CN116076508A - 包含结合至鞘脂的抗体的农用化学组合物 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了包含结合至鞘脂的抗体的农用化学组合物。本发明涉及用于抵抗有害生物,更具体地植物有害生物的农用化学和生物控制组合物,所述组合物包含特异性结合至植物病原体的鞘脂的抗体的至少一个重链可变域。本发明还提供了保护或治疗植物或植物的一部分抵抗感染或与植物病原体的其它生物相互作用的方法,所述方法至少包括以下步骤:在对于保护或治疗植物或植物的一部分抵抗感染或与植物病原体的生物相互作用有效的条件下,将农用化学组合物直接或间接应用于植物或植物的一部分。
Description
本申请是申请日为2014年4月29日的题为“包含结合至鞘脂的抗体的农用化学组合物”的中国专利申请No.201480037515.7的分案申请。
技术领域
本发明涉及植物有害生物(病虫害,pest)的有效控制。更具体地,本发明提供了包含对抵抗作物有害生物(如昆虫、真菌、线虫、细菌等)有用的特定长度和浓度的多肽组合物的农用化学组合物。
背景技术
高效农业需要的作物保护仍大量依赖于杀虫剂的使用,通过将杀虫剂喷雾至作物来向作物应用杀虫剂,这是在作物浇水期间应用的或将它们掺入到土壤中应用的。杀虫剂通常是有机化学分子并且由于喷雾漂浮、在土壤中的持久性或者清洗至地表水或地下水,它们对作物的反复应用对处理期间的农业工人以及对环境都会造成毒性威胁。能够使用对人和环境具有低毒性,但同时对植物有害生物能够提供有效控制的替代化合物将是有利的。在这方面,对某些植物有害生物靶标具有特异性的蛋白质杀虫剂可能是非常有利的,这是因为预期它们在环境中的存活期短并且具有非靶标低毒作用。然而,仅有少量蛋白质或肽能杀虫剂是已知的。一些实例为Bt毒素、凝集素、防御素、fabatins、鲎素(tachyplesin)、蛙皮素(magainin)、过敏蛋白(harpin)(参见WO2010019442)、豌豆白蛋白1-亚基b(PA1b)。然而,这些蛋白质杀虫剂是具有通过一些二硫桥稳定的致密结构的小肽,或者是以结晶形式存在的较大的蛋白质(>300个氨基酸)(cry毒素)。在农业领域,的确已知生物制品,并且具体地蛋白质是开发杀虫剂的具有挑战性的结构,这是因为它们通常具有远远不够的稳定性以维持它们在农用化学制剂中的杀虫功能,具体地,用于田间应用时维持杀虫功能。
发明内容
本发明人已成功开发了对植物或作物的有害生物靶标具有出人意料的高特异性、亲合力和效力的多肽,具体地,植物、致病有害生物,如(但不限于)植物、致病真菌。此外,已表明这些多肽在农用化学组合物(本文中将进一步定义)中保留了它们的完整性、稳定性和活性并且可以通过向作物应用包含如本发明申请中所公开的多肽的农用化学组合物出人意料地实现有效的有害生物或致病控制。
如本文所公开的多肽的有效性和效力表明对于较低处理剂量和/或相同剂量下更有效的处理的可能。这可以表示不希望的副作用的降低和毒性的降低。此外,这允许应用较低量的本文所公开的多肽或农用化学组合物/公顷。
更具体地,本发明人已发现当直接或间接应用于植物或植物的一个或多个部分时,用本文设想的多肽靶向植物病原体的分子结构使得能够有效控制该病原体。
具体地,本发明人已开发了能够预防、保护、治疗或治愈植物(发展)由植物病原体或与植物病原体的任何其它生物相互作用的多肽或氨基酸序列。因此,本发明首次证明生物分子(如多肽或氨基酸序列)可以用于有效保护或治疗植物抵抗植物与植物病原体之间的生物相互作用(如(例如)通过植物病原体感染)以任何方式所造成的损害或抵抗遭受所述生物相互作用。
在第一个方面,本发明提供了农用化学组合物,其包含特异性结合至植物病原体的鞘脂的抗体的至少一个重链可变域(VHH或VH)或其功能性片段。
在具体的实施方式中,如本文所公开的农用化学组合物包含重链抗体(VHH)的至少一个重链可变域,其天然缺少轻链或其功能性片段,如(但不限于)骆驼重链抗体(骆驼VHH)的重链可变域或其功能性片段。
在具体的实施方式中,如本文所公开的农用化学组合物包含常规四链抗体(骆驼化VH)的至少一个骆驼化重链可变域或其功能性片段。
在某些具体实施方式中,如本文所公开的农用化学组合物包含抗体的至少一个重链可变域或其功能性片段,其不具有与天然存在的VH域的氨基酸序列(如来自哺乳动物,并且具体地来自人的天然存在的VH域的氨基酸序列)完全相同的氨基酸序列(即与天然存在的VH域的氨基酸序列的序列同一性为100%)。
在其它具体实施方式中,如本文所公开的农用化学组合物至少包含特异性结合至植物病原体的鞘脂,如(例如,但不限于)葡糖苷酰鞘氨醇的抗体的重链可变域或其功能性片段。
在某些具体的实施方式中,如本文所公开的农用化学组合物至少包含抗体的重链可变域或其功能性片段,其特异性结合至植物病原真菌,如(但不限于)选自包括下列属的组中的植物病原真菌属:链格孢属(Alternaria)、壳二孢属(Ascochyta)、葡萄孢属(Botrytis)、尾孢属(Cercospora)、刺盘孢属(Colletotrichum)、色二孢属(Diplodia)、白粉菌属(Erysiphe)、镰刀菌属(Fusarium)、小球腔菌属(Leptosphaeria)、禾顶囊壳属(Gaeumannomyces)、长蠕孢属(Helminthosporium)、壳球孢属(Macrophomina)、丛赤壳属(Nectria)、青霉菌属(Penicillium)、霜霉属(Peronospora)、茎点霉属(Phoma)、瘤梗孢属(Phymatotrichum)、疫霉属(Phytophthora)、单轴霉属(Plasmopara)、叉丝单囊壳属(Podosphaera)、柄锈属(Puccinia)、核腔菌属(Pyrenophora)、梨孢属(Pyricularia)、腐霉属(Pythium)、丝核菌属(Rhizoctonia)、小菌核属(Scerotium)、核盘霉属(Sclerotinia)、壳针孢属(Septoria)、根串珠霉属(Thielaviopsis)、钩丝壳属(Uncinula)、黑星菌属(Venturia)、轮枝孢菌属(Verticillium)、大毁壳属(Magnaporthe)、布氏白粉菌属(Blumeria)、小球壳属(Mycosphaerella)、黑粉菌属(Ustilago)、无柄锈属(Melampsora)、层锈菌属(Phakopsora)、链核盘菌属(Monilinia)、毛霉菌属(Mucor)、根霉属(Rhizopus)和曲霉菌属(Aspergillus)。
在具体的实施方式中,如本文所公开的农用化学组合物至少包括抗体的重链可变域或其功能性片段,其特异性结合至植物病原体,所述植物病原体是对于选自包括以下的组的植物的植物病原体:谷类、高粱、水稻、甜菜、饲用甜菜(fodder beet)、水果、坚果、车前科或葡萄树、豆类作物、油料作物、葫芦科植物、纤维植物、燃料作物、蔬菜、观赏植物、灌木、阔叶树、常绿植物、草、咖啡、茶、烟草、啤酒花、胡椒、橡胶和乳胶植物。
在某些具体的实施方式中,本文所公开的农用化学组合物中抗体的至少一个重链可变域或其功能性片段以对保护或治疗植物或植物的一部分抵抗感染或与植物病原体的其它生物相互作用有效的量存在,如(例如,但不限于)农用化学组合物中至少一个重链可变域的浓度在按重量计0.0001%至50%的范围内。
在其它具体实施方式中,在水溶液中,任选地(但无限制地)与农用化学适合的载体和/或一种或多种适合的佐剂一起配制本文所公开的农用化学组合物中抗体的至少一个重链可变域或其功能性片段。
在其它具体实施方式中,本文所公开的农用化学组合物中抗体的至少一个重链可变域或其功能性片段至少包括:
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在其它实施方式中,本文所公开的农用化学组合物中抗体的至少一个重链可变域或其功能性片段至少包括具有选自SEQ ID NO:1至84中的任一种的序列的氨基酸序列。
在另一个方面,本发明提供了保护或治疗植物或植物的一部分抵抗感染或与植物病原体的其它生物相互作用的方法,其中所述方法至少包括以下步骤:在对于保护或治疗所述植物或所述植物的一部分抵抗感染或与植物病原体的生物相互作用有效的条件下,将如本文所公开的农用化学组合物直接或间接应用于所述植物或所述植物的一部分。
在具体的实施方式中,这些方法包括将如本文所公开的农用化学组合物以高于50g农用化学组合物/公顷的应用量(施加率,application rate)直接或间接应用于植物或植物的一部分,如(但不限于)高于75g农用化学组合物/公顷的应用量,如高于100g农用化学组合物/公顷的应用量,或者具体地高于200g农用化学组合物/公顷的应用量。
在具体的实施方式中,这些方法包括将如本文所公开的农用化学组合物以50g至100g农用化学组合物/公顷的应用量直接或间接应用于植物或植物的一部分,如(但不限于)50g至200g农用化学组合物/公顷的应用量,具体地75g至175g农用化学组合物/公顷的应用量,如75g至150g农用化学组合物/公顷或75g至125g/公顷。
在具体的实施方式中,可选地在收获后,通过喷雾、雾化、起泡、生雾(fogging)、在水培法中培养、在水耕法(hydroponics)中培养、涂覆、浸没和/或结壳将如本文所公开的农用化学组合物直接或间接应用于植物或植物的一部分。
在其它方面,本发明提供了保护或治疗收获的植物或植物收获的部分抵抗感染或与植物病原体的其它生物相互作用的收获后处理方法,所述方法至少包括以下步骤:在对于保护或治疗所述收获的植物或所述植物收获的部分抵抗感染或与植物病原体的生物相互作用有效的条件下,将如本文所公开的农用化学组合物直接或间接应用于所述收获的植物或所述植物收获的部分。
在其它方面,本发明提供了如本文所公开的农用化学组合物作为抗有害生物试剂的应用。在具体的实施方式中,所述抗有害生物试剂是生物抑制剂、抑真菌剂、有害生物杀灭剂(杀虫剂,pesticidal agent)和/或杀真菌剂。
在其它方面,本发明提供了抑制植物病原体生长的方法或杀死植物病原体的方法,所述方法包括至少以下步骤:将如本文所公开的农用化学组合物直接或间接应用于植物或植物的一部分。
在这些方法的具体实施方式中,任选地在收获后,通过喷雾、雾化、起泡、生雾(fogging)、在水培法中培养、在水耕法中培养、涂覆、浸没和/或结壳(encrusting)将如本文所公开的农用化学组合物直接或间接应用于植物或植物的一部分。
在另一方面,本发明提供了产生如本文所公开的农用化学组合物的方法,所述方法至少包括以下步骤:
—获得特异性结合至植物病原体的鞘脂的抗体的至少一个重链可变域(VHH或VH)或其功能性片段,和
—在农用化学组合物中配制所述重链可变域或其功能性片段。
在这些方法的具体实施方式中,获得特异性结合至植物病原体的鞘脂的抗体的至少一个重链可变域(VHH或VH)或其功能性片段的步骤包括:
(a)表达编码特异性结合至植物病原体的鞘脂的抗体重链可变域或其功能性片段的核苷酸序列,和任选地
(b)分离和/或纯化所述可变域或其功能性片段。
在这些方法的具体实施方式中,获得特异性结合至植物病原体的鞘脂的抗体的至少一个重链可变域或其功能性片段(VHH或VH)的步骤包括:
a)提供VHH序列或VH序列或其功能性片段的序列的组、集合或文库;
b)对VHH序列或VH序列或其功能性片段序列的组、集合或文库筛选特异性结合至植物病原体的鞘脂和/或对植物病原体的鞘脂具有亲合力的序列,和任选地
c)分离特异性结合至植物病原体的鞘脂和/或对植物病原体的鞘脂具有亲合力的VHH序列或VH序列或其功能性片段序列。
附图说明
图1:作为含有VHH的粗胞质提取物对来自金顶侧耳(pleurotuscitrinopileatus)的涂覆的真菌GlcCer的VHH结合。抗-GlcCer VHH结合至真菌GlcCer,对于不相关的VHH未观察到结合。
图2:VHH 41 D01的结合特异性。0.1μg/ml的纯化的VHH 41 D01与来自尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)或金顶侧耳(pleurotus citrinopileatus)的涂覆的真菌GlcCer,和来自植物(大豆)或哺乳动物(猪肉)的非真菌GlcCer的结合。条棒代表OD 405nm的平均值,误差线代表n=6的平均标准误差。抗-GlcCer VHH 41 D01特异性结合真菌GlcCer而不结合植物或哺乳动物GlcCer。
图3A:VHH的结合特异性。1μg/ml的纯化的VHH与来自尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)或金顶侧耳(pleurotus citrinopileatus)的涂覆的真菌GlcCer的结合。不同的抗-GlcCer VHH特异性结合至不同的真菌GlcCer。
图3B:VHH的结合特异性。1μg/ml的纯化的VHH与来自植物(大豆)的涂覆的非真菌GlcCer的结合。不同的抗-GlcCer VHH不会结合植物GlcCer。
图3C:VHH的结合特异性。1μg/ml的纯化的VHH与涂覆的非真菌哺乳动物GlcCer(猪肉)的结合。不同的抗-GlcCer VHH不会结合哺乳动物GlcCer。
图4:VHH 41 D01和真菌GlcCer之间的抗体-抗原相互作用的实时测量。VHH 41D01结合真菌GlcCer。观察到GlcCer与VHH 41 D01的缓慢解离。不相关的VHH_A不会结合真菌GlcCer。
图5:VHH 41 D01和VHH 56F11的交叉反应性和特异性。0.1μg/ml的纯化的VHH 41D01和1μg/ml的VHH 56F11与涂覆的真菌脂质提取物、来自金顶侧耳(pleurotuscitrinopileatus)的GlcCer和不相关的化合物:苹果果胶、柑桔果胶或马铃薯凝集素的结合。条棒代表OD 405nm的平均值,误差线代表n=2的平均标准误差。抗-GlcCer VHH 41 D01和VHH 56F11特异性结合所测试的真菌脂质提取物中的每一个。抗-GlcCer VHH 41 D01和VHH 56F11不显示与不相关的涂覆化合物或非涂覆孔的结合。
图6:不同组合物中VHH 41 D01与来自尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的真菌GlcCer的结合。测试了含有0.1μg/ml的抗-GlcCer VHH 41 D01和蛋白酶抑制剂和/或非离子型表面活性剂和/或防腐剂的水性组合物对真菌GlcCer的结合。在所有测试组合物中,GlcCer-特异性VHH 41 D01结合至真菌GlcCer而没有任何添加剂的副作用。
图7A:真菌生长的目视评分。用灰葡萄孢孢子(1E+05/ml)接种VHH(抗-GlcCerVHH's 41 D01、56E05、56F11和57A06以及非相关VHH_A或非相关VHH_B)的连续稀释液并在室温下培育。基于一组照相标准,定量抗-GlcCer VHH's 41 D01、56E05、56F11和57A06以及非相关VHH_A或非相关VHH_B对真菌生长的影响。条棒代表平均生长%,误差线代表至少3次重复的平均标准误差。
图7B:真菌生长的目视评分。用灰葡萄孢孢子(1E+05/ml)接种VHH(抗-GlcCerVHH's 56C09、56H07、57C09、57E07、57E11以及非相关VHH_A或非相关VHH_B)的连续稀释液并在室温下培育。基于一组照相标准,定量抗-GlcCer VHH's 56C09、56H07、57C09、57E07、57E11以及非相关VHH_A或非相关VHH_B对真菌生长的影响。条棒代表平均生长%,误差线代表至少3次重复的平均标准误差。
图7C:真菌生长的目视评分。用灰葡萄孢孢子(1E+05/ml)接种VHH(抗-GlcCerVHH's 54C08、54C11、56A05、56A09以及非相关VHH_A或非相关VHH_B)的连续稀释液并在室温下培育。基于一组照相标准,定量抗-GlcCer VHH's 54C08、54C11、56A05、56A09以及非相关VHH_A或非相关VHH_B对真菌生长的影响。条棒代表平均生长%,误差线代表至少3次重复的平均标准误差。
图8A:不同真菌种的真菌生长的目视评分。在室温下,与甘蓝链格孢菌(Alternaria brassicicola)的孢子(1E+05/ml)一起培育VHH(抗-GlcCer VHH或非相关VHH)的两倍连续稀释液。VHH和对照化合物对真菌生长的影响基于一组照相标准。条棒代表平均生长%,误差线代表n=2的平均标准误差。
图8B:不同真菌种的真菌生长的目视评分。在室温下,与甜菜生尾孢(Cercosporabeticola)的孢子(1E+05/ml)一起培育VHH(抗-GlcCer VHH或非相关VHH)的两倍连续稀释液。VHH和对照化合物对真菌生长的影响基于一组照相标准。条棒代表平均生长%,误差线代表n=2的平均标准误差。
图8C:不同真菌种的真菌生长的目视评分。在室温下,与黄色镰刀菌(Fusariumculmorum)的孢子(1E+05/ml)一起培育VHH(抗-GlcCer VHH或非相关VHH)的两倍连续稀释液。VHH和对照化合物对真菌生长的影响基于一组照相标准。条棒代表平均生长%,误差线代表n=2的平均标准误差。
图8D:不同真菌种的真菌生长的目视评分。在室温下,与大丽花轮枝孢(Verticillium dahliae)的孢子(1E+05/ml)一起培育VHH(抗-GlcCer VHH或非相关VHH)的两倍连续稀释液。VHH和对照化合物对真菌生长的影响基于一组照相标准。条棒代表平均生长%,误差线代表n=2的平均标准误差。
图9:使用扩展青霉(Penicillium expansum)的体外抗真菌测定。在室温下,VHH的两倍连续稀释液接种扩展青霉(P.expansum)孢子(1E+03/ml)。测试了抗-GlcCer VHH 41D01、非相关VHH_A、BSA、非相关hlgG、抗-GlcCer小鼠单克隆抗体和水。培育24h后测量发光性(RLU)。相对于未处理的孢子,表示处理的孢子的RLU%。值表示平均RLU%,误差线表示n=4的平均标准误差。
图10:对使用抗GclCer VHH 41 D01、非相关VHH_A或水预防性处理并且接种了灰葡萄孢(Botrytis cinerea)孢子(6E+06个孢子/ml)的番茄叶片测量疾病严重性。条棒代表在感染后6天评分的平均病变直径(mm),误差线代表n=5的平均标准误差。
图11:对使用抗GclCer VHH 41 D01、非相关VHH_A或BSA治愈性处理并且接种了灰葡萄孢(Botrytis cinerea)孢子(6E+06个孢子/ml)的番茄叶片测量疾病严重性。条棒代表在感染后5天评分的平均病变直径(mm),误差线代表n=5的平均标准误差。
图12:对使用抗GclCer VHH 41 D01、非相关VHH_A或水预防性处理并且接种了灰葡萄孢(Botrytis cinerea)孢子(1E+04个孢子/ml)的梨测量疾病严重性。条棒代表在感染后4天评分的平均病变直径(mm),误差线代表n=5的平均标准误差。
具体实施方式
将相对于具体实施方式说明本发明,但是本发明不限于此。
以下说明了如本文所公开的多肽、组合物和方法的声明(特征)和实施方式。除非明确相反说明,否则如所定义的本发明所公开的每个声明和实施方式可以与任何其它声明和/或实施方式结合。具体地,指明是优选的或有利的任何特征可以与指明是优选的或有利的任何其它特征组合。
如本发明申请中所公开的编号的声明为:
1.用于抵抗植物有害生物的农用化学组合物,所述组合物包含作为活性物质的至少一种80至200个氨基酸之间的多肽。
2.用于抵抗植物有害生物的农用化学组合物,所述组合物包含作为活性物质的80至200个氨基酸的至少一种多肽,其中所述多肽以所述农用化学组合物总重量的0.01至50%(w/w)的浓度存在。
3.根据声明1或2所述的农用化学组合物,其中通过与特定植物有害生物靶标的亲合力(亲合性,affinity)选择来获得所述多肽。
4.根据声明3所述的农用化学组合物,其中所述多肽对所述靶标的亲合力的解离常数小于10-6M。
5.根据声明1-4中任一项所述的农用化学组合物,其中所述多肽包含3个CDR和4个FR。
6.根据声明1-5中任一项所述的农用化学组合物,其中所述多肽来源于骆驼抗体(camelid antibody)。
7.根据声明1-6中任一项所述的农用化学组合物,其中所述多肽是VHH。
8.根据声明1-7中任一项所述的农用化学组合物,其中所述植物有害生物是真菌病原体。
9.抵抗植物有害生物的方法,所述方法包括以高于50g/公顷的包含在所述农用化学组合物中的多肽的应用量将根据声明1-8中任一项所述的组合物应用于作物。
10.产生根据声明1-8中任一项所述的农用化学组合物的方法,其包括将具有杀虫(杀灭有害生物,pesticidal)活性的80至200个氨基酸的多肽与至少一种常用农用化学助剂一起配制。
11.通过对特定植物有害生物靶标的亲合力选择获得的80至200个氨基酸的多肽,其能够以约0.00001至1μΜ的最小抑菌浓度抑制作物有害生物的生长和/或活性。
12.编码根据声明11的多肽的核酸序列。
13.包含植物可表达启动子、根据声明12的核酸序列和终止子序列的嵌合基因。
14.包含根据声明13所述的嵌合基因的重组载体。
15.包含如声明14中所定义的嵌合基因的植物。
16.包含特异性结合至植物病原体的鞘脂的抗体的至少一个重链可变域(VHH或VH)或其功能性片段的农用化学组合物。
17.根据声明1-8中任一项所述的农用化学组合物,其包含特异性结合至植物病原体的鞘脂的抗体的至少一个重链可变域(VHH或VH)或其功能性片段。
