KR102135648B1 - 항독성 또는 항병원성 활성을 갖는 레오이딘 화합물 및 이의 용도 - Google Patents

항독성 또는 항병원성 활성을 갖는 레오이딘 화합물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 레오이딘 화합물의 신규 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 항독성 또는 항병원성 활성을 갖는 레오이딘 화합물, 이의 유도체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 박테리아 감염 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 레오이딘(Leoidin) 또는 이의 유도체는 박테리아의 생장에는 영향을 미치지 않으면서 박테리아에 의한 적혈구 용혈 작용을 억제할 수 있고, sae 및 sarA 조절인자의 발현을 억제하여 이를 통해 다양한 독성 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 또한, 숙주 세포로의 박테리아의 부착 및/또는 침습의 억제를 통해 박테리아 내재화(internalization)도 억제시킬 수 있다. 더욱이, 레오이딘(Leoidin) 또는 이의 유도체는 숙주 세포에 어떠한 독성도 일으키지 않기 때문에, 박테리아 감염의 예방, 개선 또는 치료를 위한 의약품, 화장료 조성물, 건강식품, 동물용 사료, 식품 또는 사료 첨가제 등의 제조에 용이하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 의료용기의 세척이나 나아가 항생제 내성을 가지거나 항생제 처리 시 독성을 가지는 박테리아의 억제용도로 유용하게 사용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

항독성 또는 항병원성 활성을 갖는 레오이딘 화합물 및 이의 용도{Leoidin compound having anti-virulence activity and use thereof}
본 발명은 레오이딘 화합물의 신규 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 항독성 또는 항병원성 활성을 갖는 레오이딘 화합물, 이의 유도체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 박테리아 감염 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
박테리아성 질환의 전세계적인 재출현으로 나타나는 바와 같이 박테리아 병원체는 공공 보건에 대해 심각한 위협을 계속 가하고 있다. 특히, 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus) ("S. aureus")은 인간 집단의 25% 이상을 공생적으로 집락화하는 박테리아다. 중요하게는, 상기 생물체는 집락화의 최초 부위를 깨뜨리고, 박테리아 파종과 질환을 유발할 수 있다. 황색포도상구균 (S. aureus)은 병원 내 감염의 주도적인 원인이고, 전염성 심장내막염 뿐만 아니라 피부와 연조직 감염의 가장 일반적인 원인 병원체이고, 그리고 식품-매개 질환의 4가지 주도적인 원인 중의 하나이다. 전체적으로, 황색포도상구균 (S. aureus)은 미국 병원에서 매년 1.2백만 명 이상의 환자를 감염시키고 있다.
이러한 황색포도상구균 (S. aureus)을 포함한 박테리아 감염을 치료하기 위하여 일반적으로 항생제를 사용한다. 항생제(antibiotics)는 미생물이 생산하는 대사산물로서, 소량으로 다른 미생물의 발육을 억제하거나 사멸시키고, 병원균에 의한 감염증을 치료하는 약물로서 감염 증세에 뛰어난 효능을 보이기 때문에 전 세계적으로 사용되고 있다.
하지만, 항생제의 남용으로 인하여 병원균 스스로 저항할 수 있는 힘을 길러 그 내성이 점차로 강해져 어떤 항생제에도 저항할 수 있게 된 일명 슈퍼박테리아(super bacteria)가 1996년 일본에서 처음 등장함에 따라 항생제의 효과적인 사용에 문제가 발생하였다. 항생제의 경우 박테리아를 죽이는 작용으로 인해 박테리아의 돌연변이를 유도하게 되고, 이러한 돌연변이 형성과정에서 항생제 내성을 유발하는 유전자를 만들게 되어, 약제내성 돌연변이 박테리아가 만들어질 수 있으며, 이 내성균들은 내성 유전자를 다른 세균들에게 전달시켜 주어 내성균의 확대는 신속하게 이루어질 수 있다. 이러한 슈퍼박테리아는 대표적으로 MRSA(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)와 더욱 강한 항생제 내성을 가진 VRSA(Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus) 및 VRE(Vancomycin-resistant Enterococci)를 들 수 있고, 항생제 내성 박테리아의 경우 항생제에 내성을 가지고, 내성은 점차로 강해져 어떤 항생제에도 저항할 수 있게 된다.
이에, 이러한 약제내성 박테리아의 출현을 막기 위해서, 최근에는 감염박테리아를 죽이는 항생제를 처리하는 대신, 생체 내 침투한 박테리아가 숙주를 위협하는데 이용하는 독성인자의 발현이나 활성을 억제하여 병원성을 감소시키는 항독성제를 이용하여 박테리아 감염질환을 치료하는 방법이 대안으로 제시되고 있다. 이러한 항독성제의 의해 독성을 잃은 세균은 인체의 면역작용에 의해 사멸되어 궁극적으로 치료효과를 기대할 수 있게 된다. 이러한 항독성제는 실제로 기존에 알려진 항생제와 전혀 다른 기전으로 작용하므로 감수성균 뿐 아니라 이미 내성을 갖고 있는 다제내성균 감염에 의한 감염질환을 치료하는 치료제로도 사용될 수 있다. 또한 이러한 항독성제는 기존에 사용되고 있는 항생제와 병용투여함으로써 항생제의 투여용량을 줄이거나 활성을 증가시키는데 이용될 수 있다. 이러한 새로운 기전의 항독성제에 대한 연구들이 보고되고 있지만 (한국공개특허 제10-2015-0045216호 참조), 실제로 이러한 방법을 이용한 치료제 개발은 아직 미미한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 내성을 발생시키지 않으면서 감수성 혹은 다제내성 박테리아의 감염질환을 치료할 수 있는 새로운 방법으로서 박테리아의 독성인자를 타겟으로 이들의 독성활성을 저해하거나 독성인자의 발현을 저해하는 항독성 천연물 소재를 발굴하기 위해 연구 노력한 결과, 레오이딘(Leoidin)이 균주의 생장에는 영향을 미치지 않으면서 균의 독성인자 발현, 균에 의한 세포 용혈 및 세포 침습을 현저히 억제하는 항독성 활성을 갖는 다는 것을 확인하였고, 또한 기존에 사용하고 있는 항생제와 병용투여하였을 때 다제내성균의 항생제 감수성을 증가시킨다는 것을 발견하였다, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명의 목적은 레오이딘(Leoidin), 이의 유도체 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 박테리아 감염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 레오이딘(Leoidin), 이의 유도체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 박테리아 감염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 레오이딘은 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112019099626961-pat00001
본 발명의 다른 구현예로, 상기 레오이딘의 유도체는 하기 화학식 2로 표시된 화합물일 수 있다.
[화학식 2]
Figure 112019099626961-pat00002
상기 화학식 2에서,
R1 및 R2는, 각각 독립적으로, 수소, C1~C7의 알킬, C1~C7의 티오알킬(thioalkyl), C1~C7의 아미노알킬(aminoalkyl) 또는 C1~C7의 하이드록시알킬(hydroxyalkyl)이고,
R3은 수소, 하이드록시, 알데히드, 할라이드(halide), CN, ORa, NRb, SRc 또는 COORd이며,
R4는 수소, C1~C7의 알킬, C1~C7의 티오알킬(thioalkyl), C1~C7의 아미노알킬(aminoalkyl), C1~C7의 하이드록시알킬(hydroxyalkyl), 할라이드, CN, ORa, NRb 또는 SRc이고,
Ra, Rb, Rc 및 Rd는, 각각 독립적으로, 수소, 하이드록시, C1~C7의 티오알킬, C1~C7의 아미노알킬 또는 C1~C7의 하이드록시알킬을 나타낸다.
구체적인 일 예로서, 상기 레오이딘 유도체는 하기 화학식 4로 표시된 화합물일 수 있다.
[화학식 4]
Figure 112019099626961-pat00003
본 발명의 다른 구현예로, 상기 레오이딘의 유도체는 하기 화학식 3으로 표시된 화합물일 수 있다.
