JP3943334B2 - リピッドａ類縁体含有注射剤の評価方法 - Google Patents
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Description
発明の属する技術分野
本発明は、リピッドＡ類縁体含有注射剤の体内動態の予測方法と評価方法、更には、一定の体内動態を示すことを保証する注射剤の品質評価方法及び製造方法に関する。
従来の技術
リピッドＡは、リポポリサッカライド（以下ＬＰＳと称する）の活性発現中心であり、マクロファージ刺激作用、抗腫瘍作用、発熱作用などさまざまな生物活性を有することが知られている（高田春比古、小谷尚三；蛋白質・核酸・酵素、３１（４）、３６１（１９８６））。
さらに、近年は、リピッドＡ類縁体が種々合成され、その生物活性が調べられているが（小川祐示他；代謝、２６（５）、４１５（１９８９））、糖脂質構造を有するリピッドＡ類縁体の多くは、水難溶性であり注射剤化が困難であった。
注射剤化の為に、透明性の高い水溶液を得るための可溶化剤としては、トリエチルアミン、牛血清アルブミン、脂質などの添加（Ｙ．Ｂ．Ｋｉｍ，ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１，２３０（１９７２）及びＲ．Ｂ．Ｒａｍｓｅｙ，ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，５６，３０７（１９８０）、及びＪ．Ｄｉｊｋｓｔｒａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３８，２６６３（１９８７））、塩基性アミノ酸やポリアミンの利用（特開平４−１９８１９２号公報）などが報告されている。
また、レシチンなどの脂質を水に分散させ、リポソーム等の会合体を形成させる為に、中性領域の緩衝液に脂質を入れて加熱し、超音波照射する方法が知られている。
我々は、特開平５−１９４４７０号公報、ＷＯ９６／３９４１１号公報によって開示される方法で製造されたリピッドＡ類縁体またはその薬理学的に許容できる塩を、アルカリ性水溶液に溶解し、次いで緩衝液を添加することにより、直径３０ｎｍ以下の会合体を含有する透明性の高い注射用製剤を調製した。
しかし、この注射用製剤をラットやビーグル犬等の生体に投与した際には、原薬や製剤ロットの違いによりリピッドＡ類縁体の血中薬物濃度が大きくばらつく問題があった。これは、この注射用製剤の溶液中における薬物（脂質）の会合状態が、一定でないためである。
一般に、溶液中における脂質の会合状態を評価する手段としては、電子顕微鏡による外観評価、レーザー回折式粒度分布測定装置による粒度分布の評価、臨界ミセル濃度や表面張力測定等の物性値からの考察などの方法が、実施されている。
しかし、本願発明に係る評価法として使用した円偏光二色性分光法及び／又は膜流動性評価法に関しては、報告例は少ない。
即ち、円偏光二色性分光法（以下ＣＤ法と称する）は、左右円偏光に対する光学活性物質の屈折率および吸光度の差を反映して測定されるものであり、一般的には、ペプチド、蛋白質のコンフォメーション解析や低分子化合物の光学活性分析に繁用されているが、脂質関連物質のＣＤ法での解析はほとんど行われていなかった。報告では、リポゾーム膜内での脂質の動的な温度依存性の変化をＣＤスペクトル変化の解析により検討した例（特開昭６２−２５２７９５）、ＣＤ法は水中の脂質粒子の特徴の評価の為に有用な手法であり、操作上極めて簡便な評価法であると同時に、希薄濃度で膜内の動的な状態変化を測定することが可能であるとした報告例（Ｎ．Ｎａｋａｓｈｉｍａ ｅｔ Ａｌ，ＣＨＥＭ．ＬＥＴ．，１５０３，１０（１９８５））、プロスタグランジンＥｌの種々リポソーム処方による会合体特性と溶出特性の相関を検討し、その評価法の一つにＣＤ法を用いた例（Ｓｈａｒｏｎ Ｍ．Ｋ．ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１３２７，９７（１９９７））などがあるにすぎない。
一方、膜流動性（膜の堅牢さ）の評価法には、蛍光プローブ法、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）法などが知られている（ロバートＢ ゲニス；生体膜 ｐ１４６、（１９９２）シュプリンガーフェアラーク東京）。この中で、蛍光プローブ法は、リン脂質の２分子膜構造の膜流動性を評価する方法として、脂質の膜内にジフェニールヘキサトリエン（以下ＤＰＨと称する）などの蛍光プローブを混入し、偏向している入射光を照射した時に発する蛍光の偏向度を測定することにより、蛍光物質の近傍の膜の状態を観察する方法であり、リピッドＡ類縁体に適用した報告例がある（Ｂｒａｕｄｅｎｂｕｒｇ Ｋ ｅｔ ａｌ；Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２２５，７７５（１９８４））。蛍光プローブ法では、脂質試料から発する蛍光の鉛直偏向成分と水平偏向成分を別個に測定することにより、蛍光偏向度（Ｐ：範囲０〜０．５）及び／又は蛍光異方性（ｒ：範囲０〜０．４）及び／又はオーダーパラメーター（Ｓ：範囲０〜１．０）を算出できる（寺田弘、吉村哲郎；ライフサイエンスにおけるリポゾーム（１９９２）、シュプリンガーフェアラーク東京）。ここで、オーダーパラメーター（Ｓ）は、０に近いほど膜流動性が大きく、１．０に近いほど膜流動性は小さいことを意味している。
しかし、リピッドＡ類縁体において、薬物の溶液中における会合状態を測定・評価することにより、体内動態との相関性の観点からリピッドＡ類縁体の体内動態を明確に予測または評価した例はない。また、溶液中における薬物（脂質）の会合状態の観点から、リピッドＡ類縁体の体内動態が制御された注射用製剤の製造法または一定の体内動態を保証する品質保証法の報告例もない。
リピッドＡ類縁体またはその薬理学的に許容できる塩を、アルカリ性水溶液に溶解し、次いで緩衝液を添加することにより、直径３０ｎｍ以下の会合体を含有する注射用製剤を調製することは可能である。この注射用製剤においては、リピッドＡ類縁体またはその薬理学的に許容できる塩は、脂質二分子膜小胞体またはミセル構造を有している。即ち、水溶液とした時に澄明性が高く、ｐＨが注射剤として好ましい範囲であり、安定性も良好であるリピッドＡ類縁体の注射剤が製造できる。
しかし、その注射用製剤をラットやビーグル犬に投与した際には、原薬や製剤間のロットの差異により、血中濃度が大きくばらつく問題があった。これは、原薬や製剤間のロットの差により、リピッドＡ類縁体の溶液中での存在状態、即ち、直径３０ｎｍ以下の脂質二分子膜小胞体またはミセルの会合体構造が一様でなかった為である。従って、リピッドＡ類縁体の実用に供しうる注射剤、即ち、原薬や製剤のロットに依存することなく、血中濃度に代表される体内動態の変動の少ない注射剤及びその体内動態を予測する評価方法が渇望されている。
発明の開示
以上のような状況に鑑み、本発明者らは、リピッドＡ類縁体を含有する澄明性が高く、安定性も良好である上に、体内動態が原薬や製剤のロットに依存することなく変動の少ない注射剤並びにそれらの体内動態の予測評価法を探索すべく鋭意研究を行った。その結果、以下に示す構成により所期の目的を達成できることを見いだし、本発明を完成した。
本発明は、リピッドＡ類縁体またはその薬理学的に許容できる塩を含有する注射用製剤において、溶液中での膜流動性及び／又は円偏光性を測定することを特徴とするリピッドＡ類縁体の体内動態の予測方法である。
本発明は、また、リピッドＡ類縁体またはその薬理学的に許容できる塩を含有する注射用製剤において、溶液中での膜流動性及び／又は円偏光性を測定することを特徴とするリピッドＡ類縁体の体内動態の評価方法である。
また、本発明は、リピッドＡ類縁体またはその薬理学的に許容できる塩を含有する注射用製剤において、溶液中での膜流動性及び／又は円偏光性を測定し評価することにより、生体内でリピッドＡ類縁体が一定の体内動態を示すことを保証するリピッドＡ類縁体含有注射剤の品質評価法である。
さらに本発明は、リピッドＡ類縁体またはその薬理学的に許容できる塩を含有する注射用製剤の製造工程において、溶液中での膜流動性及び／又は円偏光性の測定を必須とする注射用製剤の製造方法である。
本発明の体内動態の予測方法は、注射用製剤の評価、一定の体内動態を示す注射用製剤を得るための品質評価および注射用製剤の製造工程において用いることができる。
本発明によると、リピッドＡ類縁体またはその薬理学的に許容できる塩（以下、単に、リピッドＡ類縁体と称する）を透明で安定な体内動態が保証された注射用製剤とすることができるが、これが本発明の目的である。また、本発明においては、リピッドＡ類縁体を含有する注射用製剤において、膜流動性及び／又は円偏光性を測定することによる体内動態の予測方法、評価方法を提供することができるとともに、リピッドＡ類縁体が一定の体内動態を示すことを保証するリピッドＡ類縁体含有注射剤の品質評価方法を提供することができるが、これもまた、本発明の目的のひとつである。
本発明によるリピッドＡ類縁体は次の化学構造式を有し、例えば特開平５−１９４４７０号公報またはＷＯ９６／３９４１１号公報によって開示される方法で製造することができる。
式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３又はＲ４の少なくとも一つは、
（式中、各ＬはＯ，Ｎ又はＣであり；各ＭはＯ又はＮであり；各Ｅは、独立して０から１４までの整数であり；各Ｇは、独立してＮ，Ｏ，Ｓ，ＳＯ又はＳＯ２であり；各ｍは、独立して０から１４までの整数であり；各ｎは、独立して、０から１４までの整数であり；各ｐは独立して０から１０までの整数であり；各ｑは、独立して０から１０までの整数である）であり；
残りのＲ１，Ｒ２，Ｒ３及びＲ４の各々は、独立して、
（式中、各ＬはＯ，Ｎ又はＣであり；各ＭはＯ又はＮであり；各ｘは、独立して、０から１４までの整数であり；各ｙは、独立して、０から１４までの整数であり；各ｚは、独立して０から１０までの整数であり；各Ｇは、独立して、Ｎ，Ｏ，Ｓ，ＳＯ又はＳＯ２である）であり；
各Ａ１とＡ２は、独立して、Ｈ，ＯＨ，ＯＣＨ３、
（式中、各ｄは、独立して、０から５までの整数であり；各ｆは、独立して、０から５までの整数であり；各ｇは、独立して、０から５までの整数であり；各Ａ３は、独立して、
（式中、各ｊは、独立して、０から１４までの整数である）である）であり；Ｘは、Ｈ，（ＣＨ２）ｔ，ＣＨ３，（ＣＨ２）ｔＯＨ，（ＣＨ２）ｔＯ（ＣＨ２）ｖＣＨ３，（ＣＨ２）ｔＯＰＯ（ＯＨ）２，（ＣＨ２）ｔ−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｖＣＨ３，（ＣＨ２）ｔ−Ｏ−Ｒ５，
（式中、各ｔとｖは、それぞれ独立して、０から１４までの整数であり；Ｒ５はＲ１〜Ｒ４に対する上記定義のいずれかである）であり；
Ｙは、Ｈ，ＯＨ，Ｏ（ＣＨ２）ｗＣＨ３，ハロゲン原子、
（式中、ｗは０から１４までの整数である）である。
【化６】
式中Ｒ１は
（式中、Ｊ，Ｋ及びＱは、それぞれ直鎖又は分枝の炭素数１〜１５のアルキル基であり、ＬはＯ，ＮＨ２又はＣＨ２であり、ＭはＯ又はＮＨであり、ＧはＮＨ，Ｏ，Ｓ，ＳＯ又はＳＯ２である）から成る群から選ばれる基であり；
Ｒ２は直鎖又は分枝状の炭素数５〜１５のアルキル基であり；
Ｒ３は、
（式中、Ｅは、Ｎ，Ｏ，Ｓ，ＳＯ又はＳＯ２であり、Ａ，Ｂ及びＤは、それぞれ直鎖又は分枝の炭素数１〜１５のアルキル基である）からなる群から選ばれる基であり；
Ｒ４は直鎖又は分枝の炭素数４〜２０のアルキル基、及び
（式中、Ｕ及びＶは、それぞれ直鎖又は分枝の炭素数２〜１５のアルキル基であり、Ｗは水素原子、あるいは直鎖又は分枝の炭素数１〜５のアルキル基である）からなる群から選ばれる基であり；
Ｒ５は水素原子、Ｊ’、−Ｊ’−ＯＨ、−Ｊ’−Ｏ−Ｋ’、−Ｊ’−Ｏ−Ｋ’−ＯＨ及び−Ｊ’−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２（式中Ｊ’及びＫ’は、それぞれ直鎖又は分枝の炭素数１〜５のアルキル基である）から選ばれる基であり；
Ｒ６は水酸基、ハロゲン原子、炭素数１〜５のアルコキシ基及び炭素数１〜５のアシルオキシ基からなる群から選ばれる基であり；
Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、
（式中、Ｚは直鎖又は分枝の炭素数１〜１０のアルキル基である）からなる群から選ばれる基である。
