间的稳定性。相比之下，未被保护的类似物在24小时的处理后则丧失了稳定性。类似物19*在24小时后抑制了97％的细胞蛋白酶体糜蛋白酶样活性，而其未被保护的对应物6仅抑制了30％的活性。与其它被保护和未被保护的化合物对相比，22*显示出比其对应物11在糜蛋白酶抑制作用强度方面相对小的增加，这表明22*可能在细胞内转化成了母体药物。尽管机理还不是完全清楚，但其它过乙酸酯保护的绿茶类似物似乎在细胞环境中被转化成为显著有效的化合物。
在合成茶多酚的蛋白酶体抑制作用之后还对多个蛋白酶体靶蛋白进行了评价(图15)。实验数据提供了另一个证据，证明过乙酸酯保护的类似物需要细胞环境和/或细胞提取物环境来转化为有效的蛋白酶体抑制剂，这表现为Bax，p27和泛素化蛋白的聚积。在与体外模型相对的细胞模型中，被保护类似物比其未被保护对应物更能有效地聚积靶蛋白。相对之下，未被保护类似物没有表现出与被保护类似物相同程度的靶蛋白聚积作用，这可能是-OH基上质子给出和随后降解的结果。实验数据进一步说明，过乙酸酯保护的类似物在体内转化为新的化合物并起到前药的作用。
台盼蓝分析证明，主要由被保护的类似物处理后，诱导了细胞死亡和特征性细胞凋亡形态学变化的发生(图16)。被保护类似物在24小时时再一次表现出比未被保护类似物更强的稳定性(其细胞死亡数高于总数的50％)。Caspase-3活性证明，在用被保护化合物孵育4小时后发生细胞凋亡，Caspase-3活性与对照相比增加高至16倍(图17)。对PARP裂解的蛋白质印迹分析进一步表明，PARP裂解在用被保护类似物如19*，24*和22*处理4小时后发生。最重要的是，过乙酸酯保护的(-)-EGCG类似物19*优先诱导Jurkat T细胞凋亡，而非转化YT细胞仍然不怎么受影响(图18)，这一点暗示了将被保护类似物开发成新型抗癌剂的潜力。
总之，流行病学研究已指出绿茶消费品的抗癌益处。已经显示在癌症的病理状态中存在蛋白酶体的作用(Ciechanover A：Embo J 17：7151-7160，1998)，绿茶多酚作为蛋白酶体抑制剂可能是一些癌症可行的治疗物质。目前的研究进一步指出，含有过乙酸酯保护的-OH基的合成绿茶多酚是有效的蛋白酶体抑制剂，并且进一步研究这些化合物可阐明这种形式治疗剂的其它益处。
本发明提供了多种至少与(-)-EGCG同样有效的(-)-EGCG衍生物。(-)-EGCG的羧酸酯保护形式及其衍生物比其可用作蛋白酶体抑制剂以减少肿瘤细胞生长的未被保护的形式更稳定。此外，从1，2，3，4，19*，21*，22*和23*的结构可以看出，(-)-EGCG的没食子酸酯环上的一些羟基可能对作用强度不重要。
虽然通过实施例详细描述了本发明的优选实施方案，但是很明显，本领域技术人员可以对本发明进行修改和调整。而且，本发明的实施方案不应被理解为仅限于实施例或附图。应该明确的是，那些修改和调整均在下列权利要求书中所述的本发明的范围内。例如，举例说明或描述的作为一个实施方案的一部分的特征可以用于另一个实施方案以产生又一个实施方案。因此，本发明意欲保护那些属于本权利要求及其等同体范围内的修改和变化。
Claims (23)
1.一种抑制蛋白酶体的下式化合物：
其中，
● R11、R12、R13、R21、R22、R2、R3和R4均各自独立地选自-H和C1-C10酰氧基；以及
● R5选自-H、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C3-C7环烷基、苯基、苯甲基和C3-C7环烯基，同时，最后提到的7个基团中的每一个都可用1到6个卤素原子的任意组合取代；
● R11、R12、R13、R21、R22、R2、R3和R4中至少有一个是C1-C10酰氧基；以及
● R11、R12、R13、R21、R22、R2、R3和R4中至少有一个是-H。
2.权利要求1的化合物，其中R11、R2和R4各自均为-H，并且R12、R13、R21、R22和R3各自均为乙酸酯基团。
