CN116077642A - 用于减少或防止转移的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及用于减少或防止转移的组合物和方法。提供了包含吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA)的组合物和利用其减少或防止癌症转移形成的方法。所述组合物可配制用于局部‑区域递送。所述组合物可以是基本上没有癌抗原的。用GLA的治疗可与用COX2抑制剂和β肾上腺素能受体阻断剂的治疗组合。

Description

用于减少或防止转移的组合物和方法
本申请是分案申请，原申请的申请日为2014年6月4日、申请号为201480043921.4、发明名称为“用于减少或防止转移的组合物和方法”。
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2014年4月18日提交的美国申请序列号14/256,881的优先权，其要求2013年6月4日提交的美国临时申请序列号61/830,675的优先权。所有这些申请均通过提述以它们的整体并入本申请。
技术领域
本发明涉及使用吡喃葡萄糖基脂质佐剂(如GLA或短的，SLA)单独或与COX2抑制剂和β肾上腺素能受体阻断剂组合来减少或甚至防止转移的发展。
发明背景
在近十年来，尽管癌症早期检测和治疗干预取得了进展，但总的癌症存活率没有显著改善，而且转移仍然是大多数实体恶性肿瘤的主要致死原因。
近来人们开始认识到，原发性肿瘤切除术的围手术期，即外科手术即将开始前、术中和术后的时期，潜伏着几种未被人注意到的长期癌症复发风险因素，因此围手术期的特征在于既存的微小转移爆发和新的转移起始的风险都很高。这些围手术期风险大部分是由于原发性肿瘤的手术去除所诱导的各种扰动所致，人们认为这些扰动通过若干机制促进既存的微小转移的进展和新的转移起始，其中一些机制是最近才被鉴定的。
在整个围手术期中，作为患者对于(i)原发性肿瘤的存在，(ii)生理和心理应激，和(iii)手术过程本身及其伴随的麻醉、镇痛，输血和其它手术中的程序的神经内分泌和旁分泌响应的结果，多种可溶的因子系统性地增加。这些可溶的化合物包括儿茶酚胺、前列腺素、糖皮质激素、阿片类药物，和各种施用的麻醉和镇痛剂。近年来已经清楚，在体外，这些因子中许多直接作用于恶性细胞，激活对肿瘤转移活动而言关键的几种分子过程，包括肿瘤细胞增殖、粘附、运动、胞外基质侵入能力、对细胞凋亡和失巢凋亡(anoikis)的抗性，和促血管生成因子的分泌。此外，体外以及人类和动物体内研究显示，这些可溶的因子中许多可导致抗转移细胞介导的免疫(CMI)的阻遏，这确实是一种常见的围手术期现象。
CMI，特别是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和自然杀伤(NK)细胞，甚至在手术前就被抑制，而且在手术后抑制更显著，抑制的程度与手术创伤和组织损伤的程度对应。值得注意的是，已经在因果关系上证明，CMI抑制可介导促进动物模型中的癌症转移，而且临床研究已将CMI抑制与转移发展的易感性增加关联起来。
在各种旨在减少恶性组织和/或防止CMI抑制的治疗中，癌症患者中的免疫治疗在过去的十年中已重新获得了发展势头。具体而言，已知1型T辅助细胞(Th1)和促炎细胞因子(例如IL-2，IL-12，IFN-γ)显著增强CMI，在恶性细胞的体内消除中起重要的作用。免疫刺激方法(ISA)通常利用确立的生物反应调节剂(BRM)，包括含有病原体相关分子模式的天然或合成的化合物(例如LPS、CpG)，或这些化合物诱导的促炎/Th1型细胞因子。
然而，虽然采用抗肿瘤ISA的动物研究显示了有希望的结果，但癌症患者中的临床研究大体上不太成功。有人提出这种差异背后的原因是在动物模型中模拟人类癌症发生的几个难点，这些难点大多集中在植入的癌性组织的生物学与宿主生理学(包括免疫易感性和与植入组织的兼容性)的差异。有人提出这种差异的背后原因还有应激反应，已知应激反应可诱导免疫抑制作用，它由癌症患者中的特征性心理和生理状况所产生，这些状况在动物模型中并不存在。
Neeman等(2012)Clin Cancer Res.，18(18):4895-902描述了一种通过利用同时阻断β-肾上腺素能和抑制COX-2，在围手术期靶向儿茶酚胺和前列腺素来减少术后癌症复发的方法。
Avraham等(2010)Brain Behav Immun.，24(6):952-8描述了免疫刺激疗法与防止手术后免疫抑制的内分泌阻断剂药物干预的集成，以减少手术后肿瘤进展。
尽管围手术期的重要性得到了承认，而且在使用ISA的动物实验中获得了明显有希望的结果，但免疫刺激疗法很少在围手术期中被用于患者，这可能是由于预期ISA有热原效应和不良作用，它们无法与手术环境中危及生命的感染的指征相区分。为数不多的尝试过该手段的临床试验使用了单一的Th1(例如，IL-2，IL-12)或促炎性(例如，IFN-α)细胞因子，且确实报告了对这些疗法的严重不良反应，包括白细胞减少症、体能状况恶化、发热、呕吐，和精神抑郁。近来FDA批准的合成药物，它们基于病原体相关分子模式(PAMP)，引起的不良反应明显较少，同时可诱导有效的、自控的、内源性的多细胞因子应答。这样的ISA包括TLR-4激动剂，称为吡喃葡萄糖基脂质佐剂(如US 8,273,361和WO 2010/141861中公开的GLAS)，其激活T细胞、B细胞和树突细胞。
US 8,273,361基于发现一种以基本上均质的化学形式提供的合成吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA)的有用的免疫佐剂性质而公开了组合物和方法，包括用于诱导或增强免疫应答的疫苗和药物组合物。还提供了疫苗和药物组合物，其包括GLA和一种或多种抗原，Toll样受体(TLR)激动剂、共佐剂和载体如药物载体。
WO 2010/141861公开了具有替代的化学结构和性质的化合物，特别是吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA)化合物。也公开了药物组合物、疫苗组合物，和用于诱导或增强免疫应答的相关方法。
仍然需要针对转移发展的更有效的治疗。
本文引用的所有出版物、专利和专利申请在此通过提述以其整体并入用于所有目的。
发明内容
本发明提供使用吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA)减少或预防癌症转移形成的组合物和方法。根据一些实施方案，本发明涉及使用GLA的局部-区域递送来减少或预防转移发展。根据一些实施方案，在没有癌症抗原的共施用(无论作为确定的肽，蛋白质，或肽、蛋白质或片段的混合物，还是作为灭活或修饰的癌细胞制备物)的条件下使用GLA。根据一些实施方案，将GLA与COX2抑制剂和β-肾上腺素能受体阻断剂组合。
本发明首次公开了将GLA局部-区域递送至与待治疗的肿瘤邻近的空间或空腔，或递送至与待治疗的肿瘤的引流淋巴结邻近的空间或空腔，或直接递送入待治疗的肿瘤的引流淋巴结中。这种GLA局部-区域递送也可在去除原发性肿瘤后进行，将其递送至切除肿瘤块后形成的空间或空当。本发明因此提供一种更受控的GLA施用方式，以改善治疗结果。有利地，局部-区域递送可提供活性成分的更持续的作用。此外，GLA的局部-区域递送可允许较低的GLA全身给药，并减少在癌症背景中可与全身递送相关的有害副作用。