[화학식 3]
Figure 112019099626961-pat00004
상기 화학식 3에서,
R1 및 R2는, 각각 독립적으로, 수소, C1~C7의 알킬, C1~C7의 티오알킬(thioalkyl), C1~C7의 아미노알킬(aminoalkyl) 또는 C1~C7의 하이드록시알킬(hydroxyalkyl)이고,
R3은 수소, 하이드록시, 알데히드, 할라이드(halide), CN, ORa, NRb, SRc 또는 COORd이며,
R4및 R5는, 각각 독립적으로, 수소, C1~C7의 알킬, C1~C7의 티오알킬(thioalkyl), C1~C7의 아미노알킬(aminoalkyl), C1~C7의 하이드록시알킬(hydroxyalkyl), 할라이드, CN, ORa, NRb 또는 SRc이고,
Ra, Rb, Rc 및 Rd는, 각각 독립적으로, 수소, 하이드록시, C1~C7의 티오알킬, C1~C7의 아미노알킬 또는 C1~C7의 하이드록시알킬을 나타낸다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 조성물은 박테리아에 대한 항독성 또는 항병원성 활성을 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 박테리아에 의한 적혈구 용혈 작용을 억제할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 sae(staphylococcal accessory effector) 또는 sar(staphylococcal accessory regulator) 유전자 발현을 억제할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 박테리아의 내재화(internalization)를 억제할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 박테리아 감염에 의한 숙주세포 손상으로부터 숙주세포를 보호할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 페루스(Streptococcus ferus), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia), 스타필로코커스 사프로피티쿠스(Staphylococcus saprophyticus), 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni), 헬리코박터 파일로리 (Helicobactor pylori), 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 엔테로코커스 피칼리스 (Enterococcus fecalis), 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis), 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 코리네박테리움 디프테리아 (Corynebacterium diphtheriae), 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 리스테리아 이노쿠아 (Listreia innocua), 버크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia), 스트렙토코커스 파라상귀니스 (Streptococcus parasanguinis), 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium), 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus), 스트렙토코커스 상귀니스 (Streptococcus sanguinis), 스트렙토코커스 이니에(Streptococcus iniae), 스트렙토코커스 파이오젠 (Streptococcus pyogene), 스트렙토코커스 미티스(Streptococcus mitis), 리스테리아 이바노비(Listeria Ivanovii subsp ivanovii), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 스트렙토코커스 수이스 (Streptococcus suis), 크로스트리디움 퍼플린젠스 (Clostridium perfringens), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 쉬겔라 보이디(Shigella boydii), 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei), 살모넬라 콜레라에슈이스(Salmonella choleraesuis subsp), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 본고리(Salmonella bongori), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 마이코박테리움 튜버클로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 레프래(Mycobacterium leprae), 크로스트리디움 보툴리늄(Clostridium botulinum), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 클라미디아 뉴모니아(Chlamydia pneumonia), 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 콕시엘라 부르네티(Coxiella burnetii), 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 보렐리아 속(Borrelia sp.), 바르토넬라 속(Bartonella sp.), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 및 마이코플라즈마 뉴모니아(Mycoplasma pneumonia)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 항생제와 함께 제제화하거나 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 항생제는 메티실린(methicillin), 옥사실린(oxacillin), 노르플록사신(norfloxacin), 반코마이신(vancomycin), 아미카신(Amikacin), 젠타마이신(Gentamicin), 카나마이신(Kanamycin), 네오마이신(Neomycin), 네틸마이신(Netilmicin), 토브라마이신(Tobramycin), 파로모마이신(Paromomycin), 스트렙토마이신(Streptomycin), 스펙티노마이신(Spectinomycin), 겔다나마이신(Geldanamycin), 허비마이신(Herbimycin), 리팍시민(Rifaximin), 로라카르베프(Loracarbef), 어타페넴(Ertapenem), 도리페넴(Doripenem), 이미페넴/실라스타틴(Imipenem/Cilastatin), 메로페넴(Meropenem), 세파드록실(Cefadroxil), 세파졸린(Cefazolin), 세팔로틴(Cefalothin), 세팔렉신(Cefalexin), 세파클로르(Cefaclor), 세파만돌(Cefamandole), 세폭시틴(Cefoxitin), 세프프로질(Cefprozil), 세프록심(Cefuroxime), 세픽심(Cefixime), 세프디니르(Cefdinir), 세프디토렌(Cefditoren), 세포페라존(Cefoperazone), 세포탁심(Cefotaxime), 세프포독심(Cefpodoxime), 세프타지딤(Ceftazidime) , 세프티부텐(Ceftibuten), 세프티족심(Ceftizoxime), 세프트리악손(Ceftriaxone), 세페핌(Cefepime), 세프타롤린 포사밀(Ceftaroline fosamil), 세프토비프롤(Ceftobiprole), 테이코플라닌(Teicoplanin), 텔라반신(Telavancin), 달바반신(Dalbavancin), 오리타반신(Oritavancin), 클린다마이산(Clindamycin), 린코마이신(Lincomycin), 뎁토마이신(Daptomycin), 아지트로마이신(Azithromycin), 클래리스로마이신(Clarithromycin), 디리스로마이신(Dirithromycin), 에리스로마이신(Erythromycin), 록시스로마이신(Roxithromycin), 트로린도마이신(Troleandomycin), 테리스로마이신(Telithromycin), 스피라마이신(Spiramycin), 아즈트레오남(Aztreonam), 푸라졸리돈(Furazolidone), 니트로퓨란토인(Nitrofurantoin), 리네졸리드(Linezolid), 포시졸리드(Posizolid), 라데졸리드(Radezolid), 토레졸리드(Torezolid), 아목시실린(Amoxicillin), 엠피실린(Ampicillin), 아즈로실린(Azlocillin), 카르베니실린(Carbenicillin), 클록사실린(Cloxacillin), 디클록사실린(Dicloxacillin), 플루클록사실린(Flucloxacillin), 메즈로실린(Mezlocillin), 나프실린(Nafcillin), 페니실린 G(Penicillin G), 페니실린 V (Penicillin V), 피페라실린(Piperacillin), 테모실린(Temocillin), 티카실린(Ticarcillin), 아목시실린/클라불란산(Amoxicillin/clavulanate), 엠피실린/설박탐(Ampicillin/sulbactam), 피페라실린/타조박탐(Piperacillin/tazobactam), 티카실린/클라불란산(Ticarcillin/clavulanate), 바시트라신(Bacitracin), 콜리스틴(Colistin), 폴리믹신 B(Polymyxin B), 시프로플록사신(Ciprofloxacin), 이녹사신(Enoxacin), 가티플록사신(Gatifloxacin), 제미플록사신(Gemifloxacin), 레보플록사신(Levofloxacin), 로메플록사신(Lomefloxacin), 목시플록사신(Moxifloxacin), 날리딕스산(Nalidixic acid), 오플록사신(Ofloxacin), 트로바플록사신(Trovafloxacin), 그레파플록사신(Grepafloxacin), 스파플록사신(Sparfloxacin), 테마플록사신(Temafloxacin), 마펜나이드(Mafenide), 설파아세타마이드(Sulfacetamide), 설파다이아진(Sulfadiazine), 실버설파다이아진(Silver sulfadiazine), 설파디메톡신(Sulfadimethoxine), 설파메티졸(Sulfamethizole), 설파메톡사졸(Sulfamethoxazole), 설파닐리마이드(Sulfanilimide), 설파살라진(Sulfasalazine), 설피속사졸(Sulfisoxazole), 트리메소프림-설파메톡사졸(Trimethoprim-Sulfamethoxazole(Co-trimoxazole), TMP-SMX), 설폰아미도 크리소이딘(Sulfonamido chrysoidine), 데메클로사이클린(Demeclocycline), 독시사이클린(Doxycycline), 미노사이클린(Minocycline), 옥시테트라사이클린(Oxytetracycline), 테트라사이클린(Tetracycline), 클로파지민(Clofazimine), 답손(Dapsone), 카프레오마이신(Capreomycin), 사이클로세린(Cycloserine), 에탐부톨(Ethambutol), 에티오나미드(Ethionamide), 이소니아지드(Isoniazid), 피라진아미드(Pyrazinamide), 리팜피신(Rifampicin), 리파부틴(Rifabutin), 리파펜틴(Rifapentine), 아르스페나민(Arsphenamine), 클로람페니콜(Chloramphenicol), 포스포마이신(Fosfomycin), 푸시딘산(Fusidi cacid), 메트로니다졸(Metronidazole), 무피로신(Mupirocin), 플라텐시마이신(Platensimycin), 퀴누프리스틴/달포프리스틴(Quinupristin/Dalfopristin), 치암페니콜(Thiamphenicol), 티지사이클린(Tigecycline), 티니다졸(Tinidazole), 및 트리메소프림(Trimethoprim)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 레오이딘(Leoidin), 이의 유도체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 박테리아 감염을 치료하는 방법을 제공한다.
더욱이, 본 발명은 레오이딘(Leoidin), 이의 유도체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염의 박테리아 감염의 예방, 개선, 또는 치료 용도를 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 레오이딘(Leoidin), 이의 유도체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 박테리아 독성 또는 병원성을 억제하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 레오이딘(Leoidin), 이의 유도체 또는 이들의 화장품학적으로 허용가능한 염을 포함하는 박테리아 감염 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 레오이딘(Leoidin) 또는 이의 유도체를 포함하는 박테리아 감염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 레오이딘(Leoidin) 또는 이의 유도체를 포함하는 동물용 사료를 제공한다.
본 발명에 따른 레오이딘(Leoidin) 또는 이의 유도체는 박테리아의 생장에는 영향을 미치지 않으면서 박테리아에 의한 적혈구 용혈 작용을 억제할 수 있고, sae 및 sarA 조절인자의 발현을 억제하여 이를 통해 다양한 독성 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 또한, 숙주 세포로의 박테리아의 부착 및/또는 침습의 억제를 통해 박테리아 내재화(internalization)도 억제시킬 수 있다. 더욱이, 레오이딘(Leoidin) 또는 이의 유도체는 숙주 세포에 어떠한 독성도 일으키지 않기 때문에, 박테리아 감염의 예방, 개선 또는 치료를 위한 의약품, 화장료 조성물, 건강식품, 동물용 사료, 식품 또는 사료 첨가제 등의 제조에 용이하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 의료용기의 세척이나 나아가 항생제 내성을 가지거나 항생제 처리 시 독성을 가지는 박테리아의 억제용도로 유용하게 사용할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 천연물 유래 저분자 화합물 라이브러리로부터 강력한 독성 억제 활성을 갖는 화합물로 스크리닝된 레오이딘(Leoidin) 화합물의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 천연물 유래 저분자 화합물 라이브러리로부터 강력한 독성 억제 활성을 갖는 화합물로 스크리닝된 강갈레오이딘(Gangaleoidin) 화합물의 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 다양한 농도의 레오이딘(1, 2, 4 및 8μM)을 처리한 경우의 USA300에 대한 항독성 효과를 확인한 결과이다.
도 4는 다양한 농도의 강갈레오이딘(1, 2, 5, 10, 15, 20 및 25 μM)을 처리한 경우의 USA300에 대한 항독성 효과를 확인한 결과이다.
