CN102480952A - 抗菌剂 - Google Patents

抗菌剂 Download PDF

Info

Publication number
CN102480952A
CN102480952A CN2010800339129A CN201080033912A CN102480952A CN 102480952 A CN102480952 A CN 102480952A CN 2010800339129 A CN2010800339129 A CN 2010800339129A CN 201080033912 A CN201080033912 A CN 201080033912A CN 102480952 A CN102480952 A CN 102480952A
Authority
CN
China
Prior art keywords
acyl group
egcg
antibacterial agent
derivative
described antibacterial
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2010800339129A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102480952B (zh
Inventor
开发邦宏
松本佳巳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Osaka University NUC
Original Assignee
Osaka University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Osaka University NUC filed Critical Osaka University NUC
Publication of CN102480952A publication Critical patent/CN102480952A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102480952B publication Critical patent/CN102480952B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A61K31/353—3,4-Dihydrobenzopyrans, e.g. chroman, catechin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/02—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • A01N43/04—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom
    • A01N43/14—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom six-membered rings
    • A01N43/16—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom six-membered rings with oxygen as the ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

本发明提供一种安全性和抗菌性优异的表儿茶素没食子酸酯衍生物(EGCG衍生物)。使用下述化学式(1)表示的表儿茶素没食子酸酯衍生物、或者其异构体或它的盐作为抗菌剂。下述式中，R1-R6分别为氢原子、卤素、钠、钾或直链或者支链状的饱和或者不饱和酰基，可以相同，也可以不同，所述酰基也可以被1个或多个取代基取代，所述R1-R6的至少一个为所述酰基，R7-R16分别为氢原子、卤素、钠或钾，可以相同，也可以不同。[化1]
Figure DDA0000133179480000011