本发明进一步公开了使用GLA对抗癌症转移而不共施用癌抗原，例如：来源于被治疗的受试者的肿瘤的抗原；含有已知与被治疗的受试者的肿瘤类型相关的抗原的抗原或抗原组合物；或者来源于肿瘤细胞施用的抗原(antigens derived from administration oftumor cells)的制备物，或来自患者的肿瘤细胞的制备物，或患者定义的肿瘤(patientdefined tumors)的混合物，由此区别于在用于癌症疫苗的组合物的语境中的GLA施用。有利地，本发明中GLA的所述使用不限于已鉴定了癌症特异性抗原的癌症类型。
在一些实施方案中，将GLA用于在肿瘤切除手术后防止实体瘤的转移。现在公开了在手术之前和之后施用的GLA实现转移发展的有效抑制。
本发明进一步公开了可将GLA治疗与用β肾上腺素能受体阻断剂和/或COX2-选择性抑制剂的治疗组合，以进一步优化转移抑制的结果。不受限于任何特定的作用机制或理论，我们设想β肾上腺素能受体阻断剂和COX2抑制剂的组合对抗在癌症患者中可能发生的应激诱导的免疫抑制，由此导致GLA功效的改善。本申请公开的活性成分的组合至少加和性地起作用，优选协同性地起作用。
在一个方面，本发明提供治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括对所述受试者施用包含吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA)或其药物可接受的盐作为活性成分的药物组合物的步骤，其中所述施用对治疗癌症是有效的。
根据一个方面，本发明提供用于减少或防止受试者中转移发展的方法，所述方法包括对所述受试者施用包含吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA)或其药学上可接受的盐作为活性成分的药物组合物的步骤，其中所述施用对减少或防止转移是有效的。
如本申请使用的，术语“转移”、“癌症转移”或“肿瘤转移”可互换地使用，指源自位于一个器官或组织中的原发性癌性肿瘤的癌细胞在另一个非邻近的器官或组织中的生长。转移还涵盖微转移(micrometastasis)，微转移是在与原始的原发性癌性肿瘤的器官不直接相连的身体部分或器官中存在不可检测量的癌细胞。转移也可以被定义为过程的几个步骤，如癌细胞从原始肿瘤部位出发，和癌细胞迁移和/或侵入到身体的其他部分。
如本申请使用的，“减少或防止转移发展(metastasis development)”指延缓或甚至完全抑制转移的扩散、发展和生长。该术语还可包括减少器官或组织中转移的数目，以及减少待通过本发明的组合物治疗的现有癌症的大小、数目或恶性状态。如本领域的普通技术人员会理解的，转移发展的减少或防止可通过本领域已知的标准方法来测量，包括通过本领域已知的多种放射学、影像、循环肿瘤标志物、触诊(palpitation)、直接测量或观察技术测量的肿瘤大小或数目的减少。因此，转移发展的减少或防止还可以用与被治疗的癌症的疾病状态相关的体征或症状的减少、或存活的延长、或因被治疗的癌症的疾病体征或症状而遭受的痛苦的减少来度量。
在一些实施方案中，GLA或其药学上可接受的盐通过局部-区域递送施用。
如本申请使用的，“局部-区域递送”表示递送至与待治疗肿瘤邻近的空间或空腔，或递送至与待治疗肿瘤的引流淋巴结邻近的空间或空腔，或直接递送入待治疗肿瘤的引流淋巴结中。如果局部-区域递送在原发性肿瘤切除手术后施用，则其包括递送至切除肿瘤块后形成的空间或空当。局部-区域递送可如下进行：单次注射至单个或多个局部-区域空间，或作为同时给予或历时至少约一分钟、数分钟、数小时、数天或数周给予的一系列注射。如本申请使用的，局部-区域递送不包括肿瘤内施用。此外，局部-区域递送不包括表面(topical)施用：在表面施用中将药物组合物施用于受试者的外体表上。
在一些实施方案中，施用GLA或其药学上可接受的盐而无癌症抗原。
在一些实施方案中，所施用的包含GLA或其药学上可接受的盐的药物组合物基本上没有癌症抗原。
如本申请使用的“基本上没有”指小于约1％，优选小于约0.1％，小于约0.01％(w/w)，小于约0.001％(w/w)。
在一些实施方案中，将所述方法用于在肿瘤切除手术后减少或防止受试者中的转移发展。在一些实施方案中，在肿瘤切除手术的围手术期中施用GLA或其药学上可接受的盐。
所述“围手术期”指即将手术之前、手术过程中和刚手术后的时间。它包括手术之前的时间，此时患者正准备手术(“术前期”)，然后是手术中花费的时间(“手术期”)和直到手术后的时间，此时患者正在恢复并通常被监测并发症(“术后期”)。围手术期可发生在医院、外科中心和/或医疗人员的办公室。
如本申请使用的，围手术期通常指起于肿瘤切除手术前2-10天、止于该手术后14-21天的时间，例如，起于手术前4-5天、止于手术后约14天，或者起于手术前7天、止于手术后约7天。
在一些实施方案中，将GLA或其药学上可接受的盐在手术前施用至少一次(例如两次、三次、四次或更多)。在一些实施方案中，将GLA或其药学上可接受的盐在手术后施用至少一次(例如两次、三次、四次或更多)。在一些实施方案中，在手术之前和之后均施用GLA或其药学上可接受的盐。
在一些多次施用GLA或其药学上可接受的盐的实施方案中，其以恒定剂量施用。根据这些实施方案，每次施用GLA或其药学上可接受的盐时，将其以相同剂量施用。在另外的多次施用GLA或其药学上可接受的盐的实施方案中，其以变化剂量施用。根据这些实施方案，GLA或其药学上可接受的盐的施用剂量在整个治疗期变化。
在一些实施方案中，GLA具有下述结构式(I)：
Figure BDA0004100388890000061
其中:R1，R3，R5和R6为C11-C20烃基；R2和R4为C12-C20烃基。
在一些实施方案中，R1，R3，R5和R6为十一烷基，R2和R4为十三烷基。
在一些实施方案中，GLA具有下述结构式(II)：
Figure BDA0004100388890000071
其中：
L1，L2，L3，L4，L5和L6为相同或不同的，且独立地为-O-，-NH-或-(CH2)-；
L7，L8，L9,和L10为相同或不同的，且独立地为不存在或为-C(＝O)-；
Y1为酸官能团；
Y2和Y3为相同或不同的，且独立地为-OH，-SH，或酸官能团；
Y4为-OH或-SH；
R1，R3，R5和R6为相同或不同的，且独立地为C8-C13烃基；且
R2和R4为相同或不同的，且独立地为C6-C11烃基。
在一些实施方案中，本申请使用的GLA佐剂可具有下述结构式(III)：
Figure BDA0004100388890000072
其中：
R1，R3，R5和R6为C11-C20烃基；R2和R4为C9-C20烃基。
在更具体的实施方案中，GLA具有上面所列的式III，其中R1，R3，R5和R6为C11-14烃基；且R2和R4为C12-15烃基。
在更具体的实施方案中，GLA具有上面所列的式III，其中R1，R3，R5和R6为C11烃基；且R2和R4为C13烃基。
在更具体的实施方案中，GLA具有上面所列的式III，其中R1，R3，R5和R6为C11烃基；且R2和R4为C9烃基。
在一些实施方案中，GLA是合成的，且具有下述结构式(IV)：
Figure BDA0004100388890000081
在上面的GLA结构(式IV)的一些实施方案中，R1，R3，R5和R6为C11-C20烃基；且R2和R4为C9-C20烃基。在一些实施方案中，R1，R3，R5和R6为C11烃基；且R2和R4为C9烃基。