도 5는 다양한 농도의 레오이딘(1, 2, 4 및 8μM)을 처리한 경우의 USA300에 의한 적혈구 용혈 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 6은 다양한 농도의 강갈레오이딘(1, 2, 4, 8, 16 및 32 μM)을 처리한 경우의 USA300에 의한 적혈구 용혈 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 7은 레오이딘에 의한 전사 조절 인자의 발현 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 8은 레오이딘에 의한 sae 조절 인자에 의해 조절되는 독성 유전자의 발현 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 9는 레오이딘에 의한 sarA 조절 인자에 의해 조절되는 독성 유전자의 발현 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 10은 레오이딘에 의한 기타 독성 유전자의 발현 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 11은 레오이딘에 의한 Hela 상피 세포에서 USA300의 내재화 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 12는 레오이딘의 S. aureus에 의한 세포 손상으로부터 세포 보호 효과를 확인하기 위해, USA300을 감염시키지 않은 경우(A), 레오이딘을 처리하지 않고 USA300와 함께 배양시킨 경우(B), 4uM 농도의 레오이딘을 처리한 경우(C), 및 8uM의 레오이딘(Leoidin)을 처리한 경우(D)에서의 살아있는 세포와 죽은 세포를 확인한 결과이다.
도 13은 레오이딘과 옥사실린 조합에 의한 상승 효과를 확인하기 위해, 옥사실린을 단독 처리한 경우(A), 4uM 농도의 레오이딘과 조합한 경우(B), 8uM 농도의 레오이딘과 조합한 경우(C)에서의 항독성 효과를 확인한 결과이다.
도 14는 레오이딘과 노르플록사신 조합에 의한 상승 효과를 확인하기 위해, 노르플록사신을 단독 처리한 경우(A), 4uM 농도의 레오이딘과 조합한 경우(B), 8uM 농도의 레오이딘과 조합한 경우(C)에서의 항독성 효과를 확인한 결과이다.
도 15는 레오이딘과 메티실린 조합에 의한 상승 효과를 확인하기 위해, 메티실린을 단독 처리한 경우(A), 4uM 농도의 레오이딘과 조합한 경우(B), 8uM 농도의 레오이딘과 조합한 경우(C)에서의 항독성 효과를 확인한 결과이다.
도 16은 레오이딘과 반코마이신 조합에 의한 상승 효과를 확인하기 위해, 반코마이신을 단독 처리한 경우(A), 4uM 농도의 레오이딘과 조합한 경우(B), 8uM 농도의 레오이딘과 조합한 경우(C)에서의 항독성 효과를 확인한 결과이다.
도 17은 레오이딘의 26종의 병원성 균주에 대한 용혈 억제 효과를 확인한 결과이다.
본 발명자들은 천연물 유래 저분자 화합물 라이브러리로부터 박테리아의 생장에는 영향을 미치지 않으면서 독성 및/또는 병원성을 억제시킬 수 있는 물질을 스크리닝한 결과, 항독성 및/또는 항병원성 물질로써 레오이딘(Leoidin)의 신규한 용도를 규명하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 레오이딘(Leoidin), 이의 유도체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 박테리아 감염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명의 조성물의 투여에 의해 박테리아 감염 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명의 조성물의 투여에 의해 박테리아 감염 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서, 레오이딘(Leoidin)은 천연에서 얻어지거나, 인공적으로 합성된 방법에 의해서도 얻어질 수 있는데, 어떠한 원료나 제조방법 등에 의해 생산되는지 여부를 불문하며, 하기 화학식 1로 나타낼 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112019099626961-pat00005
본 발명에서, "레오이딘(Leoidin)의 유도체"란 레오이딘(Leoidin)과 동일한 활성을 나타내며, 박테리아의 생장에는 영향을 미치지 않으면서 독성 및/또는 병원성을 억제시키는 효과가 있는 화합물로서, 바람직하게는, 하기 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시된 화합물일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
[화학식 2]
Figure 112019099626961-pat00006
상기 화학식 2에서,
R1 및 R2는, 각각 독립적으로, 수소, C1~C7의 알킬, C1~C7의 티오알킬(thioalkyl), C1~C7의 아미노알킬(aminoalkyl) 또는 C1~C7의 하이드록시알킬(hydroxyalkyl)이고,
R3은 수소, 하이드록시, 알데히드, 할라이드(halide), CN, ORa, NRb, SRc 또는 COORd이며,
R4는 수소, C1~C7의 알킬, C1~C7의 티오알킬(thioalkyl), C1~C7의 아미노알킬(aminoalkyl), C1~C7의 하이드록시알킬(hydroxyalkyl), 할라이드, CN, ORa, NRb 또는 SRc이고,
Ra, Rb, Rc 및 Rd는, 각각 독립적으로, 수소, 하이드록시, C1~C7의 티오알킬, C1~C7의 아미노알킬 또는 C1~C7의 하이드록시알킬을 나타낸다.
구체적인 일 예로서, 상기 레오이딘 유도체는 하기 화학식 4로 표시된 화합물일 수 있다.
[화학식 4]
Figure 112019099626961-pat00007
[화학식 3]
Figure 112019099626961-pat00008
상기 화학식 3에서,
R1 및 R2는, 각각 독립적으로, 수소, C1~C7의 알킬, C1~C7의 티오알킬(thioalkyl), C1~C7의 아미노알킬(aminoalkyl) 또는 C1~C7의 하이드록시알킬(hydroxyalkyl)이고,
R3은 수소, 하이드록시, 알데히드, 할라이드(halide), CN, ORa,NRb,SRc또는 COORd이며,
R4 및 R5는, 각각 독립적으로, 수소, C1~C7의 알킬, C1~C7의 티오알킬(thioalkyl), C1~C7의 아미노알킬(aminoalkyl), C1~C7의 하이드록시알킬(hydroxyalkyl), 할라이드, CN, ORa, NRb 또는 SRc이고,
Ra, Rb, Rc 및 Rd는, 각각 독립적으로, 수소, 하이드록시, C1~C7의 티오알킬, C1~C7의 아미노알킬 또는 C1~C7의 하이드록시알킬을 나타낸다.
이때, 화학식 3으로 표시되는 화합물은 화학식 2로 표시되는 화합물로부터 하기의 통상의 반응을 통해 제조될 수 있다.
Figure 112019099626961-pat00009
본 발명에 따른 조성물에 유효성분으로 포함되는 상기 화학식 1로 표시되는 레오이딘(Leoidin), 또는 상기 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 레오이딘(Leoidin) 유도체는 박테리아의 생장에는 영향을 미치지 않으면서 박테리아에 대한 항독성 및/또는 항병원성 활성을 가질 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 화합물인 레오이딘(Leoidin) 또는 이의 유도체는 박테리아에 의한 적혈구 용혈 작용을 억제하고, 전사 조설인자 및 독성 유전자의 발현을 억제하는 작용을 통해 항독성 및/또는 항병원성 활성을 가질 수 있다. 이때, 박테리아는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 페루스(Streptococcus ferus), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia), 스타필로코커스 사프로피티쿠스(Staphylococcus saprophyticus), 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni), 헬리코박터 파일로리 (Helicobactor pylori), 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 엔테로코커스 피칼리스 (Enterococcus fecalis), 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis), 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 코리네박테리움 디프테리아 (Corynebacterium diphtheriae), 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 리스테리아 이노쿠아 (Listreia innocua), 버크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia), 스트렙토코커스 파라상귀니스 (Streptococcus parasanguinis), 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium), 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus), 스트렙토코커스 상귀니스 (Streptococcus sanguinis), 스트렙토코커스 이니에(Streptococcus iniae), 스트렙토코커스 파이오젠 (Streptococcus pyogene), 스트렙토코커스 미티스(Streptococcus mitis), 리스테리아 이바노비(Listeria Ivanovii subsp ivanovii), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 스트렙토코커스 수이스 (Streptococcus suis), 크로스트리디움 퍼플린젠스 (Clostridium perfringens), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 쉬겔라 보이디(Shigella boydii), 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei), 살모넬라 콜레라에슈이스(Salmonella choleraesuis subsp), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 본고리(Salmonella bongori), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 마이코박테리움 튜버클로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 레프래(Mycobacterium leprae), 크로스트리디움 보툴리늄(Clostridium botulinum), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 클라미디아 뉴모니아(Chlamydia pneumonia), 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 콕시엘라 부르네티(Coxiella burnetii), 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 보렐리아 속(Borrelia sp.), 바르토넬라 속(Bartonella sp.), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 및 마이코플라즈마 뉴모니아(Mycoplasma pneumonia)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 화합물인 레오이딘(Leoidin)이 S. aureus에 대한 용혈을 현저히 억제함을 확인하였고(실시예 3 참조), 독성 유전자를 조절하는 전사 조절인자인 sae와 sarA의 발현뿐만 아니라 이들에 주로 조절되는 독성 유전자 및 이외의 독성 유전자의 발현도 현저히 억제함을 확인하였다(실시예 4 및 5 참조).
또한, 본 발명의 화합물인 레오이딘(Leoidin) 또는 이의 유도체는 숙주 세포로의 박테리아의 부착 및/또는 침습의 억제에 의한 박테리아 내재화(internalization)를 억제하는 작용을 통해서도 항독성 및/또는 항병원성 활성을 가질 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 본 발명의 화합물인 레오이딘(Leoidin)이 S. aureus에 의한 내재화를 현저히 감소시키고, 박테리아 감염에 의한 세포 손상으로부터 세포를 농도 의존적으로 보호하는 것을 확인하였다(실시예 6 및 8 참조).
