CN115058482A - 一种用于评价物料的保湿和/或干燥修复性能的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于评价物料的保湿和/或干燥修复性能的方法，所述方法包括将HaCaT细胞进行干燥处理；加入待检测物料溶液；采用流式的方法测定AQP3的表达量和HaCaT细胞的存活率及凋亡率，从而实现待检测物料对皮肤的保湿和/或干燥修复性能进行测试。该方法价格低、耗时短、易操作、且准确度高。
Description
技术领域
本发明属于检测方法领域，尤其涉及一种用于评价物料的保湿和/或干燥修复性能的方法。
背景技术
HaCaT细胞是人类永生化表皮细胞，也称为表皮角质形成细胞，由角质形成细胞培育而来，保留了角质形成细胞分化能力的永生细胞。
现有技术中，对物料的保湿和/或干燥修复性能的评价方法较少。传统方法中，常采用WB法、q-PCR法检测AQP3的表达量，进而说明皮肤保湿效果或皮肤水分测试仪对皮肤保湿效果进行测试，WB法指的是在电场作用下将电泳分离的多肽从聚丙烯酰胺凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异性抗体来检测。q-PCR法指的是在PCR反应体系中加入过量荧光染料，DNA扩增的过程中，荧光染料特异性地掺入DNA双链，发射荧光信号，随着反应的进行，荧光强度逐渐增强，并且可以实时测量。WB法和q-PCR法检测灵敏度高、背景低，但价格高、耗时长、操作复杂。皮肤水分测试仪测试结果准确度低。
发明内容
针对上述现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种用于评价物料的保湿和/或干燥修复性能的方法。所述方法包括将HaCaT细胞进行干燥处理；加入待检测物料溶液；采用流式的方法测定AQP3的表达量和HaCaT细胞的存活率及凋亡率，从而实现待检测物料对皮肤的保湿和/或干燥修复性能效果进行测试。该方法价格低、耗时短、易操作、且准确度高。
本发明目的在于提供一种用于评价物料的保湿和/或干燥修复性能的方法，所述方法包括将HaCaT细胞进行干燥处理；加入待检测物料溶液；测定AQP3的表达量和HaCaT细胞的存活率及凋亡率。
HaCaT细胞中含有AQP3蛋白，AQP3蛋白是人体皮肤上最重要的水通道蛋白，主要表达于角质形成细胞和皮肤成纤维细胞。AQP3蛋白在人类表皮中的分布和表皮中水的分布是一致的，角质层中AQP3蛋白表达的缺失和角质层失水量一致。因此，可通过检测人永生角质细胞(HaCaT)表面AQP3蛋白的表达量从而反应皮肤保湿情况。本发明通过对HaCaT细胞进行干燥处理，加入待检测物料溶液，测定HaCaT细胞中AQP3的表达量和HaCaT细胞的存活率及凋亡率，进而实现对物料的保湿和/或干燥修复性能进行评价。该方法价格低、耗时短、易操作、且准确度高。
具体地，所述AQP3的表达量测定步骤具体如下：
将HaCaT细胞在20±5°下干燥处理10～40min，加入含所述待检测物料溶液的DMEM培养基，消化、固定、0.5％的TritonX-100通透5-20min、1％的BSA血清封闭30-90min，加入一抗，孵育，加入二抗，孵育，对AQP3进行荧光强度检测。
优选地，所述消化为采用0.25％的含EDTA胰蛋白酶进行消化。
优选地，所述固定为采用4％多聚甲醛进行固定。
优选地，所述一抗为rabbit-anti-Aquaporin 3antibody。
优选地，所述一抗的浓度为0.00085-0.005mg/mL，所述一抗的孵育时间为30-60min。
优选地，所述二抗为Goat Anti-Rabbit IgG H&L(Alexa 
488)。
优选地，所述二抗的浓度为0.003-0.015mg/mL，所述二抗的孵育时间为10-60min。
优选地，所述AQP3的表达量和所述HaCaT细胞的存活率及凋亡率采用流式细胞仪进行测定。流式细胞仪进行测定具有高速度、高灵敏度、高精度特点，有利于缩短检测时间、提高测试效率。
本发明的另一目的在于提供一种HaCaT细胞干燥模型的构建方法，包括以下步骤：
步骤S1.对HaCaT细胞进行体外培养；
步骤S2.对HaCaT细胞进行干燥处理；
步骤S3.利用胰酶对所述HaCaT细胞进行消化；
步骤S4.在所述HaCaT细胞中加入荧光颜料，避光反应。
本发明通过对HaCaT细胞进行体外培养、干燥处理、消化、染色，建立HaCaT细胞干燥模型，该HaCaT细胞干燥模型的构建方法简单，可应用于评价物料的保湿和/或干燥修复性能研究，利用该模型探究物料对HaCaT细胞存活率和凋亡率的影响和HaCaT细胞中AQP3蛋白的表达量，进而说明物料的保湿和/或干燥修复性能，具有重要的临床意义。
优选地，步骤S1中，所述体外培养采用含15％胎牛血清的DMEM培养基。
优选地，步骤S2中，所述干燥处理为20±5°下暴露10～40min。干燥时间超过40min，HaCaT细胞的死亡率过高，实验误差大。
优选地，步骤S3中，所述胰酶为0.25％的胰蛋白酶。
其中，0.25％的胰蛋白酶表示为1L胰酶消化液含有2.5g胰蛋白酶。
优选地，步骤S4中，所述荧光染料为APC Annexin V Apoptosis Detection Kitwith 7-AAD荧光染料。
本发明再一目的在于提供一种上述方法构建的HaCaT细胞干燥模型。
本发明再一目的在于提供一种上述HaCaT细胞干燥模型在评价物料的保湿和/或干燥修复性能的应用。
附图说明
图1为实施例1的HaCaT细胞的细胞凋亡染色图。
图2为实施例2的HaCaT细胞的细胞凋亡染色图。
图3为实施例3的HaCaT细胞的细胞凋亡染色图。
图4为实施例4的HaCaT细胞的细胞凋亡染色图。
图5为实施例5的HaCaT细胞的细胞凋亡染色图。
图6为不同浓度的槐花溶液对HaCaT细胞毒性图。
图7为HaCaT细胞空白组的流式图。
图8为同型对照组的AQP3流式荧光强度图。
图9为未干燥组的AQP3流式荧光强度图。
图10为干燥模型组的AQP3流式荧光强度图。
图11为空白组、同型对照组、未干燥组和干燥模型组的AQP3流式荧光强度叠加图。
图12为干燥+DMEM组的AQP3流式荧光强度图。
图13为干燥+槐花组的AQP3流式荧光强度图。
图14为空白组、同型对照组、干燥模型组、干燥+DMEM组和干燥+槐花组的AQP3流式荧光强度叠加图。
图15为未干燥组的AQP3免疫荧光激光共聚焦图(60X油镜)。
图16为干燥模型组的AQP3免疫荧光激光共聚焦图(60X油镜)。
图17为干燥+DMEM组的AQP3免疫荧光激光共聚焦图(60X油镜)。
图18为干燥+槐花组的AQP3免疫荧光激光共聚焦图(60X油镜)。
图19为实施例39的HaCaT细胞凋亡染色图。
图20为实施例40的HaCaT细胞凋亡染色图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实验材料：HaCaT人永生表皮细胞、澳洲胎牛血清(Excell、货号：FND500)、DMEM培养基(Gibco，货号：REF 11965-092)、0.25％的含EDTA胰蛋白酶(Gibco，货号：25200072)、PBS(beyotime，货号：C0221A)、CCK-8(MCE、货号：HY-K0301)APC Annexin V ApoptosisDetection Kit with 7-AAD(Biolegend，货号：640930)、4％多聚甲醛固定液(碧云天，货号：P0099)、0.5％Triton X-100(碧云天，货号：P0096)、1％BSA(SIGMA，货号：A1933)、cellstaining buffer(Biolegend，货号：420201)、rabbit-anti-Aquaporin 3antibody(Abcam，货号：ab125219)、Goat Anti-Rabbit IgG H&L(Alexa 
488)(Abcam，货号：ab150077)、兔IgG(Abcam，货号：ab125219)。
仪器与设备：六孔板(Corning，货号：3516)、流式管、Cytoflex流式细胞仪(Beckman公司)、分析天平(Mettler-Toledo)、Vortex 3涡旋混合仪(IKA)、离心机(Beckman公司)、10uL移液枪(GILSON)、200uL移液枪(GILSON)、1mL移液枪(GILSON)。
干燥保湿模型的建立：
实验方法与步骤：a.将HaCaT细胞放置于六孔板中，待HaCaT细胞长满六孔板70％时，吸干含15％胎牛血清的DMEM培养基，用PBS洗涤三次并吸干PBS；
b.超净台下，无风，控制温度在20±5°的条件下暴露10min、20min、30min、40min，同时设置未干燥处理组；
c.用0.25％的含EDTA胰蛋白酶消化HaCaT细胞后，PBS洗一遍，用cell stainingbuffer悬浮HaCaT细胞，同时加入APC Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AAD荧光染料，Vortex 3漩涡器混匀，避光室温反应15min，通过流式细胞仪进行分析。最终获得不同暴露时间下活细胞及凋亡细胞的比例。未经干燥处理和经干燥处理的HaCaT细胞活力由APC Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AAD凋亡试剂盒测得。
实验结果：不同干燥时间下，HaCaT细胞染色结果见图1-5，实验重复三次，HaCaT细胞存活率见表1。
表1.不同干燥时间下，HaCaT细胞存活率测试结果。
由表1可知，使用该方法对HaCaT细胞进行干燥损伤是可行的，三次干燥平行实验误差在5.0％以内，干燥20min时对HaCaT细胞的损伤可达到需要使HaCaT细胞模型细胞活力降至45％-70％的损伤程度。
槐花的细胞毒性实验：
实验方法：
实验组：a.将HaCaT细胞放置于96孔板中，每孔加入100μL 10000个细胞，培养24h后待细胞贴壁后，弃去DMEM培养基，将槐花溶解于DMEM培养基中，配制成150、300、600、1200μg/mL浓度的槐花溶液，分别加入到96孔板的各孔中，在培养箱中培养24h；
b.弃去槐花溶液，每孔加入100μLDMEM培养基和10μLCCK-8溶液，放入培养箱中孵育1h，在450nm波长处测定吸光值As。
对照组：a.将HaCaT细胞放置于96孔板中，每孔加入100μL 10000个细胞，培养24h后待细胞贴壁后，在培养箱中继续培养24h；
c.每孔加入100μLDMEM培养基和10μLCCK-8溶液，放入培养箱中孵育1h，在450nm波长处测定吸光值Ac。
空白组：每孔加入100μLDMEM培养基和10μLCCK-8溶液，放入培养箱中孵育1h，在450nm波长处测定吸光值Ab。
利用公式计算细胞的活力率：细胞存活率＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100％；其中，As：实验组(含有HaCaT细胞的培养基、CCK-8、物料)；
Ac：对照组(含有HaCaT细胞的培养基、CCK-8、无物料)；
Ab：空白组(不含HaCaT细胞的培养基、CCK-8)。
实验结果见图6，由图6可知，槐花浓度在300μg/mL以下对HaCaT细胞无毒。
流式细胞仪(Flow)检测HaCaT细胞中水通道蛋白3(AQP3)的表达量：
表2.AQP3表达量的测试物质的组成及步骤。
按表2各组添加的物质将HaCaT细胞放置于六孔板中，待HaCaT细胞长满六孔板70％时，吸干含15％胎牛血清的DMEM培养基，用PBS洗涤三次并吸干PBS；超净台下，无风，温度在20-25°中暴露20min，分别加入含300μg/mL槐花的DMEM培养基、DMEM培养基，分别用预热好的0.25％的含EDTA胰蛋白酶消化，培养基中止，计数，每管细胞约10万个，分别用4％多聚甲醛固定10-60min，预冷PBS洗一遍，分别用0.5％TritonX-100室温通透5-20min，PBS洗一遍，1％BSA室温封闭30-90min，离心去除封闭液，加入浓度0.00085-0.005mg/mL rabbitanti-Aquaporin 3antibody或浓度为0.0025mg/mL的兔IgG，室温孵育30分钟，PBS洗一遍，加入0.003-0.015mg/mL的Goat Anti-Rabbit IgG H&L(Alexa 
488)，室温孵育30分钟，PBS洗一遍，加入200uL cell staining buffer，采用流式细胞仪对AQP3进行荧光强度检测。结果见表3～4、表6～10和图7～18。
实验结果：
(1)4％多聚甲醛固定时间的影响：
多聚甲醛固定时间对实验影响不大，优选为10-20min，选择时间短即可。
(2)0.5％TritonX-100通透时间的影响：
表3. 0.5％TritonX-100通透时间对荧光强度的影响。
由表3可知，0.5％TritonX-100通透时间在5min时最优，能最大程度的减少非特异性结合，且可膜通透。
(3)1％BSA封闭时间的影响：
表4. 1％BSA封闭时间对荧光强度的影响。
由表4可知，1％BSA封闭时间在60-90min时最优，能最大程度减少非特异性结合，因60-90min非特异性结合差异不大，故建议采用60min，耗时较短。
(4)10％山羊血清封闭时间的影响。
表5. 10％山羊血清封闭时间对荧光强度的影响。
由表5可知，10％山羊血清封闭时间对同型对照组(非特异性结合)影响不大，且均比1％BSA封闭后非特异性结合高，故未采用。
(5)rabbit-anti-Aquaporin 3antibody孵育时间的影响：
表6.rabbit-anti-Aquaporin 3antibody孵育时间对荧光强度的影响。
由表6可知，rabbit-anti-Aquaporin 3antibody孵育时间在30min时最优，可标记上且耗时较短。
(6)rabbit-anti-Aquaporin 3antibody浓度的影响。
表7.rabbit-anti-Aquaporin 3antibody浓度对荧光强度的影响。
由表7可知，rabbit-anti-Aquaporin 3antibody的浓度为0.0025mg/mL可达最优效果，标记比例较高，且用量少。
(7)Goat Anti-Rabbit IgG H&L(Alexa
488)孵育时间的影响：
表8.Goat Anti-Rabbit IgG H&L(Alexa
488)孵育时间对荧光强度的影响。
由表8可知，Goat Anti-Rabbit IgG H&L(Alexa
488)孵育时间在30min时最优，能完全标记上且数据稳定。
(8)Goat Anti-Rabbit IgG H&L(Alexa
488)浓度的影响。
表9.Goat Anti-Rabbit IgG H&L(Alexa
488)浓度对荧光强度的影响。
由表9可知，Goat Anti-Rabbit IgG H&L(Alexa
488)的浓度为0.005mg/mL可达最优效果，标记比例较高，且用量少。
按4％多聚甲醛固定时间为10min、0.5％TritonX-100通透时间为5min、1％BSA封闭时间为60min、rabbit-anti-Aquaporin 3antibody孵育时间为30min、rabbit-anti-Aquaporin 3antibody的浓度为0.0025mg/mL、Goat Anti-Rabbit IgG H&L(Alexa
488)孵育时间为30min、Goat Anti-Rabbit IgG H&L(Alexa
488)的浓度为0.005mg/mL对表2中的各组进行实验，并测定AQP3荧光强度值，结果见表10。
表10.各组AQP3荧光强度值。
计算公式：按照下列公式求AQP3荧光强度值：样品AQP3实际荧光强度值＝A-B
其中，A表示测得样品组荧光强度值、B表示测得同型对照荧光强度值。
荧光强度强说明AQP3表达量多、荧光强度低说明AQP3表达量少。
流式细胞仪测定：实验前需要对流式细胞仪进行微球校正，以保证实验顺利进行。通过同型对照组调节实验FSCvsSSC的实验电压，以确保本批次细胞后续实验的结果计算。
槐花对干燥损伤的修复作用：
实验方法及步骤：
表11.槐花对干燥后HaCaT细胞存活率及凋亡率测试组分及实验步骤。
按表11各组添加的物质将HaCaT细胞放置于六孔板中，待HaCaT细胞长满六孔板70％时，吸干含15％胎牛血清的DMEM培养基，用PBS洗涤三次并吸干PBS；超净台下，无风，温度在20-25°中暴露20min，分别加入含300μg/mL槐花的DMEM培养基、DMEM培养基，培养24h后，预热好的0.25％的含EDTA胰蛋白酶消化，PBS洗一遍，分别用cell staining buffer悬浮细胞后，同时分别加入APC Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AAD荧光染料，用漩涡器混匀后，分别避光室温反应15min，采用流式细胞仪分析。结果见表12～13和图19～20。
表12.槐花对干燥后HaCaT细胞存活率的测试结果。
表13.槐花对干燥后HaCaT细胞凋亡率的测试结果。
由表12和13可知，HaCaT细胞干燥处理后，干燥+DMEM组的HaCaT细胞存活率为49.56±2.03％，干燥+槐花组的HaCaT细胞存活率为72.66±2.32％；干燥+DMEM组的HaCaT细胞凋亡率为19.82±3.27％，干燥+槐花组的HaCaT细胞凋亡率为11.98±1.42％，与干燥模型组细胞相比，干燥+槐花组细胞活力提高了20.69％、细胞凋亡率下降了44.64％。由此可知，槐花对细胞干燥损伤有保护和/或修复作用，对细胞凋亡有明显的抑制作用，对干燥导致的细胞凋亡有保护作用。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管对照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，技术人员阅读本申请说明书后依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，例如，槐花可替换成雨生红球藻、透明质酸钠、荔枝酵素等，但这些修改或变更均未脱离本发明申请待批权利要求保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于评价物料的保湿和/或干燥修复性能的方法，其特征在于，所述方法包括将HaCaT细胞进行干燥处理；加入待检测物料溶液；测定AQP3的表达量和HaCaT细胞的存活率及凋亡率。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述AQP3的表达量测定包括如下步骤：
将HaCaT细胞在20±5°下干燥处理10～40min，加入含所述待检测物料溶液的DMEM培养基，消化、固定、0.5％的TritonX-100通透5-20min、1％的BSA封闭30-90min，加入一抗，孵育，加入二抗，孵育，对AQP3进行荧光强度检测。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述一抗的浓度为0.00085-0.005mg/mL，所述一抗的孵育时间为30-60min。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述二抗的浓度为0.003-0.015mg/mL，所述二抗的孵育时间为10-60min。
5.一种HaCaT细胞干燥模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1.对HaCaT细胞进行体外培养；
步骤S2.对HaCaT细胞进行干燥处理；
步骤S3.利用胰酶对所述HaCaT细胞进行消化；
步骤S4.在所述HaCaT细胞中加入荧光颜料，避光反应。
6.如权利要求5所述HaCaT细胞干燥模型的构建方法，其特征在于，步骤S1中，所述体外培养采用含15％胎牛血清的DMEM培养基。
7.如权利要求5所述HaCaT细胞干燥模型的构建方法，其特征在于，步骤S2中，所述干燥处理为20±5°下暴露10～40min。
8.如权利要求5所述HaCaT细胞干燥模型的构建方法，其特征在于，步骤S3中，所述胰酶为0.25％的胰蛋白酶。
9.一种如权利要求5～8任意一项所述方法构建的HaCaT细胞干燥模型。
10.一种如权利要求9所述的HaCaT细胞干燥模型在评价物料的保湿和/或干燥修复性能的应用。
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