JP2020533417A

JP2020533417A - 抗菌組成物

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Publication number: JP2020533417A
Application number: JP2020537039A
Authority: JP
Inventors: ジェローム・ギヨネ; クロディーヌ・ゼミリリネ; パスカル・バティ
Original assignee: セバ・サンテ・アニマル; ユニオン・セラピューティクス・アー／エス
Priority date: 2017-09-15
Filing date: 2018-09-14
Publication date: 2020-11-19
Also published as: EP3681468B1; BR112020005162A2; CA3075662A1; US11331289B2; CN111902128A; US20200323801A1; RU2020113452A; AU2018334025A1; EP3681468A1; RU2020113452A3; WO2019053180A1

Abstract

本発明は、ニクロサミドおよび／またはオキシクロザニドを含む新規局所組成物、ならびに非ヒト哺乳動物の膿皮症または皮膚炎の治療または予防のための該組成物の使用に関する。

Description

動物の皮膚は常に病原微生物に曝露され、攻撃されている。そのような攻撃に対する防御の最前線として、動物の厚い表皮は、わずかに塩基性のｐＨを示し、殺菌作用を有する抗生物質ペプチドの存在に関連する比較的低い水分含有量を示す。それにもかかわらず、水分の増加または皮膚の傷などの表皮の構造の変化は、一般に病原微生物による皮膚のコロニー形成および感染を引き起こし、しばしば膿皮症に向かって進化することになる。

イヌの膿皮症は、皮膚の細菌感染を特徴とする皮膚疾患の一般的な分類を表す。ほとんどの場合、原因生物はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓであるが、他のブドウ球菌種（例えばＳ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉ）も関与している可能性がある。非ブドウ球細菌（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａも罹患した皮膚から分離され得る。

Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓは、イヌの粘膜の常在菌であり、健康なイヌの皮膚表面に一時的にコロニー形成すると考えられている。イヌの膿皮症のほとんどの症例は、皮膚の損傷、炎症性皮膚疾患、および免疫障害を引き起こす原疾患などの根本的な原因に関連している。それは、アトピー性皮膚炎の頻繁な合併症である。

そのため、膿皮症は、完全な解決の後でも、根本的な疾患が適切に対処されない場合には再発する傾向がある。イヌの膿皮症の異なる臨床症状の多くは、病変の種類および分布に基づいて認識される。病変の深さによる分類は、抗菌薬療法の選択が罹患した皮膚組織層により異なり得るため、有用と考えられる。

イヌの膿皮症の治療は、典型的には、３〜４週間の全身殺菌薬投与に基づいており、局所抗菌薬療法は、補助治療として提案される。ガイドラインは、全身抗生物質療法の第一選択の経験的薬剤として、アモキシシリン−クラブラン酸、セファレキシン、またはクリンダマイシンを推奨している。

細菌性病原体、および特にイヌの膿皮症に関連するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓの抗生物質感受性の一般的な減少により、これらの症例の治療は、ますます困難になってきている。１９９９年のメチシリン耐性株（すなわち、ベータラクタムファミリーのすべてのメンバーに耐性のある株）の最初の報告以来、耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ株の数が世界中で増加していることが報告されている。臨床分離菌のそのような株の有病率は、地理的位置および医師の種類（一般開業医または紹介医）に応じて８．２％〜４７．９％と大きく異なる。

小動物の臨床診療における抗菌薬耐性の上昇により、局所療法は、表在性細菌感染の管理のための合理的な抗菌薬使用の重要な要素となっている。最近の研究では、合併症のない表在性皮膚感染症の唯一の治療として消毒剤を使用することが推奨されている。

ＷＯ２０１６０３８０３５は、グラム陽性菌により引き起こされる感染または疾患の局所予防または治療におけるハロゲン化サリチルアニリドの局所使用を開示している。しかし、ＷＯ２０１６０３８０３５は、特に罹患した皮膚の領域に広がるクリーム、泡、ゲル、液滴、ローション、および軟膏を介した非常に特定の種類の局所薬剤に焦点を当てている。この手法に伴う問題は、イヌに適用した場合、これらの局所治療の薬物が舐められ、それにより、治療の有効性が低下し、動物の安全性の懸念さえ引き起こし得ることである。

ＷＯ２０１６０３８０３５

したがって、業界では、適用が簡単で、長時間作用するため治療を完了する上で限られた回数の適用しか必要とされ得ず、膿皮症および多剤耐性細菌により引き起こされる膿皮症でさえ治療するのに有効であり、局所的ではあるが、治療する皮膚の特定の領域から遠く離れて（すなわち、舐めることができない領域に）適用され得、優れた治療コンプライアンスために耐性の発生につながらない、イヌの膿皮症の強力な抗生物質治療が依然として必要とされている。

驚くべきことに、本発明者らは、オキシクロザニを動物の皮膚の表面にわたって分布させるのに非常に効率的である、ジエチレングリコールモノメチルエーテルを含む溶媒中に少なくとも１つのハロゲン化サリチルアニリドとＤＭＳＯとを含む局所組成物を見い出し、それにより、膿皮症の治療のためのスポットオンまたはラインオン適用を可能にする。したがって、膿皮症に罹患した領域の局所治療の必要はないが、感染領域の近くまたは動物の背中の肩の間へのラインオンまたはスポットオンでの組成物の単回適用は、薬物への全身曝露が制限されている膿皮症に罹患した動物の皮膚のあらゆる領域への活性物質の拡散を可能にする。