在一些实施方案中，GLA是合成的且具有下述结构式(V)：
Figure BDA0004100388890000082
在上面的GLA结构(式V)的一些实施方案中，R1，R3，R5和R6为C11-C20烃基；且R2和R4为C9-C20烃基。在一些实施方案中，R1，R3，R5和R6为C11烃基；且R2和R4为C9烃基。
在一些实施方案中，GLA是合成的且具有下述结构式(VI)：
Figure BDA0004100388890000091
在上面的GLA结构(式VI)的一些实施方案中，R1，R3，R5和R6为C11-C20烃基；且R2和R4为C9-C20烃基。在一些实施方案中，R1，R3，R5和R6为C11烃基；且R2和R4为C9烃基。
在一些实施方案中，合成的GLA具有下述结构：
Figure BDA0004100388890000092
在一些实施方案中，合成的GLA具有下述结构：
Figure BDA0004100388890000093
在一些实施方案中，合成的GLA具有下述结构：
Figure BDA0004100388890000101
在一些实施方案中，本发明的方法进一步包括施用β肾上腺素能受体阻断剂和COX2抑制剂的步骤。
在一些实施方案中，β肾上腺素能受体阻断剂和COX2抑制剂的施用在肿瘤切除手术的围手术期过程中进行。
在一些典型的实施方案中，β肾上腺素能受体阻断剂和COX2抑制剂存在于不同的药物组合物中。
在一些实施方案中，将β肾上腺素能受体阻断剂和/或COX2抑制剂在手术前施用至少一次(例如两次、三次、四次或更多)。在另外的实施方案中，将β肾上腺素能受体阻断剂和/或COX2抑制剂在手术后施用至少一次(例如两次、三次、四次或更多)。在一些实施方案中，将β肾上腺素能受体阻断剂和/或COX2抑制剂在手术之前和之后施用。
在一些实施方案中，GLA或其药学上可接受的盐、β肾上腺素能受体阻断剂和COX2抑制剂在围手术期过程中于同日施用。在另外的实施方案中，将它们于不同日施用。
在一些实施方案中，所述β肾上腺素能受体阻断剂选自下组：醋丁洛尔(acebutolol)、阿替洛尔(atenolol)、倍他洛尔(betaxolol)、比索洛尔(bisoprolol)、卡替洛尔(carteolol)、卡维地洛(carvedilol)、塞利洛尔(celiprolol)、艾司洛尔(esmolol)、拉贝洛尔(labetalol)、美托洛尔(metoprolol)、纳多洛尔(nadolol)、奈必洛尔(nebivolol)、氧烯洛尔(oxyprenolol)、喷布洛尔(penbutolol)、吲哚洛尔(pindolol)、普萘洛尔(propranolol)、索他洛尔(sotalol)、噻吗洛尔(timolol)，或它们药学上可接受的盐。每个可能性代表本发明的分别的实施方案。在具体的实施方案中，其为普萘洛尔或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述COX2抑制剂选自下组：塞来考昔(celecoxib)、西米考昔(cimicoxib)、艾托考昔(etoricoxib)、依托度酸(etodolac)、依托考昔(eoricoxib)、罗美昔布(lumiracoxib)、美洛昔康(meloxicam)、帕瑞考昔(parecoxib)、罗非考昔(rofecoxib)、替拉考昔(tiracoxib)、伐地考(valdecoxib)，或它们药学上可接受的盐。每个可能性代表本发明的分别的实施方案。在具体的实施方案中，其为依托度酸或其药学上可接受的盐。
根据另一个方面，本发明提供包含GLA或其药学上可接受的盐作为活性成分的药物组合物，用于减少或防止转移发展，所述组合物基本上没有癌抗原。
在一些实施方案中，所述药物组合物由作为唯一活性成分的GLA或其药学上可接受的盐组成。
在一些实施方案中，将所述药物组合物配制用于局部-区域递送。
在一些实施方案中，所述药物组合物在肿瘤切除手术的围手术期过程中使用。
在一些实施方案中，所述药物组合物在肿瘤切除手术的围手术期过程中与β肾上腺素能受体阻断剂和COX2抑制剂一起使用。
本发明的这些和其他方面和特征通过附图、详细说明、实施例和随附的权利要求将不言自明。
附图简述
图1A和1B。雄性大鼠中有(图1A)或无(图1B)肾上腺素的情况下GLA对于MADB106LTR的作用的剂量曲线。在图1A中，n＝38；*-来自PBS，p<0.0001；#-来自佐剂，p<0.05。在图1B中，n＝37；*-来自PBS，p<0.05；#-来自佐剂，p<0.05。
图2A和2B。雄性(图2A)和雌性(图2B)大鼠中GLA作用的起始和持续的时间过程。在图2A中，n＝79；*-来自PBS，p<0.05；**-来自PBS，p<0.0001；#-来自佐剂，p<0.05。在图2B中，n＝93；*-来自PBS，p<0.05；#-来自佐剂，p<0.05。
图3。GLA对于大鼠的肺中MADB106转移的发展的作用。n＝86(44雌性)；*-来自PBS，p<0.05；#-来自佐剂，p<0.01。
图4A和4B。GLA在首次实验动物中(
Figure BDA0004100388890000111
animal)与NK耗竭的动物中对MADB106LTR的作用的对比(图4A)以及仅在首次实验动物中对MADB106 LTR的作用(图4B)。在图4A中，对于“未耗竭”：n＝25；*-来自PBS，p<0.01；对于“耗竭”：n＝27；组差异不明显。
发明详述
本发明涉及减少或甚至防止转移形成。本申请公开的手段基于用GLA进行免疫刺激。GLA可任选地与COX2抑制剂和β肾上腺素能受体阻断剂组合。
药物组合物
在一个方面，本发明的药物组合物可包含至少一种GLA化合物，与药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂组合。在另一个方面，本发明的药物组合物通常包含至少一种GLA化合物，β肾上腺素能受体阻断剂如普萘洛尔，或COX2-选择性抑制剂如依托度酸，与药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂组合。本申请所述的活性剂的药学上可接受的盐也在本发明的范围内。“药学上可接受的盐”指本申请所述的化合物通过该化合物与有机或有机酸组合而成的盐(酸加成盐)或与有机或无机碱组合而成的盐(碱加成盐)。本发明的组合物可以以游离碱或盐的形式使用，两种形式都视为在本发明的范围内。
吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA)：
GLA是合成的TLR-4激动剂，能够引发宿主中的免疫反应，特别是细胞介导的免疫反应。GLA不同于其他TLR-4激动剂，如LPS、MPL和3-DMPL，它是完全合成的，且具有确定数目、长度和位置的碳链。GLA能够引发高效的Th1活化，同时仅引起极小的不良Th2作用。包含GLA的组合物在例如US 8,273,361和WO 2010/141861中有描述。
用于本发明的组合物的GLA分子包含：