18.根据声明1-8和17中任一项所述的农用化学组合物,其包含特异性结合至植物病原体的鞘脂的重链抗体的至少一个重链可变域(VHH)或其功能性片段。
19.根据声明1-8、17和18中任一项所述的农用化学组合物,其包含特异性结合至植物病原体的鞘脂的重链抗体的至少一个骆驼重链可变域(骆驼VHH)或其功能性片段。
20.根据声明1-8和17中任一项所述的农用化学组合物,其包含特异性结合至植物病原体的鞘脂的常规四链抗体的至少一个骆驼化重链可变域(骆驼化VH)或其功能性片段。
21.根据声明1-8和17-20中任一项所述的农用化学组合物,其中所述鞘脂是神经酰胺。
22.根据声明1-8和17-21中任一项所述的农用化学组合物,其中所述鞘脂是葡糖苷酰鞘氨醇。
23.根据声明1-8和17-22中任一项所述的农用化学组合物,其中所述植物病原体是植物病原真菌。
24.根据声明1-8和17-23中任一项所述的农用化学组合物,其中所述植物病原真菌的属选自包括链格孢属(Alternaria)、壳二孢属(Ascochyta)、葡萄孢属(Botrytis)、尾孢属(Cercospora)、刺盘孢属(Colletotrichum)、色二孢属(Diplodia)、白粉菌属(Erysiphe)、镰刀菌属(Fusarium)、小球腔菌属(Leptosphaeria)、禾顶囊壳属(Gaeumannomyces)、长蠕孢属(Helminthosporium)、壳球孢属(Macrophomina)、丛赤壳属(Nectria)、青霉菌属(Penicillium)、霜霉属(Peronospora)、茎点霉属(Phoma)、瘤梗孢属(Phymatotrichum)、疫霉属(Phytophthora)、单轴霉属(Plasmopara)、叉丝单囊壳属(Podosphaera)、柄锈属(Puccinia)、核腔菌属(Pyrenophora)、梨孢属(Pyricularia)、腐霉属(Pythium)、丝核菌属(Rhizoctonia)、小菌核属(Scerotium)、核盘霉属(Sclerotinia)、壳针孢属(Septoria)、根串珠霉属(Thielaviopsis)、钩丝壳属(Uncinula)、黑星菌属(Venturia)、轮枝孢菌属(Verticillium)、大毁壳属(Magnaporthe)、布氏白粉菌属(Blumeria)、小球壳属(Mycosphaerella)、黑粉菌属(Ustilago)、无柄锈属(Melampsora)、层锈菌属(Phakopsora)、链核盘菌属(Monilinia)、毛霉菌属(Mucor)、根霉属(Rhizopus)和曲霉菌属(Aspergillus)的组。
25.根据声明1-8和17-24中任一项所述的农用化学组合物,其中所述植物病原体是选自包括以下的组的植物的植物病原体:谷类、高粱、水稻、甜菜、饲用甜菜、水果、坚果、车前科或葡萄树、豆类作物、油料作物、葫芦科植物、纤维植物、燃料作物、蔬菜、观赏植物、灌木、阔叶树、常绿植物、草、咖啡、茶、烟草、啤酒花、胡椒、橡胶和乳胶植物。
26.根据声明1-8和17-25中任一项所述的农用化学组合物,其中所述至少一个重链可变域以对保护或治疗植物或植物的一部分抵抗感染或与植物病原体的其它生物相互作用有效的量存在。
27.根据声明1-8和17-26中任一项所述的农用化学组合物,其中所述农用化学组合物中的所述至少一个重链可变域的浓度在按重量计0.0001%至50%的范围内。
28.根据声明1-8和17-27中任一项所述的农用化学组合物,其中在水溶液中配制所述至少一个重链可变域。
29.根据声明1-8和17-28中任一项所述的农用化学组合物,其还包含农用化学适合的载体和/或一种或多种适合的佐剂。
30.根据声明1-8和17-29中任一项所述的农用化学组合物,其中抗体的所述至少一个重链可变域至少包括:
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31.根据声明1-8和17-30中任一项所述的农用化学组合物,其中所述至少一个重链可变域包含选自包括SEQ ID NO:1-84的组的至少一种氨基酸序列。
32.保护或治疗植物或植物的一部分抵抗感染或与植物病原体的其它生物相互作用的方法,所述方法至少包括以下步骤:在对于保护或治疗所述植物或所述植物的一部分抵抗感染或与植物病原体的生物相互作用有效的条件下,将根据声明1-8和17-31中任一项所述的农用化学组合物直接或间接应用于所述植物或所述植物的一部分。
33.根据声明9用于保护或治疗植物或植物的一部分抵抗感染或与植物病原体的其它生物相互作用的方法,所述方法至少包括以下步骤:在对于保护或治疗所述植物或所述植物的一部分抵抗感染或与植物病原体的生物相互作用有效的条件下,将根据声明1-8和17-31中任一项所述的农用化学组合物直接或间接应用于所述植物或所述植物的一部分。
34.根据声明9、32或33中任一项所述的方法,其包括以高于50g农用化学组合物/公顷的应用量,将根据声明1-8和17-31中任一项所述的农用化学组合物直接或间接应用于植物或植物的一部分。
35.根据声明9或32-34中任一项所述的方法,其中通过喷雾、雾化、起泡、生雾(fogging)、在水培法中培养、在水耕法中培养、涂覆、浸没和/或结壳将所述农用化学组合物直接或间接应用于植物或植物的一部分。
36.根据声明9或32-35中任一项所述的方法,其中任选地在收获后,将所述农用化学组合物直接或间接应用于植物或植物的一部分。
37.用于保护或治疗收获的植物或植物收获的部分抵抗感染或与植物病原体的其它生物相互作用的收获后治疗(处理,treatment)方法,所述方法至少包括以下步骤:在对于保护或治疗所述收获的植物或所述植物收获的部分抵抗感染或与植物病原体的生物相互作用有效的条件下,将根据声明1-8和17-31中任一项所述的农用化学组合物直接或间接应用于所述收获的植物或所述植物收获的部分。
38.根据声明1-8和17-31中任一项所述的农用化学组合物作为抗有害生物试剂的应用。
39.根据声明38所述的应用,其中所述抗有害生物试剂是生物抑制剂。
40.根据声明38或39所述的应用,其中所述抗有害生物试剂是抑真菌剂。
41.根据声明38所述的应用,其中所述抗有害生物试剂是有害生物杀灭剂(pesticidal agent)。
42.根据声明38或41所述的应用,其中所述抗有害生物试剂是杀真菌剂。
43.抑制植物病原体生长的方法,其包括至少以下步骤:将根据声明1-8和17-31中任一项所述的农用化学组合物直接或间接应用于植物或植物的一部分。
44.杀死植物病原体的方法,其包括至少以下步骤:将根据声明1-8和17-31中任一项所述的农用化学组合物直接或间接应用于植物或植物的一部分。
45.根据声明43或44所述的方法,其中通过喷雾、雾化、起泡、生雾(fogging)、在水培法中培养、在水耕法中培养、涂覆、浸没和/或结壳将所述农用化学组合物直接或间接应用于植物或植物的一部分。
46.根据声明43-45中任一项所述的方法,其中任选地在收获后,将所述农用化学组合物直接或间接应用于植物或植物的一部分。
47.用于产生根据声明1-8和17-31中任一项所述的农用化学组合物的方法,其至少包括以下步骤:
—获得特异性结合至植物病原体的鞘脂的抗体的至少一个重链可变域(VHH或VH)或其功能性片段,和
—在根据声明1-8和17-31中任一项所述的农用化学组合物中配制可变域或其功能性片段。
48.用于产生根据声明1-8和17-31中任一项所述的农用化学组合物的根据声明10所述的方法,其至少包括以下步骤:
—获得特异性结合至植物病原体的鞘脂的抗体的至少一个重链可变域(VHH或VH)或其功能性片段,和
—在根据声明1-8和17-31中任一项所述的农用化学组合物中配制可变域或其功能性片段。
49.根据声明10、47或48所述的方法,其中获得特异性结合至植物病原体鞘脂的抗体的至少一个重链可变域或其功能性片段的步骤包括:
(a)表达编码特异性结合至植物病原体鞘脂的抗体重链可变域(VHH或VH)或其功能性片段的核苷酸序列,和任选地
(b)分离和/或纯化所述可变域或其功能性片段。
50.根据声明10、47或48所述的方法,其中获得特异性结合至植物病原体鞘脂的抗体的至少一个重链可变域或其功能性片段的步骤包括:
a)提供重链可变域序列或其功能性片段序列的组、集合或文库;
b)对重链可变域序列或其功能性片段序列的组、集合或文库筛选特异性结合至植物病原体的鞘脂和/或对植物病原体的鞘脂具有亲合力的序列,和任选地
c)分离特异性结合至植物病原体的鞘脂和/或对植物病原体的鞘脂具有亲合力的可变域序列或其功能性片段序列。
[定义]
将相对于具体实施方式说明本发明,但是本发明不限于此,而是仅受权利要求的限制。权利要求中的任何参考符号不应视作对范围的限制。
当在本说明和权利要求中使用术语“包含”时,它不排除其它元素或步骤。
当对于单数名词使用不定冠词或定冠词时,例如,“一个”或“一种”、“所述”,则除非具体说明了其它情形,否则这包括该名词的复数。
当表示可测量值,如参数、量、短暂持续时间等时,如本文所使用的术语“约”表示涵盖了给定值的和与给定值相差+/-10%或更小的,优选地+/-5%或更小的,更优选地+/-1%或更小,并且更优选地+/-0.1%或更小的变化,在该范围内,在所公开的发明中实施这些变化是合理的。应理解本身还具体并且优选地公开了修饰词“约”所涉及的值。
仅为了帮助理解本发明,提供了以下术语或定义。除非在本文中明确定义,否则本文所使用的术语的含义与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同。实践者具体参考:Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold SpringHarbor Press,Plainsview,New York(1989);和Ausubel等人,Current Protocols inMolecular Biology(Supplement 47),John Wiley&Sons,New York(1999),用于本领域的定义和术语。本文所提供的定义不应视为具有小于本领域技术人员所理解的范围。
除非另外说明,否则可以实施未详细明确描述的所有方法、步骤、技术和操作,并且对于技术人员将是清楚的,以本身已知的方式进行。例如,另外参考了标准手册、以上提及的一般背景技术和其中引用的其它参考文献。
如本文所使用的,术语“多肽”、“蛋白质”、“肽”和“氨基酸序列”是可互换使用的,并且表示任何长度的氨基酸的聚合形式,它可以包括编码和非编码氨基酸,化学或生物化学修饰或衍生化的氨基酸,和具有修饰的肽主链(骨架,backbone)的多肽。
如本文所使用的,将通过它们的全称或者根据标准3字母或单字母氨基酸代码表示氨基酸残基。