本発明において、好ましいリピッドＡ類縁体として、６−Ｏ−｛２−デオキシ−６−Ｏ−メチル−４−Ｏ−フォスフォノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−３−Ｚ−ドデク−５−エノイルオキシデシル］−２−［３−オキソ−テトラデカノイルアミド］−β−Ｏ−フォスフォノ−α−Ｄ−グルコピラノース］四ナトリウム、α−Ｄ−グルコピラノース，３−Ｏ−デシル−２−デオキシ−６−Ｏ−［２−デオキシ−３−Ｏ−（３−メトキシデシル）−６−Ｏ−メチル−２−［（１−オキソ−１１−オクタデセニル）アミノ］−４−Ｏ−フォスフォノ−β−Ｄ−グルコピラノシル］−２−［（１，３−ジオキソテトラデシル）アミノ］−，１−（ディハイドロジェンフォスフェイト），ジナトリウム［６（２Ｚ，３Ｒ）］及びα−Ｄ−グルコピラノース，３−Ｏ−デシル−２−デオキシ−６−Ｏ−［２−デオキシ−３−Ｏ−（３−メトキシデシル）−６−Ｏ−メチル−２−［（１−オキソ−１１−オクタデセニル）アミノ］−４−Ｏ−フォスフォノ−β−Ｄ−グルコピラノシル］−２−［（１，３−ジオキソテトラデシル）アミノ］−，１−（ディハイドロジェンフォスフェイト），テトラナトリウム［６（２Ｚ，３Ｒ）］を挙げることができる。これらの化学構造式は次の式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）で表わされる。
一般に、リン脂質のリポゾームは、スカベンジャーレセプターを介して肝臓などの網内系に取り込まれることにより、その血中濃度変動に大きな影響を受けることが知られている。また、リポゾームなどのアニオン性高分子を認識し取り込むスカベンジャーレセプターのメカニズムについての研究では、膜流動性（膜の堅牢さ）、表面荷電及び粒径が、スカベンジャーレセプターの認識の上で重要な役割を果たすことも知られている（寺田弘、吉村哲郎；ライフサイエンスにおけるリポゾームｐ．３２６（１９９２）シュプリンガーフェアラーク東京）。
しかし、リピッドＡ類縁体含有製剤において、体内動態制御の観点から、膜の物理化学的性質を評価した例は、従来は、なかった。
本発明では、リピッドＡ類縁体をアルカリ性水溶液に溶解し、次いで緩衝液を添加して製する直径３０ｎｍ以下の会合体を含有する注射用製剤を調製する製造工程において、その膜流動性と円偏光二色性の測定・評価により、リピッドＡ類縁体含有注射剤の体内動態プロファイルを制御できることを明らかにした。
即ち、ＤＰＨを使用した注射用製剤中の粒子の膜流動性は、血中濃度プロファイルに密接に関係があり、製剤を投与した際には、膜流動性の大きい製剤（膜が柔らかい製剤）ほど血中からの消失は遅く（ＡＵＣは大きく）、膜流動性の小さい製剤（膜が硬い製剤）ほど血中からの消失は速く（ＡＵＣは小さく）なる。これは、膜流動性は、リピッドＡ含有注射剤を投与後の薬剤の生体内動態に影響を及ぼし、膜流動性が大きいほど、スカベンジャーレセプターにトラップされにくく肝臓などの食細胞に取り込まれにくくなり、循環血液中からのリピッドＡの消失が遅くなるからである。また、ＣＤスペクトルの変化と体内動態の変動に相関があることも明らかにした。
本発明は、リピッドＡ類縁体を含有する注射用製剤において、血中からの消失の速い処方と遅い処方間では、溶液中での膜流動性及び円偏光二色性が明確に異なることを用いて、膜流動性及び／又は円偏光性を測定することにより、良好な体内動態の保証された注射用製剤の製造を可能とするものである。また、リピッドＡ類縁体を含有する注射用製剤において、膜流動性及び／又は円偏光性を測定することによる体内動態の予測方法、評価方法または一定の体内動態を示すことを保証する品質評価法の提供も可能とするものである。
本発明においては、リピッドＡ類縁体をアルカリ性水溶液に溶解し、次いで緩衝液を添加すると共に、溶液中での膜流動性及び／又は円偏光性を測定することにより、体内動態の制御された直径３０ｎｍ以下の会合体を含有する透明性の高い注射用製剤を調製することができる。この発明において用いる注射用製剤の膜流動性測定は、蛍光プローブ法によるものであり、リン脂質の２分子膜構造の膜流動性を評価する方法である。即ち、脂質の膜内に蛍光プローブを混入し、偏向している入射光を照射した時に発する蛍光の偏光度を測定することにより、蛍光物質の近傍の膜の状態を観察する方法である。本発明における膜流動性評価のパラメーターとしては、蛍光偏向度（Ｐ：範囲０〜０．５）及び蛍光異方性（ｒ：範囲０〜０．４）及びオーダーパラメーター（Ｓ：範囲０〜１．０）から選ばれる１種類以上のいずれを用いても良い。また、使用する蛍光プローブは、安定な蛍光を発するものであればいずれでも良く、例えばジフェニールヘキサトリエン（ＤＰＨ）、カルボキシフルオレセイン、カルセイン、ナイルレッド、ピレン、ペリレンなどが挙げられる。
ここで、例えば、オーダーパラメーター（Ｓ）は、０に近いほど膜流動性が大きく、１．０に近いほど膜流動性は小さいことを意味している。尚、式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）で表わされるリピッドＡ類縁体のオーダーパラメーター（Ｓ）は、通常０．０５〜０．７であり、好ましくは０．１〜０．６であり、更に好ましくは０．１〜０．５である。
また、本発明において用いる注射用製剤の円偏光性評価（ＣＤ法）は、リピッドＡ類縁体の体内動態制御及び予測法として有用な方法であり、多数の注射用製剤のＣＤスペクトルを評価して、ＣＤ強度の差が大きい波長を選択することが望ましい。尚、式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）で表わされるリピッドＡ類縁体のＣＤ法における測定波長は、通常２６０〜３２０ｎｍであり、好ましくは２７０〜３１０ｎｍであり、更に好ましくは２８０〜３００ｎｍである。
本発明におけるアルカリ性水溶液としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属の水酸化物を使用できるが、好ましくは、水酸化ナトリウムである。その濃度は通常、０．０００１Ｍ〜０．１Ｍであり、好ましくは０．０００５Ｍ〜０．０１Ｍであり、より好ましくは０．００１Ｍ〜０．０１Ｍである。
本発明においては、リピッドＡ類縁体にアルカリ性水溶液を添加後、加温することができるが、加温温度はリピッドＡ類縁体またはその薬理学的に許容できる塩の相転移温度以上であればよく、通常３０℃〜６０℃であり、より好ましくは４５℃〜５５℃である。撹拌時間は通常１０分〜３時間である。撹拌は、通常用いられる装置により行うことができる。加温アルカリ性水溶液に溶解する場合は、あらかじめ加温したアルカリ性水溶液にリピッドＡ類縁体を添加してもよいし、またはアルカリ性水溶液にリピッドＡを添加後，加温してもよい。本発明において、加温する目的は、リピッドＡ類縁体の相転移温度以上にすることにより、リピッドＡ類縁体の水和を促進して分散性を向上させ、よって短時間の撹拌により澄明な溶液を得るためである。
ただし、式（ＩＶ）で表わされるリピッドＡ類縁体においては、加温しても良いし、室温で１０分〜１．５時間の撹拌をしても良い。
また、本発明に用いる緩衝液の成分は、リン酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、クエン酸塩またはグリシンなどを用いることができる。緩衝液の濃度は、通常、１ｍＭ〜２０ｍＭである。最終のリピッドＡ類縁体水溶液のｐＨは、好ましくは４〜９、より好ましくは６〜８、さらに好ましくは６．８〜８である。最終のｐＨは緩衝液を加えた後、さらに水酸化ナトリウム溶液や塩酸溶液等を添加することによって調製することができる。
緩衝液には、必要に応じて、糖類及び／又はアミノ酸を添加すると、より好ましい結果を得ることができる。この場合、添加する糖類及び／またはアミノ酸は１種類でもよく、２種類以上添加してもさしつかえない。使用できる糖類としては、乳糖（ラクトース）、ソルビトール、グルコース、トレハロース、マンニトール、デキストラン等を挙げることができ、また、アミノ酸の例としては、グリシン等の中性アミノ酸、アスパラギン酸等の酸性アミノ酸、アルギニン等の塩基性アミノ酸を挙げることができる。
本発明においては、更に、得られたリピッドＡ類縁体水溶液を通常用いられる手段により凍結乾燥製剤とすることができる。すなわち、リピッドＡ類縁体を、アルカリ性水溶液に溶解し、必要に応じてさらに加温撹拌し、次いで緩衝液を添加してｐＨを調製し、滅菌濾過後、バイアル瓶等に充填し凍結・乾燥して凍結乾燥製剤とすることができる。
本発明にかかる注射用製剤を水溶液として供した場合の浸透圧比は、ヒトに投与するに適した値とすることが望ましく、通常は１前後である。
次に、注射用製剤の膜流動性、円偏光性（ＣＤ法）の測定法及び製剤投与後のラット体内動態評価法の一例を以下に示す。
注射用製剤の膜流動性の測定法
蛍光プローブ法を用いて、蛍光偏向度（Ｐ）及び／又は蛍光異方性（ｒ）及び／又はオーダーパラメーター（Ｓ）により評価を行う。
最初に、リピッドＡ類縁体を含有する注射用製剤として、濃度０．５〜０．６ｍｇ／ｍｌの溶解液を調製する（１．５〜１．６ｍｇ／バイアルの凍結乾燥製剤の場合は、蒸留水３ｍｌを添加して調製する）。次に、ＤＰＨ１．５ｍｇをＴＨＦ１０ｍｌに溶解させた蛍光プローブ溶液４μｌを添加し、十分に混合後、５０℃で１時間の放置をする。次に、室温まで冷却後に、Ｐ及び／又はｒを蛍光分光光度計で測定する。尚、蛍光分光光度計Ｆ−４５０型（日立製作所）の測定条件は、励起波長＝３６０ｎｍ、発光波長＝４２８ｎｍ、加電圧＝７００Ｖ、測定温度＝２５℃、スリット幅＝５ｎｍとした。またオーダーパラメーター（Ｓ）は、Ｓ＝（ｒ／０．３９８）１／２で算出した。
尚、Ｓは、０に近いほど膜流動性は大きく（膜は柔らかく）、１に近いほど膜流動性は小さい（膜は硬い）と判断できる。
製剤の円偏光性（ＣＤ法）の測定法
リピッドＡ類縁体を含有する注射用製剤として、濃度０．５〜０．６ｍｇ／ｍｌの溶解液を調製する（１．５〜１．６ｍｇ／バイアルの凍結乾燥製剤の場合は、蒸留水３ｍｌを添加して調製する）。これを、スペクトロポーラロメーターＪ７２０ＷＩ型（日本分光）でＣＤ強度を評価する。測定条件は、波長＝２００〜５００ｎｍ（固定波長使用時は２８０ｎｍ）、測定温度＝室温、セルの長さ＝１ｃｍ、スキャンスピード＝２０ｎｍ／分、積算回数＝５回とした。
製剤投与後のラット体内動態の評価法
製剤の体内動態プロファイルは、血中薬物濃度一時間曲線から得られる曲線下面積（以下ＡＵＣと称する）を指標として判断される。
最初に、リピッドＡ類縁体を含有する注射用製剤として、注射用蒸留水を加えて濃度０．６ｍｇ／ｍｌの溶液を調製する。この溶液を、１ｍｌ／Ｋｇの用量で雄性ＳＤラットに大腿部静脈より投与（０．６ｍｇ／Ｋｇ）し、投与前および投与後２，５，１５，３０，６０，１２０分後に、各々０．２５ｍｌの採血を行った。得られた血液を遠心分離し血漿を得た後に、この血漿中に含まれるリピッドＡ類縁体を液一液抽出し、ＡＤＡＭ試薬（フナコシ薬品）による蛍光ラベルを行った。さらに、固層抽出を行った後に、高速液体クロマトグラフィーで蛍光検出法により、血漿中リピッドＡ類縁体の濃度を測定した。尚、ＡＵＣは、０〜１２０分の血中濃度推移から算出した。
本発明によると、リピッドＡ類縁体を透明で安定な体内動態が制御された注射用製剤とすることが可能であり、また、注射用製剤の体内動態の予測法、評価方法又は、一定の体内動態を示すことを保証するリピッドＡ類縁体含有注射剤の品質評価法を提供することができる。その効果例を以下に示す。
実験例１
本願発明に係る体内動態プロファイル（ＡＵＣ）の異なる製剤の膜流動性と円偏光二色性評価
１）クリアランスの小さい注射用製剤を以下の方法で調製した。５０ｍＬガラス製ビーカーに、式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体３２．４７ｍｇを秤量し、これに７．５ｍＬの０．０１Ｍ−ＮａＯＨを加えた後、室温で６０分間スターラーバー（長さ＝２ｃｍ）で攪拌した。次に、２５ｍＬの乳糖・リン酸緩衝液（精製水２５ｍＬ中に乳糖１水和物を５００ｍｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏを２．２５ｍｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏを１．７５ｍｇ溶解させた水溶液）を加え、スターラーバーにて５分間攪拌後、５０ｍＬメスフラスコに全量を移し、注射用蒸留水を加えて５０ｍＬにメスアップした。