3.权利要求1的化合物，其中R11、R2和R4各自均为-H，并且R12、R13、R21、R22和R3各自均为苯甲酸酯基团。
4.权利要求1的化合物，其中R11是-H，并且R12、R13、R21、R22、R2、R3和R4各自均为乙酸酯基团。
5.权利要求1的化合物，其中R11是-H，并且R12、R13、R21、R22、R2、R3和R4各自均为苯甲酸酯基团。
6.权利要求1的化合物，其中R11、R13、R2和R4各自均为-H，并且R12、R21、R22和R3各自均为乙酸酯基团。
7.权利要求1的化合物，其中R11、R13、R2和R4各自均为-H，并且R12、R21、R22和R3各自均为苯甲酸酯基团。
8.权利要求1的化合物，其中R11和R13各自均为-H，并且R12、R21、R22、R2、R3和R4各自均为乙酸酯基团。
9.权利要求1的化合物，其中R11和R13各自均为-H，并且R12、R21、R22、R2、R3和R4各自均为苯甲酸酯基团。
10.权利要求1的化合物，其中R11、R12和R13各自均为-H，并且R21、R22、R2、R3和R4各自均为乙酸酯基团。
11.权利要求1的化合物，其中R11、R12和R13各自均为-H，并且R21、R22、R2、R3和R4各自均为苯甲酸酯基团。
12.权利要求1的化合物，其中R5是-H，并且R11、R12、R13、R21和R22各自均为乙酸酯基团。
13.权利要求12的化合物，其中R2是乙酸酯基团，并且R3和R4各自均为-H。
14.权利要求12的化合物，其中R3是乙酸酯基团，并且R2和R4各自均为-H。
15.权利要求12的化合物，其中R2和R4各自均为乙酸酯基团，并且R3是-H。
16.减少肿瘤细胞生长的方法，包括施用有效量的下式化合物的步骤：
其中，
● R11、R12、R13、R21、R22、R2、R3和R4均各自独立地选自-H和C1-C10酰氧基；以及
● R5选自-H、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基、C2-C10-炔基、C3-C7-环烷基、苯基、苯甲基和C3-C7-环烯基，同时，最后提到的7个基团中的每一个都可用1到6个卤素原子的任意组合取代；以及
● R11、R12、R13、R21、R22、R2、R3和R4中至少有一个是C1-C10酰氧基。
17.下式化合物在制造减少肿瘤细胞生长的药物中的应用：
其中，
● R11、R12、R13、R21、R22、R2、R3和R4均各自独立地选自-H和C1-C10酰氧基；以及
● R5选自-H、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基、C2-C10-炔基、C3-C7-环烷基、苯基、苯甲基和C3-C7-环烯基，同时，最后提到的7个基团中的每一个都可用1到6个卤素原子的任意组合取代；以及
● R11、R12、R13、R21、R22、R2、R3和R4中至少有一个是C1-C10酰氧基。
18.抑制蛋白酶体的下式化合物：
其中，
● R1是-H；
● R2、R3和R4均各自独立地选自-H和-OH；以及
● R2、R3和R4中至少有一个是-H。
19.权利要求18的化合物，其中R2是-OH，并且R3和R4各自均为-H。
20.权利要求18的化合物，其中R3是-OH，并且R2和R4各自均为-H。
21.权利要求18的化合物，其中R2和R4各自均为-OH，并且R3是-H。
22.减少肿瘤细胞生长的方法，包括施用有效量的下式化合物的步骤：
其中，
● R1是-H；
● R2、R3和R4均各自独立地选自-H和-OH；以及
● 如果R2＝R3＝R4，则R2不是-OH。
23.下式化合物在制造减少肿瘤细胞生长的药物中的应用：
其中，
● R1是-H；
● R2、R3和R4均各自独立地选自-H和-OH；以及
● 如果R2＝R3＝R4，则 R2不是-OH。
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