한편, 본 발명에 따른 조성물은 기존의 항생제와 함께 제제화하거나 병용하여 사용할 수 있고, 이때 항생제는, 메티실린(methicillin), 옥사실린(oxacillin), 노르플록사신(norfloxacin), 반코마이신(vancomycin), 아미카신(Amikacin), 젠타마이신(Gentamicin), 카나마이신(Kanamycin), 네오마이신(Neomycin), 네틸마이신(Netilmicin), 토브라마이신(Tobramycin), 파로모마이신(Paromomycin), 스트렙토마이신(Streptomycin), 스펙티노마이신(Spectinomycin), 겔다나마이신(Geldanamycin), 허비마이신(Herbimycin), 리팍시민(Rifaximin), 로라카르베프(Loracarbef), 어타페넴(Ertapenem), 도리페넴(Doripenem), 이미페넴/실라스타틴(Imipenem/Cilastatin), 메로페넴(Meropenem), 세파드록실(Cefadroxil), 세파졸린(Cefazolin), 세팔로틴(Cefalothin), 세팔렉신(Cefalexin), 세파클로르(Cefaclor), 세파만돌(Cefamandole), 세폭시틴(Cefoxitin), 세프프로질(Cefprozil), 세프록심(Cefuroxime), 세픽심(Cefixime), 세프디니르(Cefdinir), 세프디토렌(Cefditoren), 세포페라존(Cefoperazone), 세포탁심(Cefotaxime), 세프포독심(Cefpodoxime), 세프타지딤(Ceftazidime) , 세프티부텐(Ceftibuten), 세프티족심(Ceftizoxime), 세프트리악손(Ceftriaxone), 세페핌(Cefepime), 세프타롤린 포사밀(Ceftaroline fosamil), 세프토비프롤(Ceftobiprole), 테이코플라닌(Teicoplanin), 텔라반신(Telavancin), 달바반신(Dalbavancin), 오리타반신(Oritavancin), 클린다마이산(Clindamycin), 린코마이신(Lincomycin), 뎁토마이신(Daptomycin), 아지트로마이신(Azithromycin), 클래리스로마이신(Clarithromycin), 디리스로마이신(Dirithromycin), 에리스로마이신(Erythromycin), 록시스로마이신(Roxithromycin), 트로린도마이신(Troleandomycin), 테리스로마이신(Telithromycin), 스피라마이신(Spiramycin), 아즈트레오남(Aztreonam), 푸라졸리돈(Furazolidone), 니트로퓨란토인(Nitrofurantoin), 리네졸리드(Linezolid), 포시졸리드(Posizolid), 라데졸리드(Radezolid), 토레졸리드(Torezolid), 아목시실린(Amoxicillin), 엠피실린(Ampicillin), 아즈로실린(Azlocillin), 카르베니실린(Carbenicillin), 클록사실린(Cloxacillin), 디클록사실린(Dicloxacillin), 플루클록사실린(Flucloxacillin), 메즈로실린(Mezlocillin), 나프실린(Nafcillin), 페니실린 G(Penicillin G), 페니실린 V (Penicillin V), 피페라실린(Piperacillin), 테모실린(Temocillin), 티카실린(Ticarcillin), 아목시실린/클라불란산(Amoxicillin/clavulanate), 엠피실린/설박탐(Ampicillin/sulbactam), 피페라실린/타조박탐(Piperacillin/tazobactam), 티카실린/클라불란산(Ticarcillin/clavulanate), 바시트라신(Bacitracin), 콜리스틴(Colistin), 폴리믹신 B(Polymyxin B), 시프로플록사신(Ciprofloxacin), 이녹사신(Enoxacin), 가티플록사신(Gatifloxacin), 제미플록사신(Gemifloxacin), 레보플록사신(Levofloxacin), 로메플록사신(Lomefloxacin), 목시플록사신(Moxifloxacin), 날리딕스산(Nalidixic acid), 오플록사신(Ofloxacin), 트로바플록사신(Trovafloxacin), 그레파플록사신(Grepafloxacin), 스파플록사신(Sparfloxacin), 테마플록사신(Temafloxacin), 마펜나이드(Mafenide), 설파아세타마이드(Sulfacetamide), 설파다이아진(Sulfadiazine), 실버설파다이아진(Silver sulfadiazine), 설파디메톡신(Sulfadimethoxine), 설파메티졸(Sulfamethizole), 설파메톡사졸(Sulfamethoxazole), 설파닐리마이드(Sulfanilimide), 설파살라진(Sulfasalazine), 설피속사졸(Sulfisoxazole), 트리메소프림-설파메톡사졸(Trimethoprim-Sulfamethoxazole(Co-trimoxazole), TMP-SMX), 설폰아미도 크리소이딘(Sulfonamido chrysoidine), 데메클로사이클린(Demeclocycline), 독시사이클린(Doxycycline), 미노사이클린(Minocycline), 옥시테트라사이클린(Oxytetracycline), 테트라사이클린(Tetracycline), 클로파지민(Clofazimine), 답손(Dapsone), 카프레오마이신(Capreomycin), 사이클로세린(Cycloserine), 에탐부톨(Ethambutol), 에티오나미드(Ethionamide), 이소니아지드(Isoniazid), 피라진아미드(Pyrazinamide), 리팜피신(Rifampicin), 리파부틴(Rifabutin), 리파펜틴(Rifapentine), 아르스페나민(Arsphenamine), 클로람페니콜(Chloramphenicol), 포스포마이신(Fosfomycin), 푸시딘산(Fusidi cacid), 메트로니다졸(Metronidazole), 무피로신(Mupirocin), 플라텐시마이신(Platensimycin), 퀴누프리스틴/달포프리스틴(Quinupristin/Dalfopristin), 치암페니콜(Thiamphenicol), 티지사이클린(Tigecycline), 티니다졸(Tinidazole), 및 트리메소프림(Trimethoprim)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 메티실린(methicillin), 옥사실린(oxacillin), 노르플록사신(norfloxacin), 및 반코마이신(vancomycin)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명의 화합물인 레오이딘(Leoidin)과 기존 항생제인 메티실린, 옥사실린, 노르플록사신 및 반코마이신(vancomycin)을 조합하여 항생제 내성균에 처리하는 경우 현저히 우수한 항생 활성을 가짐을 확인하였다(실시예 9 참조).
본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 레오이딘(Leoidin) 또는 이의 유도체는 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 수화물 및 용매화물을 모두 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용하는 경우, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.
본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 레오이딘(Leoidin)을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 동량의 레오이딘(Leoidin) 및 물 중의 산 또는 알코올을 가열하고, 이어서 이 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
본 발명의 약학적 조성물은 임상투여 시에 다양한 하기의 경구 또는 비경구 투여 형태로 제제화되어 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/ 또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.
레오이딘(Leoidin) 또는 이의 유도체를 유효 성분으로 포함하는 약학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사, 흉부 내 주사 또는 경피투여 방법에 의할 수 있으며, 바람직하게는 도포에 의한 국부 투여 (topical application) 방식으로 적용될 수 있다.
이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 레오이딘(Leoidin), 이의 유도체 또는 이들의 약학적으로 허용되는 염을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 레오이딘(Leoidin), 이의 유도체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 박테리아 감염의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 레오이딘(Leoidin), 이의 유도체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 박테리아의 독성 또는 병원성을 억제시키는 방법을 제공한다.
본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 레오이딘(Leoidin), 이의 유도체 또는 이들의 화장품학적으로 허용가능한 염을 포함하는 박테리아 감염 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에 함유된 화장품학적으로 유효한 담체는 제형에 따라, 당업계에서 통상적으로 이용되는 담체가 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로 플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제,에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분과 담체 성분 이외에, 화장품학적 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 레오이딘(Leoidin) 또는 이의 유도체를 포함하는 박테리아 감염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다. 본 발명에서, 레오이딘(Leoidin) 또는 이의 유도체는 항독성 및/또는 항병원성 효과가 있는 건강기능식품, 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 음료의 제조에 용이하게 활용할 수 있다.
본 발명에서 상기 "건강기능식품"이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 이는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
상기 레오이딘(Leoidin) 또는 이의 유도체의 양은 전체 건강기능식품 중량의 0.001 중량% 내지 90 중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.1 중량% 내지 40 중량%로 포함할 수 있고, 장기간 섭취 용도일 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으나, 유효성분이 안전성 면에서 아무런 문제가 없어 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있기 때문에 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 레오이딘(Leoidin) 또는 이의 유도체를 포함하는 동물용 사료를 제공한다. 상기 동물용 사료는 임의의 적절한 형태, 예컨대 건조 형태, 반-습윤 형태 또는 습윤 형태일 수 있고, 이는 냉장 또는 장기 보존되는 애완동물 사료 제품일 수 있다. 상기 동물용 사료는 본 발명에 따른 레오이딘(Leoidin) 또는 이의 유도체 이외에, 임의의 탄수화물원, 단백질원 및 지질원을 함유할 수 있다. 상기 동물용 사료는 당해분야에 널리 알려진 통상의 제조방법, 즉 압출 성형(extrusion cooking)이나, 굽기 (baking) 및 기타 적당한 가공법을 이용하에 제조될 수 있다. 동물용 사료를 압출 성형할 경우, 보통 키블(kibble) 형태로 제공될 수 있다. 습윤 식품 또는 습윤 애완동물 사료의 경우, 육류 모방 제품 형태로 제공될 수 있다. 청크 타입(chunk type) 제품의 제조를 위한 다른 방법 또한, 예컨대 스팀 오븐에서 조리시 사용할 수 있다. 이와 다르게, 적절한 육재료를 유화하여 고기 유화물을 제조하고, 적절한 겔화제를 가하고, 고기 유화물을 가열한 후 캔 또는 기타 용기에 담아서 로프 타입(loaf type) 제품을 제조할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 실험준비 및 분석방법
1-1. 균주 배양 및 리포터 시스템(reporter system) 제작
다제내성을 지닌 황색포도상구균(S. aureus) 균주(USA300)는 에어레이션(aeration)을 구비한 회전진탕배양기(rotary shaker)에서 37℃, TSB(tryptic soy broth) 배지에서 배양하였다.
한편, 독성 리포터 균주 (Virulence reporter strain)는 USA300에 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP)이 융합된 hla 프로모터를 도입하여 제작하였다. 리포터 균주의 선별을 위해, 배양 배지에 5 μg/ml 클로람페니콜(chloramphenicol)(Sigma-Aldrich, USA)을 첨가하였다. 생균수는 희석된 배양물을 TSA(tryptic soy agar)에서 도말하여 측정하였다.