２）クリアランスの大きい注射用製剤を以下の方法で調製した。５０ｍＬガラス製ビーカーに、式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体を３２．９７ｍｇ秤量し、これに０．２５ｍＬの０．０１Ｍ−ＮａＯＨと７．２５ｍＬの注射用蒸留水を加えて混和後、室温で６０分間スターラーバー（長さ＝２ｃｍ）で攪拌した。次に、２５ｍＬの乳糖・リン酸緩衝液（精製水２５ｍＬ中に乳糖１水和物を５００ｍｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏを２．２５ｍｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏを１．７５ｍｇ溶解させた水溶液）を加え、スターラーバーにて５分間攪拌後、５０ｍＬメスフラスコに全量を移した。次に、７．４５ｍＬの０．０１Ｍ−ＮａＯＨを加えて混和し、更に０．０１Ｍ−ＮａＯＨを加えてｐＨを７．４に調整した後、注射用蒸留水を加えて５０ｍＬにメスアップした。
このクリアランスの小さな処方１）と大きな処方２）の２種類の注射用製剤処方について、そのＡＵＣと膜流動性及び円偏光二色性との相関について評価した。
図１に示されるように、リピッドＡ類縁体含有の注射用製剤のラット血中濃度推移は、クリアランスの小さな注射用製剤と大きな注射用製剤では、大きく異なった。また、その膜流動性を示すオーダーパラメーター（Ｓ）は、クリアランスの小さな注射用製剤では０．４９９、クリアランスの大きな注射用製剤では０．６２４であり、有意な差が認められた。
さらに、円偏光二色性（ＣＤ法）によるＣＤ強度は、図２に示されるように、波長２８０ｎｍにおいてＣＤ強度の明確な差異が認められた。以上から、本願発明に係るリピッドＡ類縁体を含有する注射用製剤において、その体内動態の変動を評価する上で、膜流動性及び／又は円偏光二色性評価が有用であることは、明らかである。
実験例２
本願発明に係る注射用製剤の膜流動性及び／又は円偏光二色性の測定・評価とＡＵＣとの相関性
式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体を含有する注射用製剤を１０ロット調製し、そのＣＤ強度（波長＝２８０ｎｍ）及び／又はオーダーパラメーター（Ｓ）とラット静脈内投与時のＡＵＣの相関性を評価した。その結果、図３に示すように、ラットのＡＵＣとＣＤ強度の間には良好な正の相関があり、ＣＤ強度が大きいほど製剤ほどＡＵＣの上昇が認められた。また、図４に示すように、ラットのＡＵＣとオーダーパラメーター（Ｓ）の間には良好な負の相関があり、オーダーパラメーター（Ｓ）が小さい（０に近い）製剤ほどＡＵＣの上昇が認められた。更に、図５に示すように、注射用製剤のＣＤ強度（波長＝２８０ｎｍ）とオーダーパラメーター（Ｓ）との間には良好な負の相関があり、ＣＤ強度が大きくなるにつれてオーダーパラメーター（Ｓ）が小さく（０に近く）なった。
一方、式（ＩＩＩ）で示されるリピッドＡ類縁体を含有する注射用製剤についても数１０ロットを調製し評価した結果、図６に示すようにラットのＡＵＣとオーダーパラメーター（Ｓ）の間には同様に負の相関が認められ、その相関係数は０．８７３であった。また、ラットのＡＵＣと注射用製剤の平均粒径との関係に於いては、平均粒径１０〜２０ｎｍの範囲でＡＵＣの変動が大きく、明確な相関性は認められず（図７）、体内動態の予測評価法としては不十分であった。
以上から、本願発明に係る注射用製剤の膜流動性及び／又は円偏光二色性評価に対する薬物速度論的プロファイル（ＡＵＣ）の良好な相関性が証明された。即ち、膜流動性（オーダーパラメーター（Ｓ））と円偏光性（ＣＤ）は、リピッドＡ類縁体含有注射用製剤の体内動態の予測評価法として、十分に有効であることは明らかである。また、膜流動性及び／又は円偏光性による溶液中での会合状態の評価を特徴とする体内動態が保証された注射用製剤の調製が可能となる。即ち、リピッドＡ類縁体を含有する注射用製剤について、オーダーパラメーター（Ｓ）及び／又は円偏光性（ＣＤ）の値を測定することにより、ＡＵＣが推測可能となるのである。従って、本発明は産業上、利用することができる有用な発明である。
実施例
以下に実施例を挙げ本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるわけではない。
下記に示す実施例１〜１０は、式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体を含有する注射用製剤を調製する際の溶解工程において、使用する水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）濃度を変化させて調製した水性注射剤である。表１に、各実施例製剤のＣＤ強度、オーダーパラメーター（Ｓ）とラット投与時のＡＵＣ値を示した。また、図８に、各実施例製剤での上記溶解工程に使用した水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）濃度とＡＵＣの相関性を示した。水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）濃度が増加するにつれてＡＵＣ及びオーダーパラメーター（Ｓ）が増大したが、０．００１〜０．０１ＭでＡＵＣ及びオーダーパラメーター（Ｓ）値はプラトーとなった。即ち、体内動態の保証された及び／又は予測された式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体注射剤の溶解工程に使用した最適水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）濃度は０．００１〜０．０１Ｍであった。
実施例１
５０ｍＬのガラス製ビーカーに式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体３２．４７ｍｇを秤量し、これに０．０１Ｍ−ＮａＯＨを７．５ｍＬ加えた。これに長さ２ｃｍのスターラーバーを入れ、室温にて６０分間攪拌した（溶解工程に使用した水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）濃度＝０．０１Ｍ）。この溶液に、２５ｍＬの乳糖・燐酸緩衝液（２５ｍＬ中に乳糖１水和物が５００ｍｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏが２．２５ｍｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏが１．７５ｍｇが溶解した水溶液）を加えた。スターラーにて５分間攪拌後、５０ｍＬのメスフラスコに全量を移し、注射用蒸留水を加えて５０ｍＬにメスアップした。この時の溶液のｐＨは７．３９であった。
実施例２
５０ｍＬのガラス製ビーカーに式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体２．２３ｍｇ秤量し、これに０．０１Ｍ−ＮａＯＨを０．７５ｍＬ、注射用蒸留水６．７５ｍＬを加えた。これに長さ２ｃｍのスターラーバーを入れ、室温にて６０分間攪拌した（溶解工程に使用した水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）濃度＝０．０１Ｍ×１／１０）。この溶液に、２５ｍＬの乳糖・燐酸緩衝液（２５ｍＬ中に乳糖１水和物が５００ｍｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏが２．２５ｍｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏが１．７５ｍｇが溶解した水溶液）を加えた。スターラーにて５分間攪拌後、５０ｍＬのメスフラスコに全量を移した。更にメスフラスコに６．７５ｍＬの０．０１Ｍ−ＮａＯＨを加え混和した後、注射用蒸留水を加えて５０ｍＬにメスアップした。この時の溶液のｐＨは７．４１であった。
実施例３
５０ｍＬのガラス製ビーカーに式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体３２．１３ｍｇ秤量し、これに０．０１Ｎ−ＮａＯＨを０．２５ｍＬ、注射用蒸留水７．２５ｍＬを加えた。これに長さ２ｃｍのスターラーバーを入れ、室温にて６０分間攪拌した（溶解工程に使用した水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）濃度＝０．０１Ｍ×１／３０）。この溶液に、２５ｍＬの乳糖・燐酸緩衝液（２５ｍＬ中に乳糖１水和物が５００ｍｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏが２．２５ｍｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏが１．７５ｍｇが溶解した水溶液）を加えた。スターラーにて５分間攪拌後、５０ｍＬのメスフラスコに全量を移した。更にメスフラスコに７．２５ｍＬの０．０１Ｍ−ＮａＯＨを加え混和した後、注射用蒸留水を加えて５０ｍＬにメスアップした。この時の溶液のｐＨは７．４２であった。
実施例４
５０ｍＬのガラス製ビーカーに式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体３２．１６ｍｇ秤量し、これに０．０１Ｍ−ＮａＯＨを０．１２５ｍＬ、注射用蒸留水７．３７５ｍＬを加えた。これに長さ２ｃｍのスターラーバーを入れ、室温にて６０分間攪拌した（溶解工程に使用した水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）濃度＝０．０１Ｍ×１／６０）。この溶液に、２５ｍＬの乳糖・燐酸緩衝液（２５ｍＬ中に乳糖１水和物が５００ｍｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏが２．２５ｍｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏが１．７５ｍｇが溶解した水溶液）を加えた。スターラーにて５分間攪拌後、５０ｍＬのメスフラスコに全量を移した。更にメスフラスコに７．３７５ｍＬの０．０１Ｍ−ＮａＯＨを加え混和した後、注射用蒸留水を加えて５０ｍＬにメスアップした。この時の溶液のｐＨは７．３０であった。
実施例５
５０ｍＬのガラス製ビーカーに式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体３２．６３ｍｇを秤量し、これに０．０１Ｍ−ＮａＯＨを０．１２５ｍＬ、注射用蒸留水７．３７５ｍＬを加えた溶液を５．０ｍＬ加え更に注射用蒸留水２．５ｍＬを加えた。これに長さ２ｃｍのスターラーバーを入れ、室温にて６０分間攪拌した（溶解工程に使用した水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）濃度＝０．０１Ｍ×１／９０）。この溶液に、２５ｍＬの乳糖・燐酸緩衝液（２５ｍＬ中に乳糖１水和物が５００ｍｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏが２．２５ｍｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏが１．７５ｍｇが溶解した水溶液）を加えた。スターラーにて５分間攪拌後、５０ｍＬのメスフラスコに全量を移した。更にメスフラスコに７．４ｍＬの０．０１Ｍ−ＮａＯＨを加え混和し、更に０．０１Ｍ−ＮａＯＨを加えてｐＨを７．４に調整した後、注射用蒸留水を加えて５０ｍＬにメスアップした。この時の溶液のｐＨは７．４２であった。
実施例６
５０ｍＬのガラス製ビーカーに式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体３２．０７ｍｇを秤量し、これに０．０１Ｍ−ＮａＯＨを０．１２５ｍＬ、注射用蒸留水７．３７５ｍＬを加えた溶液を３．７５ｍＬ加え更に注射用蒸留水３．７５ｍＬを加えた。これに長さ２ｃｍのスターラーバーを入れ、室温にて６０分間攪拌した（溶解工程に使用した水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）濃度＝０．０１Ｍ×１／１２０）。この溶液に、２５ｍＬの乳糖・燐酸緩衝液（２５ｍＬ中に乳糖１水和物が５００ｍｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏが２．２５ｍｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏが１．７５ｍｇが溶解した水溶液）を加えた。スターラーにて５分間攪拌後、５０ｍＬのメスフラスコに全量を移した。更にメスフラスコに７．４ｍＬの０．０１Ｎ−ＮａＯＨを加え混和し、更に０．０１Ｍ−ＮａＯＨを加えてｐＨを７．４に調整した後、注射用蒸留水を加えて５０ｍＬにメスアップした。この時の溶液のｐＨは７．４８であった。
実施例７