Description

抗菌剂
技术领域
本发明涉及一种抗菌剂。
背景技术
表儿茶素没食子酸酯(以下称为EGCG)是从茶叶中抽出的儿茶素类的一种，作为具有抗菌效果的有用的天然物质而被关注(非专利文献1-7)。特别是，EGCG来自天然物质，因而显示出优异的安全性，期待其作为抗菌剂的实用化。
但是，在实用化时，期望EGCG的抗菌效果进一步提高。
现有技术文献
非专利文献1：户田真佐子等、日本细菌学杂志、45(2)563，1990
非专利文献2：Zhao W-H.，et al.，Antimicrob，AgentsChemother.Vol.46：p.588-560，2002年
非专利文献3：Zhao W-H.，et al.，Antimicrob，AgentsChemother.Vol.45：p.1737-1742，2001年
非专利文献4：Yanagawa Y.，et al.，Curr.Microbiol.Vol.47：p.244-249，2003年
非专利文献5：Hatano T.，et al.，Phytochemistry，Vol.69，p.3111-3116，2008年
非专利文献6：K.Kida，et al.，J.Agric.Food Chem.Vol.48，p.4151-4155，2000年
非专利文献7：T.Tanaka，et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.Vol.8，p.1801-1806，1998年
发明内容
发明要解决的问题
于是，本发明的目的在于提供安全性以及抗菌性优异的新的EGCG衍生物。
解决问题的手段
为达到所述目的，本发明的抗菌剂的特征在于，包含下述化学式(1)表示的表儿茶素没食子酸酯(EGCG)的衍生物、或者其异构体或它们的盐，
[化1]
Figure BDA0000133179460000021
在所述化学式(1)中，R1-R6分别为氢原子、卤素、钠、钾或直链或者支链状的饱和或者不饱和酰基，可以相同，也可以不同，所述酰基也可以进一步被1个或多个取代基取代，所述R1-R6中的至少一个为所述酰基，R7-R16分别为氢原子、卤素、钠或钾，可以相同，也可以不同。
发明的效果
若采用本发明，可以优异的稳定性和抗菌性阻碍菌感染。
附图说明
图1是表示本发明的实施例1中，EGCG衍生物对MRSA的抗菌效果的图表。
图2是表示本发明的所述实施例1中，EGCG衍生物的抗菌效果的图表。
图3是表示在本发明的实施例4中，EGCG衍生物对细胞膜的破坏性的图表。
图4是表示在本发明的实施例7中，EGCG衍生物的代谢稳定性的图表。
具体实施方式
在本发明中，“抗菌”是指抑制细菌增殖，例如，可以是杀菌带来的增殖抑制，也可以抑菌带来的增殖抑制。
本发明的抗菌剂，如前所述，其特征在于，包含下述化学式(1)中表示的表儿茶素没食子酸酯的衍生物、或者其异构体或它们的盐：
[化2]
Figure BDA0000133179460000031
在所述化学式(1)中，
R1-R6分别为氢原子、卤素、钠、钾或直链或者支链状饱和或者不饱和酰基，可以相同，也可以不同，所述酰基也可以进而由1个或多个取代基取代，所述R1-R6中的至少一个为所述酰基，R7-R16分别为氢原子、卤素、钠或钾，可以相同也可以不同。钠或钾也可以是其他一价金属或碱金属。
在所述化学式(1)中，A、B、C和D是EGCG中各环的标记。在本发明中，以下，表儿茶素没食子酸酯称为“EGCG”，EGCG的衍生物称为“EGCG衍生物”。
在本发明中，EGCG衍生物也包括，例如所述化学式(1)所表示的化合物、它的盐、互变异构体、立体异构体、光学异构体、几何异构体等异构体、异构体混合物。所述盐并无特别限制，例如可以列举无机酸盐、有机酸盐、无机碱盐、有机碱盐、酸性或碱性氨基酸盐等。所述异构体，例如可以用各种色谱法等现有公知的分离方法来纯化。另外，在本发明中，所述EGCG衍生物例如也包含所述化学式(1)表示的化合物受到氧化、还原、水解、化合等代谢而生成的化合物。
在R1-R6中，所述酰基的主链长无特别限制，例如，包含羰基碳在内，原子数为2-20，优选原子数为4-20，更优选原子数为8-18，进一步优选原子数为12-16。所述酰基的主链长是指例如在酰基中最长链的原子数，除了碳原子之外，还可以包含氮原子、硫原子、磷原子、氧原子、硼原子、卤素原子等。另外，在本发明的抗菌剂中，所述EGCG衍生物的基本骨架EGCG，例如是茶等所包含的儿茶素，熟知其安全性优异，另外，R1-R6的酰基安全性也优异。因此，本发明的抗菌剂，例如可以称为安全性也优异的药剂。
在R1-R6中，所述酰基的碳原子数无特别限制，例如，包含羰基碳在内，碳原子数为2-20，优选碳原子数为4-20，更优选碳原子数为8-18，进而优选碳原子数为12-16。另外，所述碳原子数例如优选4、8、12、16、18或20，更优选8、12、16、18或20，进而优选16、18或20，特别优选16或18。所述酰基进一步用所述取代基取代时，所述碳原子数，例如优选为不包括所述取代基中的碳原子数的数目。所述不饱和酰基，例如可以是顺式也可以是反式。
所述酰基无特别限制，例如，可以列举甲酰基(C1)、乙酰基(C2)、丙酰基(C3)、丁酰基(C4)、异丁酰基(C4)、戊酰基(C5)、异戊酰基(C5)、三甲基乙酰基(C5)、己酰基(C6)、辛酰基(C8)、香叶酰基(geranoyl)(3，7-二甲基辛-2，6-二烯酰基)(C10)、反式-8-甲基-6-壬烯酰基(C10)、十一烷酰基(C11)、月桂酰基(十二烷酰基)(C12)、十三烷酰基(C13)、12-(二甲氨基)月桂酰基(12-(二甲氨基)十二烷酰基)(C14)、法呢酰基(farnesoyl)(3，7，11-三甲基十二烷-2，6，10-三烯酰基(C15)、棕榈酰基(十六烷酰基)(C16)、棕榈油酰基(C16)、十七烷酰基(C17)、硬脂酰基(十八烷酰基)(C18)、油酰基(C18)、亚油酰基(C18)、亚麻酰基(C18)、十九烷酰基(C19)、花生酰基(二十烷酰基)(C20)等。列举的酰基的括号内的“C”表示包含羰基碳在内的碳数。
在所述酰基中，例如，还特别优选下述化学式所示的酰基等。在下述化学式中，不饱和键的位置不限于这些。作为具体例子，例如，反式-8-甲基-壬烯酰基(C10)的不饱和键(双键)不限于如下所示的6位，例如，也可以在2-5位和7位中的任一个位置。
[化3]
[化4]
Figure BDA0000133179460000061
[化5]
Figure BDA0000133179460000062
所述酰基的种类无特别限制，如前述那样，可以是不饱和酰基和饱和酰基中的任一个。其中，对于主链长相同的酰基，例如，优选不饱和酰基，优选不饱和键数目较多。所述酰基中的不饱和键的数目无特别限制，例如为1-3，优选2-3。
在R1-R6中，所述酰基进一步被所述取代基取代时，所述取代基无特别限制。所述取代基例如可以列举烷基、氨基、烷基氨基和二烷基氨基等。
所述烷基例如可以列举碳原子数1-6的直链或者支链烷基，优选甲基。另外，所述烷基氨基中的烷基例如可以列举碳原子数1-6的直链或者支链烷基，优选甲基氨基。所述二烷基氨基中的烷基例如可以列举碳原子数1-6的直链或者支链烷基，优选二甲基氨基。这些可以相同也可以不同。
在所述化学式(1)中，例如可以是R1-R6中两处以上为所述酰基，也可以只有任一处为酰基。对于前者，各部位的酰基例如可以相同也可以不同。两处以上为所述酰基的情况下，所述酰基的所述主链长，例如优选为碳数4-12，更优选碳数为4-8。酰基以外的其他的R无特别限制，例如，优选氢原子。
在所述化学式(1)中，R1-R6中酰基的部位无特别限制。在所述化学式(1)中，例如，优选B环的R1和R2以及D环的R5和R6中至少一处为所述酰基，特别是优选R1、R2、R5和R6中任一处为所述酰基。此时，酰基以外的其他的R无特别限制，例如，优选氢原子。
在所述化学式(1)中，优选B环的R1、R2和R3中至少一处为酰基，更优选B环的R1和R2中仅一处为酰基。B环被修饰的EGCG衍生物例如代谢稳定性更优异。
在所述化学式(1)中，如前所述，R7-R16可以相同也可以不同，除酰基以外，例如可以列举氢原子、卤素、钠或钾。R7-R16，例如，如下述化学式(2)所示，优选氢原子。在下述式(2)中，例如，R1-R6任一个可以为所述酰基。作为具体例子，例如，优选R1-R6中至少一处或任一处为前述酰基，更优选R1、R2、R5和R6中至少一处或任一处为前述酰基，在所述酰基中，例如，优选丁酰基、辛酰基、反式-8-甲基-6-壬烯酰基、香叶酰基、月桂酰基、12-(二甲氨基)月桂酰基、法呢酰基、棕榈酰基、棕榈油酰基、硬脂酰基、油酰基、亚油酰基、亚麻酰基或花生酰基。
[化6]
在本发明中，“卤素”是指任意的卤素元素。所述卤素例如可以列举氟、氯、溴和碘。另外，在本发明中，“烷基”并无特别限定。所述烷基例如可以列举，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基等。对于结构中含有烷基的基团或由烷基衍生的基团，具体地例如烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、羧基烷基、烷氧基羰基烷基、烷氧基烷基、链烯氧基烷基等，也同样。
取代基等为含有链状结构的基团时，例如为烷基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、羧基烷基、烷氧基羰基烷基、烷氧基烷基、链烯氧基烷基等的情况下，只要没有特别限制，例如可以是直链状也可以是支链状。取代基等的一部分包含链状结构时，例如取代烷基和取代芳基等中的取代基包含链状结构时，也同样。取代基等存在异构体时，只要无特别限制，例如哪个异构体都可以。作为具体例，仅提及“丙基”的情况下，例如正丙基和异丙基哪个都可以。另外，仅提及“丁基”的情况下，例如，正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基任一个都可以。仅提及“萘基”的情况下，例如1-萘基和2-萘基哪个都可以。
本发明的EGCG衍生物，例如可以是一种也可以两种以上结合使用。本发明的EGCG衍生物，例如可以是R1-R6中的不同部位具有酰基的两种以上的EGCG衍生物，也可以是具有不同酰基的两种以上的EGCG衍生物。作为具体例子，可以是含有B环的R1为所述酰基的EGCG衍生物、B环的R2为所述酰基的EGCG衍生物、B环的R3为所述酰基的EGCG衍生物中的任意两种以上或全部三种的混合物，也可以是含有D环的R4为所述酰基的EGCG衍生物、D环的R5为所述酰基的EGCG衍生物、D环的R6为所述酰基的EGCG衍生物中的任意两种以上或全部三种的混合物。另外，也可以是B环的R1-R3至少任一个为所述酰基的EGCG衍生物和D环的R4-R6中至少任一个为所述酰基的EGCG衍生物的混合物。