1-2. 후보 화합물 스크리닝
약 800개의 천연물 유래 화합물을 포함하고 있는 라이브러리를 Microsource discovery systems, Inc, USA.로부터 구입하였다. 모든 화합물은 95% 순도를 가지며, 추가적인 정제 없이 사용하였다. 라이브러리 화합물의 항균 및 항독성 활성을 측정하는 고속대량스크리닝(high-throughput screening)을 위해 상기 실시예 1-1에서 제작된 리포터 균주를 사용하였다. 즉, 리포터 균주 콜로니를 TSA 플레이트로부터 수집하고, OD600에서 1이 되도록 신선한 TSB 배지가 있는 튜브에 현탁시켰다. 이후, 회전진탕배양기(rotary shaker)에서 180 rpm, 37℃ 조건에서 지수기(exponential phase)까지 배양시키고, 초기 지수기(early exponential phase)에서 ～2×107 CFU ml-1의 세포 밀도가 되도록 신선한 배지에서 희석시켰다. 희석된 배양액은 48-well plate(Nunc, Wiesbaden, Germany)의 각 well에 첨가하였다. 10 μM의 천연 화합물을 처리하고 6시간 동안 배양 후, 600nm에서의 흡광도와 480/520 nm에서 형광을 측정하였다. 이때, 비히클(미처리 대조군)과 비교하여 박테리아의 생장을 감소시키지 않으면서 GFP 생산을 감소시키는 경우에 해당 화합물이 활성이 있다고 기록하였다.
1-3. 화합물의 유효 농도 결정
실시예 1-1에 의해 제작된 리포터 균주를 TSB에서 하룻밤동안 배양하고, 신선한 TSB 배지에서 1:100으로 희석시키고 초기 지수기까지 배양한 후, 배양액 100μl(2x107 박테리아 함유)을 화합물의 2배-연속희석물 및 비히클(미처리 대조군)과 함께 멸균된 폴리스티렌 재질의 48-well plate에 첨가하였다. 상기 plate를 37℃에서 6시간 동안 배양한 후, 형광을 측정하였다. 화합물의 유효 농도는 비히클(대조군)과 비교하여 IC50 및 IC90을 측정함으로써 산출하였다.
1-4. 항-독성 활성(Anti-virulent activity) 분석
USA300을 TSB에서 하룻밤동안 배양하고, 신선한 TSB 배지에서 1:100으로 희석시키고 초기 지수기까지 생장시킨 후, 다양한 농도의 레오이딘(Leoidin) 또는 이의 유도체를 첨가 또는 첨가하지 않은 배양액 500μl을 멸균된 폴리스티렌 재질의 48-well plate에 분주하였다. 배양액을 37℃에서 6시간 동안 200rpm 회전진탕배양기(rotary shaker)에서 생장시킨 후 레오이딘의 경우 595nm에서, 이의 유도체의 경우 600nm에서 흡광도를 측정하였다.
1-5. 용혈활성(Hemolytic activity) 분석
레오이딘(Leoidin) 또는 이의 유도체의 항-용혈활성은 인간 유래 적혈구를 사용하여 측정하였다. USA300을 하룻밤동안 배양하고, 신선한 TSB 배지 20ml에서 OD600=0.1이 되도록 희석한 후, OD600=0.6이 되도록 3시간동안 37℃에서 배양하였다. 4℃, 10분 동안 10,000xg에서 원심분리하여 세포를 수집한 후, PBS(phosphate buffer saline) 20ml에서 재현탁하였다. 2% 적혈구는 1ml의 신선한 탈섬유소 혈액을 원심분리하여 얻었고, 이를 1ml의 멸균 PBS 내에서 재현탁하였다. 그리고 나서, PBS로 반복하여 세척한 후 PBS 0.75ml에서 재현탁하였으며, 2% 적혈구 현탁액이 분석을 위해 준비되었다. 다양한 농도의 레오이딘을 첨가 또는 첨가하지 않은 배양액 100μl을 2% 적혈구 세포 900μl와 혼합하여 3시간 동안 37℃에서 배양하였다. 앨리쿼트(aliquot)를 원심분리하고, 용혈율은 540nm에서의 흡광도에 의해 측정되었다.
1-6. Quantitative real time RT-PCR 분석
레오이딘(Leoidin) 8μM 첨가 또는 첨가하지 않은 USA300 균주를 초기 지수기까지 생장시켰다. Qiagen RNA Protect Bacteria Reagent 및 RNeasy Mini Kit (Qiagen)를 사용하여 총 RNA를 분리 및 정제하고, 기계적 및 효소적 분쇄를 실시하였다. 실리카 컬럼을 사용하여 RNA를 정제하고, DNase를 처리하여 DNA 오염물(contaminantion)을 제거하였다. Eco dry premix random hexamers (Clontech Laboratories, Inc.) 및 서모사이클러(Applied biosystem)를 사용하여 RNA로부터 cDNA를 얻었고, 이때 반응은 제조사의 지침에 따라 42℃에서 60분으로 설정되었고, 72℃에서 10분간 정지되었다. Quantitative PCR은 iTaq universal SYBR green supermix (Bio Rad)과 BioRad Real-Time PCR system를 사용하여 수행되었고, 이때 반응조건은 다음과 같다 : 95℃에서 5초간 변성(denaturation), 60℃에서 15초간 결합(annealing), 30 사이클 이상. 반응은 3회 실시하였고, 이때 사용된 프라이머 정보는 하기 표 1에 나타내었다. 한편, 결과는 16S 및 ProC에 상대적으로 전사가 몇 배 증가 하였는지로 표시하였다.
구분 서열정보
FP(forward primer) RP(reverse primer)
agrA 5'-ACAGACTCATTGCCCATT-3'(서열번호 1) 5'-AACGTTTCTCACCGATGC-3'(서열번호 2)
SaeS 5'-ACCGCACATTAGAAGTGA-3'(서열번호 3) 5'-AATCCAATACCTTCATC-3'(서열번호 4)
sarA 5'-CAATGGTCACTTATGCTG-3'
(서열번호 5)		 5'-TCTTTCATCATGCTCATTAC-3'
(서열번호 6)
sigB 5'-AGTGAGCGATGAACTAACC-3'
(서열번호 7)		 5'-CTTGTTGCCCATAATATC-3'
(서열번호 8)
hla 5'-CAACAACACTATTGCTAGGTTCCATATT-3'
(서열번호 9)		 5'-CCTGTTTTTACTGTAGTATTGCTTCCA-3'
(서열번호 10)
ent 5'-AGTTGCTGGCAGAGTGTA-3'
(서열번호 11)		 5'-GTAGCTCTTTATGCGACTC-3'
(서열번호 12)
coa 5'-TAATGTAGATTGGGCAATTACA-3'
(서열번호 13)		 5'-ATGCTTTAATTCAGTTAGAAGC-3'
(서열번호 14)
plc 5'-TTCAATGGGCAGACAATGCG-3'
(서열번호 15)		 5'-CCTCCAGACGCTACACTCAA-3'
(서열번호 16)
sspB 5'-GGAAGGTCTTGCTCACTTACTT-3'
(서열번호 17)		 5'-CTCATGGTGTGCAGGATTCA-3'
(서열번호 18)
sspA 5'-TCCCACATTGTTGCTACAGG-3'
(서열번호 19)		 5'-TCAGGCGAAGGTGATTTAGC-3'
(서열번호 20)
nuc 5'-ATGGTCCTGAAGCAAGTG-3'
(서열번호 21)		 5'-GCCAAGCCTTGACGAACTA-3
(서열번호 22)
sak 5'-GCTCTGATAAATCTGGGACAAC-3'
(서열번호 23)		 5'-TGGGCATTAGATGCGACAG-3'
(서열번호 24)
aur 5'-TGTCTGCGTGTACTTTCACTTC-3'
(서열번호 25)		 5'-AAGAGTGATGCGGTCAAAGC-3'
(서열번호 26)
lukS 5'-GTCTGGAACAAAATAGTCTCTCGG-3'
(서열번호 27)		 5'-GGTCCATCAACAGGAGGTAATG-3'
(서열번호 28)
lukF 5'-TGTGCTTCAACATCCCAACC-3'
(서열번호 29)		 5'-ACGGTAGGTTATTCTTATGGTGGAG-3
(서열번호 30)
hlgA 5'-ATCAATCGGAGGCAGTGGC-3'
(서열번호 31)		 5'-GCAGATACTTGACCATTCGGTG-3'
(서열번호 32)
hlgB 5'-CTATCACACAGACAAGATGGCG-3'
(서열번호 33)		 5'-CCCAGTAGAAGCCATTCCAAC-3
(서열번호 34)
hlgC 5'-TCCAATCAGCCCCATCAC-3'
(서열번호 35)		 5'-TTTGACGCCCCATAAAACAC-3'
(서열번호 36)
chp 5'-ACACACCATCATTCAGCGA-3'
(서열번호 37)		 5'-AGCGTTGTAGGAAGACCAC-3'
(서열번호 38)
Cap5 5'-ATGACGATGAGGATAGCG-3'
(서열번호 39)		 5'-CTCGGATAACACCTGTTGC-3'
(서열번호 40)
sdrE 5'-TCAGTAAGAACAGATGCTAATGGTC-3'
(서열번호 41)		 5'-GAGTCTTTTTCACCATCAGTTGTTC-3'
(서열번호 42)
isdH 5'-AGATCAAGCGTCAAGCCAAC-3'
(서열번호 43)		 5'-TCATCTGCTGGTGGATACTG-3'
(서열번호 44)
clfA 5'-TTTCAACAACGCAAGATA-3'
(서열번호 45)		 5'-GCTACTGCCGCTAAACTA-3'
(서열번호 46)
clfB 5'-TTTGGGATAGGCAATCATCA-3'
(서열번호 47)		 5'-TCATTTGTTGAAGCTGGCTC-3'
(서열번호 48)
fnbA 5'-TACCCGTTTCCACTTTCGC-3'
(서열번호 49)		 5'-GGCTACACAAAATCAAGTCGC-3'
(서열번호 50)
fnbB 5'-GTGTTGATTGTGATGGTTGCTC-3'
(서열번호 51)		 5'-GTAGAGGAAAGTGGGAGTTCAG-3'
(서열번호 52)
psma 5'-GCCATCCCAACTTAATAACCATGT-3'
(서열번호 53)		 5'-TATCAAAAGCTTAATCGAACAATTC-3'
(서열번호 54)
geh 5'-AGGCGTGGTGTCAGTGTTAG-3'
(서열번호 55)		 5'-TCGCATTCCCTTGTTCTCCC-3'
(서열번호 56)
eap 5'-GTTACTGCCACTTTAGCATTGG-3'
(서열번호 57)		 5'-AGGAACAGTGTGATAACCATCC-3'
(서열번호 58)
cap8 5'-CAGCAGTTAAAGTCGCACCA-3'
(서열번호 59)		 5'-GAACCCAATACAGGCAATCCT-3'
(서열번호 60)
1-7. 세포 생존능 분석
Hela 세포를 5% CO2챔버에서, 10% FBS(fetal bovine serum, Invitrogen)이 첨가된 DMEM에서 배양하였다. 레오이딘(Leoidin)(IC50 및 IC90과 동일한 농도)을 처리하여 1시간 동안 배양한 후, 12-well micro-titre plate에 배치된 커버 글라스에 첨가하였다. 모든 실험은 3 회 반복 수행 하였다. 하룻밤 동안 배양된 USA300 배양액을 4℃에서 10분 동안 4000rpm으로 원심분리하였다. 세포를 DMEM 배지로 3회 세척하고, OD=1 (약 109 cfu/ml 함유)로 설정하였다. 2x107cfu/ml의 USA300을 well에 분주하고, 6시간동안 배양하였다. 세포를 FDA(fluorescein diacetate) 및 PI(propidium iodide)로 염색을 하고, 염색된 세포는 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 확인하였다.