５０ｍＬのガラス製ビーカーに式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体３２．４３ｍｇを秤量した。これに０．０１Ｍ−ＮａＯＨを０．１２５ｍＬ、注射用蒸留水１４．８７５ｍＬを加えて混和した溶液を５．０ｍＬ加え更に注射用蒸留水２．５ｍＬを加えた。これに長さ２ｃｍのスターラーバーを入れ、室温にて６０分間攪拌した（溶解工程に使用した水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）濃度＝０．０１Ｍ×１／１８０）。この溶液に、２５ｍＬの乳糖・燐酸緩衝液（２５ｍＬ中に乳糖１水和物が５００ｍｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏが２．２５ｍｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏが１．７５ｍｇが溶解した水溶液）を加えた。スターラーにて５分間攪拌後、５０ｍＬのメスフラスコに全量を移した。更にメスフラスコに７．４５ｍＬの０．０１Ｍ−ＮａＯＨを加え混和し、更に０．０１Ｍ−ＮａＯＨを加えてｐＨを７．４に調整した後、注射用蒸留水を加えて５０ｍＬにメスアップした。この時の溶液のｐＨは７．４１であった。
実施例８
５０ｍＬのガラス製ビーカーに式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体３２．８４ｍｇを秤量した。これに０．０１Ｍ−ＮａＯＨを０．１２５ｍＬ、注射用蒸留水１４．８７５ｍＬを加えて混和した溶液を３．７５ｍＬ加え更に注射用蒸留水３．７５ｍＬを加えた。これに長さ２ｃｍのスターラーバーを入れ、室温にて６０分間攪拌した（溶解工程に使用した水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）濃度＝０．０１Ｍ×１／２４０）。この溶液に、２５ｍＬの乳糖・燐酸緩衝液（２５ｍＬ中に乳糖１水和物が５００ｍｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏが２．２５ｍｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏが１．７５ｍｇが溶解した水溶液）を加えた。スターラーにて５分間攪拌後、５０ｍＬのメスフラスコに全量を移した。更にメスフラスコに７．４５ｍＬの０．０１Ｍ−ＮａＯＨを加え混和し、更に０．０１Ｍ−ＮａＯＨを加えてｐＨを７．４に調整した後、注射用蒸留水を加えて５０ｍＬにメスアップした。この時の溶液のｐＨは７．４１であった。
実施例９
５０ｍＬのガラス製ビーカーに式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体３２．３５ｍｇを秤量した。これに０．０１Ｍ−ＮａＯＨを０．２５ｍＬ、注射用蒸留水７．２５ｍＬを加えて混和した溶液を０．７５ｍＬ加え更に注射用蒸留水６．７５ｍＬを加えた。これに長さ２ｃｍのスターラーバーを入れ、室温にて６０分間攪拌した（溶解工程に使用した水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）濃度＝０．０１Ｍ×１／３５０）。この溶液に、２５ｍＬのの乳糖・燐酸緩衝液（２５ｍＬ中に乳糖１水和物が５００ｍｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏが２．２５ｍｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏが１．７５ｍｇが溶解した水溶液）を加えた。スターラーにて５分間攪拌後、５０ｍＬのメスフラスコに全量を移した。更にメスフラスコに７．４５ｍＬの０．０１Ｍ−ＮａＯＨを加え混和し、更に０．０１Ｍ−ＮａＯＨを加えてｐＨを７．４に調整した後、注射用蒸留水を加えて５０ｍＬにメスアップした。この時の溶液のｐＨは７．４１であった。
実施例１０
５０ｍＬのガラス製ビーカーに式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体３２．９７ｍｇを秤量した。これに０．０１Ｍ−ＮａＯＨを０．２５ｍＬ、注射用蒸留水７．２５ｍＬを加えて混和した溶液を０．５ｍＬ加え更に注射用蒸留水７．０ｍＬを加えた。これに長さ２ｃｍのスターラーバーを入れ、室温にて６０分間攪拌した（溶解工程に使用した水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）濃度＝０．０１Ｍ×１／４５０）。この溶液に、２５ｍＬの乳糖・燐酸緩衝液（２５ｍＬ中に乳糖１水和物が５００ｍｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏが２．２５ｍｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏが１．７５ｍｇが溶解した水溶液）を加えた。スターラーにて５分間攪拌後、５０ｍＬのメスフラスコに全量を移した。更にメスフラスコに７．４５ｍＬの０．０１Ｍ−ＮａＯＨを加え混和し、更に０．０１Ｍ−ＮａＯＨを加えてｐＨを７．４に調整した後、注射用蒸留水を加えて５０ｍＬにメスアップした。この時の溶液のｐＨは７．４３であった。
下記に示す実施例１１〜２１は、式（ＩＩＩ）で示されるリピッドＡ類縁体を含有する注射用製剤を調製する際の溶解工程において、実施例１１〜１６では室温攪拌を、実施例１７〜２１では超音波分散（１０℃以下）を行ったものである。式（ＩＩＩ）で示されるリピッドＡ類縁体法の相転移温度は約３０℃であるため、実施例１１〜２１では十分な溶解分散が得られず、表２に示すように、ラット投与時のＡＵＣおよびオーダーパラメーター（Ｓ）を初めとする物理化学的パラメーターのばらつきが大きく認められた。
実施例１１〜１６
ガラス製ビーカーに、式（ＩＩＩ）で示されるリピッドＡ類縁体１００ｍｇを秤量した。これに０．０１Ｍ−ＮａＯＨを５０ｍＬ添加し、室温（約２５℃）でスターラー攪拌した。この溶液に、６００ｍＬの乳糖・燐酸緩衝液（注射用蒸留水６００ｍＬ中に乳糖１水和物１００ｇ，Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ０．４５ｇ，ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ０．３５ｇを溶解した水溶液）を加えスターラー攪拌後に、注射用蒸留水を適量加えて１Ｌにメスアップした。この薬液を０．２２μｍフィルターでろ過した後に、そのろ液５．３ｍｌずつをバイアルに充填し、凍結乾燥を行なった。この注射用凍結乾燥製剤バイアルに、注射用蒸留水５ｍＬを加えて復水し、ラット体内動態（ＡＵＣ）、粒子径、膜流動性（オーダーパラメーター（Ｓ）、蛍光異方性ｒ、蛍光偏光度Ｐ）を評価した結果を、表２に示した。
実施例１７〜２１
ガラス製ビーカーに、式（ＩＩＩ）で示されるリピッドＡ類縁体１００ｍｇを秤量した。これに０．０１Ｍ−ＮａＯＨを１５０ｍＬ添加し、室温でスターラー攪拌した。式（ＩＩＩ）で示されるリピッドＡ類縁体によるゲルがなくなったことを目視で確認後に、ガラス製ビーカーをバスタイプソニケーター中で１０℃以下を維持しながら超音波照射を行った。この溶液に、６００ｍＬの乳糖・燐酸緩衝液（注射用蒸留水６００ｍＬ中に乳糖１水和物１００ｇ，Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ０．４５ｇ，ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ０．３５ｇを溶解した水溶液）を加えスターラー攪拌後に、注射用蒸留水を適量加えて１Ｌにメスアップした。この薬液を０．２２μｍフィルターでろ過した後に、そのろ液５．３ｍｌずつをバイアルに充填し、凍結乾燥を行なった。この注射用凍結乾燥製剤バイアルに、注射用蒸留水５ｍＬを加えて復水し、ラット体内動態（ＡＵＣ）、粒子径、膜流動性（オーダーパラメーター（Ｓ）、蛍光異方性ｒ、蛍光偏向度Ｐ）を評価した結果を、表２に示した。
実施例２２〜２６
ガラス製ビーカーに式（ＩＩＩ）で示されるリピッドＡ類縁体１００ｍｇを秤量した。これに０．００３Ｍ−ＮａＯＨを５０ｍＬ添加し、５０±５℃でスターラー攪拌した。尚、スターラー攪拌時間は、３，８，１５，３０，９０分間と変化させた。攪拌後の溶液に、６００ｍＬの乳糖・燐酸緩衝液（注射用蒸留水６００ｍＬ中に乳糖１水和物１００ｇ，Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ０．４５ｇ，ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ０．３５ｇを溶解した水溶液）を加えスターラー攪拌後に、注射用蒸留水を適量加えて１Ｌにメスアップした。この薬液を０．２２μｍフィルターでろ過した後に、そのろ液５．３ｍＬずつをバイアルに充填し、凍結乾燥を行なった。この注射用凍結乾燥製剤バイアルに、注射用蒸留水５ｍＬを加えて復水し、ラット体内動態（ＡＵＣ）、粒子径、膜流動性（オーダーパラメーター（Ｓ））、表面荷電を評価した結果を、表３に示した。式（ＩＩＩ）で示されるリピッドＡ類縁体の相転移温度（約３０℃）以上の温度（５０±５℃）の水酸化ナトリウム溶液中での攪拌を行ったため、ＡＵＣは攪拌時間に依存し、攪拌時間が長くなるほどＡＵＣの増加が認められた。また、ＡＵＣが大きくなるほどオーダーパラメーター（Ｓ）が小さくなった。更に、粒子径や表面荷電に関しては、ＡＵＣとの明確な相関は認められなかった。
実施例２７
ガラス製ビーカーに式（ＩＩＩ）で示されるリピッドＡ類縁体１００ｍｇを秤量した。これに０．００３Ｍ−ＮａＯＨを５０ｍＬ添加し、５０±５℃で３０分間のスターラー攪拌を行った。攪拌後の溶液に、６００ｍＬの乳糖・燐酸緩衝液（注射用蒸留水６００ｍＬ中に乳糖１水和物１００ｇ，Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ０．４５ｇ，ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ０．３５ｇを溶解した水溶液）を加えスターラー攪拌後に、注射用蒸留水を適量加えて１Ｌにメスアップした。この薬液を０．２２μｍフィルターでろ過した後に、そのろ液５．３ｍｌずつをバイアルに充填し、凍結乾燥を行なった。この製造初期品と４０℃−７５％相対湿度下での安定性試験品（１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月の保存後の注射用凍結乾燥製剤）について、例数ｎ＝３で各々注射用蒸留水５ｍＬを加えて復水し、膜流動性（オーダーパラメーター（Ｓ））を評価した。その結果を表４に示した。オーダーパラメーター（Ｓ）の測定時の変動は小さく、十分な再現性が確認された。また、初期〜３ヶ月安定性試験品の間では、オーダーパラメーター（Ｓ）及び体内動態の変化は認められず、安定な注射用製剤であることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
図１は、式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体含有注射剤のラット投与（０．６ｍｇ／ｋｇ）時の血中濃度推移を示すグラフである。
図２は、式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体含有注射剤のＣＤスペクトル（円偏光二色性分光法評価によるスペクトル）を示すグラフである。
図３は、式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体含有注射剤のＣＤ強度とＡＵＣ（ラット投与時）の相関性を示すグラフである。
図４は、式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体含有注射剤のオーダーパラメーター（Ｓ）とＡＵＣ（ラット投与時）の相関性を示すグラフである。
図５は、式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体含有注射剤のＣＤ強度とオーダーパラメーター（Ｓ）の相関性を示すグラフである。
図６は、式（ＩＩＩ）で示されるリピッドＡ類縁体含有注射剤のオーダーパラメーター（Ｓ）とＡＵＣ（ラット投与時）の相関性を示すグラフである。
図７は、式（ＩＩＩ）で示されるリピッドＡ類縁体含有注射剤の平均粒径とＡＵＣ（ラット投与時）の相関性を示すグラフである。
図８は、式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体含有注射剤の溶解工程における水酸化ナトリウム濃度とＡＵＣ（ラット投与時）の相関性を示すグラフである。
本発明は、リピッドＡ類縁体含有注射剤の体内動態の予測方法と評価方法、更には、一定の体内動態を示すことを保証する注射剤の品質評価方法及び製造方法に関する。
従来の技術