本发明的抗菌剂无特别限制，可以适用于各种细菌。所述细菌，例如可以列举革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。作为具体的例子，例如，杆菌属(Bacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、微球菌属(Micrococcus)、摩拉克氏菌属(Moraxella)、嗜血杆菌属(Haemophilis)、大肠杆菌(Eschericia coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、单胞菌属(Stenotrophomonas)、缠绕杆菌属(Helicobacter)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、军团杆菌属(Legionella)等的细菌。杆菌属(Bacillus)，例如可以列举枯草杆菌(B.subtilus)、蜡样芽胞杆菌(B.cereus)等。葡萄球菌属，例如可以列举金黄色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)等葡萄球菌。所述金黄色葡萄球菌，例如可以列举甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌(MSSA)、甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)等。所述链球菌属，例如肺炎链球菌(S.pneumoniae)、酿脓链球菌A群(S.pyogenes Group A)、无乳链球菌(S.agalactiae)等链球菌。肠球菌属，例如粪肠球菌(E.faecalis)等肠球菌。微球菌属，例如藤黄微球菌(M.lutus)等。作为摩拉克氏菌属，可以列举卡他莫拉菌(M.catarhalis)等。嗜血杆菌属，可以列举流感嗜血杆菌(H.influenzae)等。肠杆菌属，例如阴沟肠杆菌(E.cloacae)、产气肠杆菌(E.aerogenes)等、沙雷氏菌属，例如可以列举粘质沙雷氏菌(S.marcescens)等。耶尔森氏菌属，例如小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)等。假单胞菌属，例如可以列举绿脓假单胞菌(P.aeruginosa)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)等。单胞菌属例如可以列举嗜麦芽窄食单胞菌(S.maltophilia)等，缠绕杆菌属(Helicobacter)，例如可以列举幽门螺旋杆菌(H.pylori)等。弯曲杆菌属，例如可以列举空肠弯曲杆菌(C.ieiuni)等，军团杆菌属，例如可以列举嗜肺军团杆菌(L.pneumophila)等。
本发明的抗菌剂，只要包含所述EGCG衍生物就可以，对其形态没有任何限制。所述形态，例如可以列举溶液、悬浊液或分散液等液体、固体、粉末等。另外，对剂型也无特别限制，例如，可以根据给药方法适当设定，可以列举液剂、胶囊剂、片剂、细粒剂等粒剂、粉剂等。所述给药方法无特别限制，可以列举口服、非口服。非口服例如可以列举经皮给药、腹腔内给药、静脉注射等静脉内给药、肌肉给药、皮下注射等皮下给药、直肠给药等，优选经皮给药。本发明的抗菌剂，例如根据这些给药方式，可以作为所述EGCG衍生物自身或包含所述EGCG衍生物的内服药、舌下剂、点眼·点鼻药、含漱药、药膏等给药，另外，所述EGCG衍生物自身或作为包含所述EGCG衍生物的溶液、悬浊液或者分散液，可以使用注射、喷雾器、吸引器等给药。另外，本发明的抗菌剂，例如所述EGCG衍生物自身或作为包含所述EGCG衍生物的粉末，例如可以使用喷雾器、吸引器等给药。另外，本发明的抗菌剂，例如能降低菌的感染能力，因此例如也可以列举包含所述EGCG衍生物的洗手剂、擦拭剂等清洗剂的形式。通过采用本发明的抗菌剂例如处理手或桌子等被认为存在菌的地方，就能使存在的菌的感染能力降低，也能实现预防菌感染。另外，可以用罩、过滤器等负载本发明的抗菌剂。
本发明的抗菌剂例如能用于菌感染的抑制和预防、以及菌感染后的治疗。本发明的抗菌剂的给药对象无特别限制，例如可以列举人、非人动物。所述非人动物，例如可以列举猪、雪貂、大鼠、小鼠、牛等非人哺乳类、鸭、鸡等禽类等。
在本发明的抗菌剂中，所述EGCG衍生物的含量无特别限制，例如，可以根据给药目的、给药方法适当决定。本发明的抗菌剂为含漱药的情况下，例如，优选含有每次20-100μmol/L的EGCG衍生物。另外，本发明的抗菌剂为点眼·点鼻药的情况下，例如优选含有每次20-100μmol/L的EGCG衍生物。
本发明的抗菌剂，例如，除了所述EGCG衍生物以外，还可含有其他抗菌物质。
本发明的抗菌剂，例如，根据其剂型、给药方法，还可适当含有添加剂、基质等。所述添加剂，例如可以列举赋形剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂(矯味剤)、除臭剂(矯
Figure BDA0000133179460000111
剤)、乳化剂、表面活性剂、助溶剂、悬浮剂、张力调整剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、稳定剂、吸收促进剂等。这些物质的添加比例无特别限制，可以在无损所述EGCG衍生物效果的范围内添加。
本发明的EGCG衍生物的制造方法无特别限制。所述方法例如可以采用有机合成法、利用酶等的化学合成法等现有公知的方法。所述利用酶的化学合成法无特别限制，例如，可以列举国际公开WO2007/105280号文本所公开的利用脂肪酶的方法。该方法例如是在有机溶剂中以EGCG和酰基供体作为底物，利用脂肪酶进行酶反应，将EGCG酰化的方法。若采用该方法，例如，能选择性地使EGCG酰化。以下例示使用脂肪酶的方法的一例，但本发明的EGCG衍生物的制造方法无任何限制。
所述脂肪酶，例如可以使用IUB No.3.1.1.3.的脂肪酶。作为具体例子，可以列举来自黑曲霉(Aspergillus niger)等曲霉(Aspergillus)属的脂肪酶、来自皱褶假丝酵母(Candida rugosa)、柱状假丝酵母(Candida cylindracea)、南极假丝酵母(Candida antarctica)等念珠菌(Candida)属的脂肪酶、来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)等假单胞菌(Pseudomonas)属的脂肪酶、来自产碱杆菌(Alcaligenes)属的脂肪酶、来自洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)等伯克氏菌(Burkholderia)属的脂肪酶、来自猪胰脏的脂肪酶等。这些可以利用现有公知的方法制备，例如也可以使用Lipase AS“AMANO”、Lipase AYS“AMANO”、LipasePS“AMANO”、Lipase AK“AMANO”20、Lipase AH“AMANO”(均为商品名，天野エンザイム社制)、Lipase MY、Lipase OF、Lipase PL、Lipase PLC、Lipase PLG、Lipase QLM、Lipase QLC、Lipase QLG、Lipase SL、Lipase TL(均为商品名，名糖产业社制)、Lipase PPL、L4777Lipase acrylic resin from Candida Antarctica、L3126Lipasefrom porcine pancreas(均为商品名，シグマアルドリツチ社制)等市售品。各市售品的物理化学性质如各自的商品说明书所记载，同样也可以使用具有相同的物理化学性质的酶。
另外，所述脂肪酶也可以是具有如下所示的(1)-(8)的任一个物理化学特性和酶特性的脂肪酶。
(1)分子量35,000、等电点4.10
例如来自黑曲霉(Aspergillus niger)的脂肪酶
(2)分子量64,000、等电点4.30、80℃10分钟的处理下失活
例如来自皱褶假丝酵母(Candida rugosa)的脂肪酶
(3)最适pH8、最适温度60℃、pH4-10的范围内特别稳定，70℃以下特别稳定
例如，来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的脂肪酶
(4)分子量60,000、最适pH6-7、pH稳定性3-8、最适温度40-50℃、在37℃以下溶液状态下特别稳定
例如，来自柱状假丝酵母(Candida cylindracea)的脂肪酶、来自皱褶假丝酵母(Candida rugosa)的脂肪酶
(5)分子量30,000、等电点4.5、最适pH8-9.5、pH稳定性7-10、最适温度50℃、40℃以下特别稳定
例如来自产碱杆菌(Alcaligenes)属的脂肪酶
(6)分子量31,000、等电点4.9、最适pH7-9、pH稳定性6-10、最适温度65-70℃、50℃以下特别稳定
例如来自产碱杆菌(Alcaligenes)属的脂肪酶
(7)分子量31,000、等电点5.2、最适pH7-9、pH稳定性6-10、最适温度65-70℃、60℃以下特别稳定
例如，来自洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)的脂肪酶、来自洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)的脂肪酶
(8)分子量27,000、等电点6.6、最适pH7-8、pH稳定性6-9、最适温度50℃、40℃以下特别稳定
例如，来自施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)的脂肪酶
所述有机溶剂无特别限制，例如，可以使用乙腈、丙酮、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)等。所述有机溶剂例如可为显示疏水性的参数(logP值)在-1.35至0.28范围内的有机溶剂，这样的有机溶剂可以列举前述的乙腈(logP值：-0.45至0.19)、丙酮(logP值：-0.16至0.19)、DMF(logP值：-1.01至0.28)、DMSO(logP值：-1.35至0.28)。除了这些之外，还可以使用满足所述参数的现有公知的溶剂。所述logP是溶剂固有的值，因此，如果是本领域技术人员，就能选择满足所述参数的溶剂。所谓“logP”，是将目的物质添加到辛醇和水的混合溶液中，达到平衡时辛醇层和水层中所述目的物质的浓度比表示为常用对数的参数，如前所述，作为表示物质疏水性的参数是常规的。