(i)二葡糖胺骨架，具有还原性末端葡糖胺和非还原性末端葡糖胺，二者通过非还原性末端葡糖胺的己糖胺1位和还原性末端葡糖胺的己糖胺6位之间的醚键相连接；(ii)O-磷酰基，附接于非还原性末端葡糖胺的己糖胺4位；和(iii)至多六个脂肪酰基链；其中一个脂肪酰基链通过酯键附接于还原性末端葡糖胺的3-羟基，其中一个脂肪酰基链通过酰胺键附接于非还原性末端葡糖胺的2-胺基，并包含通过酯键连接于多于12个碳原子的烷酰基链的十四烷酰基链(tetradecanoyl chain)，且其中的一个脂肪酰基链通过酯键附接于非还原性末端葡糖胺的3-羟基，并包含通过酯键连接于多于12个碳原子的烷酰基链的十四烷酰基链。GLA通常不是3'-脱-O-酰基化的。
如本申请使用的GLA可具有下述结构式(I)：
Figure BDA0004100388890000131
其中：
R1，R3，R5和R6为C11-C20烃基；且R2和R4为C12-C20烃基。
一个具体实例是这样的GLA，其中R1，R3，R5和R6为十一烷基，且R2和R4为十三烷基。
此外，如本申请使用的GLA可具有下述结构式(II)：
Figure BDA0004100388890000132
其中:
L1，L2，L3，L4，L5和L6为相同或不同的，且独立地为-O-，-NH-或-(CH2)-；
L7，L8，L9,和L10为相同或不同的，且独立地为缺少或-C(＝O)-；
Y1是酸官能团；
Y2和Y3为相同或不同的，且独立地为-OH，-SH，或酸官能团；
Y4为-OH或-SH；
R1，R3，R5和R6为相同或不同的，且独立地为C8-C13烃基；和
R2和R4为相同或不同的，且独立地为C6-C11烃基。
可使用的合适GLA分子的实例在上述WO 2010/141861和美国专利号8,722,064中描述。
在一些实施方案中，本申请使用的GLA佐剂可具有下述结构式(III)：
Figure BDA0004100388890000141
其中：
R1，R3，R5和R6为C11-C20烃基；且R2和R4为C9-C20烃基。
在更具体的实施方案中，GLA具有上述所列式III，其中R1，R3，R5和R6为C11-14烃基；且R2和R4为C12-15烃基。
在更具体的实施方案中，GLA具有上述所列式III，其中R1，R3，R5和R6为C11烃基；且R2和R4为C13烃基。
在更具体的实施方案中，GLA具有上述所列式III，其中R1，R3，R5和R6为C11烃基；且R2和R4为C9烃基。
在一些实施方案中，GLA是合成的，且具有下述结构式(IV)：
Figure BDA0004100388890000142
在上述GLA结构(式IV)的一些实施方案中，R1，R3，R5和R6为C11-C20烃基；且R2和R4为C9-C20烃基。在一些实施方案中，R1，R3，R5和R6为C11烃基；且R2和R4为C9烃基。
在一些实施方案中，GLA是合成的，且具有下述结构式(V)：
Figure BDA0004100388890000151
在上述GLA结构(式V)的一些实施方案中，R1，R3，R5和R6为C11-C20烃基；且R2和R4为C9-C20烃基。在一些实施方案中，R1，R3，R5和R6为C11烃基；且R2和R4为C9烃基。
在一些实施方案中，GLA是合成的，且具有下述结构式(VI)：
Figure BDA0004100388890000152
在上述GLA结构(式VI)的一些实施方案中，R1，R3，R5和R6为C11-C20烃基；且R2和R4为C9-C20烃基。在一些实施方案中，R1，R3，R5和R6为C11烃基；且R2和R4为C9烃基。
在一些实施方案中，合成的GLA具有下述结构：
Figure BDA0004100388890000153
在一些实施方案中，合合成的GLA具有下述结构：
Figure BDA0004100388890000161
在一些实施方案中，合成的GLA具有下述结构：
Figure BDA0004100388890000162
“烃基”(alkyl)意指直链或支链的、非环状或环状的、不饱和或饱和的脂肪烃，其含有1至20个碳原子，且在一些优选的实施方案中含有11至20个碳原子。代表性的饱和直链烃基包括甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基等，包括十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基等；而饱和支链烃基包括异丙基、仲丁基、异丁基、叔丁基、异戊基等。代表性的饱和环烃基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基等；而不饱和环烃基包括环戊烯基和环己烯基等。环烃基在本申请中还称为“同素环(homocycles)”或“同素碳环(homocyclic rings)”。不饱和烃基含有至少一个邻近碳原子之间的双键或三键(分别称为“烯基”或“炔基”)。代表性的直链和支链的烯基包括乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基等；而代表性的直链和支链的炔基包括乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-甲基-1-丁炔基等。
“酸官能团”意指能够在水性介质中贡献质子的官能团(即，布朗斯台德-洛里酸(
Figure BDA0004100388890000163
-Lowry acid))。在贡献质子后，酸官能团变成带负电的物质(即，酸官能团的共轭碱)。酸官能团的实例包括但不限于：-OP(＝O)(OH)2(磷酸根)、-OS(＝O)(OH)2(硫酸根)、-OS(OH)2(亚硫酸根)、-C(＝O)OH(羧酸根)、-OC(＝O)CH(NH2)CH2C(＝O)OH(天冬氨酸根)、-OC(＝O)CH2CH2C(＝O)OH(琥珀酸根)，和-OC(＝O)CH2OP(＝O)(OH)2(羧甲基磷酸根)。
GLA可商业获得。用于合成GLA的方法在例如上述的WO 2010/141861和美国专利号8,722,064中提供。
GLA制剂可以基本上均质的形式制备，其指GLA制备物就GLA分子而言是至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％和还更优选至少96％、97％、98％或99％纯的。熟悉适当的分析化学方法者可以容易地确定给定GLA制备物的纯度，如通过气相层析、液相层析、质谱术和/或核磁共振分析进行。
包含本发明的GLA的药物组合物优选基本上没有癌症-特异性抗原，并施用于受试者以刺激免疫反应，例如非特异性免疫反应。
如本申请使用的“基本上没有”指小于约1％，优选小于约0.1％，小于约0.01％(w/w)，小于约0.001％(w/w)。
术语“约”当指可测量的值，比如量时，在本申请中用于涵盖距离特定值+/-10％，更优选+/-5％，更优选+/-1％，更优选+/-0.1％的变动，只要这样的变动对于实现预期目的是适当的。
可优选地将GLA配制为稳定乳剂。例如，在一个具体实施方案中，提供的组合物在基本上没有癌抗原的稳定乳剂中包含GLA。乳剂体系包括单相或多相乳剂体系，如本领域已知的。
在一些实施方案中，组合物处于水包油乳剂的形式。在另外的实施方案中，组合物处于油包水的形式。在其他的实施方案中，组合物处于微粒的形式。
在一个具体实施方案中，本发明的组合物包含水包油乳剂，其中GLA掺入油相中。
为了让任何水包油组合物适用于人体施用，乳剂体系的油相优选包含可代谢的油。术语“可代谢的油”的含义是本领域已知的。“可代谢的”可定义为“能够通过代谢而被转化”。油可为任何植物油、鱼油、动物油或合成的油，其对于接受者无毒并能够通过代谢而被转化。坚果(如花生油)、种子和谷粒是植物油的普通来源。合成的油也是此发明的一部分，其可包括商业上可得到的油如
