KR20100094693A - 머드의 보좌제로서의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 머드(mud)를 유효성분으로 포함하는 보좌제(adjuvant) 조성물에 관한 것으로, 머드는 항원과 함께 사용될 경우 세포성 면역과 체액성 면역을 모두 유도하는 보좌제로서, 예방 및 치료용 백신의 보좌제로서 매우 적합하다.

머드, 보좌제, 소 네오스포라병, 백신, 예방약, 면역반응

Description

머드의 보좌제로서의 용도{Usage of Mud as Adjuvant}

본 발명은 머드를 유효성분으로 포함하는 보좌제 조성물, 이 조성물과 항원을 함유하는 백신 조성물 및 머드를 보좌제로 사용하여 항원에 의해 유도되는 면역반응을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

면역반응은 이물질이 몸 안에 들어왔을 때 면역세포가 이를 항원으로 인식하여 일어나는 반응이다. APC(Antigen Presenting Cell)는 이러한 이물질을 세포 속에 삼킨 후에, 적당한 크기로 소화해서 MHC Class I 또는 MHC Class II와 함께 세포 표면에 제시한다. 이렇게 제시된 항원(eitope)은 면역세포 중 특히 CD4 T 세포, CD8 T 세포에 존재하는 독특한 수용체를 통해 항원으로 인식되는데, 이 때 면역세포와 APC가 동시에 활성화되어 보조 신호전달을 일으키는 Costimulatory Molecule들이 유도되고 항원의 성격에 따라 사이토카인을 만들게 된다. 이물질이 아닌 자기 몸의 성분이 항원으로 제시되었을 경우에는 필요한 Costimulatory Molecule이 유도되지 않으며, 면역반응은 무산(anergy)된다. 또한, APC는 톨 유사 수용체(Toll like receptor)와 같은 감염된 미생물 고유의 분자형태를 인식하는 수 용체(Pathogen Associated Molecular Pattern Recognition Receptor)를 가지고 있어 항원의 분자형태를 인식하고, 신호 정보를 발함으로써 특수한 싸이토카인을 생성해서 면역반응의 성격, 즉 세포성 면역반응을 강하게 일으키느냐 또는 체액성 면역반응을 강하게 일으키느냐를 결정한다.

일반적으로 면역체계의 자극을 통해서 항원에 대한 특이적인 반응을 유발하여 다양한 질병을 예방 또는 치료하는 물질을 백신이라고 한다. 백신의 경우, 크게 예방용 백신(prophylactic vaccine)과 치료용 백신(therapeutic vaccine)으로 구분된다. 예방용 백신은 병원균에 노출되기 전에 미리 접종하여, 이후에 그 병원균이 체내에 침투하더라도 면역체계를 활성화하여, 질병을 예방할 수 있게 만들어주는 백신을 말한다. 반면, 치료용 백신은 대부분 예방의 기능도 가지고 있기는 하지만, 원래 질병에 걸리기 전의 예방을 목적으로 하기보다는 이미 감염된 환자를 치료할 목적으로 만든 백신을 말한다. 대부분의 백신은 항원에 의한 면역반응을 상승시킬 수 있는 보좌제를 포함한다.

현재 가장 일반적으로 사용되는 보좌제는 알루미늄 화합물(황산알루미늄, 수산화알루미늄, 인산알루미늄 등)이다. 알루미늄 화합물은 체액성 면역반응을 유도하여 항원 특이적인 방어용 항체를 생산하는 기능을 하며, 주로 예방 백신용 보좌제로 사용된다. 그러나, 알루미늄 화합물은 체액성 면역반응을 잘 유도하는 반면 세포성 면역반응의 유도 효율이 낮다는 한계를 가진다. 이를 개선하고자, 세포 톡신(콜라레톡신 등), 계면활성 작용물질(사포닌류, 고급 지방산 등), 미생물 또는 식물성분(BCG, 무라밀펩타이드), 사이토카인류(인터루킨 등), 기능 단백질(heat shock potein 등), 합성 폴리음이온과 폴리양이온 등의 새로운 보좌제의 연구와 개발이 진행되었다. 그러나, 여전히 체액성 면역반응과 세포성 면역반응을 모두 유도할 수 있는 효과적이고 안전한 보좌제의 개발이 요구되고 있다.

본 발명자는 체액성 면역반응과 세포성 면역반응을 모두 유도할 수 있는 보좌제를 개발하기 위해 주력하던 중 소 네오스포라 캐니눔(Neospora caninum) 항원과 천연물질인 머드를 함유하는 보좌제 조성물을 혼합하여 백신을 제조하고 소에게 접종한 결과, 세포성 면역을 생성시키고, 체액성 면역을 유지시킴으로써 네오스포라병을 효과적으로 예방할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명은 머드를 유효성분으로 포함하는 보좌제 조성물을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 보좌제 조성물과 항원을 포함하는 백신 조성물을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 머드를 보좌제로 사용하여 항원에 의해 유도되는 면역반응을 증가시키는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 머드를 포함하는 보좌제 조성물에 관한 것으로서, 본 발명에서는 'CpM'이라고 임의적으로 명명하기도 한다.

본 발명에서 '보좌제(adjuvant)'란, 그 자신은 백신의 면역원에 대한 특이적인 면역반응을 유발할 수 없지만, 항원과 함께 작용하였을 때 면역계를 자극하여 면역반응을 상승시키는 작용을 하는 기질 또는 첨가물을 의미한다.

본 발명에서 유효성분 '머드(Mud)'는 '물기가 있어 질적한 흙'이라는 사전적 의미를 가지고 있으며, 보통 진흙을 함유한 점토성 물질과 동식물들의 분해산물, 그리고 토양, 미네랄 등이 퇴적되어 오랜 세월동안 지질학적, 화학적 작용을 받고 미생물의 분해 작용을 받아 형성된 것이다.

머드에는 여러 가지 종류가 있지만, 그 중에서도 이스라엘 사해산, 캐나다 콜롬비아 해안의 빙하토, 러시아 바이칼, 캘리포니아 클레어 머드, 뉴질랜드 화산 머드가 많이 알려져 있으며, 우리나라에서는 보령 머드가 유명하다. 본 발명에서는 전술된 바와 같은 당업계에 알려져 있는 모든 머드를 사용할 수 있다.

본 발명에서 머드는 100~400 mesh를 가지는 것이 바람직하다. 또한, 표면에 0.2 내지 0.3㎛의 구멍을 다수 보유하는 것일 수 있다.

본 발명의 보좌제 조성물에, 머드는 조성물의 총 중량을 기준으로 0.1 내지 50중량%, 바람직하게는 1 내지 20중량%, 보다 바람직하게는 5 내지 10중량%로 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 머드를 함유하는 보좌제 조성물과 함께 사용될 수 있는 '항원'은 특별히 제한되지 않는다. 항원은 천연 또는 재조합 정제 항원일 수 있으며, 바이러스, 박테리아, 원충류 및 진균류를 비롯한 생, 약독화 또는 사멸된 병원체, 병원체로부터 유래한 단백질, 펩타이드, 지질 또는 탄수화물 항원이 포함될 수 있다. 바람직하게는 원충류이고, 보다 바람직하게는 소의 질병을 유발하는 원충류이다.

상기 소의 질병을 유발하는 원충류로는 바베시아(Babesia) 속 원충(B. ovata, B. bigemina, B. major, B. bovis, B. divergens), 타이레리아(Theileria) 속 원충(T, parva, T annulata, T. sergenti, T. mutans), 트리코모나스병 원충(Trichomonas fetus), 트리파노소마(Trypanosoma) 속 원충(T. vivax, T. congolense, T. brucei, T. evansi), 콕시듐병 원충(Eimeria zurnii, E. bovis), 네오스포라병 원충(Neospora caninum)(도 2 참조) 등을 예시할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물에서, 머드와 항원의 혼합비는 당업자에 의해 결정될 수 있다. 머드와 항원은 1~100:1, 바람직하게는 1~10:1의 비율로 혼합될 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하고, 인체 또는 수의용으로 제형화되어 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 경로는 경구, 복강, 정맥, 근육, 피하, 피내 등의 경로로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 주사제로 제형화하여 투여할 수 있다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성용제, 식물유, 고급 지방산 에스테르(예, 올레인산에틸 등), 알코올류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 성장을 저지하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레 솔, 벤질알코올 등) 등의 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 약제학적 유효량으로 투여한다. 용어 "약제학적 유효량"이란 백신효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 투여될 항원에 따라 달라지며, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 결정될 수 있으며, 1회 내지 수회 투여 가능하다.

본 발명은 머드를 보좌제로 사용하여 항원에 의해 유도되는 면역반응을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 대상 동물은 사람을 제외한 가금류, 돼지, 소, 염소, 양, 말, 산양, 젖소, 고양이 또는 개일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 머드를 함유한 보좌제 조성물은 항원에 의한 세포성 면역을 생성시키고, 체액성 면역을 유지시킴으로써 질병을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

또한, 머드는 생체에 안전하면서도 종래에 보좌제로서 이용된 물질에 비하여 저렴하기 때문에 비용 효율적인 효과도 기대할 수 있다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: CpM의 주사현미경 사진

보령 갯벌에서 채취한 머드(Mud)를 마쇄하여 100~400 mesh로 걸러서 이를 멸균한 후 주사현미경을 이용하여 관찰하였다. 머드의 표면에는 수많은 지름이 약0.2~0.3㎛인 작은 구멍들이 존재하는 것으로 확인되었다(도 1).

실시예 2: CpM 안정성 및 안전성 실험

2-1. CpM 주사

실험동물 토끼를 이용하여 CpM (머드와 PBS의 혼합물)의 안전성 실험을 실시하였다. 10ml의 PBS에 Mud를 0.1g, 0.5g, 2g, 5g를 각각 넣어 1%, 5%, 20%, 50%의 Mud를 만들어 2ml의 양을 토끼에 피하 주사하였다.

2-2. 주사부위에 대한 CpM의 흡수성 측정을 위한 조직검사

접종 1주일 후에 토끼의 주사부위의 조직을 채취하여 조직절편을 만들어 검경하였다(도 3). 5%의 Mud를 피하 주사한 근육조직은 염증반응이 일어나지 않아 정상조직과 같았다. 20%의 Mud를 피하 주사한 근육조직은 5%의 Mud를 접종한 조직보다 세포 과다형성(cell hyperplasia) 소견이 조금 보였으나, 정상조직과 거의 같 았다. 50%의 Mud를 접종한 조직은 granulomatus panniculitis의 소견을 보였고, 가운데 흡수되지 않은 Mud와 염증세포도 관찰되었다.

2-3. 실험동물 저빌에 대한 CpM 안전성 조사

실험동물 저빌에 대한 CpM의 안전성 실험을 수행하였다. 10%, 20% 농도의 CpM을 저빌에 피하로 주사하여 안전성을 조사한 결과 보좌제로서의 안전성이 확인되었다.

실시예 3: CpM을 이용한 백신 제조 및 그 백신의 안전성 조사

3-1. 백신의 안전성 조사

CpM으로 제조된 백신의 안전성 실험을 수행하였다. 보좌제 PBS로 만든 백신과 보좌제 CpM 10%로 만든 백신 400㎍을 저빌 8마리에 피하 주사한 결과 백신이 안전함을 확인하였다.

3-2. 목적 동물 소에 대한 백신의 효과 실험

앞서 제조한 백신을 목적동물 소에 접종하여 백신 효과 실험을 수행하였다. 실험 설계는 종부 전 백신 투여군과 종부 후 백신 투여군으로 나눠서 진행하였고 실험 설계는 아래 표 3과 같다. 종부 전 백신 투여군 28마리, 종부 후 백신 투여군 26마리, 그리고 대조군 8마리로 실험을 수행하였다. 원충주 NC-Kr2의 원충을 BEI로 처리하여 수득한 단백질 450mg과 보좌제 대조군으로 50% IMS1313, 폴리젠(polygen)을 사용하여 만든 백신 또는 10% CpM을 사용하여 만든 백신을 투여하였다. 종부 전 백신 투여군은 1차 백신을 투여한 다음 한달 후에 2차 백신을 투여하였다. 20일 후 발정동기화를 유도하고 10일 후에 종부시킨 다음 종부 10주 후에 공격접종을 하였다. 종부 후 백신투여군은 종부 1주일 후에 1차 백신을 투여하였고, 종부 3주 후에 2차 백신을 투여하였다. 그리고 종부 15주 후에 공격접종을 실시하였다. 대조군은 종부 후 15주에 공격접종을 실시하였다.

3-3. 목적 동물 소에 대한 백신의 항체가 조사

앞서 제조한 백신을 목적동물 소에 접종한 후 네오스포라에 대한 항체형성검사를 위하여 IFA로 항체역가를 검사한 결과 대부분의 접종된 소에서 네오스포라 항체 형성을 확인하였고, 강한 개체는 x25600배까지 항체가 검출되었다(도 4).

3-4. 목적동물 소에 대한 백신의 효과 실험 결과

목적동물 소에 대한 백신의 효과 실험에서 보좌제 폴리엔을 사용한 종부전 백신군은 5마리 중 4마리가 임신이 확인되었고 2마리가 유산하여 50%의 방어율을 보였고, 보좌제 IMS1313을 사용한 종부전 백신군은 13마리 중 11마리의 임신을 확인하였고 그 중 10마리 모두 유산을 하지 않아 97%의 방어율을 보였다. 보좌제 CpM을 사용한 종부전 백신군은 10마리 중 9마리가 임신을 하였고 2마리가 유산을 하여 78%의 방어율을 보였다. 보좌제 폴리엔을 사용한 종부후 백신군은 5마리에서 4마리가 임신이 확인되었고 그 중 2마리가 유산하여 50%의 방어율을 보였고, 보좌제 IMS1313을 사용한 종부후 백신군은 13마리 중 11마리의 임신을 확인하였고 그 중 3마리가 유산하여 73%의 방어율을 보였다. 보좌제 CpM을 사용한 종부후 백신군은 8마리 중 7마리가 임신을 하였고 1마리가 유산을 하여 86%의 방어율을 보였다. 비백신공격군(대조군)은 8마리 모두 임신을 확인하였고 1마리만이 정상분만하여 22%의 방어율을 보았다. 위 결과를 보아 보좌제 CpM을 사용한 소 네오스포라 예방용 백신이 현재 시판되어 사용하는 보좌제 폴리엔보다는 더 높은 방어율을 보이고 보좌제 IMS1313과의 큰 효과 차이를 보이지 않아 보좌제로서의 CpM의 효과를 인정할 수 있었다.

도 1은 천연물질 머드를 주사현미경으로 관찰한 도면을 나타낸 것이다(a: x45,000, b: x9,500).

도 2는 vero 세포를 깨고 나온 네오스포라 원충의 세포 배양 후 그람 염색하여 나타낸 도면이다(x1,000).

도 3은 토끼에 CpM 주사부위에 대한 조직 검경 결과를 나타낸 것이다(a: 5%의 Mud, b:10%의 Mud, c와 d: 20%의 Mud, e와 f: 50%의 Mud).

도 4a는 소 종부전 백신군에 대한 네오스포라 항체 형성 검사를 한 것을 나 타내는 그래프이다.

도 4b는 소 종부후 백신군에 대한 네오스포라 항체 형성 검사를 한 것을 나타내는 그래프이다.

Claims (9)

1. 머드를 유효성분으로 포함하는 보좌제 조성물.
2. 제 1항에 있어서,

   상기 머드는 100~400 mesh를 가지는 것을 특징으로 하는 보좌제 조성물.
3. 제 1항에 있어서,

   상기 머드는 표면에 0.2 내지 0.3㎛의 구멍을 보유하는 것을 특징으로 하는 보좌제 조성물.
4. 제 1항에 있어서,

   상기 머드는 0.1 내지 50 중량% 포함되는 것을 특징으로 하는 보좌제 조성물.
5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 따른 보좌제 조성물과 항원을 포함하는 백신 조성물.
6. 제 5항에 있어서,

   상기 항원은 네오스포라 카니눔(neospora caninum)인 것을 특징으로 하는 백 신 조성물.
7. 제 5항에 있어서,

   주사제로 제형화되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
8. 머드를 보좌제로 사용하여 항원에 의해 유도되는 면역반응을 증가시키는 방법.
9. 제 8항에 있어서,

   대상 동물은 가금류, 돼지, 소, 염소, 양, 말, 산양, 젖소, 고양이 또는 개인 것을 특징으로 하는 방법.

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