第一の態様において、本発明の目的は、２〜２０重量／体積％の少なくとも１つのハロゲン化サリチルアニリド、またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物、３５〜５５重量／体積％のジメチルスルホキシドを含む局所獣医学スポットオンまたはラインオン組成物であり、ここで、少なくとも１つのハロゲン化サリチルアニリドは、ニクロサミドおよび／またはオキシクロザニドから選択され、本組成物は、ジエチレングリコールモノメチルエーテルに溶解している。

非ヒト哺乳動物の膿皮症または皮膚炎の治療または予防に使用するための局所獣医学スポットオンまたはラインオン組成物も提供され、ここで、該組成物は、２〜２０重量／体積％の少なくとも１つのハロゲン化サリチルアニリド、またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物、３５〜５５重量／体積％のジメチルスルホキシドを含み、少なくとも１つのハロゲン化サリチルアニリドは、ニクロサミドおよび／またはオキシクロザニドから選択され、本組成物は、ジエチレングリコールモノメチルエーテルに溶解している。

２〜２０重量／体積％の少なくとも１つのハロゲン化サリチルアニリド、またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物、３５〜５５重量／体積％のジメチルスルホキシドを含むスポットオンまたはライン組成物を介して局所的に適用することを含む、膿皮症または皮膚炎を予防および／または治療する方法も提供され、ここで、少なくとも１つのハロゲン化サリチルアニリドは、ニクロサミドおよび／またはオキシクロザニドから選択され、本組成物は、ジエチレングリコールモノメチルエーテルに溶解している。

以下の明細書および特許請求の範囲で使用される以下の用語は、本明細書で記載される以下の意味を有する。

本発明の文脈における「治療する」または「治療」という用語は、病状、状態、または疾患の緩和、根絶、または予防を指す。それは、グラム陽性菌により引き起こされる疾患または感染症の予防、膿皮症または皮膚炎などのグラム陽性菌により引き起こされる疾患または感染症の症状のうちの１つ以上の抑制または緩和、体のある領域からの非症候性のグラム陽性菌のコロニー形成の低減または根絶、症候性皮膚感染症によるグラム陽性菌の低減または根絶、皮膚感染症以外（例えば、アトピー性皮膚炎などの皮膚炎に罹患した皮膚の領域などの炎症性皮膚状態のコロニー形成）の皮膚の状態に罹患した体のある領域のグラム陽性菌のコロニー形成の低減または根絶、別の非感染疾患（例えば、アトピー性皮膚炎の皮膚病変などの炎症性皮膚状態）に罹患した体のある領域からのグラム陽性菌により引き起こされる疾患の１つ以上の症状の抑制または緩和、炎症性皮膚状態（例えば、皮膚炎病変の感染の予防）に罹患した皮膚のグラム陽性菌感染の予防、および外傷（例えば、傷、火傷、刺傷、または咬傷）、外科手術、医療機器（例えば、針、カテーテル、またはカニューレなど）による損傷皮膚のグラム陽性菌感染症、または皮膚のバリア機能を損なう状態に罹患した皮膚の予防を含み得る。

「薬学的に許容される塩」という用語は、本明細書に記載の化合物の生物学的有効性および特性を保持し、生物学的またはその他の点で望ましくないものではない塩を指す。薬学的に許容される塩は、当業者に周知されている。

第１の態様では、本発明は、２〜２０重量／体積％の少なくとも１つのハロゲン化サリチルアニリド、またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物、３５〜５５重量／体積％のジメチルスルホキシドを含む局所獣医学スポットオンまたはラインオン組成物に関し、ここで、少なくとも１つのハロゲン化サリチルアニリドは、ニクロサミドおよび／またはオキシクロザニドから選択され、本組成物は、ジエチレングリコールモノメチルエーテルに溶解している。

本発明の文脈において、「局所薬剤」は、皮膚または粘膜などの体表面に適用される薬剤である。局所薬剤は、他の多くの種類の薬物とは異なるが、それは、薬物の取り扱いを誤ると、動物または薬物の投与者にとってある特定の合併症が生じ得るためである。

本発明による組成物は、スポットオンまたはラインオンで投与される。スポットオンは、本組成物の総量が動物の皮膚の１箇所に送達されることを意味する。ラインオンは、本組成物が動物の脊椎に沿って尾根から肩甲骨まで、または脊椎に沿って背骨の中央から肩甲骨まで、またはそれ以降の皮膚に適用されることを意味する。「ラインオン」適用の長さは、例えば、３０ｃｍ、または２０ｃｍ、または１５ｃｍ、または１０ｃｍ、または５ｃｍであり得、好ましい長さは１０ｃｍであり得る。スポットオンまたはラインオン組成物は、動物の体重および／またはサイズに適合した単位用量として製剤化され、全用量が一度に動物に適用される。

ハロゲン化サリチルアニリドは、サリチル酸およびアニリンのアミドである。ニクロサミドおよびオキシクロザニドの両方は、塩素化誘導体である。本発明による好ましいイヌハロゲン化サリチルアニリドは、イヌのブドウ球菌に対する抗菌特性の観点から、ニクロサミドおよびオキシクロザニドであり、さらに最も好ましいのはオキシクロザニドである。