如本文所使用的,术语“核酸分子”、“多核苷酸”、“多聚核酸”、“核酸”是可互换使用的,并且表示任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸,或其类似物)的聚合形式。多核苷酸可以具有任何三维结构,并且可以实施任何已知的或未知的功能。多核苷酸的非限制性实例包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使核糖核酸(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核糖酶、cDNA、重组多核苷酸、分支(支化,branched)多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、控制区、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。核酸分子可以是线性的或环形的。
如本文所使用的,术语“同源性”表示两个大分子之间(具体地,两个多肽或多核苷酸之间,其来自相同或不同的分类单元)至少二级结构相似性,其中所述相似性是由于共有祖先所造成的。因此,术语“同系物”表示具有所述二级和任选地三级结构相似性的所相关的大分子。为了比较两个或更多个核苷酸序列,可以使用本领域技术人员已知的方法计算第一核苷酸序列与第二核苷酸序列之间的“序列同一性(的百分比)”,例如,通过将第一核苷酸序列中与第二核苷酸序列对应位置处的核苷酸相同的核苷酸的数目除以第一核苷酸序列中核苷酸的总数并乘以100%或者通过使用用于序列对比的已知的计算机算法,如NCBI Blast。确定两个氨基酸序列之间的序列同一性程度时,技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代(替换),它通常可以被描述为其中氨基酸残基被具有类似化学结构的另一种氨基酸残基替代并且对多肽的功能、活性或其它生物性质具有很少或基本无影响的氨基酸取代。可能的保守氨基酸取代将对本领域技术人员是显而易见的。如果在它们的整个长度上具有100%的序列同一性,则氨基酸序列和核酸序列被称为是“完全相同的”。
在抗体背景内,如本文所使用的,术语“互补决定区”或“CDR”是指H(重)或L(轻)链(还分别缩写为VH和VL)的可变区并且包含能够特异性结合至抗原靶标的氨基酸序列。这些CDR区负责抗体对特定抗原决定簇结构的基本特异性。这些区还被称为“高变区”。CDR代表可变区内的非邻接氨基酸段,但不考虑物种,已发现这些关键氨基酸序列在可变重链和轻链区内的位置定位在可变链的氨基酸序列内具有相似的定位。所有规范抗体(canonicalantibodies)的可变重链和轻链各具有3个CDR区,对于各轻(L)链和重(Η)链,每个CDR区与其它CDR区不邻接(称为L1、L2、L3、H1、H2、H3)。
如本文所使用的,术语“亲合力”是指多肽(具体地免疫球蛋白,如抗体或免疫球蛋白片段,如VHH)结合至抗原从而使抗原和多肽的平衡向通过它们的结合所形成的复合物的存在性移动的程度。因此,例如,当抗原和抗体(片段)以相对相等的浓度结合时,高亲合力的抗体(片段)将结合至可用的抗原,从而平衡向高浓度的所得复合物的方向移动。解离常数通常用于描述蛋白结合域和抗原靶标之间的亲合力。通常,解离常数小于10-5M。优选地,解离常数小于10-6M,更优选地,小于10-7M。最优选地,解离常数小于10-8M。
如本文所使用的,术语“特异性结合”和“特异性结合的”一般是指多肽,具体地免疫球蛋白,如抗体或免疫球蛋白片段,如VHH优先结合至存在于不同抗原的均一混合物中的特定抗原的能力。在某些实施方式中,特异性结合相互作用将区分样品中希望和不希望的抗原,在一些实施方式中,大于约10至100倍或更大(例如,大于约1000或10000倍)。
因此,当氨基酸序列对所述靶标(或至少一部分或其片段)具有亲合力、特异性和/或特异性针对所述靶标(或至少一部分或其片段)时,如本文所公开的氨基酸序列称为“特异性结合至”特定靶标。
可以基于亲合力(affinity)和/或亲合性(avidity)确定如本文所公开的氨基酸序列的“特异性”。
当它结合至所关心的第一靶标抗原的亲合力比如本文所公开的氨基酸序列结合至所关心的第二靶标抗原的亲合力高至少5倍,如至少10倍,如至少100倍,并且优选地至少1000倍时,将如本文所公开的氨基酸序列称为“相对于所关心的第二靶标抗原,对所关心的第一靶标抗原特异”。因此,在某些实施方式中,当相对于所关心的第二靶标抗原,将如本文所公开的氨基酸序列称为对所关心的第一靶标抗原“特异”,则它可以特异性结合至(如本文所定义的)所关心的第一靶标抗原,但不能特异性结合至所关心的第二靶标抗原。
如本文所使用的,术语“抑制”、“降低”和/或“防止”可以表示特异性结合至所关心的靶标抗原并且抑制、降低和/或防止所关心的靶标抗原与其天然结合伴侣之间的相互作用的如本文所公开的氨基酸序列(的使用)。术语“抑制”、“降低”和/或“防止”还可以表示特异性结合至所关心的靶标抗原并且抑制、降低和/或防止所关心的靶标抗原的生物活性(如使用适合的体外、细胞或体内测定所测量的)的如本文所公开的氨基酸序列(的使用)。因此,术语“抑制”、“降低”和/或“防止”还可以表示特异性结合至所关心的靶标抗原并且抑制、降低和/或防止其中涉及所关心的靶标抗原的一种或多种生物或生理机制、作用、反应、功能途径或活性的如本文所公开的氨基酸序列(的使用)。根据所关心的靶标抗原,可以以任何适合的方式和/或使用任何本领域中已知的适合的(体外,并且通常细胞或体内)测定确定如本文所公开的氨基酸序列作为拮抗剂的这种作用。
因此,更具体地,使用如本文所公开的氨基酸序列的“抑制”、“降低”和/或“防止”可以表示抑制、降低和/或防止所关心的靶标抗原与其天然结合伴侣之间的相互作用,或者抑制、降低和/或防止所关心的靶标抗原的活性,或抑制、降低和/或防止其中涉及所关心的靶标抗原的一种或多种生物或生理机制、作用、反应、功能途径或活性,如使用适合的体外、细胞或体内测定所测量的,与在相同条件下在相同测定中但不使用如本文所公开的氨基酸序列时所关心的靶标抗原的活性相比,抑制、降低和/或防止了(如)至少10%、但优选地至少20%,例如至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或更多。另外,“抑制”、“降低”和/或“防止”还可以表示引起所关心的靶标抗原对其天然结合伴侣中的一种或多种的亲合力(affinity)、亲合性(avidity)、特异性和/或选择性的降低和/或与相同条件但不存在如本文所公开的氨基酸序列时相比,引起所关心的靶标抗原对所关心的靶标抗原所处的介质或周围环境中的一种或多种条件(如pH、离子强度、辅因子的存在等)的敏感性的降低。在本发明的背景中,“抑制”、“降低”和/或“防止”还可以涉及所关心的靶标抗原的活性的变构抑制、降低和/或防止。
抑制或拮抗如本文所公开的氨基酸序列的活性或者提高或激动(agonize)其活性可以是可逆的或不可逆的,但对于农用化学品应用通常将可逆地发生。
如本文所使用的,当已从产生它的宿主细胞和/或介质中提取或纯化时,将如本文所公开的氨基酸序列认为是“(处于)基本分离的(形式)”。
相对于如本文所公开的氨基酸序列,在本文中,术语在如本文所公开的氨基酸序列上存在的“结合区”、“结合位点”或“相互作用位点”应具有以下含义:靶标分子上存在的特定位点、区、位置、部分或域,所述特定位点、区、位置、部分或域负责与该靶标分子结合。因此,该结合区基本由靶标分子的特定位点、区、位置、部分或域组成,当与该靶标分子结合时,其与氨基酸序列接触。
如本文所使用的,“植物”表示活的植物或活的植物部分,包括新鲜水果、蔬菜和种子。另外,如本文所使用的术语“植物”涵盖了完整植物、植物的祖代和子代以及植物部分,包括种子、芽、茎、叶、根(包括块茎(tuber))、花以及组织和器官,其中每个上述部分包含所关心的基因/核酸。术语“植物”还涵盖了植物细胞、悬浮培养、愈伤组织、胚芽、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子,再次其中每个上述部分包含所关心的基因/核酸。
适合的对照植物的选择是实验计划的常规部分并且可以包括相应的野生型植物或无所关心基因的相应植物。对照植物通常与所评价的植物是相同植物种或甚至相同变种。对照植物还可以是所评价的植物的无效纯合子(nullizygote)。无效纯合子是通过分离(segregation)而错过转基因的个体。如本文所使用的,“对照植物”不但是指完整植物,而且还是指植物部分,包括种子和种子部分。
如本文所使用的“作物”是指作为食物、家畜饲料、燃料原材料或出于任何其它经济目的生长至收获的植物种或变种。作为非限制性实例,所述作物可以是玉米、谷类,如小麦、黑麦(rye)、大麦和燕麦、高粱、水稻、甜菜和饲用甜菜、水果,如仁果类(pome fruit)(例如,苹果和梨)、柑桔类水果(例如,橙、柠檬、酸橙、葡萄柚或桔)、核果(例如,桃、油桃或李子)、坚果(例如,杏仁或胡桃)、软果(例如,樱桃、草莓、黑莓或树莓)、车前科或葡萄树、豆类作物,如豆、小扁豆、豌豆和大豆、油料作物,如向日葵、红花、油菜籽、油菜、蓖麻或橄榄、葫芦科植物,如黄瓜、甜瓜或南瓜、纤维植物,如棉花、亚麻或大麻、燃料作物,如甘蔗、芒属或柳枝稷、蔬菜,如马铃薯、番茄、胡椒、莴苣、菠菜、洋葱、胡萝卜、茄子、芦笋或卷心菜、装饰植物,如花(例如,矮牵牛、天竺葵、玫瑰、郁金香、百合或菊花)、灌木、阔叶树(例如,白杨或柳树)和常绿植物(例如,针叶树)、草,如草地、草皮或饲用牧草或其它有用的植物,如咖啡、茶、烟草、啤酒花、胡椒、橡胶或乳胶植物。
如本文所使用的“有害生物”是对植物、动物、人或人所关心的事物(humanconcerns)有害的生物,并且包括(但不限于)作物有害生物(如随后定义的)、家居有害生物,如蟑螂、蚂蚁等和疾病媒介物,如疟疾蚊子。