リピッドＡは、リポポリサッカライド（以下ＬＰＳと称する）の活性発現中心であり、マクロファージ刺激作用、抗腫瘍作用、発熱作用などさまざまな生物活性を有することが知られている（高田春比古、小谷尚三；蛋白質・核酸・酵素、３１（４）、３６１（１９８６））。
さらに、近年は、リピッドＡ類縁体が種々合成され、その生物活性が調べられているが（小川祐示他；代謝、２６（５）、４１５（１９８９））、糖脂質構造を有するリピッドＡ類縁体の多くは、水難溶性であり注射剤化が困難であった。
注射剤化の為に、透明性の高い水溶液を得るための可溶化剤としては、トリエチルアミン、牛血清アルブミン、脂質などの添加（Ｙ．Ｂ．Ｋｉｍ，ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１，２３０（１９７２）及びＲ．Ｂ．Ｒａｍｓｅｙ，ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，５６，３０７（１９８０）、及びＪ．Ｄｉｊｋｓｔｒａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３８，２６６３（１９８７））、塩基性アミノ酸やポリアミンの利用（特開平４−１９８１９２号公報）などが報告されている。
また、レシチンなどの脂質を水に分散させ、リポソーム等の会合体を形成させる為に、中性領域の緩衝液に脂質を入れて加熱し、超音波照射する方法が知られている。
我々は、特開平５−１９４４７０号公報、ＷＯ９６／３９４１１号公報によって開示される方法で製造されたリピッドＡ類縁体またはその薬理学的に許容できる塩を、アルカリ性水溶液に溶解し、次いで緩衝液を添加することにより、直径３０ｎｍ以下の会合体を含有する透明性の高い注射用製剤を調製した。
しかし、この注射用製剤をラットやビーグル犬等の生体に投与した際には、原薬や製剤ロットの違いによりリピッドＡ類縁体の血中薬物濃度が大きくばらつく問題があった。これは、この注射用製剤の溶液中における薬物（脂質）の会合状態が、一定でないためである。
一般に、溶液中における脂質の会合状態を評価する手段としては、電子顕微鏡による外観評価、レーザー回折式粒度分布測定装置による粒度分布の評価、臨界ミセル濃度や表面張力測定等の物性値からの考察などの方法が、実施されている。
しかし、本願発明に係る評価法として使用した円偏光二色性分光法及び／又は膜流動性評価法に関しては、報告例は少ない。
即ち、円偏光二色性分光法（以下ＣＤ法と称する）は、左右円偏光に対する光学活性物質の屈折率および吸光度の差を反映して測定されるものであり、一般的には、ペプチド、蛋白質のコンフォメーション解析や低分子化合物の光学活性分析に繁用されているが、脂質関連物質のＣＤ法での解析はほとんど行われていなかった。報告では、リポゾーム膜内での脂質の動的な温度依存性の変化をＣＤスペクトル変化の解析により検討した例（特開昭６２−２５２７９５）、ＣＤ法は水中の脂質粒子の特徴の評価の為に有用な手法であり、操作上極めて簡便な評価法であると同時に、希薄濃度で膜内の動的な状態変化を測定することが可能であるとした報告例（Ｎ．Ｎａｋａｓｈｉｍａ ｅｔ Ａｌ，ＣＨＥＭ．ＬＥＴ．，１５０３，１０（１９８５））、プロスタグランジンＥｌの種々リポソーム処方による会合体特性と溶出特性の相関を検討し、その評価法の一つにＣＤ法を用いた例（Ｓｈａｒｏｎ Ｍ．Ｋ．ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１３２７，９７（１９９７））などがあるにすぎない。
一方、膜流動性（膜の堅牢さ）の評価法には、蛍光プローブ法、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）法などが知られている（ロバートＢ ゲニス；生体膜 ｐ１４６、（１９９２）シュプリンガーフェアラーク東京）。この中で、蛍光プローブ法は、リン脂質の２分子膜構造の膜流動性を評価する方法として、脂質の膜内にジフェニールヘキサトリエン（以下ＤＰＨと称する）などの蛍光プローブを混入し、偏向している入射光を照射した時に発する蛍光の偏向度を測定することにより、蛍光物質の近傍の膜の状態を観察する方法であり、リピッドＡ類縁体に適用した報告例がある（Ｂｒａｕｄｅｎｂｕｒｇ Ｋ ｅｔ ａｌ；Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２２５，７７５（１９８４））。蛍光プローブ法では、脂質試料から発する蛍光の鉛直偏向成分と水平偏向成分を別個に測定することにより、蛍光偏向度（Ｐ：範囲０〜０．５）及び／又は蛍光異方性（ｒ：範囲０〜０．４）及び／又はオーダーパラメーター（Ｓ：範囲０〜１．０）を算出できる（寺田弘、吉村哲郎；ライフサイエンスにおけるリポゾーム（１９９２）、シュプリンガーフェアラーク東京）。ここで、オーダーパラメーター（Ｓ）は、０に近いほど膜流動性が大きく、１．０に近いほど膜流動性は小さいことを意味している。
しかし、リピッドＡ類縁体において、薬物の溶液中における会合状態を測定・評価することにより、体内動態との相関性の観点からリピッドＡ類縁体の体内動態を明確に予測または評価した例はない。また、溶液中における薬物（脂質）の会合状態の観点から、リピッドＡ類縁体の体内動態が制御された注射用製剤の製造法または一定の体内動態を保証する品質保証法の報告例もない。
リピッドＡ類縁体またはその薬理学的に許容できる塩を、アルカリ性水溶液に溶解し、次いで緩衝液を添加することにより、直径３０ｎｍ以下の会合体を含有する注射用製剤を調製することは可能である。この注射用製剤においては、リピッドＡ類縁体またはその薬理学的に許容できる塩は、脂質二分子膜小胞体またはミセル構造を有している。即ち、水溶液とした時に澄明性が高く、ｐＨが注射剤として好ましい範囲であり、安定性も良好であるリピッドＡ類縁体の注射剤が製造できる。
しかし、その注射用製剤をラットやビーグル犬に投与した際には、原薬や製剤間のロットの差異により、血中濃度が大きくばらつく問題があった。これは、原薬や製剤間のロットの差により、リピッドＡ類縁体の溶液中での存在状態、即ち、直径３０ｎｍ以下の脂質二分子膜小胞体またはミセルの会合体構造が一様でなかった為である。従って、リピッドＡ類縁体の実用に供しうる注射剤、即ち、原薬や製剤のロットに依存することなく、血中濃度に代表される体内動態の変動の少ない注射剤及びその体内動態を予測する評価方法が渇望されている。
発明の開示
以上のような状況に鑑み、本発明者らは、リピッドＡ類縁体を含有する澄明性が高く、安定性も良好である上に、体内動態が原薬や製剤のロットに依存することなく変動の少ない注射剤並びにそれらの体内動態の予測評価法を探索すべく鋭意研究を行った。その結果、以下に示す構成により所期の目的を達成できることを見いだし、本発明を完成した。
本発明は、リピッドＡ類縁体またはその薬理学的に許容できる塩を含有する注射用製剤において、溶液中での膜流動性及び／又は円偏光性を測定することを特徴とするリピッドＡ類縁体の体内動態の予測方法である。
本発明は、また、リピッドＡ類縁体またはその薬理学的に許容できる塩を含有する注射用製剤において、溶液中での膜流動性及び／又は円偏光性を測定することを特徴とするリピッドＡ類縁体の体内動態の評価方法である。
また、本発明は、リピッドＡ類縁体またはその薬理学的に許容できる塩を含有する注射用製剤において、溶液中での膜流動性及び／又は円偏光性を測定し評価することにより、生体内でリピッドＡ類縁体が一定の体内動態を示すことを保証するリピッドＡ類縁体含有注射剤の品質評価法である。
さらに本発明は、リピッドＡ類縁体またはその薬理学的に許容できる塩を含有する注射用製剤の製造工程において、溶液中での膜流動性及び／又は円偏光性の測定を必須とする注射用製剤の製造方法である。
本発明の体内動態の予測方法は、注射用製剤の評価、一定の体内動態を示す注射用製剤を得るための品質評価および注射用製剤の製造工程において用いることができる。
本発明によると、リピッドＡ類縁体またはその薬理学的に許容できる塩（以下、単に、リピッドＡ類縁体と称する）を透明で安定な体内動態が保証された注射用製剤とすることができるが、これが本発明の目的である。また、本発明においては、リピッドＡ類縁体を含有する注射用製剤において、膜流動性及び／又は円偏光性を測定することによる体内動態の予測方法、評価方法を提供することができるとともに、リピッドＡ類縁体が一定の体内動態を示すことを保証するリピッドＡ類縁体含有注射剤の品質評価方法を提供することができるが、これもまた、本発明の目的のひとつである。
本発明によるリピッドＡ類縁体は次の化学構造式を有し、例えば特開平５−１９４４７０号公報またはＷＯ９６／３９４１１号公報によって開示される方法で製造することができる。
残りのＲ１，Ｒ２，Ｒ３及びＲ４の各々は、独立して、
各Ａ１とＡ２は、独立して、Ｈ，ＯＨ，ＯＣＨ３、
Ｙは、Ｈ，ＯＨ，Ｏ（ＣＨ２）ｗＣＨ３，ハロゲン原子、
【化６】
Ｒ２は直鎖又は分枝状の炭素数５〜１５のアルキル基であり；
Ｒ３は、
Ｒ４は直鎖又は分枝の炭素数４〜２０のアルキル基、及び
Ｒ５は水素原子、Ｊ’、−Ｊ’−ＯＨ、−Ｊ’−Ｏ−Ｋ’、−Ｊ’−Ｏ−Ｋ’−ＯＨ及び−Ｊ’−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２（式中Ｊ’及びＫ’は、それぞれ直鎖又は分枝の炭素数１〜５のアルキル基である）から選ばれる基であり；
Ｒ６は水酸基、ハロゲン原子、炭素数１〜５のアルコキシ基及び炭素数１〜５のアシルオキシ基からなる群から選ばれる基であり；
Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、
本発明において、好ましいリピッドＡ類縁体として、６−Ｏ−｛２−デオキシ−６−Ｏ−メチル−４−Ｏ−フォスフォノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−３−Ｚ−ドデク−５−エノイルオキシデシル］−２−［３−オキソ−テトラデカノイルアミド］−β−Ｏ−フォスフォノ−α−Ｄ−グルコピラノース］四ナトリウム、α−Ｄ−グルコピラノース，３−Ｏ−デシル−２−デオキシ−６−Ｏ−［２−デオキシ−３−Ｏ−（３−メトキシデシル）−６−Ｏ−メチル−２−［（１−オキソ−１１−オクタデセニル）アミノ］−４−Ｏ−フォスフォノ−β−Ｄ−グルコピラノシル］−２−［（１，３−ジオキソテトラデシル）アミノ］−，１−（ディハイドロジェンフォスフェイト），ジナトリウム［６（２Ｚ，３Ｒ）］及びα−Ｄ−グルコピラノース，３−Ｏ−デシル−２−デオキシ−６−Ｏ−［２−デオキシ−３−Ｏ−（３−メトキシデシル）−６−Ｏ−メチル−２−［（１−オキソ−１１−オクタデセニル）アミノ］−４−Ｏ−フォスフォノ−β−Ｄ−グルコピラノシル］−２−［（１，３−ジオキソテトラデシル）アミノ］−，１−（ディハイドロジェンフォスフェイト），テトラナトリウム［６（２Ｚ，３Ｒ）］を挙げることができる。これらの化学構造式は次の式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）で表わされる。
しかし、リピッドＡ類縁体含有製剤において、体内動態制御の観点から、膜の物理化学的性質を評価した例は、従来は、なかった。
本発明では、リピッドＡ類縁体をアルカリ性水溶液に溶解し、次いで緩衝液を添加して製する直径３０ｎｍ以下の会合体を含有する注射用製剤を調製する製造工程において、その膜流動性と円偏光二色性の測定・評価により、リピッドＡ類縁体含有注射剤の体内動態プロファイルを制御できることを明らかにした。
即ち、ＤＰＨを使用した注射用製剤中の粒子の膜流動性は、血中濃度プロファイルに密接に関係があり、製剤を投与した際には、膜流動性の大きい製剤（膜が柔らかい製剤）ほど血中からの消失は遅く（ＡＵＣは大きく）、膜流動性の小さい製剤（膜が硬い製剤）ほど血中からの消失は速く（ＡＵＣは小さく）なる。これは、膜流動性は、リピッドＡ含有注射剤を投与後の薬剤の生体内動態に影響を及ぼし、膜流動性が大きいほど、スカベンジャーレセプターにトラップされにくく肝臓などの食細胞に取り込まれにくくなり、循環血液中からのリピッドＡの消失が遅くなるからである。また、ＣＤスペクトルの変化と体内動態の変動に相関があることも明らかにした。
本発明は、リピッドＡ類縁体を含有する注射用製剤において、血中からの消失の速い処方と遅い処方間では、溶液中での膜流動性及び円偏光二色性が明確に異なることを用いて、膜流動性及び／又は円偏光性を測定することにより、良好な体内動態の保証された注射用製剤の製造を可能とするものである。また、リピッドＡ類縁体を含有する注射用製剤において、膜流動性及び／又は円偏光性を測定することによる体内動態の予測方法、評価方法または一定の体内動態を示すことを保証する品質評価法の提供も可能とするものである。