本発明による組成物は、２〜２０重量／体積％の少なくとも１つのハロゲン化サリチルアニリドを含む。これは、最終溶液１００ミリリットルあたり５〜２０グラムの溶質を意味する。好ましくは、本組成物は、５〜１５重量／体積％、より好ましくは８〜１２重量／体積％の少なくとも１つのハロゲン化サリチルアニリド、さらにより好ましくは９〜１１重量／体積％を含む。

本発明による組成物は、３５〜５５重量／体積％のジメチルスルホキシド、好ましくは３０〜５０重量／体積％、さらにより好ましくは約４５重量／体積％のＤＭＳＯをさらに含む。
本発明を通して任意の数値に関して使用される用語は、値の＋／−１０％を意味し、例えば、約１０は９〜１１を意味する。

本明細書に記載のスポットオンまたはラインオン組成物は、皮膚表面の１つ以上の点への単純な適用により、その全体および皮脂腺のレベルでの拡散を可能にする拡散溶媒ビヒクルを含む。これらの皮脂腺に蓄積されるＤＭＳＯ／Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌとオキシクロザニドとの複合体からなる溶媒系は、優先的に、皮脂生成物とともに皮膚表面に徐々に拡散する。

本組成物は、ハロゲン化サリチナリニドの溶解度を高めるために当技術分野で一般に既知のさらなる溶媒、ならびに乳化剤、界面活性剤、保湿剤、防腐剤、緩衝剤、酸化防止剤、または着色剤などの追加の賦形剤を含有し得る。本発明による好ましい追加の賦形剤は、モノエタノールアミンである。

本発明による組成物について上述したすべての実施形態は、該組成物の使用、および治療方法にも適用される。

別の実施形態では、本発明は、２〜２０重量／体積％の少なくとも１つのハロゲン化サリチルアニリド、またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物、３５〜５５重量／体積％のジメチルスルホキシドを含む局所獣医学スポットオンまたはラインオン組成物に関し、ここで、少なくとも１つのハロゲン化サリチルアニリドは、ニクロサミドおよび／またはオキシクロザニドから選択され、本組成物は、非ヒト哺乳動物の膿皮症または皮膚炎の治療または予防に使用するためにジエチレングリコールモノメチルエーテルに溶解しており、本組成物は、任意に５〜１０日毎に複数回繰り返される単回適用で、非ヒト哺乳動物に局所適用される。

膿皮症は、Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓ．ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、およびＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓを含むブドウ球菌種による化膿性皮膚細菌感染症である。根本的な疾患プロセス、主にニキビダニ症、アレルギー性皮膚疾患、および内分泌障害に続発することが非常に多い。したがって、本出願を通して「膿皮症」という用語が使用されている場合は、常に、これらすべての態様を包含することを意味する。

本出願で特許請求されている膿皮症には、表面、表在性、および深部膿皮症が含まれる。本出願による膿皮症は、好ましくはイヌの膿皮症であり、膿性外傷性皮膚炎、膿痂疹（表在性膿疱性皮膚炎）、表在性細菌性毛包炎、顎膿皮症（イヌ座瘡）、皮膚ひだ皮膚炎（間擦疹、皮膚ひだ膿皮症）、粘膜膿皮症、鼻膿皮症、細菌性足皮膚炎、イヌのペダルフルンクローシス（指間水疱、指間膿肉芽腫）が含まれる。最も好ましくは、膿皮症は、表面および表在性膿皮症である。

本発明による使用のための局所獣医学スポットオンまたはラインオン組成物は、任意に５〜１０日毎に複数回繰り返される単回適用で、非ヒト哺乳動物に局所的に適用される。好ましくは、それは、３〜６週間連続して５〜１０日毎に１回、非ヒト哺乳動物に適用される。より好ましくは、本組成物は、３〜６週間連続して、６〜８日毎に１回、さらにより好ましくは３〜６週間連続して、週に１回適用される。治療は、必要に応じて何度でも繰り返され得、深部膿皮症の場合はより長い治療期間が必要になり得る。全体の治療期間は、１〜６週間、好ましくは３〜６週間、より好ましくは４〜５週間、さらにより好ましくは約４週間である。治療期間は、すべての臨床徴候が消失した後１週間適用されるように、当業者により簡単に決定され得る。

非ヒト哺乳動物は、好ましくは伴侶動物であり、より好ましくはイヌまたはネコであり、さらにより好ましくはイヌである。

本発明による使用のための局所獣医学スポットオンまたはラインオン組成物は、１０〜８００ｍｇのハロゲン化サリチルアニリド、好ましくは５０〜５００ｍｇ、さらにより好ましくは約２００ｍｇのハロゲン化サリチルアニリドを送達する。

本発明による使用のための局所獣医学スポットオンまたはラインオン組成物は、体重１０ｋｇあたり０．５〜５ｍｌ、好ましくは体重１０ｋｇあたり１〜３ｍｌ、さらにより好ましくは、体重１０ｋｇあたり約２ｍｌの用量で適用される。本組成物は、非ヒト哺乳動物の体重および／またはサイズに適合した単位用量として製剤化され、全用量が動物に適用される。