所述酰基(R-CO-)供体例如可列举羧酸乙烯酯(R-CO-O-CH＝CH2)。所述酰基例如可以列举前述那样的直链或者支链状的饱和或者不饱和酰基。
使用DMF作为所述有机溶剂的情况下，脂肪酶反应的反应液中的EGCG的添加比例无特别限制，例如为0.2-100mmol/L，优选0.5-50mmol/L，更优选0.5-20mmol/L。所述酰基供体的添加比例无特别限制，例如，可以根据所述反应液中的EGCG的添加比例适当确定。作为具体例子，EGCG和所述酰基供体之间的添加比例(摩尔比)例如为1∶1-1∶10，优选1∶1-1∶5，更优选1∶1-1∶3。另外，所述反应液中的脂肪酶的添加比例，例如，可以根据EGCG和所述酰基供体的添加比例、脂肪酶的比活性等适当确定，无特别限制。作为具体例子，所述脂肪酶的添加比例，例如相对于EGCG 1mmol/L，为例如500-50,000U/L，优选500-5,000U/L，更优选1,000-2,500U/L。
酶反应的条件无特别限制。反应温度例如在45-75℃的范围。所述反应时间无特别限制，例如根据底物和酶的量适当确定。所述反应时间为例如30分-24小时(1440分)，优选1小时(60分)-3小时(180分)，更优选1.5小时(90分)-3小时(180分)。
可以进一步在所述反应液中添加碱性催化剂。所述碱性催化剂例如可以列举三乙胺等叔胺、吡啶等。所述反应液中的碱性催化剂的添加比例无特别限制，例如为5-720mmol/L，优选12-240mmol/L，更优选12-48mmol/L。
EGCG中导入所述酰基的位置例如可以根据使用的脂肪酶的种类来选择。导入EGCG的酰基的数目，例如，可以根据使用的有机溶剂的种类和反应时间来确定。作为具体例子，例如，有机溶剂的疏水性相对越高，即，亲水性相对越低，则可相对减少导入的酰基的数目。另一方面，例如，有机溶剂的亲水性相对越高，即，疏水性相对越低，则可相对增加导入的酰基的数目。另外，例如也可以通过混合使用两种以上的有机溶剂，来调节导入的酰基的数目。作为具体例子，例如，导入1个酰基时，优选使用乙腈等，例如，导入1-2个酰基时，优选使用丙酮、乙腈等，例如导入3-5个酰基时，优选使用DMSO、DMF等。
进而，即使使用相同有机溶剂的情况下，例如，可以通过对反应温度和/或反应时间的控制等，而调节导入的酰基数。以下示出了其实例，但不限于此。使用DMF作为有机溶剂的情况下，例如，可以通过设定反应温度在约57℃-约70℃的范围，并延长反应时间、例如使反应时间为约3-5小时，优先得到在EGCG中选择性地导入2个酰基的衍生物。另一方面，例如，相对于上述条件，降低反应温度(例如，比57℃低约5℃的温度)，缩短反应时间(例如，使反应时间为约1-3小时)，由此可以选择性导入1个酰基。另外，也可以通过使用混合了相同量(重量)丙酮和DMF的混合溶剂，在EGCG中选择性导入1个酰基。
导入的酰基的数目例如可以通过在所述反应液中添加前述的碱性催化剂来增加。此时，在EGCG哪个部位进一步导入酰基，例如，如前所述，有赖于脂肪酶的位置选择性。
例如，可以通过相对高地设定反应温度，相对地提高所述脂肪酶反应产生的EGCG衍生物的收率。通常，如前所述，反应温度为45-75℃，从收率提高的观点出发，优选57-75℃，更优选57-70℃。特别地，反应温度为57-70℃时，例如，能使所述EGCG酰化衍生物的收率约为35-45％。所述收率，例如是指反应使用的EGCG为100％时的EGCG酰化衍生物(例如，全部单酰化衍生物)的比例，也可以称为转化效率。
在本发明中，EGCG衍生物，例如，如前所述，可以使用任一种，也可以使用两种以上的混合物。从所述混合物中分离一种EGCG衍生物时，例如，可以通过使用色谱等现有公知的方法来进行。
接着，本发明的感染防止方法是防止菌感染的方法，其特征在于给予被检体前述EGCG衍生物或所述本发明的抗菌剂。在本发明中，防止菌感染例如包括阻碍菌的感染、降低感染、减少、除去感染的菌等。另外，本发明的治疗方法是治疗菌感染引起的疾患的方法，其特征在于给予被检体前述EGCG衍生物或所述本发明的抗菌剂。在本发明中，特征在于使用所述EGCG衍生物或所述本发明的抗菌剂，其他的构成、条件等无任何限制。所述EGCG衍生物和所述抗菌剂及其使用方法等，例如与前述同样。
在本发明中，对被检体无任何限制，例如，可以列举人或非人动物。所述非人动物，例如可以列举猪、雪貂、大鼠、小鼠、牛等非人哺乳类、鸭、鸡等禽类等。所述被检体，例如可以是活体自身，也可以是采自活体的细胞或组织、它们的培养物。
所述被检体为活体的情况下，所述给药方法无特别限制，例如可以列举非口服和口服。非口服例如可以列举经皮给药、腹腔内给药、静脉内给药、肌肉给药、皮下给药、直肠给药等，优选经皮给药。所述给药方法如前所述。另外，在所述给药中，所述EGCG衍生物和所述抗菌剂的形态等条件如前所述。
所述被检体为采自活体的细胞、组织等的情况下，例如，所述给药方法无特别限制，例如可以列举向培养基等中添加。
对给予所述被检体所述EGCG衍生物或所述本发明的抗菌剂的时期无特别限制，例如可以是菌感染之前，也可以是菌感染之后。
本发明是用于治疗菌感染所引起的疾患的EGCG衍生物，所述EGCG衍生物如前所述。另外，本发明是包含用于治疗菌感染所引起的疾患的EGCG衍生物的组合物，所述EGCG衍生物如前所述。所述组合物，例如可以包含一种所述EGCG衍生物，也可以包含两种以上的EGCG衍生物。包含两种以上的EGCG衍生物的情况下，其种类的组合无特别限制，例如可以列举所述抗菌剂中例示的组合等。
实施例
接着，对本发明的实施例进行说明。但是，本发明不被下述实施例所限制。
(实施例1)
(1)EGCG衍生物的制备
用下述方法制备EGCG衍生物。
在DMF 100mL中混入EGCG 1g、下述表1所示的酰基供体927mg和脂肪酶(商品名Lipase PL、名糖产业社制)50,000U混合，在57℃孵育两小时进行酶反应。
[表1]
Figure BDA0000133179460000161
过滤孵育后的反应液，将滤液浓缩后，供给至色谱柱(球状、中性、40-50μm、商品名Silica gelN60、关东化学株式会社制)，除去作为杂质的未反应酰基供体。对得到的反应生成物进行电喷雾电离质谱(ESI-MS)，结果是，得到借助酯键在EGCG中导入了一个所述表1所示的酰基的EGCG衍生物。具体地，在EGCG的B环的R1或者R2、或D环的R5或者R6处导入1个所述表1所示的酰基。
进而，为确认EGCG哪个位置被酯化，对所述反应生成物用质子核磁共振(H1NMR)分析。将这个结果表示在下述表2中。
[表2]
Figure BDA0000133179460000171
*：B环酯化的EGCG衍生物与D环酯化的EGCG衍生物的比
导入了所述No.1-No.5的酰基的EGCG衍生物分别如下所示。
No.1  EGCG-C8或EGCG-辛酸酯
No.2  EGCG-C12或EGCG-月桂酸酯
No.3  EGCG-C16或EGCG-棕榈酸酯
No.4  EGCG-C18或EGCG-硬脂酸酯
No.5  EGCG-C20或EGCG-花生酸酯
这些EGCG衍生物是所述化学式(2)所示的EGCG衍生物，R1、R2、R5或R6中的任一处为所述表2所示的酰基，其他的R为氢原子。将这些EGCG衍生物作为实施例1的抗菌剂使用。
(2)抗菌效果
作为细菌，使用了甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌(Methicillin-susceptihle Staphylococcus aureus)(MSSA)NCTC8325和甲氢西林抗性金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)(MRSA)ATCC43300。对于所述各细菌的培养，作为培养基，使用了Mueller-Hinton Broth(MH-broth、Difco社制)。另外，对于各EGCG衍生物，以Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)的微量液体稀释法为基准，测定最低抑制浓度(MIC：Minimum inhibitory concentration)(以下同样)。
首先，用100％二甲基亚砜(DMSO、和光纯药工业社制)溶解所述各EGCG衍生物，使其为5120μg/mL。将这些溶液用DMSO或灭菌蒸馏水稀释，制备2倍稀释系列的抗菌剂溶液。具体地，浓度到1280μg/mL用DMSO稀释，浓度不足1280μg/mL用灭菌蒸馏水稀释。将这些抗菌剂溶液分配到96孔板的孔中。使分配到所述孔中的所述抗菌剂溶液中的EGCG衍生物浓度为最终浓度的10倍浓度。另一方面，将所述细菌用所述MH-broth在37℃下培养一夜，将得到的前述培养液用新的MH-broth 10-4稀释(104倍稀释)，制备菌液，使其约为1×105CFU/mL(CFU：Colony Forming Unit、活菌数)。在所述孔中进一步添加所述菌液，在37℃培养18小时。在所述孔中，所述抗菌剂溶液和所述菌液的添加比例(体积比)为所述抗菌剂溶液∶所述菌液＝1∶9，每个孔的所述两者的混合液的体积合计为100μL。所述混合液中的所述EGCG衍生物的最终浓度为8μg/mL-512μg/mL，所述混合液中的活菌数约为1×105CFU/mL。另外，培养结束后，判定MIC。另外，为判别详细的差异，使用酶标仪测定浊度(OD600nm)。
另外，对于比较例1，除了使用未取代的EGGG代替所述实施例1的EGCG衍生物作为抗菌剂之外，与实施例1同样地进行。另外，对于对照组，除了使用灭菌蒸馏水、100％DMSO或50％DMSO代替包含所述EGCG衍生物的所述抗菌剂溶液之外，同样地进行。
所述MIC的结果如下述表3所示。另外，MRSA的所述浊度测定结果表示在图1中。在图1的图表中，纵轴是浊度(OD600nm)，横轴是所述混合液中的EGCG或EGCG衍生物的浓度(μg/mL)。在图1的图表中，白色菱形(◇)为EGCG-C8的结果，白色四方形(□)为EGCG-C12的结果，白色圆圈(○)为EGCG-C16的结果，白色三角形(△)为EGCG-C18的结果，黑色圆圈(●)为EGCG-C20的结果，×为EGCG的结果。