本発明においては、リピッドＡ類縁体をアルカリ性水溶液に溶解し、次いで緩衝液を添加すると共に、溶液中での膜流動性及び／又は円偏光性を測定することにより、体内動態の制御された直径３０ｎｍ以下の会合体を含有する透明性の高い注射用製剤を調製することができる。この発明において用いる注射用製剤の膜流動性測定は、蛍光プローブ法によるものであり、リン脂質の２分子膜構造の膜流動性を評価する方法である。即ち、脂質の膜内に蛍光プローブを混入し、偏向している入射光を照射した時に発する蛍光の偏光度を測定することにより、蛍光物質の近傍の膜の状態を観察する方法である。本発明における膜流動性評価のパラメーターとしては、蛍光偏向度（Ｐ：範囲０〜０．５）及び蛍光異方性（ｒ：範囲０〜０．４）及びオーダーパラメーター（Ｓ：範囲０〜１．０）から選ばれる１種類以上のいずれを用いても良い。また、使用する蛍光プローブは、安定な蛍光を発するものであればいずれでも良く、例えばジフェニールヘキサトリエン（ＤＰＨ）、カルボキシフルオレセイン、カルセイン、ナイルレッド、ピレン、ペリレンなどが挙げられる。
ここで、例えば、オーダーパラメーター（Ｓ）は、０に近いほど膜流動性が大きく、１．０に近いほど膜流動性は小さいことを意味している。尚、式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）で表わされるリピッドＡ類縁体のオーダーパラメーター（Ｓ）は、通常０．０５〜０．７であり、好ましくは０．１〜０．６であり、更に好ましくは０．１〜０．５である。
また、本発明において用いる注射用製剤の円偏光性評価（ＣＤ法）は、リピッドＡ類縁体の体内動態制御及び予測法として有用な方法であり、多数の注射用製剤のＣＤスペクトルを評価して、ＣＤ強度の差が大きい波長を選択することが望ましい。尚、式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）で表わされるリピッドＡ類縁体のＣＤ法における測定波長は、通常２６０〜３２０ｎｍであり、好ましくは２７０〜３１０ｎｍであり、更に好ましくは２８０〜３００ｎｍである。
本発明におけるアルカリ性水溶液としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属の水酸化物を使用できるが、好ましくは、水酸化ナトリウムである。その濃度は通常、０．０００１Ｍ〜０．１Ｍであり、好ましくは０．０００５Ｍ〜０．０１Ｍであり、より好ましくは０．００１Ｍ〜０．０１Ｍである。
本発明においては、リピッドＡ類縁体にアルカリ性水溶液を添加後、加温することができるが、加温温度はリピッドＡ類縁体またはその薬理学的に許容できる塩の相転移温度以上であればよく、通常３０℃〜６０℃であり、より好ましくは４５℃〜５５℃である。撹拌時間は通常１０分〜３時間である。撹拌は、通常用いられる装置により行うことができる。加温アルカリ性水溶液に溶解する場合は、あらかじめ加温したアルカリ性水溶液にリピッドＡ類縁体を添加してもよいし、またはアルカリ性水溶液にリピッドＡを添加後，加温してもよい。本発明において、加温する目的は、リピッドＡ類縁体の相転移温度以上にすることにより、リピッドＡ類縁体の水和を促進して分散性を向上させ、よって短時間の撹拌により澄明な溶液を得るためである。
ただし、式（ＩＶ）で表わされるリピッドＡ類縁体においては、加温しても良いし、室温で１０分〜１．５時間の撹拌をしても良い。
また、本発明に用いる緩衝液の成分は、リン酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、クエン酸塩またはグリシンなどを用いることができる。緩衝液の濃度は、通常、１ｍＭ〜２０ｍＭである。最終のリピッドＡ類縁体水溶液のｐＨは、好ましくは４〜９、より好ましくは６〜８、さらに好ましくは６．８〜８である。最終のｐＨは緩衝液を加えた後、さらに水酸化ナトリウム溶液や塩酸溶液等を添加することによって調製することができる。
緩衝液には、必要に応じて、糖類及び／又はアミノ酸を添加すると、より好ましい結果を得ることができる。この場合、添加する糖類及び／またはアミノ酸は１種類でもよく、２種類以上添加してもさしつかえない。使用できる糖類としては、乳糖（ラクトース）、ソルビトール、グルコース、トレハロース、マンニトール、デキストラン等を挙げることができ、また、アミノ酸の例としては、グリシン等の中性アミノ酸、アスパラギン酸等の酸性アミノ酸、アルギニン等の塩基性アミノ酸を挙げることができる。
本発明においては、更に、得られたリピッドＡ類縁体水溶液を通常用いられる手段により凍結乾燥製剤とすることができる。すなわち、リピッドＡ類縁体を、アルカリ性水溶液に溶解し、必要に応じてさらに加温撹拌し、次いで緩衝液を添加してｐＨを調製し、滅菌濾過後、バイアル瓶等に充填し凍結・乾燥して凍結乾燥製剤とすることができる。
本発明にかかる注射用製剤を水溶液として供した場合の浸透圧比は、ヒトに投与するに適した値とすることが望ましく、通常は１前後である。
次に、注射用製剤の膜流動性、円偏光性（ＣＤ法）の測定法及び製剤投与後のラット体内動態評価法の一例を以下に示す。
注射用製剤の膜流動性の測定法
蛍光プローブ法を用いて、蛍光偏向度（Ｐ）及び／又は蛍光異方性（ｒ）及び／又はオーダーパラメーター（Ｓ）により評価を行う。
最初に、リピッドＡ類縁体を含有する注射用製剤として、濃度０．５〜０．６ｍｇ／ｍｌの溶解液を調製する（１．５〜１．６ｍｇ／バイアルの凍結乾燥製剤の場合は、蒸留水３ｍｌを添加して調製する）。次に、ＤＰＨ１．５ｍｇをＴＨＦ１０ｍｌに溶解させた蛍光プローブ溶液４μｌを添加し、十分に混合後、５０℃で１時間の放置をする。次に、室温まで冷却後に、Ｐ及び／又はｒを蛍光分光光度計で測定する。尚、蛍光分光光度計Ｆ−４５０型（日立製作所）の測定条件は、励起波長＝３６０ｎｍ、発光波長＝４２８ｎｍ、加電圧＝７００Ｖ、測定温度＝２５℃、スリット幅＝５ｎｍとした。またオーダーパラメーター（Ｓ）は、Ｓ＝（ｒ／０．３９８）１／２で算出した。
尚、Ｓは、０に近いほど膜流動性は大きく（膜は柔らかく）、１に近いほど膜流動性は小さい（膜は硬い）と判断できる。
製剤の円偏光性（ＣＤ法）の測定法
リピッドＡ類縁体を含有する注射用製剤として、濃度０．５〜０．６ｍｇ／ｍｌの溶解液を調製する（１．５〜１．６ｍｇ／バイアルの凍結乾燥製剤の場合は、蒸留水３ｍｌを添加して調製する）。これを、スペクトロポーラロメーターＪ７２０ＷＩ型（日本分光）でＣＤ強度を評価する。測定条件は、波長＝２００〜５００ｎｍ（固定波長使用時は２８０ｎｍ）、測定温度＝室温、セルの長さ＝１ｃｍ、スキャンスピード＝２０ｎｍ／分、積算回数＝５回とした。
製剤投与後のラット体内動態の評価法
製剤の体内動態プロファイルは、血中薬物濃度一時間曲線から得られる曲線下面積（以下ＡＵＣと称する）を指標として判断される。
最初に、リピッドＡ類縁体を含有する注射用製剤として、注射用蒸留水を加えて濃度０．６ｍｇ／ｍｌの溶液を調製する。この溶液を、１ｍｌ／Ｋｇの用量で雄性ＳＤラットに大腿部静脈より投与（０．６ｍｇ／Ｋｇ）し、投与前および投与後２，５，１５，３０，６０，１２０分後に、各々０．２５ｍｌの採血を行った。得られた血液を遠心分離し血漿を得た後に、この血漿中に含まれるリピッドＡ類縁体を液一液抽出し、ＡＤＡＭ試薬（フナコシ薬品）による蛍光ラベルを行った。さらに、固層抽出を行った後に、高速液体クロマトグラフィーで蛍光検出法により、血漿中リピッドＡ類縁体の濃度を測定した。尚、ＡＵＣは、０〜１２０分の血中濃度推移から算出した。
本発明によると、リピッドＡ類縁体を透明で安定な体内動態が制御された注射用製剤とすることが可能であり、また、注射用製剤の体内動態の予測法、評価方法又は、一定の体内動態を示すことを保証するリピッドＡ類縁体含有注射剤の品質評価法を提供することができる。その効果例を以下に示す。
実験例１
本願発明に係る体内動態プロファイル（ＡＵＣ）の異なる製剤の膜流動性と円偏光二色性評価
１）クリアランスの小さい注射用製剤を以下の方法で調製した。５０ｍＬガラス製ビーカーに、式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体３２．４７ｍｇを秤量し、これに７．５ｍＬの０．０１Ｍ−ＮａＯＨを加えた後、室温で６０分間スターラーバー（長さ＝２ｃｍ）で攪拌した。次に、２５ｍＬの乳糖・リン酸緩衝液（精製水２５ｍＬ中に乳糖１水和物を５００ｍｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏを２．２５ｍｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏを１．７５ｍｇ溶解させた水溶液）を加え、スターラーバーにて５分間攪拌後、５０ｍＬメスフラスコに全量を移し、注射用蒸留水を加えて５０ｍＬにメスアップした。
２）クリアランスの大きい注射用製剤を以下の方法で調製した。５０ｍＬガラス製ビーカーに、式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体を３２．９７ｍｇ秤量し、これに０．２５ｍＬの０．０１Ｍ−ＮａＯＨと７．２５ｍＬの注射用蒸留水を加えて混和後、室温で６０分間スターラーバー（長さ＝２ｃｍ）で攪拌した。次に、２５ｍＬの乳糖・リン酸緩衝液（精製水２５ｍＬ中に乳糖１水和物を５００ｍｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏを２．２５ｍｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏを１．７５ｍｇ溶解させた水溶液）を加え、スターラーバーにて５分間攪拌後、５０ｍＬメスフラスコに全量を移した。次に、７．４５ｍＬの０．０１Ｍ−ＮａＯＨを加えて混和し、更に０．０１Ｍ−ＮａＯＨを加えてｐＨを７．４に調整した後、注射用蒸留水を加えて５０ｍＬにメスアップした。
このクリアランスの小さな処方１）と大きな処方２）の２種類の注射用製剤処方について、そのＡＵＣと膜流動性及び円偏光二色性との相関について評価した。
図１に示されるように、リピッドＡ類縁体含有の注射用製剤のラット血中濃度推移は、クリアランスの小さな注射用製剤と大きな注射用製剤では、大きく異なった。また、その膜流動性を示すオーダーパラメーター（Ｓ）は、クリアランスの小さな注射用製剤では０．４９９、クリアランスの大きな注射用製剤では０．６２４であり、有意な差が認められた。
さらに、円偏光二色性（ＣＤ法）によるＣＤ強度は、図２に示されるように、波長２８０ｎｍにおいてＣＤ強度の明確な差異が認められた。以上から、本願発明に係るリピッドＡ類縁体を含有する注射用製剤において、その体内動態の変動を評価する上で、膜流動性及び／又は円偏光二色性評価が有用であることは、明らかである。
実験例２
本願発明に係る注射用製剤の膜流動性及び／又は円偏光二色性の測定・評価とＡＵＣとの相関性
式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体を含有する注射用製剤を１０ロット調製し、そのＣＤ強度（波長＝２８０ｎｍ）及び／又はオーダーパラメーター（Ｓ）とラット静脈内投与時のＡＵＣの相関性を評価した。その結果、図３に示すように、ラットのＡＵＣとＣＤ強度の間には良好な正の相関があり、ＣＤ強度が大きいほど製剤ほどＡＵＣの上昇が認められた。また、図４に示すように、ラットのＡＵＣとオーダーパラメーター（Ｓ）の間には良好な負の相関があり、オーダーパラメーター（Ｓ）が小さい（０に近い）製剤ほどＡＵＣの上昇が認められた。更に、図５に示すように、注射用製剤のＣＤ強度（波長＝２８０ｎｍ）とオーダーパラメーター（Ｓ）との間には良好な負の相関があり、ＣＤ強度が大きくなるにつれてオーダーパラメーター（Ｓ）が小さく（０に近く）なった。
一方、式（ＩＩＩ）で示されるリピッドＡ類縁体を含有する注射用製剤についても数１０ロットを調製し評価した結果、図６に示すようにラットのＡＵＣとオーダーパラメーター（Ｓ）の間には同様に負の相関が認められ、その相関係数は０．８７３であった。また、ラットのＡＵＣと注射用製剤の平均粒径との関係に於いては、平均粒径１０〜２０ｎｍの範囲でＡＵＣの変動が大きく、明確な相関性は認められず（図７）、体内動態の予測評価法としては不十分であった。
以上から、本願発明に係る注射用製剤の膜流動性及び／又は円偏光二色性評価に対する薬物速度論的プロファイル（ＡＵＣ）の良好な相関性が証明された。即ち、膜流動性（オーダーパラメーター（Ｓ））と円偏光性（ＣＤ）は、リピッドＡ類縁体含有注射用製剤の体内動態の予測評価法として、十分に有効であることは明らかである。また、膜流動性及び／又は円偏光性による溶液中での会合状態の評価を特徴とする体内動態が保証された注射用製剤の調製が可能となる。即ち、リピッドＡ類縁体を含有する注射用製剤について、オーダーパラメーター（Ｓ）及び／又は円偏光性（ＣＤ）の値を測定することにより、ＡＵＣが推測可能となるのである。従って、本発明は産業上、利用することができる有用な発明である。