Figure BDA0004100388890000171
及其他。合适的油的非限制性实例是角鲨烯(Squalene)(2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-三十碳六烯)。
本发明油乳剂制备物可包含抗氧化剂，例如油α-生育酚(维生素E，EP 0382271B1)。
WO 95/17210和WO 99/11241公开了基于角鲨烯、α-生育酚和
Figure BDA0004100388890000181
80的乳剂佐剂组合物。WO 99/12565公开了将甾醇(sterol)加入油相而对这些角鲨烯乳剂加以改进。此外，可将甘油三酯如三辛酸甘油酯(tricaprylin)(C27H50O6)添加至油相以使乳剂稳定化(WO 98/56414)。
在稳定的水包油乳剂中存在的油滴的大小优选小于约1微米，可为约30-600nm的范围，优选直径约30-500nm，最优选直径约150-500nm，特别是直径约150nm，如通过光子相关光谱测量的。在此方面，优选地以数目计约80％的油滴应在优选的范围内，更优选以数目计多于约90％，最优选多于约95％的油滴在限定的大小范围内。本发明的油乳剂中存在的组分的量常规地在从约2至10％油的范围内，如角鲨烯；当存在时，约2至10％α-生育酚；以及约0.3到3％表面活性剂，如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。优选地，油:α-生育酚的比例等于或小于1，因为这可提供更稳定的乳剂。Span 85也可以约1％的水平存在。在一些情况下，本发明的GLA组合物另外含有稳定剂可能是有利的。
产生水包油乳剂的方法是本领域的技术人员熟知的。通常，该方法包括将油相与表面活性剂如PBS/
Figure BDA0004100388890000182
溶液混合，然后使用均质器均质化。例如，包括将所述混合物一次、两次或多次通过注射器针头的方法适用于均质化小体积的液体。同样地，可适用微流化器(M110S微流体机，最大50次通过，以6bar的最大压力输入(约850bar的输出压力)进行2分钟的时间)中的乳化过程来产生体积更小或更大的乳剂。此适用可通过常规实验来实现，所述常规实验包括测量所得的乳剂直到实现具有所需直径的油滴的制备物。
GLA的例示性剂量范围可为约0.01μg/kg至约100mg/kg体重，如约1μg/kg至约1mg/kg，或约1μg/kg至约至约60μg/kg，或约5μg/kg至约200μg/kg。
在一些实施方案中，本发明包含GLA的药物组合物配制用于局部-区域递送。施用的合适路径的实例包括皮内(intradermal)、皮下(subcutaneous)、肌内(intramuscular)、腹膜内(intraperitoneal)。本领域技术人员容易想到，施用的数目和频率会取决于宿主的响应。
β肾上腺素能受体阻断剂(拮抗剂)–例如，普萘洛尔:
普萘洛尔可通过CAS注册号525-66-6标识。它是市售的，还可通过本领域已知的方法来合成。对于药物组合物，通常使用盐酸普萘洛尔(propranolol hydrochloride)。合适的制剂包括，例如，含有约10-80mg的口服固体剂型，含有约20-40mg/5ml的口服液体剂型，含有约60-160mg的延长释放口服剂型，和含有约1mg/ml的盐酸普萘洛尔的静脉内可注射的液体剂型。
COX2-选择性抑制剂–例如，依托度酸：
依托度酸可通过CAS注册号41340-25-4标识。它是市售的，还可通过本领域已知的方法来合成。合适的制剂包括，例如，含有约200-500mg的口服固体剂型，含有约400-600mg的延长释放口服剂型。
本发明的组合物中的化合物的对治疗特定病况有效的量取决于病况的性质，并可通过标准临床技术来确定。参见，例如，Goodman和Gilman；The Physician's DeskReference，Medical Economics Company，Inc.，Oradell，N.J.，1995；和to Drug Factsand Comparisons，Facts and Comparisons，Inc.，St.Louis，Mo.，1993。
制剂中采用的确切剂量会取决于施用的路径和疾病的严重性，并且应根据医师的判断和每个患者的情况来决定。
方法和用途
根据本发明的一个方面，本发明提供用于减少或防止受试者中转移发展的方法。
在一些实施方案中，所述方法包括施用包含吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA)或其药学上可接受的盐作为活性成分的药物组合物的步骤。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用包含吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA)或其药学上可接受的盐作为活性成分的药物组合物的步骤，进一步与向受试者施用β肾上腺素能受体阻断剂和/或COX2抑制剂组合。
在一些实施方案中，提供用于减少或防止受试者中转移发展的方法，其通过向受试者局部-区域性地单独施用GLA、或施用GLA与β肾上腺素能受体阻断剂和COX2抑制剂的组合来进行。在一些实施方案中，提供用于减少或防止受试者中转移发展的方法，其通过向受试者局部-区域性地单独施用GLA、或施用GLA与β肾上腺素能受体阻断剂和COX2抑制剂组合来进行，而无肿瘤切除。
在一些实施方案中，提供了用于在肿瘤切除手术后减少或防止受试者中转移发展的方法，其通过在肿瘤切除手术的围手术期过程中向受试者单独施用GLA或施用GLA与β肾上腺素能受体阻断剂和COX2抑制剂的组合，由此减少或防止手术后的转移发展。
在一些实施方案中，在手术之前(术前)和手术之后(术后)施用GLA。在一些实施方案中，在手术之前(术前)和手术之后(术后)施用β肾上腺素能受体阻断剂和/或COX2抑制剂。
可使用本领域已知的任何施用方法。在一些实施方案中，GLA的施用通常通过局部-区域性递送来进行。在某些情况下，例如在围手术期过程中，使用系统性(systemic)施用。如本申请使用的，系统性施用不包括静脉内施用。
GLA施用可作为单一注射或多次注射进行。
通常，本发明的方法包括施用GLA而无癌症抗原。施用的GLA的药物组合物优选基本上没有癌症抗原。
在一些实施方案中，本发明的方法还包括在围手术期过程中共施用β肾上腺素能受体阻断剂和COX2抑制剂。
在一些实施方案中，GLA在术前施用，而β肾上腺素能受体阻断剂和/或COX2抑制剂在术前和术后施用。
在一些实施方案中，所有三种活性成分均在术前和术后施用。
每种活性成分的具体剂量，以及它们相对于切除手术的具体施用日期，应由医师根据肿瘤的类型、严重程度和患者总体状况来确定。