1-8. 세포 증식 분석
세포증식분석은 제조사 지침서에 따라 EZ-Cytox 세포 생존능 측정 시약 (Daeil lab services Co, Seoul, Korea)을 사용하여 실시하였다. 즉, Hela 세포를 5% CO2 챔버에서, 10% FBS(fetal bovine serum, Invitrogen)이 첨가된 DMEM에서 배양하였다. 세포를 96-well plate(well당 1x105cells 밀도)에 접종하고 well 상에 부착하여 24시간동안 배양하였다. 2 μM 에서 10 μM의 레오이딘(Leoidin)을 각 well에 첨가하고, 72시간 동안 배양한 후, EZ-Cytox 시약 20 μl을 각 well에 첨가하였다. 그리고 나서 CO2 가습 배양기에서 37℃, 3시간 동안 배양하였다. 배양 후, 마이크로플레이트 흡광 리더기 (Tecan infinite m200, Switzerland)를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였고, 모든 실험은 3회 반복하였다.
1-9. 세포 내재화 분석
S. aureus 기반의 세포 침윤에 따른 내재화분석은 젠타마이신 (gentamycin) protection assays를 사용하여 수행하였다. 즉, Hela 세포를 5% CO2 챔버에서, 10% FBS(fetal bovine serum, Invitrogen)를 함유하는 DMEM 배지에서 배양하였다. 포화도(confluency)가 70%에 도달할 때, well당 5x105 세포를 유리 커버 슬립을 포함하는 24-well plate에 도포하고 48시간 동안 plate를 배양하였다. USA300을 TSB에서 하룻밤 동안 배양하고, 원심분리(4000rpm, 10분)한 후, 박테리아 세포를 DMEM에 현탁시키고, 109cfu/ml에 해당하는 OD600=1로 조정하였다. 박테리아 처리 1시간 전에, IC50 및 IC90 농도의 레오이딘(Leoidin)을 각 well에 첨가 하였다. Hela 세포상에 약 1x107 세포를 처리하고, CO2, 37℃ 조건에서 90분 동안 배양하여, 그 결과 감염다중도(multiplicity of infection, MOI)가 100이 되었다. 배양 후, 세포를 세척하고, 세포밖 또는 부착 포도상 구균을 용해하기 위해 젠타마이신(10 μg/mL)을 60분 동안 첨가하였다. 이후, 세포를 PBS로 세척하고, TSA plate 상에 도말한 후 24시간 동안 plate를 배양하고, 형성된 콜로니를 카운트하였다.
1-10. 항생제와 조합에 따른 상승 효과 분석
레오이딘(Leoidin)과 항생제의 조합은 바둑판 방법(checkerboard method)을 사용하여 결정하였다. 먼저, 4개의 약물인 메티실린(methicillin), 옥사실린(oxacillin), 노르플록사신(norfloxacin) 및 반코마이신(vancomycin)의 IC50을 산출하였다. USA300을 하룻밤동안 37℃에서 180rpm으로 지속적으로 흔들면서 TSB 내에서 배양하고, 0.1-10 μg/ml의 범위의 다양한 농도의 항생제와 함께 신선한 TSB 배지에서 1:100으로 희석하였다. 그리고 나서, 4가지 항생제 약물의 IC50을 단독, 또는 4 μM 또는 8 μM의 레오이딘(Leoidin)과 조합하여 처리하였다.
상기 항생제의 FIC (Fractional Inhibitory Concentration)는 하기 식을 사용하여 결정하였다.
FIC of Drug (FICA) = MIC of Drug in combination with leoidin/MIC of drug
1-11. 통계 분석
통계분석은 graph pad prism software (version 4.03)를 사용하여 수행되었다. ANOVA가 사용되고, 이어서 Graph Pad prism program version 6.0 (Graph Pad Software Inc., San Diego, CA)을 이용하여 Newman-Keuls 다중비교 시험을 하였다. 의미의 최소 수준은 P ≤ 0.001로 하였다. 모든 분석은 세 번 실시하고 통계 분석이 이루어졌다.
실시예 2. 항독성 활성(Anti-virulent activity) 효과 검증
실시예 1-2에 기재된 방법을 통해 스크리닝에 시험된 800개의 화합물 중에서, 강력한 독성 억제 활성을 갖는 레오이딘(Leoidin) 및 강갈레오이딘(Gangaleoidin)을 확인(도 1 및 도 2 참조)하고, 실시예 1-4에 기재된 방법을 통해 다양한 농도의 레오이딘(1, 2, 4 및 8 μM) 또는 강갈레오이딘(1, 2, 5, 10, 15, 20 및 25 μM)을 처리한 경우에서의 항독성 활성 효과를 확인하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 레오이딘(Leoidin)은 박테리아 생장을 95% 이상 유지하면서 녹색형광단백질(GFP) 생산을 50% 미만으로 억제하는 것을 확인할 수 있었고, 특히, 4 μM (IC50)및 8 μM (IC90)의 농도에서 녹색형광단백질(GFP) 생산을 50% 및 90% 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, 강갈레오이딘(Gangaleoidin)은 박테리아 생장을 95% 이상 유지하면서 녹색형광단백질(GFP) 생산을 50% 미만으로 억제하는 것을 확인할 수 있었고, 특히, 10 μM (IC90)의 농도에서 녹색형광단백질(GFP) 생산을 90% 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터, 레오이딘(Leoidin) 및 강갈레오이딘(Gangaleoidin)이 항병원성 제제로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 3. S. aureus에 대한 용혈 억제 효과 검증
레오이딘(Leoidin) 또는 강갈레오이딘(Gangaleoidin)이 S. aureus의 용혈작용을 억제하는 활성이 있는지 확인하기 위해, 실시예 1-5에 기재된 방법을 통해 다양한 농도의 레오이딘(1, 2, 4 및 8 μM) 또는 강갈레오이딘(1, 2, 4, 8, 16 및 32 μM)을 처리한 경우에서의 S. aureus에 대한 용혈 억제 효과를 분석하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 레오이딘(Leoidin)은 S. aureus에 의한 적혈구의 용혈을 상당히 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 보다 구체적으로, 4 μM의 레오이딘을 첨가한 경우에는 50%까지 용혈 활성을 억제하였고, 8 μM의 경우에는 측정 가능한 용혈 활성이 발견되지 않았다.
또한, 도 6에 나타낸 바와 같이, 강갈레오이딘(Gangaleoidin)은 S. aureus에 의한 적혈구의 용혈을 상당히 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 보다 구체적으로, 2 μM의 레오이딘을 첨가한 경우에는 30%까지 용혈 활성을 억제하였고, 8 μM의 경우에는 측정 가능한 용혈 활성이 발견되지 않았다.
상기 결과로부터, 레오이딘(Leoidin) 및 강갈레오이딘(Gangaleoidin)은 용혈을 일으키는 α-용혈소(α-hemolysin)의 효과적인 억제자임을 알 수 있었다.