如在本发明申请中可互换使用的“植物有害生物”、“植物病原体”或“作物有害生物”是指特异性地对植物、植物部分或植物产品,具体地,在农业中使用的植物、植物部分或植物产品有害的生物。注意,术语“植物有害生物”或“作物有害生物”用于表示所述有害生物靶向或损害植物。有害生物具体地属于无脊椎动物(例如,昆虫(包括农业有害生物昆虫、装饰植物昆虫有害生物、森林昆虫有害生物)。相关作物有害生物的实例包括(但不限于)蚜虫、毛虫、蝇、黄蜂等、线虫(在土壤中自由生活或具体地寄生于植物根部的种,如根结线虫和胞囊线虫,如大豆胞囊线虫和马铃薯胞囊线虫)、螨虫(如蛛螨、跗线螨(thread-footedmite)和瘿螨)和腹足类(包括蛞蝓,如灰蛞蝓属物种(Deroceras spp.)、Milax spp.、Tandonia sp.、蛞蝓属物种(Limax spp.)、阿勇蛞蝓属物种(Arion spp.)和Veronicellaspp.和蜗牛,如大蜗牛属物种(Helix spp.)、Cernuella spp.、Theba spp.、Cochlicellaspp.、玛瑙螺属物种(Achatina spp.)、琥珀螺属物种(Succinea spp.)、Ovachlamys spp.、Amphibulima spp.、Zachrysia spp.、巴蜗牛属物种(Bradybaena spp.)和福寿螺属物种(Pomacea spp.))、病原性真菌(包括子囊菌(如镰刀菌属物种(Fusarium spp.)、根串珠霉属物种(Thielaviopsis spp.)、轮枝孢菌属物种(Verticillium spp.)、大毁壳属物种(Magnaporthe spp.))、担子菌(如丝核菌属物种(Rhizoctonia spp.)、层锈菌属物种(Phakospora spp.)、柄锈菌属(Puccinia spp.))和真菌样卵菌(如腐霉属物种(Pythiumspp.)和疫霉属物种(Phytophthora spp.))、细菌(如伯克氏菌属物种(Burkholderiaspp.)和蛋白菌,如黄单胞菌属物种(Xanthomonas spp.)和假单胞菌属物种(Pseudomonasspp.))、植原体、螺原体、病毒(如烟草花叶病毒和花椰菜花叶病毒)和原生动物。
如本文所使用的“微生物”表示细菌、病毒、真菌、酵母等并且“微生物的”表示来源于微生物。
如本文所使用的“真菌”表示真核生物,其属于真菌门组。在本发明中术语真菌还包括真菌样生物,如卵菌纲(Oomycota)。卵菌纲(或卵菌)构成了真菌样真核微生物独特的系统发生谱系。该组原本在真菌中分类,但是现代观点支持在异长鞭毛体组内与光合生物(如褐藻和硅藻)相对近的关系。
如本文所使用的“有害生物感染”或“有害生物疾病”是指生物机体(如植物、动物或人)内由有害生物引起的任何炎性病况、疾病或病症。
如本文所使用的“真菌感染”或“真菌疾病”是指生物机体(如植物、动物或人)内由真菌引起的任何炎性病况、疾病或病症。
如在本文中可互换使用的,“活性物质”、“活性成分”或“有效物质”表示任何生物、生物化学或化学成分以及基于它的衍生物、片段或化合物,其对受试者上,并且具体地植物、植物部分或植物产品上的有害生物具有一般或特异性作用,这是因为它们天然存在或通过生产获得,其包含不可避免地由生产过程所产生的任何杂质。
如本文所使用的,“农用化学品”表示适合在农用化学品行业(包括农业、园艺、花卉园艺以及家庭和花园使用)中使用,以及设计用于非作物相关使用的产品,如公共健康/有害生物控制操作使用以控制不希望的昆虫和啮齿类动物、家庭使用,如家庭杀真菌剂和杀虫剂以及用于保护植物或植物部分、作物、球茎、块茎、果实(例如,抵抗有害生物、疾病或有害生物)的试剂;用于控制,优选地促进或提高植物生长的试剂;和/或用于促进植物、作物或所收获的植物部分(例如,它的果实、花、种子等)的产量的试剂。这些物质的实例对于技术人员将是清楚的并且可以(例如)包括作为以下物质是有活性的化合物:杀虫剂(例如,接触性杀虫剂或内吸性(系统性,systemic)杀虫剂,包括用于家庭使用的杀虫剂)、除草剂(例如,接触性除草剂或内吸性除草剂,包括用于家庭使用的除草剂)、杀真菌剂(例如,接触性杀真菌剂或内吸性杀菌剂,包括用于家庭使用的杀真菌剂)、杀线虫剂(例如,接触性杀线虫剂或内吸性杀线虫剂,包括用于家庭使用的杀线虫剂)和其它杀虫剂或杀生物剂(例如,用于杀死昆虫或蜗牛的试剂);以及肥料;生长调节剂,如植物激素;微量营养物、安全剂、信息素;防水剂;捕虫饵;和/或用于调节(例如,提高、降低、抑制、增强和/或触发)靶向植物中或靶向植物(例如,要保护的植物或要控制的植物)的基因表达(和/或其它生物或生物化学过程)的活性物质,如出于此目的本身已知的核酸(例如,单链或双链RNA,如(例如)在RNAi技术背景中使用的)和其它因子、蛋白质、化学品等。这些农用化学品的实例对于技术人员将是清楚的;并且(例如)无限制地包括:草甘膦、百草枯、异丙甲草胺、乙草胺、甲基磺草酮、2,4-D、阿特拉津、草铵膦、草硫膦、精恶唑禾草灵、二甲戊乐灵、毒莠定、氟乐灵、溴苯腈、炔草酯、氟草烟、烟嘧磺隆、苄嘧磺隆、咪草烟、麦草畏、吡虫啉、噻虫嗪、氟虫腈、毒死蜱、溴氰菊酯、λ-三氟氯氰菊酯、硫丹、甲胺磷、呋喃丹、噻虫胺、氯氰菊酯、阿巴克丁、吡氟酰草胺、多杀菌素、茚虫威、联苯菊酯、七氟菊酯、嘧菌酯、噻虫嗪、戊唑醇、代森锰锌、氰霜唑、氟啶胺、唑菌胺酯、氟环唑、百菌清、铜杀真菌剂、肟菌酯、丙硫菌唑、苯醚甲环唑、多菌灵、丙环唑、托布津、硫、啶酰菌胺及其它已知的农用化学品或其任何适合的组合。
如本文所使用的“农用化学组合物”表示如进一步所定义的用于农用化学使用的组合物,其包含至少一种活性物质,和任选地有利于农用化学品的最佳分散、雾化、沉积、叶片润湿、分布、保留和/或吸收的一种或多种添加剂。根据本文中的进一步说明将明确如本文所使用的农用化学组合物包括生物控制剂或生物杀虫剂(包括(但不限于)生物杀生物剂、生物抑制剂、抑真菌剂和杀真菌剂)并且这些术语在本发明申请中将是可互换使用的。因此,如本文所使用的农用化学组合物包括包含作为活性成分、物质或要素用于控制植物或其它农业相关背景(如(例如)土壤)中有害生物的至少一种生物分子的组合物。在本文所公开的农用化学组合物中用作活性要素的生物分子的非限制性实例是蛋白质(包括抗体及其片段,如(但不限于)抗体的重链可变域片段,包括VHH)、核酸序列、(聚)糖、脂质、维生素、激素糖脂、固醇和甘油酯。
作为非限制性实例,本文所公开的农用化学组合物中的添加剂可以包括(但不限于)稀释剂、溶剂、佐剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂(spreading agents)、油剂、固着剂(stickers)、增稠剂、渗透剂、缓冲剂、酸化剂、防沉剂、抗冻剂、光保护剂、消泡剂、杀菌剂(杀生物剂,biocide)和/或漂移控制剂(drift control)。
如本文所使用的“生物抑制组合物”或“生物抑制剂”表示任何活性成分、物质或要素或包含用于生物抑制使用的任何活性成分、物质或要素的组合物(如本文进一步定义的),所述组合物包含任选地与有利于所述活性物质或成分的最佳分散、雾化、沉积、叶片润湿、分布、保留和/或吸收的一种或多种添加剂混合的至少一种活性生物抑制物质或成分。作为非限制性实例,这些添加剂是稀释剂、溶剂、佐剂、(离子)表面活性剂、润湿剂、分散剂、油剂、固着剂、增稠剂、渗透剂、缓冲剂、酸化剂、防沉剂、抗冻剂、光保护剂、消泡剂、杀菌剂、蛋白酶抑制剂和/或漂移控制剂。
如本文所使用的“杀生物组合物”或“杀生物剂”表示任何活性成分、物质或要素或包含用于杀生物使用的任何活性成分、物质或要素的组合物(如本文进一步定义的),所述组合物包含任选地与有利于所述活性物质或成分的最佳分散、雾化、沉积、叶片润湿、分布、保留和/或吸收的一种或多种添加剂混合的至少一种活性杀生物物质或成分。作为非限制性实例,这些添加剂是稀释剂、溶剂、佐剂、(离子)表面活性剂、润湿剂、分散剂、油剂、固着剂、增稠剂、渗透剂、缓冲剂、酸化剂、防沉剂、抗冻剂、光保护剂、消泡剂、杀生物剂、蛋白酶抑制剂和/或漂移控制剂。
如本文所使用的“抑真菌组合物”或“抑真菌剂”表示任何活性成分、物质或要素或包含用于抑真菌使用的任何活性成分、物质或要素的组合物(如本文进一步定义的),所述组合物包含任选地与有利于所述活性物质或成分的最佳分散、雾化、沉积、叶片润湿、分布、保留和/或吸收的一种或多种添加剂混合的至少一种活性抑真菌物质或成分。作为非限制性实例,这些添加剂是稀释剂、溶剂、佐剂、(离子)表面活性剂、润湿剂、分散剂、油剂、固着剂、增稠剂、渗透剂、缓冲剂、酸化剂、防沉剂、抗冻剂、光保护剂、消泡剂、杀生物剂、蛋白酶抑制剂和/或漂移控制剂。
如本文所使用的“杀真菌组合物”或“杀真菌剂”表示任何活性成分、物质或要素或包含用于杀真菌使用的任何活性成分、物质或要素的组合物(如本文进一步定义的),所述组合物包含任选地与有利于所述活性物质或成分的最佳分散、雾化、沉积、叶片润湿、分布、保留和/或吸收的一种或多种添加剂混合的至少一种活性杀真菌物质或成分。作为非限制性实例,这些添加剂是稀释剂、溶剂、佐剂、(离子)表面活性剂、润湿剂、分散剂、油剂、固着剂、增稠剂、渗透剂、缓冲剂、酸化剂、防沉剂、抗冻剂、光保护剂、消泡剂、杀生物剂、蛋白酶抑制剂和/或漂移控制剂。
如本文所使用的,“农用化学应用”不但包括适合于和/或设计用于在田间生长作物(例如,农作物)中使用的如上定义的农用化学品(例如,杀虫剂、生长调节剂、营养剂/肥料、驱虫剂(repellant)、脱叶剂等)的使用,而且还包括旨在温室生长作物(例如,园艺/花卉园艺作物)或溶液培养系统中使用的如上定义的农用化学品(例如,杀虫剂、生长调节剂、营养剂/肥料、驱虫剂、脱叶剂等)的使用,并且甚至包括适合于和/或设计用于非作物使用,如私人花园中的使用、家庭使用(例如,用于家庭使用的除草剂或杀虫剂)或有害生物防治操作人员(例如,杂草控制等)的使用的如上定义的农用化学品的使用。
如本文所使用的,“生物抑制(作用)”或“生物抑制应用”包括用于控制、调节或干扰有害生物(如植物有害生物或植物病原体)的有害活性的活性物质(任选地包含在如本文所定义的生物抑制、杀生物、杀真菌或抑真菌组合物中)的任何作用或使用,其包括(但不限于)抑制有害生物的生长或活性,改变有害生物的行为以及排斥或吸引植物、植物部分中的有害生物或者在其它农业相关背景中,如(例如)用于家用用途或在土壤中使用。
如本文所使用的,“生物杀死(作用)”或“生物杀死应用”包括用于控制、调节或干扰有害生物(如植物有害生物或植物病原体)的有害活性的活性物质(任选地包含在如本文所定义的杀生物或杀真菌组合物中)的任何作用或使用,其包括(但不限于)杀死有害生物、抑制有害生物的生长或活性,改变有害生物的行为以及排斥或吸引植物、植物部分中的有害生物或者在其它农业相关背景中,如(例如)用于家用用途或在土壤中使用。
如本文所使用的,“抑真菌(作用)”或“抑真菌应用”包括用于控制、调节或干扰真菌的有害活性的活性物质(任选地包含在如本文所定义的杀真菌或抑真菌组合物中)的任何作用或使用,其包括(但不限于)抑制真菌的生长或活性,改变真菌的行为以及排斥或吸引植物、植物部分中的真菌或者在其它农业相关背景中,如(例如)用于家用用途或在土壤中使用。
如本文所使用的,“杀真菌(作用)”或“杀真菌应用”包括用于控制、调节或干扰真菌的有害活性的活性物质(任选地包含在如本文所定义的杀真菌组合物中)的任何作用或使用,其包括(但不限于)杀死真菌、抑制真菌的生长或活性,改变真菌的行为以及排斥或吸引植物、植物部分中的真菌或者在其它农业相关背景中,如(例如)用于家用用途或在土壤中使用。
如在本文中可互换使用的,“杀虫活性”或“杀生物活性”表示干扰有害生物的有害活性,其包括(但不限于)杀死有害生物,抑制有害生物的生长或活性,改变有害生物的行为,排斥或吸引有害生物。
如本文所使用的,“生物抑制活性”表示干扰有害生物的有害活性,其包括(但不限于)抑制有害生物的生长或活性,改变有害生物的行为,排斥或吸引有害生物。
可以将活性成分、物质或要素或者包含杀虫、杀生物或生物抑制活性成分、物质或要素的组合物的杀虫、杀生物或生物抑制活性表示为试剂的最小抑制活性(MIC)(以浓度单位表示,如(例如)mg/mL),然而,不限于此。
如本文所使用的,“杀真菌活性”表示干扰真菌的有害活性,其包括(但不限于)杀死真菌,抑制真菌的生长或活性,改变真菌的行为和排斥或吸引真菌。
如本文所使用的,“抑真菌活性”表示干扰真菌的有害活性,其包括(但不限于)抑制真菌的生长或活性,改变真菌的行为和排斥或吸引真菌。
可以将活性成分、物质或要素或者包含杀虫、杀生物或生物抑制活性成分、物质或要素的组合物的杀真菌或抑真菌活性表示为试剂的最小抑制活性(MIC)(以浓度单位表示,如(例如)mg/mL),然而,不限于此。
如本文所使用的,“载体”表示其中或其上可以适合地引入、包含、固定、吸附、吸收、结合、包封、包埋、连接或含有活性物质的任何固体、半固体或液体载体。这些载体的非限制性实例包括纳米胶囊、微胶囊、纳米球、微球、纳米颗粒、微粒、脂质体、囊泡、珠、凝胶、弱离子树脂颗粒、脂质体、蜗牛壳形递送媒介(cochleate delivery vehicle)、小颗粒、颗粒、纳米管、巴克球(Bucky ball)、作为油包水乳剂的一部分的水滴、作为水包油的乳剂的一部分的油滴、有机材料,如软木、木材或其它植物来源的材料(例如,以种皮、木材、木屑、浆料、球、珠、片材的形式或任何其它适合的形式)、纸或纸板、无机材料,如滑石、粘土、微晶纤维素、二氧化硅、氧化铝、硅酸盐和沸石,或甚至微生物细胞(如酵母细胞)或其适合的部分或片段。
如本文所使用的,术语“抗体”是指多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、单链抗体及其片段,如Fab、F(ab)2、Fv以及保留了亲本抗体的抗原结合功能的其它片段。照此,抗体可以表示免疫球蛋白或糖蛋白或者其片段或部分,或者表示包含抗原结合部分的构建体,所述抗原结合部分包含在修饰的免疫球蛋白样构架内,或者表示包含在构建体内的抗原结合部分,所述构建体包含非免疫球蛋白样构架或支架。
如本文所使用的,术语“单克隆抗体”是指具有同源性抗体群体的抗体组合物。对于抗体的物种或来源,该术语不受限制,并且它不意欲受其制备方式的限制。该术语涵盖了完整免疫球蛋白以及片段,如Fab、F(ab)2、Fv以及保留了抗体的抗原结合功能的其它片段。可以在本发明中使用任何哺乳动物物种的单克隆抗体。然而,在实践中,由于大鼠或鼠科细胞系对于制备产生单克隆抗体所需的杂交细胞系或杂交瘤的使用的可用性,抗体通常将是大鼠或鼠科来源的。
如本文所使用的,术语“多克隆抗体”是指具有非均一抗体群体的抗体组合物。多克隆抗体通常来源于来自免疫的动物或来自所选的人的混合血清(pooled serum)。
如本文所使用的,“抗体的重链可变域或其功能性片段”表示(i)重链抗体的重链可变域,其天然缺少轻链(此后还表示为VHH),其包括(但不限于)骆驼或鲨鱼的重链抗体的重链可变域;或者(ii)常规四链抗体的重链可变域(此后还表示为VH),其包括(但不限于)常规四链抗体的重链骆驼(骆驼化,camelized)(如本文进一步定义的)可变域(此后还表示为骆驼VH)。如下文进一步描述的,抗体的重链可变域的氨基酸序列和结构可以认为(然而,不限于此)由4个框架区或“FR”组成,所述框架区在本领域中和在下文中分别被称为“框架区1”或者“FR1”;"框架区2"或者"FR2";"框架区3"或者"FR3";和"框架区4"或者"FR4";所述框架区被3个互补决定区或“CDR”隔断,所述互补决定区在本领域中分别被称为“互补决定区1”或“CDR1”;"互补决定区2"或"CDR2"和"互补决定区3"或"CDR3"。
还如下文进一步描述的,抗体重链可变域(包括VHH或者VH)中氨基酸残基的总数可以在110-130的范围内,优选地,112-115,并且最优选地113。然而,应注意抗体重链可变域的部分、片段或类似物不具体受限于它们的长度和/或大小,只要这些部分、片段或类似物保留了功能活性(的至少一部分),如杀虫、杀生物、抑制生物活性(biostatic activity)、杀真菌或抑真菌活性(如本文所定义的)和/或保留了这些部分、片段或类似物所来源的抗体的原始重链可变域的结合特异性(的至少一部分)。在本文中,保留了功能活性(的至少一部分),如杀虫、杀生物、抑制生物活性(biostatic activity)、杀真菌或抑真菌活性(如本文所定义的)和/或保留了这些部分、片段或类似物所来源的抗体的原始重链可变域的结合特异性(的至少一部分)的部分、片段或类似物还被进一步称为重链可变域的“功能性片段”。
如在上文提及的Riechmann和Muyldermans的论文中对来自骆驼的VHH域所应用的(参见,例如,所述参考文献的图2),根据Kabat等人(“Sequence of proteins ofimmunological interest”,US Public Health Services,NIH Bethesda,Md.,Publication No.91)提供的对重链可变域的一般编号方法,对抗体的重链可变域(包括VHH或VH)的可变域的氨基酸残基编号。根据该编号方法,重链可变域的FR1包含位置1-30的氨基酸残基,重链可变域的CDR1包含位置31-36的氨基酸残基,重链可变域的FR2包含位置36-49的氨基酸,重链可变域的CDR2包含位置50-65的氨基酸残基,重链可变域的FR3包含位置66-94的氨基酸残基,重链可变域的CDR3包含位置95-102的氨基酸残基,和重链可变域的FR4包含位置103-113的氨基酸残基。[在这方面,应指出-如本领域中对VHH域所熟知的-每个CDR中氨基酸残基的总数可以改变并且可以不对应于Kabat编号所指明的氨基酸残基的总数(也就是说,在真实序列中可以不占据根据Kabat编号的一个或多个位置,或真实序列可以含有比Kabat编号所允许的数目更多的氨基酸残基)。这表示通常根据Kabat的编号可以对应或可以不对应于真实序列中氨基酸残基的真实编号。然而,通常可以说根据Kabat的编号并且不管CDR中氨基酸残基的数目,根据Kabat编号的位置1对应于FR1的开始并且反之亦然,根据Kabat编号的位置36对应于FR2的开始并且反之亦然,根据Kabat编号的位置66对应于FR3的开始并且反之亦然,并且根据Kabat编号的位置103对应于FR4的开始并且反之亦然]。
用于重链可变域的氨基酸残基编号的替代方法是Chothia等人(Nature 342,877-883(1989))所述的方法,所谓的“AbM定义”和所谓的“接触定义”。然而,在本发明的说明书、权利要求和附图中,除非另外说明,否则将遵守如通过Riechmann和Muyldermans应用于VHH域的根据Kabat的编号。
对于重链抗体及其可变域的一般说明,特别参考以下参考文献,其作为一般背景技术提及:Vrije Universiteit Brussel的WO 94/04678、WO 95/04079和WO 96/34103;Unilever的WO 94/25591、WO 99/37681、WO 00/40968、WO 00/43507、WO 00/65057、WO 01/40310、WO 01/44301、EP 1134231和WO 02/48193;Vlaams Instituut voorBiotechnologie(VIB)的WO 97/49805、WO 01/21817、WO 03/035694、WO 03/054016和WO03/055527;Algonomics N.V.和Ablynx NV的WO 03/050531;National Research Councilof Canada的WO 01/90190;Institute of Antibodies的WO 03/025020(=EP 1433793);以及Ablynx NV的WO 04/041867、WO 04/041862、WO 04/041865、WO 04/041863、WO 04/062551和Ablynx NV的其它公开的专利申请;Hamers-Casterman等人,Nature 1993 Jun.3;363(6428):446-8;Davies和Riechmann,FEBS Lett.1994 Feb.21;339(3):285-90;Muyldermans等人,Protein Eng.1994September;7(9):1129-3;Davies和Riechmann,Biotechnology(NY)1995 May;13(5):475-9;Gharoudi等人,9th Forum of AppliedBiotechnology,Med.Fac.Landbouw Univ.Gent.1995;60/4a part I:2097-2100;Davies和Riechmann,Protein Eng.1996 June;9(6):531-7;Desmyter等人,Nat Struct Biol.1996September;3(9):803-11;Sheriff等人,Nat Struct 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通常,应注意如本文以其最广泛的含义所使用的术语“重链可变域”不局限于特定的生物来源或特定的制备方法。例如,如以下将更详细地讨论的,本发明所述的重链可变域可以通过以下方式获得:(1)通过分离天然存在的重链抗体的VHH域;(2)通过分离天然存在的四链抗体的VH域;(3)通过表达编码天然存在的VHH域的核苷酸序列;(4)通过表达编码天然存在的VH域的核苷酸序列;(5)通过来自任何动物物种,具体地,哺乳动物物种,如,人的天然存在的VH域的“骆驼化”(如下所述),或者通过表达编码这些骆驼化VH域的核酸;(6)如Ward等人所述(如上),通过“域抗体”或“Dab”的“骆驼化”,或者通过表达编码这些骆驼化VH域的核酸;(7)使用用于制备蛋白质、多肽或其它氨基酸序列的合成或半合成技术;(8)通过使用核酸合成技术制备编码VHH或VH的核酸,然后表达因此所获得的核酸;和/或(9)通过上述方法的任意组合。基于本文的公开内容,用于实施上述内容的适合的方法和技术对于技术人员将是清楚的,并且例如,包括下文更详细描述的方法和技术。
然而,根据具体实施方式,如本文所公开的重链可变域不具有与天然存在的VH域的氨基酸序列(如来自哺乳动物,并且具体地来自人的天然存在的VH域的氨基酸序列)完全相同的氨基酸序列(即与天然存在的VH域的氨基酸序列的序列同一性程度为100%)。
如本文所使用的,术语“有效量”和“有效剂量”表示实现所需一种或多种结果所需要的量。