本发明的方法所治疗的受试者是患癌症(包括实体瘤和非实体瘤)的哺乳动物，通常是人。每种可能性代表本发明的分别的实施方案。在一些实施方案中，受试者是患原发性实体瘤且即将接受肿瘤切除的人。受试者可患有任何类型的实体恶性肿瘤，例如，癌瘤，如呼吸系统癌瘤、胃肠系统癌瘤、泌尿生殖系统癌瘤、睾丸癌瘤、乳腺癌瘤、前列腺癌瘤、内分泌系统癌瘤、和黑素瘤。示例性癌瘤包括由下述的组织形成的癌瘤：子宫颈、肺、前列腺、乳腺、头和颈、结肠和卵巢，还有癌肉瘤(例如，包括由癌瘤性和肉瘤性组织组成的恶性肿瘤)和腺癌(来源于腺组织，或其中肿瘤细胞形成可识别的腺结构)。待用本文公开的方法治疗的恶性肿瘤的另外的实例包括肉瘤，即支持组织或结缔组织(例如骨或软骨)的恶性肿瘤，和淋巴瘤，即淋巴组织的肿瘤。在一些实施方案中，癌症的实例包括但不限于癌瘤，包括腺癌(adenocarcinoma)、淋巴瘤(lymphoma)、囊胚(blastula)、黑素瘤(melanoma)和肉瘤(sarcoma)。所述癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌、肺癌(如小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌)、胃肠癌、何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤、胰腺癌、胶质母细胞瘤、子宫颈癌、忧郁(gloom)、卵巢癌、肝癌(如肝癌瘤(hepatic carcinoma)和血肿(hematoma))、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(如肾细胞癌和维尔姆斯氏瘤)、基底细胞癌、黑素瘤、前列腺癌、甲状腺癌、睾丸癌、食道癌、和各种类型的头颈癌。
可使用本领域已知的方法随访受试者中肿瘤切除后转移的形成，所述方法包括成像技术、活组织检查、血液测试等。
提供以下实施例以更全面地说明本发明的某些实施方案。然而它们不应以任何方式解释为限制本发明的宽范围。本领域的技术人员可以容易地设计出本文所公开的原理的许多变化和修饰而不背离本发明的范围。
实施例
材料和方法
1.动物
四至八月龄(不同实验之间年龄变化)雄性和雌性Fischer 344(F344)大鼠每笼3-4只饲养于我们在特拉维夫大学(Tel Aviv University)的动物饲养所，随意供给食物和水、12:12光-暗循环、22±1℃。在实验之前对动物进行至少4次操作，以减少可能的程序应激。在所有实验程序中配衡(counterbalance)体重、性别和药物施用。饲养条件由特拉维夫大学的动物保护和利用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)监测，该委员会也批准了本文所述的全部研究。
2.药剂
1.GLA及其施用
将溶解于稳定的乳剂(SE)(2000μg/ml)的GLA(IDRI，Seattle，WA)在PBS中稀释为3μg/ml-200μg/ml的终浓度(取决于相关实验)。在即将接种MADB106肿瘤细胞之前、接种前4h、前12h、前24h、前48h或前96h(取决于相关实验)，将所选浓度的一百μl皮下(s.c.)注射至每只动物(0.3μg-20μg/动物)。
2.稳定乳剂(SE)/佐剂乳剂
将SE(稳定的乳剂；IDRI，Seattle，WA)以与GLA完全一致的方式稀释和施用。
3.抗-NKR-P1
抗-NKR-P1是一种IGg单克隆抗体(mAb)(原先称为mAb 3.2.3)，其结合NKR-P1表面抗原，该抗原在大鼠的新鲜自然杀伤(NK)细胞和IL-2激活的自然杀伤(NK)细胞上表达，在多形核(PMNs)细胞上亦表达，但程度低得多。用抗-NKR-P1体内处理大鼠可选择性地耗竭NK细胞，并消除NK依赖和抗体依赖的非MHC限制性细胞细胞毒性。T细胞功能和T细胞、外周血单个核细胞(PBMC)及PMN的百分数不受影响。先前已经显示，此抗体在施用后可立即在体内使得NK细胞无效，并在一日内选择性地耗竭NK细胞，而同种型对照抗体则不能。在MADB106肿瘤细胞接种的同时将该抗体在轻度异氟烷麻醉下静脉注射。
3.肿瘤细胞系
1.MADB106
MADB106是一种经选择的变体细胞系，由F344大鼠中化学诱导的乳腺癌(MADB100)的肺转移获得。MADB106肿瘤细胞仅转移至肺，而肺肿瘤保留(LTR)—其强烈指示数周后会发展的转移的数目—依赖于此模型中的NK细胞。此外，因为MADB106的转移过程主要在接种后的最先24h中对NK活性敏感，故LTR相比实际转移数更能反映体内NK活性水平。将MADB106细胞系在完全培养基(RPMI-1640培养基，补充10％热失活的胎牛血清(FCS)、50μg/mL的庆大霉素、2mM的l-谷氨酰胺、0.1mM的非必需氨基酸，和1mM的丙酮酸钠)(BiologicalIndustries，Kibbutz Biet Haemek，Israel)中100％湿度，5％CO2、37℃维持单层培养。用胰蛋白酶溶液(0.25％于PBS)将细胞从培养瓶移出，并用完全培养基洗涤。肺肿瘤保留的体内评估和NK细胞毒性的体外检查都使用该细胞系。
2.YAC-1
YAC-1淋巴瘤是用于评估啮齿类体外NK细胞毒性的标准靶细胞系。将细胞系在完全培养基中100％湿度、5％ CO2、37℃下维持悬浮培养。
4.MADB106肿瘤细胞的放射标记和肺肿瘤保留的评估
通过将0.5μCi/ml的125碘脱氧尿苷(Iododeoxyuridine)(125IDUR，DanyelBiotech，Rehovot，Israel)添加至细胞培养物，历时24h来完成用于评估LTR的肿瘤细胞DNA放射性标记。对于肿瘤细胞注射，将大鼠用异氟烷轻度麻醉，将4×105/kg MADB106肿瘤细胞(溶于含有0.1％牛血清白蛋白(BSA)的2ml/kg PBS中)注射入它们的尾静脉。一些实验还另外皮下注射0.5ml溶于缓慢释放乳剂(4份PBS、3份矿物油(Sigma，Rehovot，Israel)和1份二缩甘露醇单油酸酯(mannide–monooleate)(一种非特异性表面活性乳化剂，Sigma，Rehovot，Israel))中的肾上腺素(雌性1.8mg/kg，雄性0.6mg/kg)，以便放大肺中的MADB106保留，从而允许更好的组区分。为评估LTR，将动物用CO2处死，在用125IDUR-标记的肿瘤细胞接种后24h移出它们的肺，置于γ-计数器中评估该器官中保留的放射性百分比。使用下式计算LTR：(肺的放射性计数–背景放射性)×100/(总的注射的细胞悬浮物的放射性计数–背景放射性)。
5.NK细胞毒性的离体评估
1.收获并制备循环白细胞(circulating leukocytes)、边集化肺(marginating-pulmonary，MP)白细胞和边集化肝(MH)白细胞用于评估NK细胞毒性。
以过量异氟烷处死大鼠，并打开腹腔和胸腔。从心脏的右心室收集五至8ml(分别对雌性和雄性)的血液至肝素化的注射器。将1ml的血液用3ml的PBS洗涤一次(400g，10min)并用3ml的完全培养基洗涤两次，并复原至其原始体积。通过用30U/ml的肝素化PBS灌注心脏收获MP白细胞。将PBS注射入右心室并从左心室收集灌注液。弃去被血液污染的前3ml灌注液，收集其后的25ml灌注液，并浓缩至1ml。这通过如下实现：离心灌注液(400g进行10min)，弃去上清，并将沉淀悬浮在3ml的完全培养基中，再次离心灌注液(400g，10min)并将灌注液浓缩至1ml。类似地通过用30U/ml的肝素化的PBS灌注肝脏收获MH白细胞。将PBS注射入肝门静脉，并从腔静脉收集灌注液。弃去被血液污染的前5ml的灌注液，收集其后的25ml灌注液并以与对于MP白细胞所述相同的方法浓缩。
2.NK细胞毒性的评估