さらなる実施形態では、本発明は、２〜２０重量／体積％の少なくとも１つのハロゲン化サリチルアニリド、またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物、３５〜５５重量／体積％のジメチルスルホキシドを含む組成物を、スポットオンまたはラインオンで局所的に適用することを含む、膿皮症または皮膚炎を予防および／または治療する方法に関し、ここで、少なくとも１つのハロゲン化サリチルアニリドは、ニクロサミドおよび／またはオキシクロザニドから選択され、本組成物は、ジエチレングリコールモノメチルエーテルに溶解している。

好ましくは、本発明による膿皮症または皮膚炎を予防および／または治療する方法では、治療は、局所的に単回適用され、治療は、任意に５〜１０日毎に複数回繰り返される。

実施例１：本発明によるラインオンまたはスポットオン組成物Ａ〜Ｉ

実施例２：ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｐｓｅｕｄｏｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓのイヌ分離菌に対するオキシクロザニドの時間殺滅曲線。
オキシクロザニドＶＥＴＲＡＮＡＬは、ＳＩＧＭＡからであった。
この研究では、２つのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓおよび２つのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓを試験した。ブロス微量希釈法を使用してオキシクロザニドの最小阻害濃度（ＭＩＣ）を決定した後に、これらの株を選択した。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓｎ°１６３０２およびｎ°１６３１５のオキシクロザニドのＭＩＣは、０．５μｇ／ｍｌに等しい。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓｎ°１５４０１およびｎ°Ｉ５４１０のオキシクロザニドのＭＩＣは、０．１２５μｇ／ｍｌに等しい。

時間殺滅曲線は、抗菌物質の殺菌または静菌活性を決定するために使用される。ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓのイヌ分離菌に対するオキシクロザニドの時間殺滅曲線を、ブロスマクロ希釈法を使用して得た。オキシクロザニドの異なる固定量を接種物と接触させた後、接触直後、ならびに１、３、６、および２４時間後に生菌を計数する。計数は、抗菌物質を含まない寒天培地で行う。

結果は、各試験濃度のｌｏｇ_１０ＣＦＵ／ｍｌ対時間をプロットすることにより分析される。接種物の９９．９％の殺菌により定義される殺菌活性は、ＣＦＵ／ｍｌの≧３ｌｏｇ_１０の減少の存在に注目することにより、時間殺滅曲線から決定される。

細菌株をミューラーヒントン寒天上で１つのクライオビーズから２回継代培養し、３７℃で１８〜２４時間インキュベートした。２回目の継代培養から、分離コロニーを２ｍｌのミューラーヒントンブロスを含むチューブに移して、１０^８ＣＦＵ／ｍｌの細菌懸濁液を得、これは、６２０ｎｍでの０．１の光学密度が１０^８ＣＦＵ／ｍｌの細菌懸濁液に相当することが知られている。次いで、細菌懸濁液をミューラーヒントンブロス中で希釈することにより５１０^７〜１１０^８ＣＦＵ／ｍＬに調整した。

試験するオキシクロザニドの各濃度に対して、１００倍に濃縮された５０μｌの作業溶液濃縮および１００μｌの接種物を５ｍｌのミューラーヒントンブロスに添加した。したがって、試験した濃度範囲は、０．１２５〜８μｇ／ｍｌであり、微生物の濃度は、１〜１０^６〜２１０^６ＣＦＵ／ｍｌであった。

同時に、オキシクロザニドを含まないチューブを準備した：５０μｌのＤＭＳＯおよび１００μｌの接種物を５ｍｌのミューラーヒントンブロスに添加し、増殖対照として使用した。チューブを攪拌しながら３６℃でインキュベートした。

生菌の数を、接触直後（ＴＯ）、ならびにインキュベーションの１、３、６、および２４時間後に決定した。

毎回、各チューブの試料を採取し、ミューラーヒントンブロスで希釈を行った。次いで、希釈液をミューラーヒントン寒天培地上にらせん状プラーターで広げた。３６℃で１８時間インキュベートした後、生菌の濃度を決定する自動コロニーカウンターでコロニーの計数を行った。用いられた技法により、２０ＣＦＵ／ｍｌという低い細菌濃度の定量化が可能になった。

ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌソフトウェアを使用して、オキシクロザニドの各濃度に対して時間殺滅曲線をプロットした。生き残った細菌の数を、ｌｏｇ_１０ＣＦＵ／ｍｌとして表した。各株の時間殺滅曲線は、関係するオキシクロザニド濃度の時間の関数としての生菌計数の減少を表す。

接種物の９９．９％の殺菌により定義される殺菌活性は、ＣＦＵ／ｍｌの≧３ｌｏｇ_１０の減少の存在に注目することにより、時間殺滅曲線から決定される。

各株の生菌の数を表（１ａ〜１ｄ）に示す。

結論として、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓに対するオキシクロザニドの薬力学的プロファイルは、濃度依存性と分類することができる。ＣＬＳＩガイドラインで定義されているように、殺菌活性は、ＣＦＵ／ｍｌの≧３ｌｏｇ_１０の減少の存在に注目することにより、時間殺滅曲線から決定される。したがって、両方の株について、４μｇ／ｍｌの濃度では２４時間の接触後に、８μｇ／ｍｌの濃度では６〜２４時間の接触後に殺菌効果が観察される。

実施例３：メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）およびメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｐｓｅｕｄｏｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓの４つの株に対するオキシクロザニドの時間殺滅曲線。
この研究の目的は、イヌのメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの４株に対するオキシクロザニドの時間殺滅曲線をインビトロで評価することである。