[表3]
Figure BDA0000133179460000181
如所述图1和表3所示，实施例1的EGCG衍生物与比较例1的EGCG相比能更有效地抑制MSSA和MRSA的增殖。其中，可以看到EGCG-C12和EGCG-C16对MRSA增殖有显著的抑制效果。
(3)杀菌效果
对于所述EGCG-C16，测定了对MRSA ATCC43300、大肠杆菌(E.coli)MG1655和绿脓假单胞菌(P.aeruginosa)PAO1的杀菌效果。在细菌的培养中，使用了MH-broth作为培养基。
所述混合液中的所述EGCG-C16的最终浓度，对于MRSA，为6.25μg/mL和25μg/mL，对于大肠杆菌(E.coli)，为200μg/mL，对于绿脓假单胞菌(P.aeruginosa)，为50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL，除此之外，与所述(2)同样地，混合所述抗菌剂溶液和所述菌液，在37℃进行培养。使所述抗菌剂溶液和所述菌液的混合液中的活菌数为1×105CFU/mL。另外，从培养开始到经过规定时间(0小时、2小时、4小时和6小时)时，采集培养液，用生理盐水稀释，制备10倍稀释系列。从所述稀释的菌液中各取100μL到培养皿上，用50℃保温的胰酶解大豆酪蛋白胨琼脂(Trypticase-soy Agar)(BBL社制)10mL混合、固定，在37℃培养一夜。并对出现的菌落数(CFU/mL)进行计数，测定残存的活菌数。
将这些结果表示在图2中。图2(A)、图2(B)、图2(C)分别是对MRSA ATCC43300、大肠杆菌(E.coli)MG1655、绿脓假单胞菌(P.aeruginosa)PAO1的随时间的残存活菌数变化用对数表示的图表。对于全部图，x轴表示处理时间(小时)，y轴表示菌落数(CFU/mL)的对数。处理时间为0小时的菌落数为1×105CFU/mL。另外，在图2的各图中，0μg/mL是指未添加EGCG衍生物孵育时的残存活菌数的结果。
如该图(A)所示，可知，EGCG-C16在25μg/mL下不仅抑制增殖，还使活菌数减少，因此显示了对MRSA显著的杀菌作用。另外，如上述图(B)和(C)所示，EGCG-C16显示了对大肠杆菌(E.coli)MG1655和绿脓假单胞菌(P.aeruginosa)PAO1抑制增殖的抑菌作用(抑制增殖作用)。
(实施例2)
(1)EGCG衍生物的制备
使用下述方法制备了EGCG衍生物。
除了使用下述表4所示的酰基供体之外，与所述实施例1同样地制备了EGCG衍生物。
[表4]
Figure BDA0000133179460000201
进而，为确认EGCG的哪个位置被酯化，用质子核磁共振(H1NMR)分析了所述反应生成物。将该结果表示在下述表5中。
[表5]
Figure BDA0000133179460000211
*：B环酯化的EGCG衍生物与D环酯化的EGCG衍生物的比
导入了所述No.6-No.12的酰基的EGCG衍生物分别如下所示。
No.6  EGCG-C16或EGCG-棕榈酸酯
No.7  EGCG-C8×2或EGCG-二辛酸酯
No.8  EGCG-C18或EGCG-硬脂酸酯
No.9  EGCG-C18E或EGCG-油酸酯
No.10 EGCG-C18DE或EGCG-亚油酸酯
No.11 EGCG-C18TE或EGCG-α-亚麻酸酯
No.12 EGCG-C16E或EGCG-棕榈油酸酯
这些EGCG衍生物为所述化学式(2)所示的EGCG衍生物，R1、R2、R5或R6中的任一处为所述表5所示的酰基，其他的R为氢原子。使用这些EGCG衍生物作为实施例2的抗菌剂。
(2)抗菌效果
用100％DMSO溶解所述EGCG衍生物，使其分别为1280μg/mL。将这些溶液用灭菌蒸馏水稀释，制备了抗菌剂溶液。另外，作为细菌，使用了MSSA NCTC8325、MSSA ATCC25923、MSSA ATCC12600、MSSA ATCC29213、MSSA临床分离株5株(No.1-No.5)、MRSAATCC43300和MRSA临床分离株7株(No.6-No.12)，除此之外，与所述实施例1的(2)同样地测定了最低抑制浓度(MIC)。将这些结果表示在下述表6中。
对于比较例2，使用未取代的EGCG代替所述实施例2的EGCG衍生物作为抗菌剂，除此之外，与实施例2同样地进行。另外，对于对照组，使用灭菌蒸馏水代替包含EGCG衍生物的所述抗菌剂溶液，除此之外，与实施例2同样地进行。
[表6]
Figure BDA0000133179460000221
Figure BDA0000133179460000222
如所述表6所示，实施例2的EGCG衍生物与比较例2的EGCG相比显示了对所述MSSA和MRSA更优异的抗菌性。进而，如下所示可知，酰基的碳数相同时，与饱和脂肪酸相比，两处以上导入了不饱和键的不饱和脂肪酸的EGCG衍生物的抗菌效果更好。另外，导入碳数16的饱和脂肪酸的衍生物和导入2分子碳数8的饱和脂肪酸的衍生物的抗菌效果相同。另外，可知水溶性和化学结构稳定性高。
EGCG-C16≤EGCG-C16E
EGCG-C18≤EGCG-C18E＜EGCG-C18DE≤
                       EGCG-C18TE
EGCG-C16≤EGCG-C8×2
(3)抗菌谱(MIC)
对于下述表7和表8所示的各种标准菌株，使用所述实施例2的抗菌剂溶液，除如下所示之外，与所述实施例1的(2)同样地测定了MIC。所述抗菌剂溶液为，在100％DMSO中溶解之后，用灭菌蒸馏水稀释而制备。所述各种菌株分别使用了来自ATCC或NCTC的菌株。对于卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)和烟曲霉(Aspergillus fumigatus)，使用了没有获得耐性特征的临床分离株。对于富营养菌肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)ATCC49619、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)ATCC19615、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)ATCC13813、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、和流感嗜血杆菌(Haemophilis influenzae)ATCC49766，在培养基中加入ストレプト·ヘモサプリメント(荣研化学社制)。对真菌的MIC测定，使用RPMI1640/MOPS(pH7.0)培养基，基于CLSI法，通过微量液体稀释法来进行。接种约2×103细胞/mL的真菌，在35℃培养24-48小时后，判定MIC。另外，对所述比较例2的抗菌剂溶液，也同样测定了MIC。
将各衍生物对各种标准菌株的MIC判定结果表示在下述表7和表8中。下述表7是对细菌的结果，下述表8是真菌的结果。
[表7]
[表8]
Figure BDA0000133179460000242
如所述表7和所述表8所示，实施例2的各EGCG衍生物显示了对任一菌株的抗菌活性。如所述表7所示，所述各EGCG衍生物与EGCG相比，对革兰氏阳性菌有更优异的抗菌效果。另外，如所述表7所示，各EGCG衍生物对其中的葡萄球菌显示了高抗菌活性，EGCG-C16和EGCG-C18显示了对Staphylococcus epidermidsATCC14990(表皮葡萄球菌)最强的抗菌效果。另外，如所述表8所示，各EGCG衍生物显示了对各种真菌的抗菌活性，其中，EGCG-C16E和EGCG-C18TE显示了最优异的抗真菌效果。EGCG-C16E的抗真菌效果与比较例2的EGCG相比优异2-8倍。
(实施例3)
确认了EGCG-C16对MSSA和MRSA的抗菌作用是否因添加细胞壁构成成分肽聚糖(PG)、D-Ala-D-Ala、或外膜的脂多糖(LPS)而被抑制。MIC的测定根据所述实施例2的(2)来进行。
作为抗菌剂，实施例3使用了在所述实施例1中制备的EGCG-C16。比较例3使用了未取代的EGCG，参考例使用了与PG或D-Ala-D-Ala直接结合的万古霉素(vancomycin)(VCM、SIGMA社制)和替考拉宁(teicoplanin)(TEIC、SIGMA社制)、抑制PG合成酶的氨苄西林(ampicillin)(ABPC、SIGMA社制)。对于EGCG-C16和EGCG，与所述实施例1的(2)同样地制备抗菌剂溶液。将这些以外的抗菌剂溶解于PBS，制备抗菌剂溶液。
另外，作为添加剂，准备了PG(Peptidoglycan Staphylococcus aureus、SIGMA-ALDRICH社制)、D-Ala-D-Ala(SIGMA-ALDRICH社制)和LPS(Lipopolysaccharide Salmonella、SIGMA-ALDRICH社制)。各添加剂分别溶解于PBS，将这些作为添加剂溶液而使用。
制备了所述抗菌剂溶液的稀释系列。将这些分配于96孔板，进而添加所述添加剂溶液并混合之后，添加MRSA ATCC43300或MSSAATCC25923的菌液，在37℃培养18个小时。在所述抗菌剂溶液、所述添加剂溶液和所述菌液的混合液中，PG、D-Ala-D-Ala和LPS的最终浓度分别为30μg/mL。只要没有特别示出，与所述实施例2的(2)同样地计算最低抑制浓度(MIC)。将这些结果表示在下述表9中。
[表9]
Figure BDA0000133179460000261
MH-broth：未添加所述添加剂的培养基
如所述表9所示，比较例3的EGCG抗菌活性弱，无法看到MIC的变化。实施例3的EGCG衍生物与VCM和TEIC一样，由于添加PG，MIC的值增高2倍。由此可认为，实施例3的EGCG衍生物与VCM和TEIC一样直接结合或吸附于细胞壁成分PG，推测这是显示出抗菌活性的一个原因。另外，对于VCM和TEIC，由于添加D-Ala-D-Ala，其MIC上升16倍以上，与此相对，所述EGCG衍生物未受到D-Ala-D-Ala的影响。由此可明确，PG中的所述EGCG衍生物的结合部位与VCM和TEIC不同，不是D-Ala-D-Ala。
(实施例4)
对于EGCG-C16，确认了对MSSA和MRSA的膜结构的破坏性。