実施例
以下に実施例を挙げ本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるわけではない。
下記に示す実施例１〜１０は、式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体を含有する注射用製剤を調製する際の溶解工程において、使用する水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）濃度を変化させて調製した水性注射剤である。表１に、各実施例製剤のＣＤ強度、オーダーパラメーター（Ｓ）とラット投与時のＡＵＣ値を示した。また、図８に、各実施例製剤での上記溶解工程に使用した水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）濃度とＡＵＣの相関性を示した。水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）濃度が増加するにつれてＡＵＣ及びオーダーパラメーター（Ｓ）が増大したが、０．００１〜０．０１ＭでＡＵＣ及びオーダーパラメーター（Ｓ）値はプラトーとなった。即ち、体内動態の保証された及び／又は予測された式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体注射剤の溶解工程に使用した最適水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）濃度は０．００１〜０．０１Ｍであった。
実施例１
５０ｍＬのガラス製ビーカーに式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体３２．４７ｍｇを秤量し、これに０．０１Ｍ−ＮａＯＨを７．５ｍＬ加えた。これに長さ２ｃｍのスターラーバーを入れ、室温にて６０分間攪拌した（溶解工程に使用した水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）濃度＝０．０１Ｍ）。この溶液に、２５ｍＬの乳糖・燐酸緩衝液（２５ｍＬ中に乳糖１水和物が５００ｍｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏが２．２５ｍｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏが１．７５ｍｇが溶解した水溶液）を加えた。スターラーにて５分間攪拌後、５０ｍＬのメスフラスコに全量を移し、注射用蒸留水を加えて５０ｍＬにメスアップした。この時の溶液のｐＨは７．３９であった。
実施例２
５０ｍＬのガラス製ビーカーに式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体２．２３ｍｇ秤量し、これに０．０１Ｍ−ＮａＯＨを０．７５ｍＬ、注射用蒸留水６．７５ｍＬを加えた。これに長さ２ｃｍのスターラーバーを入れ、室温にて６０分間攪拌した（溶解工程に使用した水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）濃度＝０．０１Ｍ×１／１０）。この溶液に、２５ｍＬの乳糖・燐酸緩衝液（２５ｍＬ中に乳糖１水和物が５００ｍｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏが２．２５ｍｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏが１．７５ｍｇが溶解した水溶液）を加えた。スターラーにて５分間攪拌後、５０ｍＬのメスフラスコに全量を移した。更にメスフラスコに６．７５ｍＬの０．０１Ｍ−ＮａＯＨを加え混和した後、注射用蒸留水を加えて５０ｍＬにメスアップした。この時の溶液のｐＨは７．４１であった。
実施例３
５０ｍＬのガラス製ビーカーに式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体３２．１３ｍｇ秤量し、これに０．０１Ｎ−ＮａＯＨを０．２５ｍＬ、注射用蒸留水７．２５ｍＬを加えた。これに長さ２ｃｍのスターラーバーを入れ、室温にて６０分間攪拌した（溶解工程に使用した水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）濃度＝０．０１Ｍ×１／３０）。この溶液に、２５ｍＬの乳糖・燐酸緩衝液（２５ｍＬ中に乳糖１水和物が５００ｍｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏが２．２５ｍｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏが１．７５ｍｇが溶解した水溶液）を加えた。スターラーにて５分間攪拌後、５０ｍＬのメスフラスコに全量を移した。更にメスフラスコに７．２５ｍＬの０．０１Ｍ−ＮａＯＨを加え混和した後、注射用蒸留水を加えて５０ｍＬにメスアップした。この時の溶液のｐＨは７．４２であった。
実施例４
５０ｍＬのガラス製ビーカーに式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体３２．１６ｍｇ秤量し、これに０．０１Ｍ−ＮａＯＨを０．１２５ｍＬ、注射用蒸留水７．３７５ｍＬを加えた。これに長さ２ｃｍのスターラーバーを入れ、室温にて６０分間攪拌した（溶解工程に使用した水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）濃度＝０．０１Ｍ×１／６０）。この溶液に、２５ｍＬの乳糖・燐酸緩衝液（２５ｍＬ中に乳糖１水和物が５００ｍｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏが２．２５ｍｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏが１．７５ｍｇが溶解した水溶液）を加えた。スターラーにて５分間攪拌後、５０ｍＬのメスフラスコに全量を移した。更にメスフラスコに７．３７５ｍＬの０．０１Ｍ−ＮａＯＨを加え混和した後、注射用蒸留水を加えて５０ｍＬにメスアップした。この時の溶液のｐＨは７．３０であった。
実施例５
５０ｍＬのガラス製ビーカーに式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体３２．６３ｍｇを秤量し、これに０．０１Ｍ−ＮａＯＨを０．１２５ｍＬ、注射用蒸留水７．３７５ｍＬを加えた溶液を５．０ｍＬ加え更に注射用蒸留水２．５ｍＬを加えた。これに長さ２ｃｍのスターラーバーを入れ、室温にて６０分間攪拌した（溶解工程に使用した水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）濃度＝０．０１Ｍ×１／９０）。この溶液に、２５ｍＬの乳糖・燐酸緩衝液（２５ｍＬ中に乳糖１水和物が５００ｍｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏが２．２５ｍｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏが１．７５ｍｇが溶解した水溶液）を加えた。スターラーにて５分間攪拌後、５０ｍＬのメスフラスコに全量を移した。更にメスフラスコに７．４ｍＬの０．０１Ｍ−ＮａＯＨを加え混和し、更に０．０１Ｍ−ＮａＯＨを加えてｐＨを７．４に調整した後、注射用蒸留水を加えて５０ｍＬにメスアップした。この時の溶液のｐＨは７．４２であった。
実施例６
５０ｍＬのガラス製ビーカーに式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体３２．０７ｍｇを秤量し、これに０．０１Ｍ−ＮａＯＨを０．１２５ｍＬ、注射用蒸留水７．３７５ｍＬを加えた溶液を３．７５ｍＬ加え更に注射用蒸留水３．７５ｍＬを加えた。これに長さ２ｃｍのスターラーバーを入れ、室温にて６０分間攪拌した（溶解工程に使用した水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）濃度＝０．０１Ｍ×１／１２０）。この溶液に、２５ｍＬの乳糖・燐酸緩衝液（２５ｍＬ中に乳糖１水和物が５００ｍｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏが２．２５ｍｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏが１．７５ｍｇが溶解した水溶液）を加えた。スターラーにて５分間攪拌後、５０ｍＬのメスフラスコに全量を移した。更にメスフラスコに７．４ｍＬの０．０１Ｎ−ＮａＯＨを加え混和し、更に０．０１Ｍ−ＮａＯＨを加えてｐＨを７．４に調整した後、注射用蒸留水を加えて５０ｍＬにメスアップした。この時の溶液のｐＨは７．４８であった。
実施例７
５０ｍＬのガラス製ビーカーに式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体３２．４３ｍｇを秤量した。これに０．０１Ｍ−ＮａＯＨを０．１２５ｍＬ、注射用蒸留水１４．８７５ｍＬを加えて混和した溶液を５．０ｍＬ加え更に注射用蒸留水２．５ｍＬを加えた。これに長さ２ｃｍのスターラーバーを入れ、室温にて６０分間攪拌した（溶解工程に使用した水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）濃度＝０．０１Ｍ×１／１８０）。この溶液に、２５ｍＬの乳糖・燐酸緩衝液（２５ｍＬ中に乳糖１水和物が５００ｍｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏが２．２５ｍｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏが１．７５ｍｇが溶解した水溶液）を加えた。スターラーにて５分間攪拌後、５０ｍＬのメスフラスコに全量を移した。更にメスフラスコに７．４５ｍＬの０．０１Ｍ−ＮａＯＨを加え混和し、更に０．０１Ｍ−ＮａＯＨを加えてｐＨを７．４に調整した後、注射用蒸留水を加えて５０ｍＬにメスアップした。この時の溶液のｐＨは７．４１であった。
実施例８
５０ｍＬのガラス製ビーカーに式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体３２．８４ｍｇを秤量した。これに０．０１Ｍ−ＮａＯＨを０．１２５ｍＬ、注射用蒸留水１４．８７５ｍＬを加えて混和した溶液を３．７５ｍＬ加え更に注射用蒸留水３．７５ｍＬを加えた。これに長さ２ｃｍのスターラーバーを入れ、室温にて６０分間攪拌した（溶解工程に使用した水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）濃度＝０．０１Ｍ×１／２４０）。この溶液に、２５ｍＬの乳糖・燐酸緩衝液（２５ｍＬ中に乳糖１水和物が５００ｍｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏが２．２５ｍｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏが１．７５ｍｇが溶解した水溶液）を加えた。スターラーにて５分間攪拌後、５０ｍＬのメスフラスコに全量を移した。更にメスフラスコに７．４５ｍＬの０．０１Ｍ−ＮａＯＨを加え混和し、更に０．０１Ｍ−ＮａＯＨを加えてｐＨを７．４に調整した後、注射用蒸留水を加えて５０ｍＬにメスアップした。この時の溶液のｐＨは７．４１であった。
実施例９
５０ｍＬのガラス製ビーカーに式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体３２．３５ｍｇを秤量した。これに０．０１Ｍ−ＮａＯＨを０．２５ｍＬ、注射用蒸留水７．２５ｍＬを加えて混和した溶液を０．７５ｍＬ加え更に注射用蒸留水６．７５ｍＬを加えた。これに長さ２ｃｍのスターラーバーを入れ、室温にて６０分間攪拌した（溶解工程に使用した水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）濃度＝０．０１Ｍ×１／３５０）。この溶液に、２５ｍＬのの乳糖・燐酸緩衝液（２５ｍＬ中に乳糖１水和物が５００ｍｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏが２．２５ｍｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏが１．７５ｍｇが溶解した水溶液）を加えた。スターラーにて５分間攪拌後、５０ｍＬのメスフラスコに全量を移した。更にメスフラスコに７．４５ｍＬの０．０１Ｍ−ＮａＯＨを加え混和し、更に０．０１Ｍ−ＮａＯＨを加えてｐＨを７．４に調整した後、注射用蒸留水を加えて５０ｍＬにメスアップした。この時の溶液のｐＨは７．４１であった。