診療所から分離された２つのメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）および２つのメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ（ＭＲＳＰ）を試験した。

時間殺滅曲線の評価は、ブロスマクロ希釈法（ミューラーヒントンＩＩブロス）により実現されている。

オキシクロザニドを（ＤＭＳＯ）で希釈して滅菌チューブに入れて、以下の８００〜６．２５μｇ／ｍｌの濃度を得る。次いで、これらの濃度およびストック標準溶液を、ミューラーヒントンＩＩブロスで希釈（１／１０）して、以下の１６０〜０．０６μｇ／ｍｌの濃度を得る（表２を参照）。

各操作を滅菌状態で行う。各作業標準溶液（１０＊最終活性成分濃度）を、チューブ（１ｍｌ、９ｍｌの接種物の添加後は１０ｍｌの最終用量）に分配する。活性成分を含まない１本のチューブを増殖対照として使用する（濃度＝０）。

５％の血液を補充したコロンビア寒天培地上の１つのクライオビーズから、細菌分離菌を継代培養する。純粋な培養物を３７℃で１８〜２４時間インキュベートする。同様の外観の３〜５個の分離コロニーを以前の培養から選択し、９ｍｌのミューラーヒントンＩＩブロスを含むチューブに移す。ブロスを３７℃で１２〜１８時間インキュベートする。０．５〜１ｍｌのこのブロスを別のミューラーヒントンＩＩブロスの９ｍｌのチューブに接種し、３７℃で３〜４時間インキュベートして、指数増殖期に達するようにする。細菌接種増殖指数期を、１０^８ＣＦＵ／ｍｌの細菌密度に相当する０．５のマクファーランド標準規模の光学密度に懸濁し、次いで、ガイドラインＣＬＳＩＭ２６−Ａで示されるように約５．１０^５ＣＦＵ／ｍｌ、および２回目の接種試験：１０^６ＣＦＵ／ｍｌの濃度に調整する。

ブロスチューブの接種
９ｍｌの指数期まで成長した細菌接種物を、１ｍｌの活性成分（または、増殖対照の場合はミューラーヒントンＩＩブロス）に添加する。チューブを３５℃で２４時間インキュベートする。

０、２、４、６、および２４時間の時点で、各チューブの１００μｌのブロスをサンプリングし、マイクロプレートで希釈する。
５％の血液を補充したコロンビア寒天培地上の１０μｌをストリークすることにより、各ウェルを再培養する。１８〜２４時間のインキュベーション中、プレートを３７℃でインキュベートする。したがって、残留細菌濃度が決定される（ＣＦＵ／ｍｌ）。結果を、ブロス中の経時的なＣＦＵ／ｍｌのｌｏｇ_１０値で表す。使用する手順により、評価できる最小細菌濃度は、１０^２ＣＦＵ／ｍｌである。

各株について得られた個別の計数結果を、以下の表３〜６に記載する。

結論として、検討した株について試験した２つの接種物、および試験した４つの株の間で、時間殺菌プロファイルはほぼ同様であり、濃度≧２ＭＩＣの場合の濃度依存性殺菌効果である。ＣＬＳＩＭ２６−Ａガイドラインで定義されている殺菌効果（「殺菌効果は、ＣＦＵの指定された時間での≧３ｌｏｇ_１０（９９．９％の殺菌）の減少により確認できる」）が４ＭＩＣの濃度で以下のように観察される。

実施例４：Ｍａｌａｓｓｅｚｉａに対する効果。
分離菌
真菌培養のためにＥｎｖＡ（ＢｉｏＰｏｌｅＡｌｆｏｒｔの菌学研究室）に送られたイヌの皮膚（ｎ＝５）およびネコ（ｎ＝１）からの６つの臨床分離菌。２０１６年３月に収集された分離菌は、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａｐａｃｈｙｄｅｒｍａｔｉｓ種に属していることが識別された。それらを、Ｓａｂｏｕｒａｕｄの培地への定期的な移植により維持した。分離菌を、感度を試験する２〜３日前に継代培養する。

実験プロトコル（微量希釈ブロス法）
１６００μｇ／ｍＬのオキシクロザニドのストック溶液をＤＭＳＯ中で調製する。次いで、ストック溶液をＤＭＳＯ中で希釈して、３．１２５μｇ／ｍｌ〜８００μｇ／ｍｌの濃度範囲を得る。次いで、この範囲およびストック溶液の１／５０希釈を超純水で実施して、２％のＤＭＳＯを含有する０．０６２５μｇ／ｍｌ〜３２μｇ／ｍｌの濃度範囲を得る。５０μｌのこれらの溶液をマイクロプレートのウェルに堆積させ、次いで、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ／Ｔｗｅｅｎ４０（２％）中で１０６ＣＦＵ／ｍｌに校正した５０μｌの接種物を添加する。試験濃度範囲の範囲は、０．０３１２μｇ／ｍＬ〜１６μｇ／ｍＬである。接種物と接触するＤＭＳＯの最終濃度は、１％である。その後、１６００μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢのストック溶液を用いて、同じ希釈および播種プロトコルを実施した。「プラセボ」（または、酵母増殖対照）カラムが体系的にプレートに含まれる。プレートを３７℃でインキュベートする。読み取りを２４時間および４８時間の時点で行う。いくつかの試験が実施され、プロトコルの調整が必要であった。特に、抗真菌活性を観察するためには、接種物の濃度を低減する必要があった。