作为抗菌剂，实施例4使用了所述实施例1中制备的EGCG-C16，比较例4使用了EGCG，参考例使用了膜破坏性肽NISIN(MPBiomedicals社制)。EGCG-C16和EGCG为以最高浓度溶解于DMSO，制备抗菌剂溶液，对于其他的抗菌剂，将其分别溶解于PBS，用PBS适当稀释，制备抗菌剂溶液。也研究了用于溶解所述抗菌剂的DMSO的影响。
用MH-broth(Difco)对MSSA ATCC25923、MRSA ATCC43300进行摇瓶培养直至指数增殖期后期。将得到的培养液以7000rpm的速度进行10分钟的离心，将沉淀的菌体用PBS悬浮。将菌体的悬浊液添加于384黑色板的孔中，进而添加所述各种抗菌剂溶液、混合，在37℃孵育15分钟。接着，在所述孔中混合死菌染色色素(商品名SYTOXGreen、LONZA社制)，使其为10μmol/L，在37℃孵育10分钟。使各种抗菌剂的最终浓度为EGCG衍生物4、8、16、32μg/mL、EGCG8、16、32、64、128μg/mL、NISIN 1、2、4、8μg/mL。另外，孵育后，在所述孔板的各孔照射488nm的激发光，用商品名Microplate ReaderSH-8100(コロナ电气社制)测定530nm的荧光。另一方面，作为对照组，添加PBS或10％DMSO代替所述抗菌剂溶液，同样地测定荧光强度。另外，对于MSSA和MRSA两者，将对照组(PBS)的荧光强度作为1，计算添加各药剂时的荧光强度的比率。所述SYTOX Green是不穿过活菌膜的DNA插入剂。该荧光强度相对较高表示药剂的膜破坏性相对较高，所述插入剂容易吸收进菌体内。因此，可以认为，所述荧光强度的比率与1相比越大，显示出膜破坏作用越强，比1显著小时，细菌的膜透过性有降低的可能性。
将这些结果表示在图3中。图3是用SYTOX Green的荧光强度表示的各抗菌剂对MSSA和MRSA的膜破坏性的图表。在该图中，y轴表示将对照组的荧光强度作为1时的荧光强度比。在图3中，记载在各抗菌剂上的数字表示前述浓度。另外，对于各抗菌剂的浓度，左(白)柱表示MSSA ATCC25923的结果，右(黑)柱表示MRSA ATCC43300的结果。如图3所示，比较例的EGCG的荧光强度比小于1。由此可以推测，比较例的EGCG对细胞膜的破坏性弱，所述插入剂向菌体内的导入由于与细胞壁的物理吸附而与对照组(PBS)相比被进一步抑制。对于10％DMSO，也观察到了微弱的且类似的倾向。与此相对，对于实施例4的EGCG-C16，与参考例的膜破坏性肽NISIN一样，其荧光强度比极大，显然可以推测对细胞膜具有破坏性。另外，可以看到，EGCG-C16在64μg/mL的高浓度下，其作用有减弱的倾向。由此可以推测，EGCG-C16也具有与EGCG同样的作用。以上结果可以推定，对于EGCG衍生物，如前所述，不仅显示了对细胞壁的结合作用，还具有对膜的破坏作用，因此，可以得到比EGCG更优异的抗菌活性。
(实施例5)
对于EGCG衍生物，研究了对大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655的抗菌力中的多药外排泵的影响。
(1)EGCG衍生物
作为所述EGCG衍生物，使用了所述实施例2的EGCG-C16、C8×2、C16E和C18TE。
(2)抗菌效果
使用所述EGCG衍生物，作为所述细菌，使用了Escherichia coliMG1655(以下称为野生型株)和所述Escherichia coli MG1655基因敲除株，除此之外，与所述实施例2的(2)同样地，测定了最低抑制浓度(MIC)。对于所述基因敲除株，使用敲除了所述Escherichia coliMG1655的外排泵基因acrB、acrD或acrEF的株(△acrD、△acrEF和△acrB)，敲除了与所述外排泵基因的编码蛋白质偶联的外膜蛋白质基因tolC的株(△tolC)。
比较例5除了使用EGCG代替所述EGCG衍生物之外，与所述实施例5同样地测定了最低抑制浓度(MIC)。将这些结果表示在下述表10中。
[表10]
Figure BDA0000133179460000281
如表10所示，所述EGCG衍生物显示出对△acrB和△tolC比对野生型株更优异的抗菌活性，显示出2倍于所述EGCG的抗菌性。另外，如所述表10所示，所述EGCG衍生物和所述EGCG的抗菌性在野生型株(MG1655)和所述基因敲除株(△acrD、△acrEF)之间没有显著差别。与此相对，通过敲除acrB，所述EGCG衍生物和所述EGCG显示出对所述基因敲除株(△acrB)优异的抗菌性。该抗菌性与对敲除了全部与RND型泵偶联的外膜蛋白质基因tolC的所述基因敲除株(△tolC)的抗菌性几乎同等程度。从这个结果可推测，所述EGCG衍生物和所述EGCG主要被acrB的编码蛋白质AcrB排出。
(实施例6)
对于所述EGCG-C16，通过棋盘(checkerboard)法，确认了与β-内酰胺药氨苄西林(ABPC)或亚胺培南(imipenem)(IPM)结合使用所产生的对葡萄球菌的抗菌性。
将所述EGCG-C16溶解到100％DMSO中、将所述各β-内酰胺药溶解到灭菌蒸馏水中之后，用灭菌蒸馏水稀释到规定浓度并将各药剂的各浓度分别组合，从而通过棋盘法测定了添加EGCG-C16所产生的所述各β-内酰胺药的MIC变化。使EGCG-C16的最终浓度为0、2、4、8、16、32、64和128μg/mL，使ABPC的最终浓度为0、1、2、4、8、16、32和64μg/mL，使IPM的最终浓度为0、0.001、0.002、0.004、0.008、0.016和0.031μg/mL。除了作为所述细菌使用MRSAATCC43300和所述实施例2的MRSA临床分离株No.8之外，与所述实施例2的(2)同样地测定了结合使用EGCG-C16时所述各β-内酰胺药的最低抑制浓度(MIC)。
比较例6除了使用EGCG代替所述EGCG-C16之外，与所述实施例6同样地测定了最低抑制浓度(MIC)。将这些结果表示在下述表11中。下述表11中表示了结合使用规定浓度的EGCG-C16或EGCG时β-内酰胺药的MIC变化。
[表11]
ABPC的MIC变化
Figure BDA0000133179460000301
*MIC：未添加β-内酰胺药的条件下，单独以EGCG-C16抑制发育的EGCG-C16的最小浓度IPM的MIC变化
Figure BDA0000133179460000302
*MIC：未添加β-内酰胺药的条件下，单独以EGCG-C16抑制发育的EGCG-C16的最小浓度
如所述表11所示，如果采用所述EGCG衍生物，通过结合使用，与所述EGCG相比，能更显著地降低所述β-内酰胺药对所述ATCC43300和所述临床分离株No.8的MIC。由此可知，所述EGCG衍生物能显著提高所述β-内酰胺药的抗菌性。另外，对于IPM敏感性的所述ATCC43300，所述EGCG在16-64μg/mL的浓度下显示出了较弱的拮抗作用，与此相对，所述EGCG衍生物在研究的浓度范围内未显示出拮抗作用。
(实施例7)
对于D环上有酰基的EGCG衍生物和B环上有酰基的EGCG衍生物，确认了代谢稳定性。
与实施例1同样地制作了EGCG-C16。对于所述EGCG-C16，使用了所述化学式(2)中B环的3位(R1)为棕榈酰基(C16)的衍生物和4位(R2)为棕榈酰基的衍生物的混合物(以下称为“B环衍生物”)、以及D环的4位(R5)为棕榈酰基(C16)的衍生物和5位(R6)为棕榈酰基的衍生物的混合物(以下称为“D环衍生物”)。在所述化学式(2)中，前述R以外的R均为氢原子。
将1.25μL的10mg/mL的小鼠微粒体(日本チヤ一ルズ·リバ一株式会社)、和0.25μL的1％3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸盐(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate)(CHAPS、Dojindo社)水溶液溶解于8.5μL的0.1mol/L磷酸钾水溶液(pH7.4)中。将该混合溶液在冰上孵育30分钟，洗脱出所述微粒体中的葡糖醛酸代谢酶。将其作为反应液A。接着，使10μL的10mmol/L EGCG-C16、5.0μL的10mg/mL L-α-溶血磷脂酰胆碱(Wako社)、和20μL的30mmol/L UDP-葡糖醛酸三钠(UDP-Glc；ナカライ社)分别溶解于155μL的反应缓冲液(1.0mol/L Tris-HCl(pH7.4)∶0.1mol/L MgCl2∶H2O＝2∶1∶13)。将这些分别作为反应液B。接着，在37℃的热水浴中混合所述反应液A和所述反应液B，从而进行EGCG-C16的葡糖醛酸化合反应。反应规定时间(0、0.5、1、1.5、3、6、12、24分钟)之后，为使代谢反应停止，在200μL的反应液中添加了200μL的乙腈(HPLC级；关东化学株式会社)。接着，用0.45μm PTFE制ジスミツク过滤器(Ekicrodisc 13CR；Gelman Science社)过滤所述反应液之后，将得到的滤液约40μL作为代谢反应液在下述条件下供应于HPLC分析。
在HPLC分析系统(日本分光株式会社)中，加载WP300-C4柱(5μm，4.6×150mm，GL Science社)，用265nm的波长解析EGCG-C16的代谢反应液。对于HPLC分析的流动相，使用包含0.1％三氟乙酸(HPLC级；Wako社)的蒸馏水(HPLC级；关东化学株式会社)作为A液，使用包含0.1％三氟乙酸的乙腈(HPLC级；关东化学株式会社)作为B液。另外，对B液在全部流动相(A液+B液)中所占的体积百分比进行梯度设定，使得其在洗脱时间0、3、10、22、26、28、30分时分别为0、0、25、100、100、0、0％，并以流速1.5mL/min进行分析。另外，将未反应的反应液中的EGCG-C16的峰面积作为100％，求出规定时间的反应液中的EGCG-C16的峰面积的比例作为EGCG-C16的残存率％。比较例7使用未导入酰基的EGCG来代替所述EGCG衍生物，进行了同样的处理。将这些结果表示在图4中。图4是表示EGCG-C16的反应时间和EGCG-C16残存率之间的关系的图表。在图4中，D-ring意为D环衍生物，B-ring意为B环衍生物。
如图4所示，可知，经过24分钟时，D环衍生物的峰面积减少至开始时的0.5％，但B环衍生物残存有44％，代谢稳定性更优异。
产业上利用的可能性
若采用本发明，能在优异的稳定性和抗菌性下阻碍菌的感染。另外，在本发明的抗菌剂中，所述EGCG衍生物的基本骨架EGCG例如为茶等所包含的儿茶素，众所周知其安全性优异；另外，所述EGCG衍生物的R1-R6的酰基例如也为安全性优异的基团。因此，本发明的抗菌剂，例如，可以称为安全性也优异的药剂。