如本文所使用的,术语“确定”、“测量”、“评价”、“监控”和“测定”是可互换使用的并且包括定量和定性确定两者。
在本说明书中引用的所有文档以其全部内容作为参考并入本文。除非另外定义,否则在公开本发明时使用的所有术语(包括技术和科学术语)的含义与本发明所属领域中技术人员通常理解的含义相同。通过进一步指导,包含了术语定义以更好理解本发明的教导内容。
[包含抗体的至少一个重链可变域的组合物]
在一个方面,本发明人鉴别了包含可以特异性结合至植物有害生物的鞘脂的抗体的至少一个可变域的农用化学组合物。重要地,通过与有害生物具体分子结构的这种相互作用,本文所公开的组合物能够控制、调节、抑制、预防或降低植物病原体的一种或多种生物活性,从而控制、调节、抑制、预防或降低了植物病原体的生长。在某些实施方式中,如本文所公开的农用化学组合物能够通过抗体的至少一个可变域的特异性相互作用杀死植物有害生物,所述抗体的至少一个可变域可以特异性结合至植物有害生物的鞘脂并且包含在所述组合物内。
因此,如本文所公开的农用化学组合物可以通过结合至植物有害生物鞘脂靶标上存在的结合位点,借此影响有害生物的天然生物活性(如(但不限于)生长)和/或其中涉及有害生物的结构靶标的一个或多个生物学途径,从而用于调节,如改变、减少或抑制该植物有害生物的生物学功能。
此外,如本文所公开的包含至少一个重链可变域的组合物比本领域中已知的常规免疫球蛋白和非免疫球蛋白结合剂具有一些额外的优势。的确,在某些实施方式中,如本文所公开的氨基酸序列是分离的免疫球蛋白重链可变域,它比常规四链抗体更有效并且更稳定,从而导致(1)较低的剂量形式,较不频繁的剂量和因此较低的副作用;和(2)改善的稳定性,从而导致更宽泛的施用途径选择。由于它们尺寸较小,因此免疫球蛋白重链可变域具有跨膜和渗入其它较大的多肽和蛋白质不能达到的生理学隔室、组织和器官的能力。
在一个具体(但非限制性)实施方式中,包含如本文所公开的至少一个重链可变域的组合物能够特异性结合(如本文所定义的)至植物有害生物靶标或植物有害生物抗原;和更优选地,能够以如本文所定义的亲合力(作为KD值(真实或表观)、KA值(真实或表观)、kon速率和/或koff速率适当测量和/或表示的,或者作为另外一种选择,作为IC50值适当测量和/或表示的,如本文进一步描述的)结合至有害生物或植物病原体靶标或植物有害生物抗原或植物病原体抗原。
在具体的实施方式中,本发明提供了用于抵抗植物有害生物,更具体地植物真菌的农用化学组合物或生物杀虫剂组合物,所述组合物包含作为活性物质的80至200个氨基酸的至少一种多肽或氨基酸序列。
在特定的其它实施方式中,本发明提供了用于抵抗植物有害生物的农用化学组合物,所述组合物包含作为活性物质的80至200个氨基酸的至少两种多肽或至少两种氨基酸序列。
在其它实施方式中,本发明提供了用于抵抗植物有害生物的农用化学组合物,所述组合物包含作为活性物质的80至200个氨基酸的至少三种多肽或至少三种氨基酸序列。
根据本发明所述的农用化学组合物是如先前所定义的用于抵抗植物有害生物的如本文所定义的农用化学组合物,其表示农用化学组合物,更具体地,包含在所述农用化学组合物中的如先前所定义的活性物质能够妨碍,优选地减少或停止一种或多种植物有害生物对一种或多种植物,优选地作物的不良影响。
因此,在一个实施方式中,农用化学组合物包含作为活性物质的80至200个氨基酸的多肽。
在更具体的实施方式中,农用化学组合物包含80-100个氨基酸、80-120个氨基酸、80-140个氨基酸、80-160个氨基酸或80-180个氨基酸的多肽。
在另一个实施方式中,农用化学组合物包含100-200个氨基酸、100-180个氨基酸、100-160个氨基酸、100-150个氨基酸、100-140个氨基酸或100-120个氨基酸的多肽。
在另一个实施方式中,农用化学组合物包含110-200个氨基酸、110-180个氨基酸、110-160个氨基酸、110-140个氨基酸或110-130个氨基酸的多肽。
在另一个实施方式中,农用化学组合物包含120-200个氨基酸、120-180个氨基酸、120-160个氨基酸或120-140个氨基酸的多肽。
在另一个实施方式中,农用化学组合物包含140-200个氨基酸、140-180个氨基酸或140-160个氨基酸的多肽。
在另一个实施方式中,农用化学组合物包含160-200个氨基酸或160-180个氨基酸的多肽。
包含在本文所公开的组合物中的抗体的至少一个重链可变域可以来源于天然存在的多肽,或者作为另外一种选择,它们可以是完全人工设计的。该类天然存在的多肽的非限制性实例包括重链抗体(hcAb)。
具体地,包含在本文所公开的组合物中的抗体的至少一个重链可变域由多肽单链组成并且未翻译后修饰。更具体地,包含在本文所公开的组合物中的抗体的至少一个重链可变域来源于先天或适应性免疫系统,优选地来自先天或适应性免疫系统的蛋白质。更具体地,包含在本文所公开的组合物中的抗体的至少一个重链可变域来源于免疫球蛋白。最具体地,包含在本文所公开的组合物中的抗体的至少一个重链可变域包含4个框架区和3个互补决定区或其任何适合的片段(那么,其通常将包含形成互补决定区中至少一个的至少一些氨基酸残基)。具体地,包含在本文所公开的组合物中的抗体的至少一个重链可变域易于以高得率产生,优选地,在微生物重组表达系统中产生,并且易于后续分离和/或纯化。
根据具体实施方式,本发明提供了一些特别适合于结合至鞘脂抗原或鞘脂靶标,如(但不限于)真菌鞘脂抗原或真菌鞘脂靶标的氨基酸残基段(即小肽)。
这些氨基酸残基段可能存在于和/或可能引入到如本文所公开的重链可变域中,具体地,以它们形成该重链可变域的抗原结合位点(的一部分)的方式。由于这些氨基酸残基段首先作为抗体的CDR序列产生,如抗鞘脂靶标的重链抗体或者VH或VHH序列的(或者可能基于和/或来源于这些CDR序列,如本文进一步描述的),它们在本文中通常还将被称为“CDR序列”(即分别称为CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列)。然而,应注意本发明以其最广泛的含义不局限于特定结构作用或功能:这些氨基酸残基段可以存在于如本文所公开的重链可变域中,只要这些氨基酸残基段允许如本文所公开的可变域特异性结合至鞘脂靶标。因此,通常,本发明以最广泛的含义涉及包含抗体的重链可变域的农用化学组合物,所述多肽能够结合至鞘脂靶标并且包含如本文所述的CDR序列的组合。
因此,在具体但非限制性实施方式中,如本文所公开的重链可变域序列可以是包含选自本文所述的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列的至少一种氨基酸序列的重链可变域。具体地,如本文所公开的重链可变域可以包含至少一个抗原结合位点,其中所述抗原结合位点包含本文所述的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列的至少一种组合。
包含在如本文所公开的农用化学组合物中并且具有这些CDR序列组合之一的任何重链可变域优选地使得它可以特异性结合至(如本文所定义的)鞘脂靶标或鞘脂抗原,并且更具体地,使得它特异性结合至植物病原体鞘脂,具体地,在溶液中所述可变域以10-8摩尔/升或更低的解离常数(Kd)结合。
可以以本身已知的任何适合的方式确定重链可变域与鞘脂靶标的特异性结合,所述方式包括(例如)生物淘选、斯卡查德分析(Scatchard analysis)和/或竞争性结合测定,如放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)和夹心竞争测定以及本领域中已知的它们的不同的变体。
在优选的实施方式中,通过对特定有害生物靶标分子的亲合力选择获得80至200个氨基酸之间的多肽,并且所述多肽对所述有害生物靶标分子具有高亲合力:通常,所述多肽与其有害生物靶标分子之间的结合解离常数小于10-5M,更优选地,解离常数小于10-6M,更优选地,解离常数小于10-7M,最优选地,解离常数小于10-8M。
在具体的实施方式中,包含在本文所公开的组合物中的抗体的至少一个重链可变域在溶液中对所述植物病原真菌的最小抑菌浓度(MIC)为1.0μg/mL或更低。
本文还公开了通过对特定植物有害生物靶标的亲合力选择获得的如本文先前所公开的80至200个氨基酸或子区间的多肽,其能够以约0.00001至1μΜ的最小抑菌浓度抑制作物有害生物的生长和/或活性。在具体的实施方式中,最小抑菌浓度在0.0001至1μΜ之间,在0.001至1μΜ之间,在0.01至1μΜ之间,在0.1至1μΜ之间,在0.0001至0.1μΜ之间,在0.001至0.1μΜ之间,在0.01至0.1μΜ之间,在0.00001至0.01μΜ之间,在0.0001至0.01μΜ之间,在0.001至0.01μΜ之间。
最小抑菌浓度或MIC值是在培育后抑制作物或植物有害生物的可见生长的试剂(如多肽)的最低浓度。例如,最小杀真菌浓度(MFC)被认为是在24h内防止生长并将真菌接种物减少99.90%的多肽的最低浓度。根据真菌类型和测定条件,可以在琼脂平板上确定MFC(最小杀真菌浓度),但是还可以方便地在液体(例如,微孔板)中确定。
在其它具体实施方式中,如本文所公开的农用化学组合物至少包含含有至少一种CDR序列组合的重链可变域,所述CDR序列组合选自包括以下的组:
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在具体的实施方式中,如本文所公开的组合物中的重链可变域是基本由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成的重链可变域;或者该重链可变域的任何适合的片段(那么,其通常将包含形成互补决定区中至少一个的至少一些氨基酸残基,如本文进一步描述的)。
具体地,如本文所公开的重链可变域可以是来源于常规四链抗体的重链可变域序列(如(无限制地)来源于人抗体的VH序列)或者是来源于所谓的“重链抗体”(如本文所定义的)的所谓的VHH-序列(如本文所定义的)。
在具体的实施方式中,如本文所公开的组合物至少包含来源于抗体的重链可变域序列或其功能性片段,如(但不限于)骆驼重链抗体或其功能性片段,因此,其可变域序列可以是(例如)骆驼重链抗体的重链可变域(VHH)。
然而,应注意本发明不限于包含在本文所公开的组合物中的重链可变域序列(或者用于表达它的本发明所述的核苷酸序列)的来源,并且不限于(已)产生或获得所述重链可变域或其核苷酸序列的方式。因此,本文所公开的组合物中的重链可变域可以是(来自任何适合物种的)天然存在的重链可变域或者合成或半合成重链可变域。在本发明的具体但非限制性实施方式中,所述重链可变域是(来自任何适合物种的)天然存在的免疫球蛋白序列或者合成或半合成免疫球蛋白序列,其包括(但不限于)“骆驼”免疫球蛋白序列以及通过以下技术获得的免疫球蛋白序列,如亲合力成熟(例如,从合成、随机或天然存在的免疫球蛋白序列开始)、CDR移植(CDR grafting)、镶饰(veneering)、组合来源于不同免疫球蛋白序列的片段,使用重叠引物的PCR组装(PCR assembly)和技术人员熟知的用于工程设计免疫球蛋白序列的类似技术;或者任何上述技术的任何适合的组合。