結論
オキシクロザニドは、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａｐａｃｈｙｄｅｒｍａｔｉｓに関して活性である。この活性は分離菌により異なり（分離菌３に関しては活性がない）、ＭＩＣ値は高い。比較については、表７を参照されたい。技法およびプロトコル（これまでに公開されたさまざまな研究で使用されている）は、ＭＩＣが０．１２〜８μｇ／ｍＬの範囲で非常に多様であることを強調する必要がある。

実施例５：オキシクロザニドスポットオン組成物の薬物動態プロファイル。
この研究の目的は、ビーグル犬を皮膚投与経路で（Ｃ７１９組成物を用いて）治療することにより、オキシクロザニドの忍容性、生物学的利用能、および薬物動態プロファイルを決定することであった。

試験項目（Ｃ７１９）は、以下を含む以下の組成を有する獣医学的使用のための局所用溶液であった：オキシクロザニド１０ｇ／１００ｍＬ、４６ｇのジメチルスルホキシド、およびジエチレングリコールモノエチルエーテル（Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ（登録商標））を１００ｍｌまでの適量。

実験設計
この研究で使用された６匹の成犬のオスのビーグル犬（１２Ｋｇ超）は、組み入れ検査において健康であった。それらの血液生化学的パラメータは、供給者の正常範囲内、またはさらに許容範囲内であった。動物は、動物相の開始の１５日前から駆虫薬または抗生物質を含む治療を一切受けておらず、０日目の８日前から治療を受けていなかった。

イヌは、木の削りくずの寝具で飼われていた。治療が適用された後にイヌが互いを舐め合うことを避けることにより、結果の品質を保証するために、動物を個別に収容した。動物を、１日目の２週間前に試験施設に入れた。この期間により、犬が生活条件（同じ場所で見られた供給者のものとほぼ同じ）に順応できた。適切な食物（ペレット）をフィーダーで自由に分配した。水分提供装置を使用して、水道水供給の自由を確保した。すべての動物を同じ方法で収容し、実施されている慣行に従って、動物が快適に過ごせるように特別な注意を払った。８日間の相対的隔離期間中（動物は、まだ仲間と視覚的、嗅覚的、聴覚的接触を有していた）、社会化活動を増やして、動物に引き起こされ得るいずれのストレスも制限するためにあらゆる努力を行った。

治療：６匹のイヌは０日目に治療を受けた。Ｃ７１９生成物を、首から尾根まで背骨に沿って均一にラインオンで適用した。０．１ｍｌ精度の目盛り付きシリンジを使用して、２０ｍｇのオキシクロザニド／Ｋｇ、つまり０．２０ｍｌ／ｋｇ（体重）の用量で６匹のイヌの各々に本生成物を投与した。

臨床的評価：各期の１日目で、イヌの概要を管理するために、計量を含む身体検査を実施した。イヌの世話を担当する個人が臨床的観察を毎日行った。各期の０日目での治療施術後の１時間で臨床的観察を行った。背骨から各側７〜８ｃｍの２つの領域を剃毛し、約３０ｃｍ×５ｃｍの領域をカバーした。剃毛を、以下２日目、１日目、０日目＋２４時間、０日目＋４８時間、０日目＋７２時間、４日目、５日目、および６日目の時点で再度行った。治療領域周辺の毛皮の美容的外観を、０日目＋１時間、０日目＋３時間、０日目＋２４時間、０日目＋７２時間、および７日目に評価した。各評価時に、以下のスコアリングシステムに従って、各イヌの毛皮の外観を評価した。
●湿潤外観（はい／いいえ）
●油脂的外観（はい／いいえ）
●毛皮の塊（はい／いいえ）
●堆積物（軽度／中度／重度）
●変色（説明）

皮膚忍容性を、以下０日目＋１時間、０日目＋３時間および０日目＋２４時間、０日目＋７２時間、７日目の治療後に評価した。
各評価時に、以下のスコアリングシステムに従って、治療領域の真皮忍容性を評価する。
●紅斑：
●紅斑なし
●非常に軽度な紅斑（ほぼ不可視）
●明確に画定された紅斑
●中度の紅斑
●軽度のびらん（深部病変）を伴う重度の紅斑（ビーツの根のような赤色）
●浮腫（はい／いいえ）
●擦傷（はい／いいえ）
●かさぶた（はい／いいえ）

血液サンプリング：各動物について、以下１日目、０日目＋１時間、０日目＋５時間、０日目＋９時間、０日目＋１２時間、０日目＋１６時間、０日目＋２４時間、０日目＋３２時間、０日目＋４８時間、０日目＋５６時間、０日目＋７２時間、０日目＋８０時間、４日目、５日目、６日目、およびＤ７日目の時点（１０％の忍容性）でリチウムヘパリンを含むチューブを使用して、頸静脈から約４ｍｌの血液試料を収集した。遠心分離（＋４℃で１５分間、約３５００回転／分）を、サンプリング後最大３０分行った。血漿を収集し、次いで、以下のようにチューブ（Ｎｕｎｃ、１．８ｍｌのタイプ）で２つのアリコートに分割した；Ｓ１アリコート：約０．５ｍｌ、Ｓ２アリコート：血漿の残り（０．５ｍｌ超）。各アリコートをＣＥＶＡ研究コードで識別した；動物の識別番号およびそのケース番号、アリコート番号（Ｓ１またはＳ２）、サンプリングのタイプ、日付、および時刻。アリコートを分析まで−７０℃＋／−５℃で保存した。

皮膚サンプリングディスク（Ｄ−Ｓｑｕａｍｅディスク）：本質的に、Ｖｉｄｅｍｏｎｔｅｔａｌ．：ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２３，ｐｐ．１０３−１２３，２０１１に従って行った。テープストリッピング（粘着フィルム）を、除去前に固定量の圧力で皮膚の表面に押し付ける。ＳＣの表面層はフィルムに付着し、角質層から剥がれ、次いで、さらに調査するために利用できるようになる。同時に、テープストリッピングを繰り返すことにより、皮膚バリア機能障害の効果的な比較モデルを得ることができる。

以下１日目、０日目＋３時間、０日目＋８時間、０日目＋２４時間、０日目＋４８時間、０日目＋７２時間、４日目、５日目、６日目、および７日目（１０％に忍容性）の時点に行った特別なサンプリング方法（Ｄ−Ｓｑｕａｍｅディスク）を使用して、背中の剃毛した左側の領域または右側の領域から皮膚の落屑を（交互に）行った。

直径２２ｍｍの１２枚のディスク（Ｄ−Ｓｑｕａｍｅディスク）を、背骨に沿って、明確に画定し、以前に印をつけた同じ領域に連続して適用した；ディスクを以下のように適用した。
●ピンセットを使用して、付属のエッジを使用してディスクをそのバッキングから慎重に取り外した。
●画定した領域にディスクを適用した。
●ディスクを、Ｄ−ＳｑｕａｍｅＰｒｅｓｓｕｒｅＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔ−１５０ｇ／ｃｍ^２を使用して約１秒間押し付けた。

すべての場合において、皮膚から取り外した１２枚のディスクを、以下のように３つの試料（Ｓ１、Ｓ２、およびＳ３）に分割した。
●Ｓ１：最初の２枚のディスクをシンチレーションバイアルに入れた
●Ｓ２：次の５枚のディスクをシンチレーションバイアルに入れた
●Ｓ３：最後の５枚のディスクをシンチレーションバイアルに入れた

各バイアルをＣＥＶＡ研究コードで識別した；動物の識別番号およびそれらのケース番号、バイアル番号（Ｓ１、Ｓ２、またはＳ３）、サンプリングのタイプ、日付、および時刻。

薬物動態評価
薬物動態分析を、非コンパートメントデータモデリングを実施するために設計されたＭｉｃｒｏｓｏｆｔ−ＷｉｎｄｏｗｓベースのソフトウェアプログラムであるＰｈｏｅｎｉｘソフトウェア（バージョン６．３、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ，ＵＳＡ）を使用して行った。「欠落」と示されたデータポイントは、計算中に体系的に無視したため、結果に影響しない。欠落ステータスが割り当てられ、旗印は使用されない。外れ値が疑われる場合は、ＳＴＡＴＧＲＡＰＨＩＣＳの外れ値識別手順を使用して識別した。

非コンパートメント手法を使用してデータを分析した。この手法の目的は、観察を記述するのに好適な可能な数学的モデルの存在および構造を一切仮定せずに、記述的データ分析に基づいて薬物の動態パラメータの推定値を提供することである。しかし、この分析を行うには、動態プロセスの終末消去期が指数方程式で近似し得ると仮定する必要がある。これは、体内の薬物の終末除去プロセスに属するデータの半対数変換を直線で近似し得ると仮定するのと同等である。この仮定に基づく、ＡＵＣ（ゼロモーメント）およびＴｈａｌｆ（消去半減期）などの統計的モーメント理論に基づく薬物の基本的な動態パラメータ、ならびに他の古典的なパラメータ。

算術平均、標準偏差、平均の標準誤差、変動係数（ＣＶ％）、最大、および最小などの記述統計は、毎日および各濃度パラメータの治療毎に計算される。平均濃度および標準偏差を計算し、平均濃度時間曲線をプロットした。薬物動態パラメータの記述統計を、治療毎に計算した。

結果
臨床的観察、皮膚忍容性、および美容的評価：０日目の皮膚治療後、すべてのイヌは治療によく応答した。期全体に渡って真皮忍容性の有意な兆候は現れなかった。治療領域周辺の毛皮の美容的外観を評価した。毛皮は、本質的には、最長７日間の間、２４時間湿潤および油脂的外観があり、最終的には一部の堆積物（軽度または中度）を伴った。

血液中のオキシクロザニド濃度：オキシクロザニドの平均およびＳＤ血漿濃度−時間プロファイルを表８に示す。局所適用後の生物学的利用は低かった（１２％）。オキシクロザニドの低濃度が観察され、これは、腸内細菌叢のわずかな暴露を示唆した。

皮膚中のオキシクロザニド濃度：オキシクロザニドの平均およびＳＤ表在性皮膚濃度−時間プロファイルを表９に示す。オキシクロザニドは、局所適用後に角質層に長期間蓄積する。オキシクロザニドは、適用部位とテープストリッピング領域との間に約１０ｃｍあるため、身体の皮膚領域に均等に拡散するようである。