Claims (15)

1.一种抗菌剂，其特征在于，包含下述化学式(1)所表示的表儿茶素没食子酸酯衍生物、或者其异构体或它们的盐，
[化1]
Figure FDA0000133179450000011
在所述化学式(1)中，R1-R6分别为氢原子、卤素、钠、钾或直链或者支链状的饱和或者不饱和酰基，可以相同，也可以不同，所述酰基也可以进一步被1个或多个取代基取代，所述R1-R6中的至少一个为所述酰基，R7-R16分别为氢原子、卤素、钠或钾，可以相同，也可以不同。
2.权利要求1所述的抗菌剂，其中在R1-R6中，所述酰基的主链长为原子数2-20。
3.权利要求1所述的抗菌剂，其中在R1-R6中，所述酰基的碳原子数为2-20。
4.权利要求1所述的抗菌剂，其中在R1-R6中，所述取代基为从烷基、氨基、烷基氨基和二烷基氨基构成的群中选择的至少一个。
5.权利要求4所述的抗菌剂，其中在R1-R6中，所述烷基为碳原子数1-6的直链或者支链烷基，所述烷基氨基中的烷基为碳原子数1-6的直链或者支链烷基，所述二烷基氨基中的烷基为碳原子数1-6的直链或者支链烷基，R1-R6分别可以相同，也可以不同。
6.权利要求4所述的抗菌剂，其中在R1-R6中，所述烷基为甲基，所述烷基氨基为甲基氨基，所述二烷基氨基为二甲基氨基，R1-R6分别可以相同，也可以不同。
7.权利要求1所述的抗菌剂，其中R1、R2、R5和R6中至少一个为所述酰基。
8.权利要求1所述的抗菌剂，其中R1、R2、R5和R6中至少一个为所述酰基，其他为氢原子。
9.权利要求1所述的抗菌剂，其中R7-R16为氢原子。
10.权利要求1所述的抗菌剂，其中所述酰基的主链长为原子数12-18。
11.权利要求1所述的抗菌剂，其中所述酰基的碳原子数为12-18。
12.权利要求1所述的抗菌剂，其中所述酰基为直链饱和酰基和直链不饱和酰基中的至少一个。
13.权利要求1所述的抗菌剂，其中所述酰基为从丁酰基、辛酰基、反式-8-甲基-6-壬烯酰基、香叶酰基、月桂酰基、12-(二甲氨基)月桂酰基、法呢酰基、棕榈酰基、棕榈油酰基、硬脂酰基、油酰基、亚油酰基、亚麻酰基、花生酰基和它们的异构体构成的群中选择的至少一个酰基。
14.权利要求1所述的抗菌剂，其中所述抗菌剂为针对从葡萄球菌、肺炎球菌、绿脓假单胞菌、弯曲杆菌、幽门螺旋杆菌、大肠杆菌和军团杆菌构成的群中选择的至少一个菌的抗菌剂。
15.一种感染抑制方法，是抑制菌感染的方法，其特征在于，给予被检体权利要求1所述的抗菌剂。
CN201080033912.9A 2009-07-31 2010-07-30 抗菌剂 Active CN102480952B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2009-178747 2009-07-31
JP2009178747 2009-07-31
PCT/JP2010/062952 WO2011013825A1 (ja) 2009-07-31 2010-07-30 抗菌剤