実施例１０
５０ｍＬのガラス製ビーカーに式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体３２．９７ｍｇを秤量した。これに０．０１Ｍ−ＮａＯＨを０．２５ｍＬ、注射用蒸留水７．２５ｍＬを加えて混和した溶液を０．５ｍＬ加え更に注射用蒸留水７．０ｍＬを加えた。これに長さ２ｃｍのスターラーバーを入れ、室温にて６０分間攪拌した（溶解工程に使用した水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）濃度＝０．０１Ｍ×１／４５０）。この溶液に、２５ｍＬの乳糖・燐酸緩衝液（２５ｍＬ中に乳糖１水和物が５００ｍｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏが２．２５ｍｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏが１．７５ｍｇが溶解した水溶液）を加えた。スターラーにて５分間攪拌後、５０ｍＬのメスフラスコに全量を移した。更にメスフラスコに７．４５ｍＬの０．０１Ｍ−ＮａＯＨを加え混和し、更に０．０１Ｍ−ＮａＯＨを加えてｐＨを７．４に調整した後、注射用蒸留水を加えて５０ｍＬにメスアップした。この時の溶液のｐＨは７．４３であった。
実施例１１〜１６
ガラス製ビーカーに、式（ＩＩＩ）で示されるリピッドＡ類縁体１００ｍｇを秤量した。これに０．０１Ｍ−ＮａＯＨを５０ｍＬ添加し、室温（約２５℃）でスターラー攪拌した。この溶液に、６００ｍＬの乳糖・燐酸緩衝液（注射用蒸留水６００ｍＬ中に乳糖１水和物１００ｇ，Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ０．４５ｇ，ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ０．３５ｇを溶解した水溶液）を加えスターラー攪拌後に、注射用蒸留水を適量加えて１Ｌにメスアップした。この薬液を０．２２μｍフィルターでろ過した後に、そのろ液５．３ｍｌずつをバイアルに充填し、凍結乾燥を行なった。この注射用凍結乾燥製剤バイアルに、注射用蒸留水５ｍＬを加えて復水し、ラット体内動態（ＡＵＣ）、粒子径、膜流動性（オーダーパラメーター（Ｓ）、蛍光異方性ｒ、蛍光偏光度Ｐ）を評価した結果を、表２に示した。
実施例１７〜２１
ガラス製ビーカーに、式（ＩＩＩ）で示されるリピッドＡ類縁体１００ｍｇを秤量した。これに０．０１Ｍ−ＮａＯＨを１５０ｍＬ添加し、室温でスターラー攪拌した。式（ＩＩＩ）で示されるリピッドＡ類縁体によるゲルがなくなったことを目視で確認後に、ガラス製ビーカーをバスタイプソニケーター中で１０℃以下を維持しながら超音波照射を行った。この溶液に、６００ｍＬの乳糖・燐酸緩衝液（注射用蒸留水６００ｍＬ中に乳糖１水和物１００ｇ，Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ０．４５ｇ，ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ０．３５ｇを溶解した水溶液）を加えスターラー攪拌後に、注射用蒸留水を適量加えて１Ｌにメスアップした。この薬液を０．２２μｍフィルターでろ過した後に、そのろ液５．３ｍｌずつをバイアルに充填し、凍結乾燥を行なった。この注射用凍結乾燥製剤バイアルに、注射用蒸留水５ｍＬを加えて復水し、ラット体内動態（ＡＵＣ）、粒子径、膜流動性（オーダーパラメーター（Ｓ）、蛍光異方性ｒ、蛍光偏向度Ｐ）を評価した結果を、表２に示した。
ガラス製ビーカーに式（ＩＩＩ）で示されるリピッドＡ類縁体１００ｍｇを秤量した。これに０．００３Ｍ−ＮａＯＨを５０ｍＬ添加し、５０±５℃でスターラー攪拌した。尚、スターラー攪拌時間は、３，８，１５，３０，９０分間と変化させた。攪拌後の溶液に、６００ｍＬの乳糖・燐酸緩衝液（注射用蒸留水６００ｍＬ中に乳糖１水和物１００ｇ，Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ０．４５ｇ，ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ０．３５ｇを溶解した水溶液）を加えスターラー攪拌後に、注射用蒸留水を適量加えて１Ｌにメスアップした。この薬液を０．２２μｍフィルターでろ過した後に、そのろ液５．３ｍＬずつをバイアルに充填し、凍結乾燥を行なった。この注射用凍結乾燥製剤バイアルに、注射用蒸留水５ｍＬを加えて復水し、ラット体内動態（ＡＵＣ）、粒子径、膜流動性（オーダーパラメーター（Ｓ））、表面荷電を評価した結果を、表３に示した。式（ＩＩＩ）で示されるリピッドＡ類縁体の相転移温度（約３０℃）以上の温度（５０±５℃）の水酸化ナトリウム溶液中での攪拌を行ったため、ＡＵＣは攪拌時間に依存し、攪拌時間が長くなるほどＡＵＣの増加が認められた。また、ＡＵＣが大きくなるほどオーダーパラメーター（Ｓ）が小さくなった。更に、粒子径や表面荷電に関しては、ＡＵＣとの明確な相関は認められなかった。
ガラス製ビーカーに式（ＩＩＩ）で示されるリピッドＡ類縁体１００ｍｇを秤量した。これに０．００３Ｍ−ＮａＯＨを５０ｍＬ添加し、５０±５℃で３０分間のスターラー攪拌を行った。攪拌後の溶液に、６００ｍＬの乳糖・燐酸緩衝液（注射用蒸留水６００ｍＬ中に乳糖１水和物１００ｇ，Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ０．４５ｇ，ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ０．３５ｇを溶解した水溶液）を加えスターラー攪拌後に、注射用蒸留水を適量加えて１Ｌにメスアップした。この薬液を０．２２μｍフィルターでろ過した後に、そのろ液５．３ｍｌずつをバイアルに充填し、凍結乾燥を行なった。この製造初期品と４０℃−７５％相対湿度下での安定性試験品（１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月の保存後の注射用凍結乾燥製剤）について、例数ｎ＝３で各々注射用蒸留水５ｍＬを加えて復水し、膜流動性（オーダーパラメーター（Ｓ））を評価した。その結果を表４に示した。オーダーパラメーター（Ｓ）の測定時の変動は小さく、十分な再現性が確認された。また、初期〜３ヶ月安定性試験品の間では、オーダーパラメーター（Ｓ）及び体内動態の変化は認められず、安定な注射用製剤であることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
図１は、式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体含有注射剤のラット投与（０．６ｍｇ／ｋｇ）時の血中濃度推移を示すグラフである。
図２は、式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体含有注射剤のＣＤスペクトル（円偏光二色性分光法評価によるスペクトル）を示すグラフである。
図３は、式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体含有注射剤のＣＤ強度とＡＵＣ（ラット投与時）の相関性を示すグラフである。
図４は、式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体含有注射剤のオーダーパラメーター（Ｓ）とＡＵＣ（ラット投与時）の相関性を示すグラフである。
図５は、式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体含有注射剤のＣＤ強度とオーダーパラメーター（Ｓ）の相関性を示すグラフである。
図６は、式（ＩＩＩ）で示されるリピッドＡ類縁体含有注射剤のオーダーパラメーター（Ｓ）とＡＵＣ（ラット投与時）の相関性を示すグラフである。
図７は、式（ＩＩＩ）で示されるリピッドＡ類縁体含有注射剤の平均粒径とＡＵＣ（ラット投与時）の相関性を示すグラフである。
図８は、式（ＩＶ）で示されるリピッドＡ類縁体含有注射剤の溶解工程における水酸化ナトリウム濃度とＡＵＣ（ラット投与時）の相関性を示すグラフである。
Claims (12)
- リピッドＡ類縁体またはその薬理学的に許容できる塩を含有する注射用製剤において、膜流動性及び／又は円偏光性を測定することを特徴とするリピッドＡ類縁体の体内動態の予測方法。
- 注射用製剤を評価するために行う請求項１に記載した予測方法。
- 一定の体内動態を示す注射用製剤を得るための品質評価に用いる請求項１に記載した予測方法。
- 注射用製剤の製造工程において行う請求項１に記載した予測方法。
- 膜流動性の測定法が、オーダーパラメーター（Ｓ）及び／又は蛍光偏光度（Ｐ）及び／又は蛍光異方性（ｒ）をパラメーターとする蛍光プローブ法である請求項１に記載した予測方法。
- 注射用製剤は、リピッドＡ類縁体またはその薬理学的に許容できる塩をアルカリ性水溶液に溶解し、次いで緩衝液を添加して製造され、直径３０ｎｍ以下の会合体を含有する請求項１に記載した予測方法。
- 注射用製剤が、水性注射剤又は凍結乾燥製剤である請求項１に記載した予測方法。
- リピッドＡ類縁体またはその薬理学的に許容できる塩が、次式（Ｉ）で表される化合物またはその薬理学的に許容できる塩である請求項１に記載した予測方法。
式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３又はＲ４の少なくとも一つは、
（式中、各ＬはＯ，Ｎ又はＣであり；各ＭはＯ又はＮであり；各Ｅは、独立して０から１４までの整数であり；各Ｇは、独立してＮ，Ｏ，Ｓ，ＳＯ又はＳＯ２であり；各ｍは、独立して０から１４までの整数であり；各ｎは、独立して、０から１４までの整数であり；各ｐは独立して０から１０までの整数であり；各ｑは、独立して０から１０までの整数である）であり；
残りのＲ１，Ｒ２，Ｒ３及びＲ４の各々は、独立して、
（式中、各ＬはＯ，Ｎ又はＣであり；各ＭはＯ又はＮであり；各ｘは、独立して、０から１４までの整数であり；各ｙは、独立して、０から１４までの整数であり；各ｚは、独立して０から１０までの整数であり；各Ｇは、独立して、Ｎ，Ｏ，Ｓ，ＳＯ又はＳＯ２である）であり；
各Ａ１とＡ２は、独立して、Ｈ，ＯＨ，ＯＣＨ３、
（式中、各ｄは、独立して、０から５までの整数であり；各ｆは、独立して、０から５までの整数であり；各ｇは、独立して、０から５までの整数であり；各Ａ３は、独立して、
（式中、各ｊは、独立して、０から１４までの整数である）である）であり；ＸはＨ，（ＣＨ２）ｔ，ＣＨ３，（ＣＨ２）ｔＯＨ，（ＣＨ２）ｔＯ（ＣＨ２）ｖＣＨ３（ＣＨ２）ｔＯＰＯ（ＯＨ）２，（ＣＨ２）ｔ，−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｖＣＨ３，（ＣＨ２）ｔ−Ｏ−Ｒ５，
（式中、各ｔとｖは、それぞれ独立して、０から１４までの整数であり；Ｒ５はＲ１〜Ｒ４に対する上記定義のいずれかである）であり；
Ｙは、Ｈ，ＯＨ，Ｏ（ＣＨ２）ｗＣＨ３，ハロゲン原子、
（式中、ｗは０から１４までの整数である）である。 - リピッドＡ類縁体またはその薬理学的に許容できる塩が、次式（II）で表される化合物またはその薬理学的に許容できる塩である請求項１に記載した予測方法。
Ｒ2は直鎖又は分枝状の炭素数５〜１５のアルキル基であり；
Ｒ3は、
Ｒ4は直鎖又は分枝の炭素数４〜２０のアルキル基、及び
Ｒ5は水素原子、Ｊ’、−Ｊ’−ＯＨ、−Ｊ’−Ｏ−Ｋ’、−Ｊ’−Ｏ−Ｋ’−ＯＨ及び−Ｊ’−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）2（式中Ｊ’及びＫ’は、それぞれ直鎖又は分枝の炭素数１〜５のアルキル基である）から選ばれる基であり；
Ｒ6は水酸基、ハロゲン原子、炭素数１〜５のアルコキシ基及び炭素数１〜５のアシルオキシ基からなる群から選ばれる基であり；
Ａ1及びＡ2は、それぞれ独立して、
- リピッドＡ類縁体が次式（ＩＩＩ）で表される化合物である請求項１に記載した予測方法。
- リピッドＡ類縁体が次式（ＩＶ）で表される化合物である請求項１に記載した予測方法。
- リピッドＡ類縁体またはその薬理学的に許容できる塩が、脂質二分子膜小胞体またはミセルの会合体構造を有している請求項１に記載した予測方法。
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