使用标准的全血51Cr释放测定法。此程序评估每ml的效应器细胞的抗-肿瘤NK细胞细胞毒性(NKCC)，而不事先纯化所研究的白细胞群体(外周血单个核细胞、MP或MH白细胞)。较早的研究已表明，使用该程序测量的细胞毒性可归因于NK细胞，而非其他细胞类型或可溶性因子，因为对NK细胞的选择性耗竭可消除所有靶向细胞的杀伤。此程序的优势包括较短的持续时间、较少干扰效应器细胞、更好地反映细胞组合物的原始的体内环境。
如下形成六种不同的效应器对靶物(E:T)比例：在微孔板中系列稀释效应器细胞制备物的150μl等分试样。然后，将含有5000个放射性标记的靶细胞(MADB106或YAC-1)的100μl完全培养基添加至每个孔中，置于效应器细胞制备物之上。靶细胞的放射性标记通过如下进行：将靶细胞与100μl盐水、100μlFCS和50μl完全培养基中的100μCi 51Cr(RotemTaassiot，Dimona，Israel)温育1h。在此温育后，将靶细胞在完全培养基中洗涤3次(300g、10min)，并将它们的浓度调整至5×104/ml。通过分别用完全培养基或Triton-X100(Sigma，Rehovot，Israel)替换效应器细胞来确定放射性的自发释放和最大释放。在4h温育期(100％湿度、5％ CO2于37℃)之前和之后，将所述板离心(400g进行10min，分别于25和4℃)。这在红血细胞表面上产生一层肿瘤细胞和白细胞的“棕黄层(buffy coat)”，使得高效的效应器-靶物相互作用成为可能。最后，回收100μl上清液样品，用于在γ-计数器中评估放射性。特异性杀伤如下计算：100x[(样品释放x HCF–自发释放)/(最大释放–自发释放)]，红细胞压积修正因子(Hematocrit Correction Factor，HCF)补偿在不同E:T比例下红细胞压积-上清体积的变化。纳入此修正因子是考虑到被释放的放射性分子分散在无细胞培养基中，该无细胞培养基的体积是变化的。
6.流式细胞术
使用标准程序制备细胞用于流式细胞术分析。血液、肺灌注液和肝灌注液中的NK细胞被APC-缀合的抗-CD161 mAb(Biolegend，San Diego，CA)识别为CD161亮细胞。已显示此标准能够排他地识别多于95％的呈现NK活性的细胞。使用PE缀合的抗-CD5 mAb(eBioscience，San Diego)鉴定T细胞，并将NKT细胞鉴定为CD161+CD5+淋巴细胞。通过FITC-缀合的NKp46(BiossUSA，Woburn，MA)和Cy7-缀合LAMP-1(BiossUSA，Woburn，MA)鉴定NK活化标记。基于前向和侧向散射鉴定粒细胞和淋巴细胞。使用FACScan(BectonDickinson)进行流式细胞术分析。为了评估每μl样品(或特定细胞亚型)的绝对数，向每个样品中每μl样品加入300个聚苯乙烯微珠(20μm，Duke Scientific，Palo Alto)，并使用下式：(样品中细胞数/样品中微珠数)×300。
7.统计分析
进行单因素或双因素方差分析(ANOVA)，其预定的显著性水平为0.05。若发现显著的组间差异，则进行Fisher's保护性最小显著差数法(Fisher's PLSD)对比以基于先验(priori)假设比较特定的成对组。
实施例1–GLA对于雄性大鼠中MADB106LTR的作用的剂量曲线
进行实验以建立GLA施用的有效的剂量(potent dosage)用于将来的实验。
步骤：
将七十五只三月龄F344雄性大鼠随机分入施用PBS、SE或以0.3μg、0.7μg、2.5μg、10μg和20μg剂量/动物的剂量施用GLA的7个实验组之一。每只动物根据其分组皮下注射100μl的药剂，并在24h之后，接种MADB106细胞(如上文第4节中详述的)。这7组中的每组进一步细分为两个单独的组—一组在肿瘤接种过程中注射肾上腺素，和另一组注射溶媒。二十四小时后，处死动物并提取肺用于LTR评估(如第4节中详述的)。
结果：
处理(SE和GLA剂量给药)对于LTR的显著主要效果在肾上腺素组(F(6,31)＝14.375，p<0.0001)和溶媒组(F(6,30)＝3.354，p<0.05)中都是明显的，指示宿主从肺中清除癌细胞的能力的改善(LTR减少)。参见图1A和1B。
肾上腺素组中的Fisher氏PLSD事后比较(post-hoc comparison)指示SE相对于PBS的显著改善(p<0.001)和所有GLA剂量给药相对于PBS的显著改善(p<0.0001)。当检查GLA相对于SE的加合作用(由于GLA最初溶解于SE这一事实，这是其作用的部分原因)时，0.7μg、2.5μg、10μg和20μg的剂量发现了显著改善(分别为p<0.05、p<0.01、p<0.01和p<0.001)。
在溶媒组内，Fisher氏PLSD事后比较对于单独的SE未产生作用，而对于GLA，在0.7μg、2.5μg、10μg和20μg的剂量显示了相对于PBS的显著改善(分别为p<0.05、p<0.01、p<0.05和p<0.01)。
这些结果表明SE组分是GLA对LTR的有益效果的部分原因，还表明在等于或大于每只动物0.7μg的剂量下，GLA在SE作用的基础上具有加合作用。在这个实验之后，确定了每只动物2μg GLA的工作剂量，为确定基于SE相关作用之外的GLA相关作用的最小有效药物剂量提供了可能。
而且，如先前已经报道的，施用肾上腺素结合MADB106细胞接种能够通过诱导对宿主更有挑战性的条件和增加LTR水平而在组间实现更好的区分。通过分析接受肾上腺素的PBS动物和接受溶媒的PBS动物之间的差异，可以计算肾上腺素对LTR的特异性作用，也可以计算各肾上腺素组内由GLA引起的相关减少作用，后者与其剂量正相关。
实施例2–GLA效果的起始和持续的时间过程
该实验进行的目的是：确定GLA施用的效果持续时间，并为其评估最佳使用时间点。
步骤：
在第一实验中，将75只六月龄F344雄性大鼠随机分配到肿瘤接种前的5个注射时间点之一：0h、4h、12h、24h和48h。每组进一步细分为三个实验药物组之一：PBS、SE、2μgGLA。每个动物根据其相关的药物组在其指定的时间点皮下注射100μl。在时间0h，注射MADB106细胞(如第4节中详述的)以及肾上腺素。将另外四只雄性F344大鼠添加至PBS组且不注射肾上腺素(接受溶媒)，让它们充当锚(anchor)以证明肾上腺素的作用。二十四小时后，处死动物并提取肺用于LTR评估(如第4节中详述的)。
在第二实验中，在雌性大鼠中进行类似的实验。八十九只六月龄F344雌性大鼠随机分入6个注射时间点—0h、4h、12h、24h、48h和96h之一。每组进一步细分到三个实验药物组—PBS、SE、2μg GLA—中之一。所有其他步骤如上述雄性中所述。
结果：
在两个实验中，PBS和SE组内的不同时间点未显示一致或显著的区别，因此将它们组合起来，以便在这些条件下积累足够的动物。
在第一实验(雄性)中，处理对于LTR的显著主效应是明显的(F(7,71)＝5.990，p<0.0001)，改善了宿主抗性。参见图2A。Fisher氏PLSD事后比较表明单独SE无作用，并表明在时间点4h、12h、24h和48h，GLA和PBS之间存在显著的区别(4h的p<0.05，其余的p<0.0001)。
在第二实验(雌性)中，处理对于LTR的显著主效应是明显的(F(8,84)＝3.229，p<0.01)。参见图2B。Fisher氏PLSD事后比较表明单独SE无作用，并表明在时间点24h和48h，GLA和PBS之间存在显著的区别(两者均p<0.05)。
这些结果表明雄性和雌性中GLA单一低剂量注射均有迅速且持续长久的作用，尽管这些结果也提示雄性对以此剂量的处理的响应更好。