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102480952A true CN102480952A (zh) 2012-05-30
CN102480952B CN102480952B (zh) 2015-01-21

Family

ID=43529475

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201080033912.9A Active CN102480952B (zh) 2009-07-31 2010-07-30 抗菌剂

Country Status (5)

Country Link
US (1) US9801850B2 (zh)
EP (1) EP2460405B8 (zh)
JP (1) JP5279054B2 (zh)
CN (1) CN102480952B (zh)
WO (1) WO2011013825A1 (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106822265A (zh) * 2017-04-01 2017-06-13 杨涵 一种治疗人乳头瘤病毒感染的环保型抗菌灭活剂
TWI686194B (zh) * 2018-02-27 2020-03-01 林蕭水銀 廣效抗菌及抗癌之醫藥組合物及其用途
CN111228177A (zh) * 2020-03-04 2020-06-05 广州清淞泉生物科技有限公司 一种抑菌易冲洗型泡沫洗手液及其制备方法
CN116162078A (zh) * 2022-12-27 2023-05-26 佛山病原微生物研究院 一种表没食子儿茶素没食子酸酯类化合物及其制备方法和应用

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8952055B2 (en) 2008-02-01 2015-02-10 Protectea, Ltd. Membrane fusion inhibitor
EP3129038A2 (en) * 2014-04-11 2017-02-15 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Use of cranberry proanthocyanidin for treatment of oropharyngeal bacterial colonization
JP6731340B2 (ja) * 2014-07-24 2020-07-29 株式会社プロテクティア アレルゲン活性の抑制剤およびその用途
JP6505905B2 (ja) * 2017-04-14 2019-04-24 株式会社プロテクティア カテキン脂肪酸誘導体の化粧料
JP7001999B2 (ja) 2018-01-04 2022-01-20 日本電気硝子株式会社 光学素子の製造方法
JP2020186197A (ja) * 2019-05-14 2020-11-19 株式会社プロテクティア カテキン脂肪酸誘導体及びキレート剤を含む組成物
CN113933405A (zh) * 2021-09-02 2022-01-14 大海粮油工业（防城港）有限公司 一种基于液相色谱仪检测茶多酚棕榈酸酯含量的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060041010A1 (en) * 2004-08-19 2006-02-23 The Hong Kong Polytechnic University (-)-Epigallocatechin gallate derivatives for inhibiting proteasome
WO2006021888A2 (en) * 2004-08-27 2006-03-02 Universidad De Murcia Dihydrofolate reductase inhibition by epigallocatechin gallate compounds
WO2007105280A1 (ja) * 2006-03-10 2007-09-20 Osaka University エピガロカテキンガレートのアシル化誘導体の製造方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2727471B2 (ja) 1989-09-14 1998-03-11 三井農林株式会社 インフルエンザウィルス感染予防剤
CN1231277A (zh) 1999-01-18 1999-10-13 余姚市四明茶叶生物制品有限公司 脂溶性茶多酚及其酯化法生产方法
JP2001253879A (ja) 2000-03-09 2001-09-18 Shizuoka Prefecture カテキン類のアルキル誘導体
JP2002255810A (ja) 2001-02-27 2002-09-11 Tokyo Food Techno Kk 新規抗菌剤、新規カテキン誘導体およびその製造方法
CA2484736A1 (en) 2002-05-10 2003-11-20 Suntory Limited Gallocatechin gallate-containing composition
AU2003263162B2 (en) * 2002-10-24 2009-05-07 Immupharm A/S Pharmaceutical compositions comprising flavonoids and menthol
WO2004076621A2 (en) 2003-02-27 2004-09-10 Yeda Research And Development Co. Ltd. Compositions of nucleic acids for treating and detecting influenza virus
CN1650856A (zh) 2004-12-10 2005-08-10 华东理工大学 一种治疗肿瘤用的化疗药物的增敏增效剂
CA2596053A1 (en) 2005-01-26 2006-08-03 Suntory Limited Esterified catechins, processes for producing the same, and foods and beverages as well as cosmetics containing such esterified catechins
JP2009084266A (ja) * 2007-09-14 2009-04-23 Osaka Univ エピガロカテキンガレートのアシル誘導体を利用した抗癌剤
US8952055B2 (en) 2008-02-01 2015-02-10 Protectea, Ltd. Membrane fusion inhibitor
EP2619194A4 (en) 2010-04-08 2014-09-10 Genesis Group Inc CATECHIN FATTY ACID DERIVATIVES AND METHODS OF USE

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060041010A1 (en) * 2004-08-19 2006-02-23 The Hong Kong Polytechnic University (-)-Epigallocatechin gallate derivatives for inhibiting proteasome
WO2006021888A2 (en) * 2004-08-27 2006-03-02 Universidad De Murcia Dihydrofolate reductase inhibition by epigallocatechin gallate compounds
WO2007105280A1 (ja) * 2006-03-10 2007-09-20 Osaka University エピガロカテキンガレートのアシル化誘導体の製造方法

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106822265A (zh) * 2017-04-01 2017-06-13 杨涵 一种治疗人乳头瘤病毒感染的环保型抗菌灭活剂
TWI686194B (zh) * 2018-02-27 2020-03-01 林蕭水銀 廣效抗菌及抗癌之醫藥組合物及其用途
CN111228177A (zh) * 2020-03-04 2020-06-05 广州清淞泉生物科技有限公司 一种抑菌易冲洗型泡沫洗手液及其制备方法
CN111228177B (zh) * 2020-03-04 2021-07-23 广州市圣莎拉化妆品有限公司 一种抑菌易冲洗型泡沫洗手液及其制备方法
CN116162078A (zh) * 2022-12-27 2023-05-26 佛山病原微生物研究院 一种表没食子儿茶素没食子酸酯类化合物及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN102480952B (zh) 2015-01-21
EP2460405A1 (en) 2012-06-06
US9801850B2 (en) 2017-10-31
JPWO2011013825A1 (ja) 2013-01-10
WO2011013825A1 (ja) 2011-02-03
EP2460405A4 (en) 2013-01-23
EP2460405B1 (en) 2015-03-18
US20120136049A1 (en) 2012-05-31
EP2460405B8 (en) 2016-07-06
JP5279054B2 (ja) 2013-09-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102480952B (zh) 抗菌剂
Ibrahim et al. Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii as an emerging concern in hospitals
Arima et al. Rutin-enhanced antibacterial activities of flavonoids against Bacillus cereus and Salmonella enteritidis
Marinas et al. Antimicrobial and antioxidant activity of the vegetative and reproductive organs of Robinia pseudoacacia
Tan et al. The bioprospecting of anti-Vibrio Streptomyces species: Prevalence and applications
Shao et al. Novel therapeutic strategies for treating Pseudomonas aeruginosa infection
Boakye et al. Antimicrobial agents: Antibacterial agents, anti-biofilm agents, antibacterial natural compounds, and antibacterial chemicals
CN101932320B (zh) 膜融合抑制剂
Leroy et al. Could azithromycin be part of Pseudomonas aeruginosa acute pneumonia treatment?
Seydlová et al. Surfactin-novel solutions for global issues
WO2020102901A1 (en) Synthetic antibacterial compounds and uses thereof
Chai et al. In vitro synergistic interactions of Protocatechuic acid and Chlorogenic acid in combination with antibiotics against animal pathogens
KR102135648B1 (ko) 항독성 또는 항병원성 활성을 갖는 레오이딘 화합물 및 이의 용도
Yuan et al. Luteolin attenuates the pathogenesis of Staphylococcus aureus by interfering with the agr system
Yang et al. Effect of LongZhang gargle on biofilm formation and acidogenicity of Streptococcus mutans in vitro
Tian et al. Bactericidal activity of gallic acid against multi-drug resistance Escherichia coli
Caiaffa et al. Cytocompatibility and synergy of EGCG and cationic peptides against bacteria related to endodontic infections, in planktonic and biofilm conditions
Goyal et al. A study on combinatorial effects of various flavonoids for their antibacterial potential against clinically significant bacterial species
Zhang et al. A novel antimicrobial peptide Scyreptin1-30 from Scylla paramamosain exhibiting potential therapy of Pseudomonas aeruginosa early infection in a mouse burn wound model
Syed et al. LiF reduces MICs of antibiotics against clinical isolates of Gram-positive and Gram-negative bacteria
Tan et al. Four temporin-derived peptides exhibit antimicrobial and antibiofilm activities against methicillin-resistant Staphylococcus aureus: Anti-MRSA peptides derived from temporin
Adams Bioactivity and genome guided isolation of a novel antimicrobial protein from Thalassomonas viridans
Sibero et al. Antibacterial activity of semi purified extract of marine-derived Trichoderma reesei PDSP 5.7 using bioguided fractionation method
Tao et al. Galleria mellonella as a Good Model to Study Acinetobacter baumannii Pathogenesis. Pathogens. 2021, 10, 1483
CN102652750B (zh) 一种含头孢呋辛的药物组合物及其制剂和制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant