CN116076713A - 一种协同改善皮肤水分与炎症的食用植物酵素组合物 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了一种协同改善皮肤水分与炎症的食用植物酵素组合物。组合物包含食用植物酵素和槐花，食用植物酵素和槐花的重量比为7:2‑29:2。组合物用于食品或保健食品领域，主要使用剂型为口服液、饮料、软糖，主要通过直接口服。本发明的组合物可以协同改善皮肤水分与炎症。

Description

一种协同改善皮肤水分与炎症的食用植物酵素组合物
技术领域
本发明属于功能性食品领域，特别涉及一种食用植物酵素组合物的制备及其应用，该组合物可用于饮品、饮料、果冻、凝胶糖果等功能性食品的生产。
背景技术
植物酵素是以新鲜蔬菜、水果、药食同源中药等植物为原料，经过榨汁或萃取等一系列工艺后，再添加酵母菌、乳酸菌等发酵菌株进行发酵所产生的含有丰富的糖类、有机酸、矿物质、维生素、酚类、萜类等营养成分以及一些重要的酶类生物活性物质的混合发酵液。植物酵素通常具有帮助人体改善胃肠功能，促进细胞营养吸收，激活细胞活力，中和体内过多自由基，提高人体免疫力的功效。
植物酵素被广泛用于改善消化健康和慢性疾病，但是在口服改善皮肤健康方向上少有报道。
中国专利CN105211863A涉及一种制作姜枣淮山酵素的组合物及其姜枣淮山酵素。该专利声称提供一种具有清肠通便、美容养颜、增强抵抗力和减肥瘦身功能的制作姜枣淮山酵素的组合物及其姜枣淮山酵素。
中国专利CN105726383A涉及一种无菌酵素抗痘露制备方法，并且声称该无菌酵素抗痘露制备方法将水果皮、丁香、桂皮和薄荷叶进行发酵后得到有营养成分的酵素，不仅能够保护皮肤，而且还能抗菌，并且没有副作用。
中国专利CN111956536A涉及刺果番荔枝发酵物在制备组合物中的用途，并且声称该刺果番荔枝发酵物促进胶原蛋白紧致，抑制蛋白质醣化，促进特定基因的表达，及/或抑制黑色素生成相关基因MITF的表达，因此有助于推迟皮肤老化现象。
中国专利CN1931269B涉及含有芦丁的药物组合物，并且声称组合物可用于治疗和/或预防代谢综合征、糖尿病及其并发症、心脑血管疾病、老年痴呆症、高脂血症，以及用于预防心脑血管疾病的复发及防止血管成形术后再狭窄。还可以用于制备具有辅助降血脂功能、辅助降血糖功能、辅助降血压功能、抗氧化功能、辅助改善记忆功能的功能性保健品及用于具备抗氧化功效的化妆品中。
本领域中需要扩展植物酵素功能的组合物。
发明内容
发明人基于以下的发现：食用植物酵素如荔枝酵素和槐花的组合物可以协同改善皮肤炎症或者协同增加皮肤保湿。将荔枝发酵液与槐花结合，协同增加皮肤抗炎和保湿的研究没有被报道。该协同配方的优点在于组合物可在低剂量下达到高剂量单一物料的效果，该优点可在扩宽物料的剂型应用范围、降低成本、节约资源等多个角度体现应用价值。该组合物发挥协同功效的原理在于靶点互补，食用植物酵素如荔枝发酵液和槐花从不同的靶点来实现皮肤的抗炎和/或保湿功能。两个物料的靶点是互补的；进而做到全面覆盖靶点、协同提升功效的作用。在本文中，组合物可以用于美容或护肤，或者辅助用于美容或护肤，或者可以用作食品或保健品。
一方面，本发明提供了食用植物酵素组合物，所述食用植物酵素组合物包含食用植物酵素和槐花，食用植物酵素和槐花的重量比为7:2-29:2。
在一个实施方案中，食用植物酵素为荔枝酵素。
在一个实施方案中，食用植物酵素为液态。
在一个实施方案中，槐花包含不小于6wt％的芦丁。
在一个实施方案中，所述组合物为口服组合物。在一个实施方案中，口服组合物为口服液、饮料或软糖。
在一个实施方案中，荔枝酵素通过二级发酵产生，二级发酵包括酵母菌与乳酸菌的混合菌剂密封静置发酵，然后通过醋酸菌静置或通气培养得到。