薬物動態分析：血漿中のオキシクロザニドの平均および個別の薬物動態パラメータを以下の表１０に要約する。１２％の局所投与後のオキシクロザニドの相対的生物学的利用を、２０ｍｇ／ｋｇの用量で治療された動物間で計算した。

局所適用後の動物間の相互変動は低かった。主なＰＫパラメータを以下の表１１に示す。

局所適用後の動物間の相互変動は低かった。主なＰＫパラメータを以下の表１２に示す。

結論
上記のオキシクロザニドの特定の特性（高い効力および薬物動態特性）により、イヌの皮膚感染症を治療するための優れた抗生物質の３つの主要な事項が達成可能である；ｉ）長期間の治療が可能になる（通常、表在性膿皮症の場合、３〜４週間および深部膿皮症の場合ははるかに長期間）ほどの毒性の低さ、ｉｉ）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓｐｐまたはグラム陽性菌を標的とし、グラム陰性菌に対しては有効性がなく、それにより、耐性の発生を防ぐ狭いスペクトル、ｉｉｉ）皮膚組織における有効濃度に達するような分布。

実際、イヌの膿皮症の治療は、典型的には、３〜４週間の全身殺菌薬投与に基づいており、局所抗菌薬療法は、補助治療として提案される。ガイドラインは、全身抗生物質療法の第一選択の経験的薬剤として、アモキシシリン−クラブラン酸、セファレキシン、またはクリンダマイシンを推奨している。微生物病原体、および特にイヌの膿皮症に関連するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ株の抗生物質感受性の減少により、これらの症例の治療は、ますます困難になってきている。１９９９年のメチシリン耐性株（すなわち、ベータラクタムファミリーのすべてのメンバーに耐性のある株）の最初の報告以来、耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ株の数が世界中で増加していることが報告されている。臨床分離菌間でのそのような株の有病率は、地理的位置および医師の種類（一般開業医または紹介医）に応じて８．２％〜４７．９％と大きく異なる。

結果として、局所療法は、表在性細菌感染症の管理のための合理的な抗菌薬使用の重要な要素となっている。研究の条件において、本発明による局所用生成物は、すべての動物において、角質層において長期間（１〜３週間）、高濃度（ＭＩＣの少なくとも１０００倍）および高い持続性を示すと結論付けることができる。これらの予備調査は、スポットオンでの毎週の投薬〜毎月の投薬は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓｐｐによる皮膚感染症の治療に効率的であり得ることを示した。

Claims

２〜２０重量／体積％の少なくとも１つのハロゲン化サリチルアニリド、またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物、３５〜５５重量／体積％のジメチルスルホキシドを含む局所獣医学スポットオンまたはラインオン組成物であって、前記少なくとも１つのハロゲン化サリチルアニリドが、ニクロサミドおよび／またはオキシクロザニドから選択され、前記組成物が、ジエチレングリコールモノメチルエーテルに溶解している、局所獣医学スポットオンまたはラインオン組成物。
前記ハロゲン化サリチルアニリドが、オキシクロザニドである、請求項１に記載の局所獣医学スポットオンまたはラインオン組成物。
５〜１５重量／体積％のオキシクロザニドを含む、請求項１に記載の局所獣医学スポットオンまたはラインオン組成物。
８〜１２重量／体積％のオキシクロザニドを含む、請求項１に記載の局所獣医学スポットオンまたはラインオン組成物。
４０〜５０重量／体積％のジメチルスルホキシドを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の局所獣医学スポットオンまたはラインオン組成物。
非ヒト哺乳動物の膿皮症または皮膚炎の治療または予防に使用するための請求項１〜５に記載の局所獣医学スポットオンまたはラインオン組成物であって、任意に５〜１０日毎に複数回繰り返される単回適用で、前記非ヒト哺乳動物に局所適用される、局所獣医学スポットオンまたはラインオン組成物。
前記スポットオンまたはラインオン組成物が、３〜５週間連続して５〜１０日毎に１回、前記非ヒト哺乳動物に適用される、請求項６に記載の使用のための局所獣医学スポットオンまたはラインオン組成物。
前記スポットオンまたはラインオン組成物が、１０〜８００ｍｇ、好ましくは約２００ｍｇのハロゲン化サリチルアニリドを送達する、請求項５〜７のいずれかに記載の使用のための局所獣医学スポットオンまたはラインオン組成物。
前記スポットオンまたはラインオン組成物が、体重１０ｋｇあたり０．５〜５ｍｌの用量で適用される、請求項５〜８のいずれかに記載の使用のための局所獣医学スポットオンまたはラインオン組成物。
膿皮症または皮膚炎を予防および／または治療する方法であって、２〜２０重量／体積％の少なくとも１つのハロゲン化サリチルアニリド、またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物、３５〜５５重量／体積％のジメチルスルホキシドを含む組成物を、スポットオンまたはラインオンで局所的に適用することを含み、前記少なくとも１つのハロゲン化サリチルアニリドが、ニクロサミドおよび／またはオキシクロザニドから選択され、前記組成物が、ジエチレングリコールモノメチルエーテルに溶解している、方法。
前記治療が、局所的に単回適用され、任意に５〜１０日毎に複数回繰り返される、請求項１０に記載の膿皮症または皮膚炎を予防および／または治療する方法。