실시예 4. 레오이딘(Leoidin)의 전사 조절 인자 발현 억제 효과 검증
이전 연구에서, S. aureus에 의해 분비되는 가장 필수적 외독소 중 하나인 α-용혈소(α-hemolysin)의 생산은 sae(staphylococcal accessory effector)에 의해 조절되는 것으로 보고되었다. 또한, hla의 발현은 sar(staphylococcal accessory regulator) 및 agr (accessory gene regulator)에 의해 영향을 받는다고 보고되었다. 따라서, 레오이딘(Leoidin) 처리에 의해 이러한 전사 조절 인자의 발현이 억제될 수 있는지를 실시예 1-6에 기재된 방법을 통해 확인하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 레오이딘(Leoidin)을 처리하지 않은 대조군과 비교할 때, 레오이딘(Leoidin)을 처리한 배양액에서 saeS 및 sarA 발현 수준이 각각 74% 및 50%로 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 한편, agrA와 같은 다른 주요 조절 인자에서는 억제 효과를 나타내지 않았다. 상기 결과로부터, 레오이딘(Leoidin)은 α-용혈소(α-hemolysin)의 발현을 억제할 뿐만 아니라, sae 및 sarA 조절인자를 통해 다양한 독성 유전자를 억제할 수 있기 때문에, 다른 외독소에 대한 항-독성 치료제로도 적용이 가능할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 5. 레오이딘(Leoidin)의 독성 유전자 발현 억제 효과 검증
레오이딘(Leoidin) 처리에 의해 S. aureus(USA300)의 독성 유전자 발현이 억제될 수 있는지를 실시예 1-6에 기재된 방법을 통해 확인하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 레오이딘(Leoidin)을 처리하지 않은 대조군과 비교할 때 레오이딘(Leoidin)을 처리하는 경우, sae에 의해 주로 조절되는 hla, eap, nuc, lukS, isdH 및 다양한 용혈소(hlgA, hlgB 및 hlgC)의 발현이 현저히 억제됨을 확인할 수 있었다. 특히, hla의 경우에는 발현 수준이 82%로 감소하였다. 마찬가지로, 레오이딘(Leoidin)을 처리하는 경우, 도 9에 나타낸 바와 같이, sarA에 의해 전사가 조절되는 cap8, clumping factors (clfA 및 clfB), 피브로넥틴 결합 단백질 (fnbA, fnbB)의 발현도 현저히 억제됨을 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라, 도 10에 나타낸 바와 같이, plc, psm(phenol-soluble modulins), geh (lipases), 프로테아제 (sspA, sspB) 및 sak(staphylokinases)의 경우에도 레오이딘(Leoidin)을 처리하는 경우 발현이 현저히 억제됨을 확인할 수 있었다(도 10의 A). 또한, CHIPS (chemotaxis inhibiting protein)의 발현도 약 2배 정도 감소하였고, 호중구에 의한 박테리아의 식균 작용을 억제하는 aureolysin과 면역 회피에 중요한 역할을 하는 sdrE (Serine-aspartate repeat protein)의 발현도 각각 91% 및 38% 정도 감소함을 확인할 수 있었다(도 10의 B). 한편, 장독소(enterotoxin), SigB, cap5 (capsular polysaccharide) 및 coa (coagulase)의 전사에서는 별다른 영향을 미치지 않았다.
실시예 6. 레오이딘(Leoidin)의 S. aureus의 세포내재화(internalization) 억제 효과 검증
상피세포에서 S. aureus의 부착(Adherence) 및 침습(invasion)에 따른 세포내재화는 다양한 감염이 일어나는데 기본적이면서 필수적인 단계이다. 따라서, 숙주 세포 내에서 레오이딘(Leoidin) 처리에 의해 이러한 S. aureus의 내재화가 억제될 수 있는지를 확인하기 위해, gentamycin protection assay를 수행하였다. 즉, 레오이딘(Leoidin) 존재 하에서, Hela 세포에 USA300을 처리하여 세포 내재화를 유도하고, 내재화되지 않은 세포외 박테리아는 젠타마이신을 이용하여 제거하였다. 이 후 숙주 세포를 용해하여 내재화된 USA300을 카운트하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 90분 동안 1x107의 USA300 세포를 5x105 Hela 세포에 처리하였을 때, 대조군과 비교하여, 레오이딘(Leoidin)을 처리한 경우 내재화가 감소되었고, 특히 8 μM/ml의 레오이딘(Leoidin)을 처리한 경우에 USA300에 의한 내재화가 현저히 감소되었음을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, 레오이딘(Leoidin)이 부착 및 내재화에 필요한 표면 결합 단백질의 발현을 억제함으로써 박테리아의 침습을 억제할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
실시예 7. 레오이딘(Leoidin)의 세포 독성 검증
상기 실시예 6에 의한 내재화 분석에서 레오이딘(Leoidin)의 효능을 확인한 후, Hela 세포에 대한 이들의 독성을 분석하였다. 그 결과, Hela 세포에서 레오이딘(Leoidin) 첨가는 8 μM 농도에서 어떠한 독성 효과도 보이지 않았고, 처리 72시간 후의 Hela 세포의 생존능도 대조군과 거의 동일함을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, 레오이딘(Leoidin)은 상피세포에서 부작용을 일으키지 않고, S. aureus 감염을 약화시킬 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 8. 레오이딘(Leoidin)의 S. aureus에 의한 세포 손상으로부터 세포 보호 효과 검증
상기 실시예 3 내지 실시예 5로부터 레오이딘(Leoidin)이 용혈소 및 다양한 독성 유전자 발현을 억제할 수 있음을 확인하였기 때문에, 레오이딘(Leoidin)이 박테리아 감염에 의한 숙주세포 손상으로부터 숙주세포를 보호할 수 있는지를 실시예 1-7에 기재된 방법을 통해 확인하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, USA300을 감염시키지 않은 대조군 세포는 녹색 형광을 유지한 반면(도 12의 A), 레오이딘(Leoidin)을 처리하지 않고 USA300와 함께 배양시키는 경우, 죽은 세포가 적색으로 염색됨을 확인할 수 있었다(도 12의 B). 하지만, 4 μM 농도의 레오이딘(Leoidin)을 처리한 경우, 죽은 세포가 감소되었으며(도 12의 C), 8 μM의 레오이딘(Leoidin)을 처리한 경우에는 세포가 녹색을 유지하는 것을 확인함으로써 레오이딘이 USA300 감염으로부터 세포를 거의 완벽히 보호함을 확인할 수 있었다(도 12의 D). 상기 결과로부터, 레오이딘(Leoidin)은 박테리아 감염에 의한 세포 손상으로부터 세포를 농도 의존적으로 보호한다는 것을 알 수 있었다.
실시예 9. 레오이딘(Leoidin)과 항생제 조합에 따른 상승 효과 검증
S. aureus의 항생제로 잘 알려진 4가지 항생제인 메티실린(methicillin), 옥사실린(oxacillin), 노르플록사신(norfloxacin) 및 반코마이신(vancomycin)과 레오이딘(Leoidin)과의 조합에 의한 항생효과의 상승 효과를 실시예 1-10에 기재된 방법을 통해 확인하였다. 다제내성균인 USA300의 경우 본 실험에 사용한 항생제들에 대한 저항성을 가지고 있기 때문에 우선 각 항생제 별로 균의 성장을 50% 이상 감소시키는 농도 (IC50)를 결정하였다 (1 μg/ml methicillin, 1 μg/ml oxacillin, 1 μg/ml norfloxacin 또는 5 μg/ml vancomycin). 이 후, 4 μM, 8 μM의 레오이딘과 IC50 농도의 항생제를 조합하여 균에 처리한 뒤 균의 성장 저해 정도를 관찰하였다.
그 결과, 도 13 내지 도 16에 나타낸 바와 같이, 항생제와 레오이딘(Leoidin)과의 조합은 대부분 항생제 단독 처리의 경우보다 현저히 우수한 성장억제 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 보다 구체적으로, 8 μM(IC90)의 레오이딘(Leoidin)과 옥사실린, 메티실린 및 노르플록사신과의 조합은 각각 72%, 70% 및 70.9% 억제를 나타내었고, 반코마이신의 경우에는 4 μM(IC50)의 레오이딘(Leoidin)과 조합할 때 70%, 8 μM(IC90)의 레오이딘(Leoidin)과 조합할 때는 88.22% 억제를 나타내었다.
실시예 10. 레오이딘(Leoidin)의 다른 병원성 박테리아의 용혈 억제 효과 검증
레오이딘(Leoidin)이 S. aureus 외에 다양한 다른 박테리아에 대해서도 용혈 억제 활성을 있는지를 확인하였고, 본 실험에서 박테리아 종류를 하기 표 2에 나타내었다.
Strains Source/ Reference
USA300 (FPR3757) Clinical strain
Streptococcus ferus KCTC3637
Serratia marcescens KCTC42171
Vibrio parahaemolyticus KCTC2729
Streptococcus pneumoniae KCTC5080
Staphylococcus saprophyticus KCTC3345
Campylobacter jejuni KCTC5327
Helicobactor pylori KCTC12083
Pseudomonas aureginosa KCTC1637
Bacillus cereus KCTC13153
Enterococcus fecalis KCTC3511
Bacillus licheniformis KCTC1918
Staphylococcus epidermidis KCTC1917
Cornebactreium diptheria KCTC3075
Klepsella pneumoniae 삼성병원감염내과
Listreia innocua KCTC3586
Burkholderia cepacia KCTC2966
Streptococcus parasanguinis KCTC15406
Salmonella typhimurium KCTC2058
Streptococcus sobrinus KCTC5809
Streptococcus sanguinis KCTC3284
Streptococcus iniae KCTC3657
Streptococcus Pyogene KCTC3208
Streptococcus mitis KCTC5650
Listeria Ivanovii subsp ivanovii KCTC3444
Listeria monocytogenes KCTC3569
Streptococcus suis 삼성병원감염내과
그 결과, 도 17에 나타낸 바와 같이, 8 μM의 레오이딘을 처리한 후의 용혈 활성을 시험한 26가지의 병원성 박테리아 중, 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia) 및 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus)에서 용혈 활성이 80% 이상 억제되었고, 스트렙토코커스 페루스(Streptococcus ferus) 및 리스테리아 이노쿠아 (Listreia innocua)의 용혈 활성은 각각 77.65% 및 76.73% 감소됨을 확인할 수 있었다. 또한, 50% 이상 감소도 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) 및 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)에서 확인되었다(도 17의 A). 뿐만 아니라, 8 μM 레오이딘과 배양하는 경우, 몇몇의 박테리아 종의 용혈 기능을 상당히 억제할 뿐만 아니라 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni), 헬리코박터 파일로리 (Helicobactor pylori), 엔테로코커스 피칼리스 (Enterococcus fecalis), 코리네박테리움 디프테리아 (Corynebacterium diphtheriae), 스트렙토코커스 파라상귀니스 (S. parasanguinis), 스트렙토코커스 상귀니스 (S. sanguinis), 스트렙토코커스 파이오젠 (S. pyogene), 스트렙토코커스 수이스 (S. suis)에 대해서는 항균 활성도 있음을 확인할 수 있었다(도 17의 B).