一方面，本发明提供了皮肤保湿组合物，其包含本文所述的食用植物酵素组合物。
在一个实施方案中，皮肤保湿组合物还包含透明质酸钠、抗性糊精和低聚果糖中的一种或多种。
一方面，本发明提供了药物组合物或保健组合物，其本文所述的食用植物酵素组合物和药学或保健可接受的赋形剂。
一方面，本发明提供了在受试者中进行皮肤保湿的方法，该方法包括对受试者施用本文所述的食用植物酵素组合物或皮肤保湿组合物。
一方面，本发明提供了在受试者中保持和/或改善皮肤健康的方法，该方法包括对受试者施用本文所述的食用植物酵素组合物或皮肤保湿组合物。
一方面，本发明提供了在受试者中改善皮肤炎症的非治疗目的的方法，该方法包括对受试者施用本文所述的食用植物酵素组合物或皮肤保湿组合物。
在本文的各个方法中，施用可以是口服施用。
一方面，本发明提供了本文所述的食用植物酵素组合物或药物组合物在制备改善皮肤炎症的药物或保健品中的用途。在一个实施方案中，药物或保健品是口服药物或保健品。
本发明的优点包括：
(1)扩宽食用植物酵素产品在皮肤炎症或保湿保健的功能方向的应用；
(2)本文所述的组合物可以协同改善皮肤炎症；
(3)本文所述的组合物中可以协同增加皮肤水分；
(4)现有的荔枝酵素/荔枝发酵液针对补水、抗炎等具体功能的公开文献较少，另外槐花针对补水的功能也是缺失的。有文献报道(CN109820752B)槐花中的芦丁甚至在直接作用于皮肤的时候有反向的作用，芦丁能够将保湿剂中吸收的水分再次排出，进而造成皮肤的缺水等问题。
附图说明
图1显示了HA标准品母液稀释过程。
图2显示了透明质酸钠标准曲线。
图3显示了一氧化氮标准曲线。
图4显示了空白组、槐花组、荔枝酵素液组、组合物1(槐花：荔枝发酵液＝2:7)、组合物2(槐花：荔枝发酵液＝1:7)、组合物3(槐花：荔枝发酵液＝2:29)、组合物4(槐花：荔枝发酵液＝1:3)、组合物5(槐花：荔枝发酵液＝1:15)的透明质酸生成实验数据的柱状图。
图5显示了空白组、桂花组、荔枝酵素液组、桂花荔枝发酵液组合物(桂花：荔枝发酵液＝1:5)的透明质酸生成实验数据的柱状图。
图6显示了槐花组、荔枝酵素液组、组合物1(槐花：荔枝发酵液＝2:7)、组合物2(槐花：荔枝发酵液＝1:7)、组合物3(槐花：荔枝发酵液＝2:29)、组合物4(槐花：荔枝发酵液＝1:3)、组合物5(槐花：荔枝发酵液＝1:15)的NO抑制率数据的柱状图。
图7显示了桂花组、荔枝酵素液组、桂花荔枝发酵液组合物(桂花：荔枝发酵液＝1:7)的NO抑制率数据的柱状图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为了进一步说明本发明的特征和优点，而不是对发明权利要求的限制。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。虽然相信本领域普通技术人员充分了解以下术语，但仍陈述以下定义以有助于说明本发明所公开的主题。
如本文所使用，术语“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，并且是包括端点在内或是开放式的，并且不排除额外的未叙述的要素或方法步骤。“包含”是权利要求语言中使用的技术术语，意思指存在所述要素，但也可以增加其它要素并且仍形成在所述权利要求范围内的构造或方法。
如本文中所使用，“食用植物酵素”是指以可用于食品加工的植物为主要原料，添加或不添加辅料，经微生物发酵制得的含有特定生物活性成分可供人类食用的酵素产品。中华人民共和国轻工行业标准QB/T 5323-2018提供了食用植物酵素的特征性指标。食用植物酵素可以为液态、半固态或固态。对于液态食用植物酵素，总酸以乳酸计(g/100g)≥0.8；游离氨基酸(mg/100g)≥33；有机酸以乳酸计(g/100g)≥660；乳酸(mg/kg)≥550；粗多糖(g/100g)≥0.1；γ-氨基丁酸(mg/kg)≥0.03；多酚(mg/g)≥0.5；SOD酶活性≥15U/L。对于半固态，总酸以乳酸计(g/100g)≥1.1；游离氨基酸(mg/100g)≥35；有机酸以乳酸计(g/100g)≥900；乳酸(mg/kg)≥800；粗多糖(g/100g)≥0.15；γ-氨基丁酸(mg/kg)≥0.039；多酚(mg/g)≥0.6；SOD酶活性≥20U/L。对于固态，总酸以乳酸计(g/100g)≥2.4；游离氨基酸(mg/100g)≥97；有机酸以乳酸计(g/100g)≥6400；乳酸(mg/kg)≥1150；粗多糖(g/100g)≥2.8；γ-氨基丁酸(mg/kg)≥0.06；多酚(mg/g)≥1.4；SOD酶活性≥30U/L。
食用植物酵素可以含有发酵菌株，例如乳酸菌和/或酵母菌。或者，食用植物酵素可以经过灭菌而不包含发酵菌株。食用植物酵素可以是荔枝酵素。
如本文中所使用，“荔枝酵素”是以荔枝为原料，经过微生物发酵得到的含有特定生物活性成分的酵素。本文中的荔枝酵素可以满足上述食用植物酵素的相关标准。荔枝酵素可以从荔枝果液和/或荔枝果渣经过微生物发酵产生。微生物可以包含酵母菌、乳酸菌和醋酸菌中的1种、2种或3种。酵母菌可以为异常汉逊酵母、清酒酵母、鲁氏酵母、面包酵母、威尔酵母、毕赤酵母或胶红酵母中的一种或多种。乳酸菌可以为植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、清酒乳杆菌、干酪乳杆菌、格氏乳杆菌或副干酪乳杆菌中的一种或多种醋酸菌为巴氏醋杆菌、醋酸醋杆菌、加纳醋杆菌、恶臭醋酸菌或醋化醋杆菌中的一种或多种。荔枝酵素可以通过二级发酵产生。二级发酵可以包括酵母菌与乳酸菌的混合菌剂(例如密封静置)的第一级发酵。二级发酵可以包括通过醋酸菌(例如静置或通气培养)的第二级发酵。荔枝酵素可以为例如中国发明专利申请号202210565739.1，发明名称“荔枝酵素、其制备方法和用途”的中国发明专利中提到的荔枝酵素。由于该专利中的荔枝酵素相对于其他植物酵素具有更好的抗炎效果，因此本发明的包含荔枝酵素的组合物可能在皮肤抗炎或保湿上比包含其他植物酵素的组合物更好的协同效果。
例如，荔枝酵素可以通过如下的方法制备，所述方法包括(1)一级发酵，其包括在荔枝果液和荔枝果渣中添加第一碳源，接种第一菌剂，于20-45℃密封静置发酵24-96小时，其中第一菌剂是酵母菌与乳酸菌的混合菌剂；(2)对一级发酵后的产物进行挤压和过滤，获得一级发酵滤液；和(3)二级发酵，其包括在一级发酵滤液中添加第二碳源，接种第二菌剂，15-40℃静置或通气培养3-15天以得到二级发酵液，其中第二菌剂是醋酸菌；(4)对二级发酵液进行过滤、灭菌以得到荔枝酵素。在一个实施方案中，方法包括对荔枝果进行清洗和压榨的前处理步骤。在一个实施方案中，第一碳源为果糖、蔗糖、红糖、麦芽糖、阿拉伯糖中的一种或多种。在一个实施方案中，第一碳源的添加量为0-5wt％。在一个实施方案中，酵母菌为异常汉逊酵母、清酒酵母、鲁氏酵母、面包酵母、威尔酵母、毕赤酵母或胶红酵母中的一种或多种。优选地，酵母菌为异常汉逊酵母、清酒酵母、面包酵母中的一种或多种。在一个实施方案中，乳酸菌为植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、清酒乳杆菌、干酪乳杆菌、格氏乳杆菌或副干酪乳杆菌中的一种或多种。在一个实施方案中，酵母菌:乳酸菌的重量比为50:1-500:1。优选地，酵母菌：乳酸菌的重量比为300:1-500:1。在一个实施方案中，第一菌剂的添加量为荔枝总质量的0.1‰-10‰。在一个实施方案中，第二碳源为乳糖、赤砂糖、葡萄糖、糖蜜或蜂蜜中的一种或多种。在一个实施方案中，第二碳源的添加量为一级发酵滤液总质量的1％-20％。在一个实施方案中，第二菌剂为巴氏醋杆菌、醋酸醋杆菌、加纳醋杆菌、恶臭醋酸菌或醋化醋杆菌中的一种或多种。在一个实施方案中，第二菌剂的添加量为一级发酵滤液总质量的0.1‰-10‰。在一个实施方案中，静置培养为8层纱布封口静置培养。在一个实施方案中，通气培养的通气量为0.1-20mL/min/mL发酵液。
在一个实施方案中，第一菌剂为酵母菌:乳酸菌为400:1；酵母菌为清酒酵母；乳酸菌为副干酪乳杆菌:罗伊氏乳杆菌:格氏乳杆菌为1:1:1。在一个实施方案中，第一菌剂的添加量为荔枝总质量的0.9‰。在一个实施方案中，第一菌剂为酵母菌:乳酸菌为100:1；酵母菌为面包酵母:毕赤酵母:鲁氏酵母为1:1:1；乳酸菌为植物乳杆菌:干酪乳杆菌:罗伊氏乳杆菌为1:1:1。在一个实施方案中，第一菌剂的添加量为荔枝总质量的5‰。在一个实施方案中，第一菌剂为酵母菌:乳酸菌为50:1；酵母菌为威尔酵母:胶红酵母:鲁氏酵母为1:1:1；乳酸菌为清酒乳杆菌:干酪乳杆菌为1:1。在一个实施方案中，第一菌剂的添加量为荔枝总质量的0.1‰。在一个实施方案中，第一菌剂为酵母菌:乳酸菌为300:1；酵母菌为异常汉逊酵母；乳酸菌为格氏乳杆菌。在一个实施方案中，第一菌剂的添加量为荔枝总质量的10‰。在一个实施方案中，第一菌剂为酵母菌:乳酸菌为500:1；酵母菌为面包酵母:清酒酵母为1:1；乳酸菌为植物乳杆菌:格氏乳杆菌:清酒乳杆菌为1:1:1。在一个实施方案中，第一菌剂的添加量为荔枝总质量的8‰。在一个实施方案中，第一菌剂为酵母菌:乳酸菌为200:1；酵母菌为胶红酵母；乳酸菌为植物乳杆菌:清酒乳杆菌为1:1。在一个实施方案中，第一菌剂的添加量为荔枝总质量的2‰。在一个实施方案中，第一菌剂为酵母菌:乳酸菌为150:1；酵母菌为面包酵母；乳酸菌为干酪乳杆菌。在一个实施方案中，第一菌剂的添加量为荔枝总质量的4‰。
二级发酵过程可以包括在一级发酵滤液中添加第二碳源，接种第二菌剂，于第二温度静置或通气培养第二时间段以得到荔枝酵素，其中第二菌剂是醋酸菌。第二菌剂可以是巴氏醋杆菌、醋酸醋杆菌、加纳醋杆菌、恶臭醋酸菌或醋化醋杆菌中的一种或多种。第二碳源可以为乳糖、赤砂糖、葡萄糖、糖蜜或蜂蜜中的一种或多种。第二碳源可以包含两种以上的糖类，例如重量百分比相同的两种以上的糖类。第二碳源的添加量为一级发酵滤液总质量的1％-20％，例如2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％。在一个实施方案中，第二碳源是乳糖。在一个实施方案中，第二碳源是赤砂糖。在一个实施方案中，第二碳源是糖蜜:乳糖为1:1。在一个实施方案中，第二碳源是葡萄糖。在一个实施方案中，第二碳源是蜂蜜。在一个实施方案中，第二碳源是葡萄糖:蜂蜜为1:1。第二温度的范围可以为15-40℃。第二时间段的范围可以为3-15天。在一个实施方案中，第二菌剂是醋酸醋杆菌：醋化醋杆菌。在一个实施方案中，第二菌剂添加量为一级发酵滤液总质量的1‰。在一个实施方案中，第二菌剂是巴氏醋杆菌。在一个实施方案中，添加量为一级发酵滤液总质量的5‰。在一个实施方案中，第二菌剂是醋化醋杆菌。在一个实施方案中，添加量为一级发酵滤液总质量的9‰。在一个实施方案中，第二菌剂是加纳醋杆菌:醋化醋杆菌:巴氏醋杆菌为1:1:1。在一个实施方案中，添加量为一级发酵滤液总质量的0.1‰。在一个实施方案中，第二菌剂是恶臭醋酸菌:醋酸醋杆菌:巴氏醋杆菌为1:1:1。在一个实施方案中，添加量为一级发酵滤液总质量的0.9‰。在一个实施方案中，第二菌剂是恶臭醋酸菌。在一个实施方案中，添加量为一级发酵滤液总质量的3‰。在一个实施方案中，第二菌剂是加纳醋杆菌。在一个实施方案中，添加量为一级发酵滤液总质量的10‰。
如本文中所述，“槐花”是指豆科植物槐的干燥花及花蕾。2015年版《中国药典》规定：含总黄酮以芦丁计，槐花不得少于8.0％；含芦丁槐花不得少于6.0％。在本文中，槐花可以为槐花粉的形式。槐花可以包含不小于6wt％的芦丁，例如7wt％、8wt％、9wt％、10wt％、11wt％、12wt％、13wt％、14wt％、15wt％、16wt％、17wt％、18wt％、19wt％、20wt％、21wt％、22wt％、23wt％、24wt％、25wt％、26wt％、27wt％、28wt％、29wt％、20wt％、21wt％、22wt％、23wt％、24wt％、25wt％、26wt％、27wt％、28wt％、29wt％、30wt％、31wt％、32wt％、33wt％、34wt％、35wt％、36wt％、37wt％、38wt％或39wt％。
本文中所述的组合物可以包含食用植物酵素和槐花。该组合物可以为食用组合物。组合物可以包含食用植物酵素和槐花，并且食用植物酵素和槐花的重量比为7:2-29:2。食用植物酵素和槐花的重量比可以为8:2、9:2、10:2、11:2、12:2、13:2、14:2、15:2、16:2、17:2、18:2、19:2、20:2、21:2、22:2、23:2、24:2、25:2、26:2、27:2或28:2。
本文中的食用植物酵素组合物可以制备为口服组合物。口服组合物可以为口服液、饮料或软糖。本文中的食用植物酵素组合物可以在添加适用的成分后制备成皮肤保湿组合物或药物组合物。皮肤保湿组合物可以包含本文中的食用植物酵素组合物。皮肤保湿组合物可以进一步包含用于皮肤保湿的成分，例如透明质酸钠。皮肤保湿组合物还可以包含填充剂，例如抗性糊精或低聚果糖等。药物组合物可以包含本文所述的组合物和药学可接受的赋形剂。
本文中所述的食用植物酵素或皮肤保湿组合物可以用于化妆用方法。该方法可以包括在受试者中进行皮肤保湿的方法，在受试者中保持和/或改善皮肤健康的方法，或在受试者中改善皮肤炎症的非治疗目的的方法。方法可以包括对受试者施用本文所述的食用植物酵素组合物或本文所述的皮肤保湿组合物。施用的方式可以包括口服施用。
本文中所述的食用植物酵素或皮肤保湿组合物可以用于辅助治疗方法。辅助治疗方法包括对受试者施用本文所述的食用植物酵素组合物或药物组合物。施用的方式可以包括口服施用。
在本文中，“受试者”可以是适合于服用本文所述的组合物的对象，例如哺乳动物。在本文中，受试者可以是人。
以下将参考实施例对本申请进行进一步的详细解释。然而，本领域技术人员应理解，这些实施例仅为了说明的目的提供，而不是意图限制本申请。
实施例
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限定本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。除非另外指明，所列出的所有量均基于总重的重量百分比描述。本申请不应解释为受限于所述的具体实施例。
荔枝酵素的制备：
(1)前处理：5吨荔枝果清洗，压榨；
(2)一级发酵：在果液和果渣的混合物中添加糖1，接种菌剂1，25℃密封静置发酵48h；
(3)过滤：压滤机挤压，获得一级发酵滤液，一级发酵滤液质量大于荔枝果总质量的60％；
(4)二级发酵：在一级发酵滤液中添加糖2，接种菌剂2，40℃通气培养9天；
(5)过滤、灭菌。
在上述制备方法中，糖1为果糖:蔗糖:红糖为1:1:1；糖1的添加量为3％(w/w)；菌剂1为酵母菌:乳酸菌为500:1；酵母菌为面包酵母:清酒酵母为1:1；乳酸菌为植物乳杆菌:格氏乳杆菌:清酒乳杆菌为1:1:1；菌剂1的添加量为荔枝总质量的8‰。糖2为蜂蜜；糖2的添加量为一级发酵滤液总质量的20％；菌剂2为恶臭醋酸菌:醋酸醋杆菌:巴氏醋杆菌为1:1:1；菌剂2添加量为一级发酵滤液总质量的0.9‰；培养方式为通气量为5mL/min/mL发酵液的通气培养。经测定上述荔枝酵素符合中华人民共和国轻工行业标准QB/T 5323-2018的液态食用植物酵素标准。
组合物的制备
槐花(江阴天江药业有限公司；芦丁含量不小于10％)；桂花(宁夏香草生物技术有限公司)；槐花荔枝发酵液组合物通过将槐花粉与荔枝发酵液按比例混合物。
组合物1(槐花：荔枝发酵液＝2:7)；组合物2(槐花：荔枝发酵液＝1:7)；组合物3(槐花：荔枝发酵液＝2:29)；组合物4(槐花：荔枝发酵液＝1:3)；组合物5(槐花：荔枝发酵液＝1:15)。
实施例1：槐花荔枝发酵液组合物促进透明质酸钠的生成量
在人永生角质细胞HaCaT中进行保湿试验：HA含量
试剂与仪器：
试剂：DMEM培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素双抗生素、0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液、PBS溶液、HA-ELISA试剂盒。
仪器：离心机、显微镜、多功能酶标仪、12孔板、CO2恒温培养箱、细胞培养耗材。
实验方法：
ELISA检测细胞上清中HA含量
1、造模方式：选用人永生角质细胞HaCaT，待HaCaT长满12孔板70％时，放置于超净台中暴露20min，控制条件为无风，温度为25℃，待细胞活力降至50％-60％；
2、加入0.5mL实验样品物料(样品物料为槐花、荔枝酵素液或者组合物1-5)(按照上述组合物1-5的比例，将荔枝酵素与槐花配制成总浓度为300μg/mL的溶液。具体配制见表1，将称好的样品溶解并定容成1mL的溶液)共孵育24h；
表1：不同比例槐花与荔枝发酵液的配置
Figure BDA0003942266920000101
3、将细胞上清吸出，3000rpm离心20min，去除细胞碎片等。由于细胞上清中HA含量较高，故需稀释10倍，备用。
4、按照ELISA试剂盒说明书(HA-ELISA；货号：CSB-E04805h；武汉华美)操作，绘制标准曲线，根据OD值计算出相应HA含量。具体操作流程如下：
标准曲线样品制备
1.从HA-ELISA试剂盒中取出一支标准品，于6000-10000rpm离心30秒。用1ml样本稀释液溶解，并用枪头对准冻存管底部反复吸打5次以助溶解，充分混匀得到标准品S7，放置备用。
2.取7个1.5ml离心管(S0-S6)依次排列，各加入250ul样本稀释液。吸取250ul标准品S7到第一个离心管中(S6)，轻轻吹打混匀。从S6中吸取250ul到第二个EP管中(S5)，轻轻吹打混匀。以此类推进行标准品的倍比稀释。
检测过程
使用前将所有试剂和样品置于室温下。样品解冻后再次离心。所有的样品和标准品进行一式两份的分析。
③每孔加标准品和样品100μl。用提供的胶条覆盖后在37℃孵育2小时。
④将每个孔的液体取出，不要清洗。
⑤向每孔加入生物素抗体(1倍)100μl，用新的胶条覆盖，37℃孵育1小时。
⑥使用多通道移液管，对每个孔进行吹吸并清洗，共清洗三次。之后用洗涤液(200μl)填充每个孔，并静置2分钟。在最后一次洗涤后，通过吸走任何剩余的洗涤缓冲液。之后把96孔板倒过来，用干净的纸巾吸干。
⑦每孔加酶标亲和素100μl(1x)，并用新的胶条覆盖微量滴定板，37℃孵育1小时。
⑧与步骤6一样，重复吸气/洗涤过程5次。
⑨每孔加入90μl TMB底物。在37℃下孵育15-30分钟，避免光照。
⑩每孔加入50μl终止液，轻拍板，以确保充分混合。
Figure BDA0003942266920000112
在5分钟内确定每个孔的OD值，使用设置为450nm的酶标仪读取其OD值。
标准曲线结果：
表2.透明质酸钠标准品浓度与OD值
Figure BDA0003942266920000111
图1显示了HA标准品母液稀释过程。图2显示了透明质酸钠标准曲线。
5、试验分组：空白组(加入的样品物料为DMEM培养基)；槐花组；荔枝酵素组；组合物1-5组；每组3个平行。使用ELISA试剂盒参考标准曲线的操作方法进行细胞离心后上清液中透明质酸钠(HA)含量的检测。
结果
图4和表3显示了空白组、槐花组、荔枝酵素液组、组合物1(槐花：荔枝发酵液＝2:7)、组合物2(槐花：荔枝发酵液＝1:7)、组合物3(槐花：荔枝发酵液＝2:29)、组合物4(槐花：荔枝发酵液＝1:3)、组合物5(槐花：荔枝发酵液＝1:15)的透明质酸生成实验数据。
在相同添加量的情况下，组合物1(槐花：荔枝发酵液＝2:7)、组合物2(槐花：荔枝发酵液＝1:7)、组合物3(槐花：荔枝发酵液＝2:29)时透明质酸钠(HA)的生成量显著高于槐花和荔枝发酵液的单一物料时透明质酸钠(HA)的生成量，而槐花：荔枝发酵液在其他比例1:3和1:15时组合物都不具有此结果。该结果证明了荔枝发酵液：槐花在比例为7:2～15:1的情况下两者在透明质酸钠(HA)的生成量上具有协同作用。
图5和表4显示了空白组、桂花组、荔枝酵素液组、桂花荔枝发酵液组合物(桂花：荔枝发酵液＝1:5)的透明质酸生成实验数据。在相同添加量的情况下，组合物(桂花：荔枝发酵液＝1:5)对透明质酸钠(HA)的生成量显著低于同浓度的荔枝发酵液。桂花：荔枝发酵液在1:5的比例下没有发现有协同提高透明质酸钠生成作用。
表3：透明质酸生成实验数据
Figure BDA0003942266920000121
表4：透明质酸生成实验数据
Figure BDA0003942266920000122
实施例2：槐花荔枝发酵液组合物的抗炎效果。
在人永生角质细胞HaCaT中进行抗炎试验：NO释放量
试剂与仪器：
试剂：DMEM培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素双抗、0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液、地塞米松、LPS。
仪器：离心机、酶标仪、24孔板、CO2恒温培养箱、细胞培养耗材。
实验方法：
1、待HaCaT长满24孔板30％时，同时加入LPS(浓度10μg/mL)250uL及待测物料(槐花、桂花、荔枝酵素液或组合物1-5)250uL，同时设置加入500uL DMEM的正常组及加入500uLLPS的模型组；
2、处理三天；
3、每孔取50uL上清液，加入NO释放量试剂盒中的试剂；
4、在A540nm处测吸光度值，根据标准品制作标准曲线，计算出NO释放量的值。
标准曲线制备过程：
1.取出Griess Reagent I和II，使回复室温。
2.用待测样品所用溶液稀释标准品(1-100μM)。
3.按50μl/孔，在96孔板中加入标准品及样品。
4.按50μl/孔，在各孔中加入室温Griess Reagent I。
5.按50μl/孔，各孔中加入室温Griess Reagent II。
6. 540nm测定吸光度。标准曲线结果：
表5：一氧化氮标准品浓度与OD值(图3)
Figure BDA0003942266920000131
图3显示了一氧化氮标准曲线。
NO抑制率％＝(模型组NO释放量-样品组NO释放量)/模型组NO释放量*100％
试验分组：LPS诱导炎症细胞模型组(待测物料为DMEM培养基)；槐花组、荔枝酵素液组、组合物1(槐花：荔枝发酵液＝2:7)、组合物2(槐花：荔枝发酵液＝1:7)、组合物3(槐花：荔枝发酵液＝2:29)、组合物4(槐花：荔枝发酵液＝1:3)、组合物5(槐花：荔枝发酵液＝1:15)；桂花组；桂花荔枝酵素组(待测物料为槐花、荔枝酵素液、组合物1-5、桂花和桂花荔枝酵素)，每组3个平行。
结果
图6显示了槐花组、荔枝酵素液组、组合物1(槐花：荔枝发酵液＝2:7)、组合物2(槐花：荔枝发酵液＝1:7)、组合物3(槐花：荔枝发酵液＝2:29)、组合物4(槐花：荔枝发酵液＝1:3)、组合物5(槐花：荔枝发酵液＝1:15)的NO抑制率数据。
在相同添加量的情况下，组合物1(槐花：荔枝发酵液＝2:7)、组合物2(槐花：荔枝发酵液＝1:7)、组合物3(槐花：荔枝发酵液＝2:29)对炎症细胞NO的抑制率显著高于槐花和荔枝发酵液的单一物料对炎症细胞NO的抑制率，而槐花：荔枝发酵液在其他比例1:3和1:15时的组合物都不具有此结果。包含槐花和荔枝发酵液的组合物在比例为7:2-29:2的情况下在对炎症细胞NO的抑制率上具有协同作用。
图7显示了桂花组、荔枝酵素液组、桂花荔枝发酵液组合物(桂花：荔枝发酵液＝1:7)的NO抑制率数据。在相同的浓度的条件下，组合物(槐花：荔枝发酵液＝1:7)对炎症细胞NO的抑制率显著高于同浓度的荔枝发酵液。桂花：荔枝发酵液在1:7的比例下没有发现有协同作用。
表6：对炎症细胞NO的抑制率
Figure BDA0003942266920000141
表7：对炎症细胞NO的抑制率
Figure BDA0003942266920000142
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.食用植物酵素组合物，所述食用植物酵素组合物包含食用植物酵素和槐花，食用植物酵素和槐花的重量比为7:2-29:2。
2.根据权利要求1所述的食用植物酵素组合物，其中食用植物酵素为液态，或者食用植物酵素为荔枝酵素。
3.根据权利要求1或2所述的食用植物酵素组合物，其中槐花包含不小于6wt％的芦丁。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的食用植物酵素组合物，其中所述食用植物酵素组合物为口服组合物，优选地口服液、饮料或软糖。
5.根据权利要求1所述的食用植物酵素组合物，其中荔枝酵素通过二级发酵产生，二级发酵包括酵母菌与乳酸菌的混合菌剂密封静置发酵，然后通过醋酸菌静置或通气培养得到。
6.皮肤保湿组合物，其包含权利要求1-5中任一项的食用植物酵素组合物。
7.根据权利要求6所述的皮肤保湿组合物，其还包含透明质酸钠、抗性糊精和低聚果糖中的一种或多种。
8.药物或保健组合物，其包含权利要求1-5中任一项的食用植物酵素组合物和药学或保健可接受的赋形剂。
9.方法，其是在受试者中进行皮肤保湿的方法，在受试者中保持和/或改善皮肤健康的方法，或在受试者中改善皮肤炎症的非治疗目的的方法，该方法包括对受试者施用权利要求1-5中任一项的食用植物酵素组合物或权利要求6-7中任一项的皮肤保湿组合物，优选地施用是口服施用。
10.权利要求1-5中任一项的食用植物酵素组合物或权利要求8的药物组合物在制备改善皮肤炎症的药物或保健品中的用途，优选地，药物或保健品是口服药物或保健品。
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