实施例3–用于评估GLA对于肺中MADB106转移的实际发展的作用的三周研究
进行此实验以评估GLA对于肺中癌症转移的实际发展的体内作用，而非关注LTR这一较短的指标。
程序：
将八十六只六月龄F344大鼠(44只雌性)分入三个实验组(2μg GLA、SE和PBS)。每个动物根据其分组皮下注射100μl。二十四小时后，将动物用异氟烷轻度麻醉并含有105个MADB106肿瘤细胞(大约4×105/kg)的0.5ml PBS(补充0.1％ BSA)注射入它们的尾部静脉。三周后，处死大鼠，移出它们的肺并在布安氏溶液(Bouin's solution)(72％饱和苦味酸溶液，23％甲醛(37％溶液)和5％冰醋酸)中放置24h。在乙醇中洗涤后，由对每个肺的来源不知情的研究者计数可见的表面转移。
结果：
处理对于转移数目的显著主效应是明显的(F(2,83)＝5.405，p<0.01)。参见图3。
Fisher氏PLSD事后比较表明单独的SE无作用，而GLA和PBS之间(p<0.05)、及GLA和SE之间(p<0.01)均有显著的区别–GLA减少转移数目。未见显著的性别差异。
实施例4–在首次实验的动物和NK耗竭的动物中GLA对MADB106LTR的作用
进行此实验以评估NK细胞在介导GLA施用对LTR的有益效果中的作用。
程序：
将五十四只四月龄F344雄性大鼠分入两组——通过施用抗-NKR-P1mAb而耗竭NK，或施用溶媒，并将各组进一步细分为三组(2μg GLA、SE和PBS)。每个动物根据其药物条件分配皮下注射100μl，并在24h后，将MADB106细胞与抗-NKR-P1 mAb或溶媒同时施用。二十四小时后处死动物，并提取肺用于LTR评估(如第4节中详述的)。
结果：
二乘三ANOVA(耗竭x药物注射)揭示了耗竭的显著效应(F(1,46)＝712.065，p<0.0001)，显示NK-耗竭的动物中的LTR水平高出约20倍，由此显示NK细胞在从肺部清除MADB106中的突出作用。参见图4A。
当分别检查耗竭组和非耗竭组时，各耗竭组之间没有明显区别，这表明在此条件下GLA或SE均无作用，而在非耗竭条件下发现组的显著效应(F(2,22)＝6.447，p<0.01)。对于非耗竭条件的Fisher氏PLSD事后比较表明单独的SE无作用，而GLA和PBS之间有显著的差异(p<0.01)。参见图4B。这些发现表明，GLA的有益效果受NK细胞的显著介导。
在先前采用此实验方法的研究中，还显示其他操作可增加或减少NK-耗竭的动物中的LTR，由此消除了此实验方法中潜在的方法学障碍，如天花板效应或地板效应。
实施例5–在自发术后转移的小鼠模型中测试GLA、β-受体阻断剂和COX2抑制剂
C57BL/6J小鼠内脚垫(intrafootpad)接种同基因的(syngeneic)B16F10.9-黑素瘤或Lewis肺癌瘤，且当发展的肿瘤大于100毫升时将爪子截肢。在截肢前施用GLA、β肾上腺素能受体阻断剂普萘洛尔、和/或环氧合酶-2抑制剂依托度酸一次(或多次)，并监测无复发存活(recurrence-free survival)。进行进一步的实验，其中在截肢前施用GLA一次，而在截肢后施用普萘洛尔+依托度酸一次。
购买6周龄的C57BL/6J雄性和雌性小鼠并饲养于动物饲养所中，每笼3-4只，随意供应食物和水，12:12光/暗循环，22 6 1℃。在每个实验中使用10-14周龄的动物，并在所有组中进行年龄匹配。肿瘤和药物施用的顺序在所有实验组中配衡，对照动物注射溶媒。
普萘洛尔溶于PBS、矿物油与Arlacel(8:7:1)的乳剂中皮下注射(5mg/kg，10ml/kg)。依托度酸溶于玉米油中皮下注射(50mg/kg，10ml/kg)。GLA以0.1μ-50μg范围的剂量/动物皮下注射。
每只小鼠内脚垫注射5x 104B16F10.9黑素瘤细胞或d122 Lewis肺癌瘤(于含有0.1％ BSA的20ml PBS中)，每天目视检查肿瘤。一旦肿瘤达到100-150ml的体积，则用2％异氟烷将小鼠麻醉并施以特定的药物治疗，且通过爪截肢切除肿瘤。将达到指定肿瘤体积的小鼠基于预定的配衡顺序分配至特定的药物治疗组，从而保证切除时的肿瘤大小和肿瘤年龄在不同的药物组之间相等分布。实施截肢的实验者对于药物治疗组不知情。随后每天监测小鼠的发病指征历时80d(且在最后一次发病后不少于2周)。对显示疾病行为或明显的癌症复发的小鼠给予过量的异氟烷，并进行尸检以确定恶性病灶。疾病行为由缓慢的身体动作、对环境刺激无响应、显著的体重减少或震颤(tremor)所定义。
特定实施方案的上述描述会如此全面地揭示本发明的一般性质，以致于他人能够通过应用目前的知识容易地修饰所述特定的实施方案和/或将其适用于多种应用而无需过多的实验且不背离通用的概念，并因此这样的适用和修饰应当且意欲在所公开的实施方案的等同物的含义和范围内加以理解。可理解的是，本发明采用的措辞或术语是为了说明而非限制的目的。用于实施多种公开的功能的手段、材料和步骤可采取许多种替换形式而不背离本发明。

Claims (10)

1.吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA)或药学上可接受的盐用于制备用于减少或防止肿瘤切除手术后受试者体内转移发展的药物组合物的用途，
其中所述药物组合物供在所述肿瘤切除手术的围手术期过程中施用，
其中所述药物组合物基本上没有癌症抗原，以及
其中GLA具有下述结构：
Figure FDA0004100388870000011
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物组合物配制为通过局部-区域递送施用。
3.根据权利要求1所述的用途，其中在所述手术之前(术前)执行所述施用至少一次或在所述手术之后(术后)执行所述施用至少一次。
4.根据权利要求1所述的用途，其中GLA与β肾上腺素能受体阻断剂、COX2抑制剂或两者组合配制。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述β肾上腺素能受体阻断剂和COX2抑制剂配制于分别的药物组合物内。
6.根据权利要求4所述的用途，其中所述β肾上腺素能受体阻断剂、COX2抑制剂或两者在所述肿瘤切除手术的围手术期过程中施用。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述β肾上腺素能受体阻断剂、COX2抑制剂或两者在所述手术之前(术前)施用至少一次。
8.根据权利要求6所述的用途，其中所述β肾上腺素能受体阻断剂、COX2抑制剂或两者在所述手术之后(术后)施用至少一次。
9.根据权利要求4所述的用途，其中所述β肾上腺素能受体阻断剂选自：醋丁洛尔、阿替洛尔、倍他洛尔、比索洛尔、卡替洛尔、卡维地洛、塞利洛尔、艾司洛尔、拉贝洛尔、美托洛尔、纳多洛尔、奈必洛尔、氧烯洛尔、喷布洛尔、吲哚洛尔、普萘洛尔、索他洛尔、噻吗洛尔，以及其药学上可接受的盐，优选为普萘洛尔或其药学上可接受的盐。
10.根据权利要求4所述的用途，其中所述COX2抑制剂选自：塞来考昔、西米考昔、艾托考昔、依托度酸、依托考昔、罗美昔布、美洛昔康、帕瑞考昔、罗非考昔、替拉考昔、伐地考昔，以及其药学上可接受的盐，优选为依托度酸或其药学上可接受的盐。
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