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> RESEARCH & BUSINESS FOUNDATION SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> Leoidin compound having anti-virulence activity and use thereof <130> MP17-252 <150> KR 10-2017-0004125 <151> 2017-01-11 <160> 60 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> agrA forward primer <400> 1 acagactcat tgcccatt 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> agrA reverse primer <400> 2 aacgtttctc accgatgc 18 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SaeS forward primer <400> 3 accgcacatt agaagtga 18 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SaeS reverse primer <400> 4 aatccaatac cttcatc 17 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sarA forward primer <400> 5 caatggtcac ttatgctg 18 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sarA reverse primer <400> 6 tctttcatca tgctcattac 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sigB forward primer 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Claims (16)

  1. i) 레오이딘(Leoidin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및
    ii) 항생제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 박테리아 감염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 레오이딘은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는, 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112019099626961-pat00010

  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 박테리아에 대한 항독성 또는 항병원성 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 박테리아에 의한 적혈구 용혈 작용을 억제하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 sae(staphylococcal accessory effector) 또는 sar(staphylococcal accessory regulator) 유전자 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 박테리아의 내재화(internalization)를 억제하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 박테리아 감염에 의한 숙주세포 손상으로부터 숙주세포를 보호하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 박테리아는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 페루스(Streptococcus ferus), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia), 스타필로코커스 사프로피티쿠스(Staphylococcus saprophyticus), 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni), 헬리코박터 파일로리 (Helicobactor pylori), 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 엔테로코커스 피칼리스 (Enterococcus fecalis), 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis), 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 코리네박테리움 디프테리아 (Corynebacterium diphtheriae), 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 리스테리아 이노쿠아 (Listreia innocua), 버크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia), 스트렙토코커스 파라상귀니스 (Streptococcus parasanguinis), 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium), 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus), 스트렙토코커스 상귀니스 (Streptococcus sanguinis), 스트렙토코커스 이니에(Streptococcus iniae), 스트렙토코커스 파이오젠 (Streptococcus pyogene), 스트렙토코커스 미티스(Streptococcus mitis), 리스테리아 이바노비(Listeria Ivanovii subsp ivanovii), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 스트렙토코커스 수이스 (Streptococcus suis), 크로스트리디움 퍼플린젠스 (Clostridium perfringens), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 쉬겔라 보이디(Shigella boydii), 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei), 살모넬라 콜레라에슈이스(Salmonella choleraesuis subsp), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 본고리(Salmonella bongori), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 마이코박테리움 튜버클로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 레프래(Mycobacterium leprae), 크로스트리디움 보툴리늄(Clostridium botulinum), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 클라미디아 뉴모니아(Chlamydia pneumonia), 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 콕시엘라 부르네티(Coxiella burnetii), 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 보렐리아 속(Borrelia sp.), 바르토넬라 속(Bartonella sp.), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 및 마이코플라즈마 뉴모니아(Mycoplasma pneumonia)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  12. 삭제
  13. 제1항에 있어서, 상기 항생제는 메티실린(methicillin), 옥사실린(oxacillin), 노르플록사신(norfloxacin), 반코마이신(vancomycin), 아미카신(Amikacin), 젠타마이신(Gentamicin), 카나마이신(Kanamycin), 네오마이신(Neomycin), 네틸마이신(Netilmicin), 토브라마이신(Tobramycin), 파로모마이신(Paromomycin), 스트렙토마이신(Streptomycin), 스펙티노마이신(Spectinomycin), 겔다나마이신(Geldanamycin), 허비마이신(Herbimycin), 리팍시민(Rifaximin), 로라카르베프(Loracarbef), 어타페넴(Ertapenem), 도리페넴(Doripenem), 이미페넴/실라스타틴(Imipenem/Cilastatin), 메로페넴(Meropenem), 세파드록실(Cefadroxil), 세파졸린(Cefazolin), 세팔로틴(Cefalothin), 세팔렉신(Cefalexin), 세파클로르(Cefaclor), 세파만돌(Cefamandole), 세폭시틴(Cefoxitin), 세프프로질(Cefprozil), 세프록심(Cefuroxime), 세픽심(Cefixime), 세프디니르(Cefdinir), 세프디토렌(Cefditoren), 세포페라존(Cefoperazone), 세포탁심(Cefotaxime), 세프포독심(Cefpodoxime), 세프타지딤(Ceftazidime) , 세프티부텐(Ceftibuten), 세프티족심(Ceftizoxime), 세프트리악손(Ceftriaxone), 세페핌(Cefepime), 세프타롤린 포사밀(Ceftaroline fosamil), 세프토비프롤(Ceftobiprole), 테이코플라닌(Teicoplanin), 텔라반신(Telavancin), 달바반신(Dalbavancin), 오리타반신(Oritavancin), 클린다마이산(Clindamycin), 린코마이신(Lincomycin), 뎁토마이신(Daptomycin), 아지트로마이신(Azithromycin), 클래리스로마이신(Clarithromycin), 디리스로마이신(Dirithromycin), 에리스로마이신(Erythromycin), 록시스로마이신(Roxithromycin), 트로린도마이신(Troleandomycin), 테리스로마이신(Telithromycin), 스피라마이신(Spiramycin), 아즈트레오남(Aztreonam), 푸라졸리돈(Furazolidone), 니트로퓨란토인(Nitrofurantoin), 리네졸리드(Linezolid), 포시졸리드(Posizolid), 라데졸리드(Radezolid), 토레졸리드(Torezolid), 아목시실린(Amoxicillin), 엠피실린(Ampicillin), 아즈로실린(Azlocillin), 카르베니실린(Carbenicillin), 클록사실린(Cloxacillin), 디클록사실린(Dicloxacillin), 플루클록사실린(Flucloxacillin), 메즈로실린(Mezlocillin), 나프실린(Nafcillin), 페니실린 G(Penicillin G), 페니실린 V (Penicillin V), 피페라실린(Piperacillin), 테모실린(Temocillin), 티카실린(Ticarcillin), 아목시실린/클라불란산(Amoxicillin/clavulanate), 엠피실린/설박탐(Ampicillin/sulbactam), 피페라실린/타조박탐(Piperacillin/tazobactam), 티카실린/클라불란산(Ticarcillin/clavulanate), 바시트라신(Bacitracin), 콜리스틴(Colistin), 폴리믹신 B(Polymyxin B), 시프로플록사신(Ciprofloxacin), 이녹사신(Enoxacin), 가티플록사신(Gatifloxacin), 제미플록사신(Gemifloxacin), 레보플록사신(Levofloxacin), 로메플록사신(Lomefloxacin), 목시플록사신(Moxifloxacin), 날리딕스산(Nalidixic acid), 오플록사신(Ofloxacin), 트로바플록사신(Trovafloxacin), 그레파플록사신(Grepafloxacin), 스파플록사신(Sparfloxacin), 테마플록사신(Temafloxacin), 마펜나이드(Mafenide), 설파아세타마이드(Sulfacetamide), 설파다이아진(Sulfadiazine), 실버설파다이아진(Silver sulfadiazine), 설파디메톡신(Sulfadimethoxine), 설파메티졸(Sulfamethizole), 설파메톡사졸(Sulfamethoxazole), 설파닐리마이드(Sulfanilimide), 설파살라진(Sulfasalazine), 설피속사졸(Sulfisoxazole), 트리메소프림-설파메톡사졸(Trimethoprim-Sulfamethoxazole(Co-trimoxazole), TMP-SMX), 설폰아미도 크리소이딘(Sulfonamido chrysoidine), 데메클로사이클린(Demeclocycline), 독시사이클린(Doxycycline), 미노사이클린(Minocycline), 옥시테트라사이클린(Oxytetracycline), 테트라사이클린(Tetracycline), 클로파지민(Clofazimine), 답손(Dapsone), 카프레오마이신(Capreomycin), 사이클로세린(Cycloserine), 에탐부톨(Ethambutol), 에티오나미드(Ethionamide), 이소니아지드(Isoniazid), 피라진아미드(Pyrazinamide), 리팜피신(Rifampicin), 리파부틴(Rifabutin), 리파펜틴(Rifapentine), 아르스페나민(Arsphenamine), 클로람페니콜(Chloramphenicol), 포스포마이신(Fosfomycin), 푸시딘산(Fusidi cacid), 메트로니다졸(Metronidazole), 무피로신(Mupirocin), 플라텐시마이신(Platensimycin), 퀴누프리스틴/달포프리스틴(Quinupristin/Dalfopristin), 치암페니콜(Thiamphenicol), 티지사이클린(Tigecycline), 티니다졸(Tinidazole), 및 트리메소프림(Trimethoprim)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  14. i) 레오이딘(Leoidin) 또는 이의 화장품학적으로 허용가능한 염; 및
    ii) 항생제 또는 이의 화장품학적으로 허용가능한 염을 포함하는 박테리아 감염 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
  15. i) 레오이딘(Leoidin) 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염; 및
    ii) 항생제 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 포함하는 박테리아 감염 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  16. i) 레오이딘(Leoidin); 및
    ii) 항생제를 포함하는 박테리아 감염 예방 또는 개선용 동물용 사료.
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