具体地,本文所公开的组合物的重链可变域序列可以是域抗体(或适合用作域抗体的重链可变域)、单域抗体(或适合用作单域抗体的重链可变域)或者“dAb”(或者适合用作dAb的重链可变域);其它单可变域,或其任何一个的任何适合的片段。对于(单)域抗体的一般说明,还参考以上引用的现有技术,以及EP 0 368 684。对于术语“dAb's”,例如,参考Ward等人(Nature 1989Oct 12;341(6242):544-6),Holt等人,Trends Biotechnol.,2003,21(11):484-490;以及,例如,WO 06/030220,WO06/003388以及Domantis Ltd.的其它公开的专利申请。
因此,在具体的实施方式中,本发明提供了具有以下(一般)结构的重链可变域FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1至FR4分别表示框架区1至4,并且其中CDR1至CDR3分别表示互补决定区1-3,并且是在本文中进一步定义的。
SEQ ID NO:1-84(参见表1)提供了已抗鞘脂靶标,具体地抗葡糖苷酰鞘氨醇的一些重链可变域的氨基酸序列。
表1 VHH序列
具体地,在一些具体实施方式中,本发明提供了包含至少一种重链可变域的农用化学组合物,所述重链可变域针对鞘脂靶标并且与SEQ ID NO:1-84(参见表1)所示的重链可变域中的至少一种具有至少80%,优选地,至少85%,如90%或95%或更高的序列同一性,和编码这些重链可变域的核酸序列。
如本文所公开的一些特别优选的重链可变域序列是可以结合至和/或针对植物病原体的鞘脂并且与SEQ ID NO:1-84(参见表1)所示的重链可变域中的至少一种具有至少90%的氨基酸同一性的那些,其中出于确定氨基酸同一性程度的目的,不考虑形成CDR序列的氨基酸残基。
在这些重链可变域中,CDR序列(参见表2)通常如本文进一步定义的。
表2:CDR序列
此外,可以以任何适合的方式并且从任何适合的来源获得这些重链可变域,并且这些重链可变域可以是(例如)天然存在的VHH序列(即,来自适合的骆驼种)或者合成或半合成重链可变域,其包括(但不限于)“骆驼化”免疫球蛋白序列(并且具体地,骆驼化重链可变域序列)以及通过以下技术获得的那些,如亲合力成熟(例如,从合成、随机或天然存在的免疫球蛋白序列开始)、CDR移植(CDR grafting)、镶饰、组合来源于不同免疫球蛋白序列的片段,使用重叠引物的PCR组装(PCR assembly)和技术人员熟知的用于工程免疫球蛋白序列的类似技术;或者如本文进一步描述的任何上述技术的任何适合的组合。
应理解在储存期间和使用期间,如本文所公开的农用化学组合物或生物控制组合物是稳定的,这表示在农用化学组合物的储存和/或使用条件下维持了农用化学组合物的完整性,所述条件可以包括升高的温度、冻融循环、pH或离子强度的变化、UV辐射、有害化学品的存在等。更优选地,本文所述的80至200个氨基酸以及多个子范围的多肽在农用化学组合物中保持稳定,这表示在农用化学组合物的储存和/或使用条件下维持了多肽的完整性和杀虫活性,所述条件可以包括升高的温度、冻融循环、pH或离子强度的变化、UV辐射、有害化学品的存在等。最优选地,当将所述农用化学组合物在环境温度储存两年的一段时间或者当将所述农用化学组合物在54℃储存两周的一段时间时,本文所述的80至200个氨基酸和多个子区间的所述多肽在农用化学组合物中保持稳定。优选地,本发明所述的农用化学组合物保留了至少约70%的活性,更优选地,至少约70%至80%的活性,最优选地约80%至90%的活性或更高的活性。任选地,如所定义的,所述多肽可以包含在载体中以保护所述多肽抵抗农用化学组合物中其它组分所引起的不良影响或者储存期间或应用期间的不良影响。适合载体的实例包括(但不限于)海藻酸盐、树胶、淀粉、β-环糊精、纤维素、聚脲、聚氨脂、聚酯、微生物细胞或粘土。
农用化学组合物可以以任何类型的制剂存在,优选的制剂是粉剂、可湿性粉剂、可湿性颗粒剂、水可分散颗粒剂、乳液、可乳化浓缩物、粉末、混悬液、混悬浓缩液、悬乳剂(suspoemulsion)(混悬液和乳液的混合物)、胶囊混悬液、水分散体、油分散体、气雾剂、糊剂、泡沫、浆液或可流动浓缩物。
如本文之前所述的80至200个氨基酸和多个子区间的多肽可以是根据本发明的农用化学或生物控制组合物中仅有的活性物质;然而,如所定义的,还可能除了多肽或氨基酸序列(或者如本文所公开的至少一种、至少两种或至少三种多肽或氨基酸序列)外,所述农用化学组合物包含一种或多种其它农用化学品。这些其它农用化学或生物控制组合物可以对植物有害生物具有与所述多肽或氨基酸序列不同的作用,它们可以与所述多肽或氨基酸序列具有协同作用,或者它们甚至可以改变所述多肽或氨基酸序列对某些植物的活性。适合的其它农用化学品可以是除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、杀螨剂、杀细菌剂、杀病毒剂、植物生长调节剂、安全剂等并且包括(但不限于)草甘膦、百草枯、异丙甲草胺、乙草胺、甲基磺草酮、2,4-D、阿特拉津、草铵膦、草硫膦、精恶唑禾草灵、二甲戊乐灵、毒莠定、氟乐灵、溴苯腈、炔草酯、氟草烟、烟嘧磺隆、苄嘧磺隆、咪草烟、麦草畏、吡虫啉、噻虫嗪、氟虫腈、毒死蜱、溴氰菊酯、λ-三氟氯氰菊酯、硫丹、甲胺磷、呋喃丹、噻虫胺、氯氰菊酯、阿巴克丁、吡氟酰草胺、多杀菌素、茚虫威、联苯菊酯、七氟菊酯、嘧菌酯、噻虫嗪、戊唑醇、代森锰锌、氰霜唑、氟啶胺、唑菌胺酯、氟环唑、百菌清、铜杀真菌剂、肟菌酯、丙硫菌唑、苯醚甲环唑、多菌灵、丙环唑、托布津、硫、啶酰菌胺及其它已知的农用化学品或其任何适合的组合。
[包含重链可变域序列变体的组合物]
在某些方面,包含在如本文所公开的农用化学组合物中的重链可变域可以任选地通过一个或多个接头连接至一个或多个其它基团、部分或残基。这些一个或多个其它基团、部分或残基可以用于结合至其它所关心的靶标。应明确这些其它基团、残基、部分和/或结合位点可以为或可以不为如本文所公开的重链可变域(和/或它所存在的组合物)提供其它官能性,和可以改变或可以不改变如本文所公开的重链可变域的性质。这些基团、残基、部分或结合单元还可以是(例如)可以在生物学上是活性的化学基团。
在具体的实施方式中,这些基团、部分或残基N-或C-末端连接至如本文所公开的组合物中的重链可变域。
在具体的实施方式中,还可以化学修饰如本文所公开的农用化学组合物中的重链可变域。例如,这些修饰可以包括向重链可变域中或上引入或键合一种或多种官能团、残基或部分。这些基团、残基或部分可以赋予所述重链可变域一种或多种所需的性质或官能性。这些官能团的实例将对技术人员是清楚的。
例如,这些官能团向重链可变域的引入或键合可以导致重链可变域溶解度和/或稳定性的提高,重链可变域毒性的降低或者重链可变域任何不希望的副作用的消除或减少和/或其它有利的性质。
在具体的实施方式中,通过一个或多个适合的接头或间隔子(spacer)将一个或多个基团、残基、部分连接至所述重链可变域。
在其它具体实施方式中,可以将本文所公开的农用化学组合物中的两种或更多种靶标特异性重链可变域彼此连接或者互相连接。在具体的实施方式中,通过一个或多个适合的接头或间隔子将两个或更多个重链可变域彼此连接。在如本文所公开的不同的重链重链可变域的连接中使用的适合的间隔子或接头将对技术人员是清楚的并且通常可以是在本领域中用于连接肽和/或蛋白质的任何接头或间隔子。
一些特别适合的接头或间隔子包括(例如,但不限于)多肽接头,如甘氨酸接头、丝氨酸接头、混合的甘氨酸/丝氨酸接头、富含甘氨酸和富含丝氨酸的接头或由基本上(大部分,largely)极性的多肽片段组成的接头,或者同或异双官能化学交联化合物,如戊二醛,或任选地PEG-间隔的马来酰亚胺或NHS酯。
例如,多肽接头或间隔子可以是长度在1至50个氨基酸之间,如1至30个氨基酸之间,并且具体地1至10个氨基酸残基之间的适合的氨基酸序列。应明确接头的长度、灵活程度和/或其它性质可以对重链可变域性质具有一些影响,其包括(但不限于)对真菌靶标的亲合力(affinity)、特异性或亲合性(avidity)。应明确当使用两种或更多种接头时,这些接头可以是相同或不同的。在本发明的背景和公开中,出于连接如本文所公开的重链可变域的目的,本领域技术人员将能够确定最佳接头,而无需任何过多的实验负担。
[包含重链可变域片段的组合物]
本发明还涵盖了包含在如本文所公开的组合物中的重链可变域的部分、片段、类似物、突变体、变体和/或衍生物和/或包含一种或多种这些部分、片段、类似物、突变体、变体和/或衍生物或基本由它们组成的多肽,只要这些部分、片段、类似物、突变体、变体和/或衍生物适合于本文设想的目的。根据本发明的这些部分、片段、类似物、突变体、变体和/或衍生物仍能够特异性结合至鞘脂靶标。
[靶标]
在具体的实施方式中,通过对特定有害生物靶标的亲合力选择获得了包含在本文所公开的组合物中的重链可变域。可以(例如)通过筛选在其表面上表达用于对有害生物靶标分子结合的多肽的细胞组、集合或文库(例如,噬菌体),从而通过对特定有害生物靶标的亲合力选择获得适合的多肽,所述有害生物靶标分子在本领域中已知是杀虫剂靶标;可以以本身已知的方式进行全部,其基本包括以下非限制步骤:a)获得分离的有害生物靶标分子的溶液或混悬液,所述分子已知是杀虫剂的靶标;b)针对所述靶标分子,从多肽文库生物淘选噬菌体或其它细胞;c)分离结合至靶标分子的噬菌体或其它细胞;d)从单个结合噬菌体或其它细胞确定编码多肽插入物的核苷酸序列;e)根据该序列,使用重组蛋白表达产生一定量的多肽,和f)确定所述多肽对所述有害生物靶标的亲合力,和任选地,g)在所述有害生物的生物测定中测试所述多肽的杀虫活性。可以使用多种方法确定多肽和有害生物靶标分子之间的亲合力,其包括(例如)酶联免疫吸附测定(ELISA)或者表面等离子体共振(SPR)测定,所述方法在本领域中是常用的,如Sambrook等人(2001),Molecular Cloning,ALaboratory Manual.第3版.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY中所述。解离常数通常用于描述多肽及其有害生物靶标分子之间的亲合力。通常,多肽与其有害生物靶标分子之间结合的解离常数低于10-5M,更优选地,所述解离常数低于10-6M,更优选地,所述解离常数低于10-7M,最优选地,所述解离常数低于10-8M。
如本文所公开的有害生物靶标分子是在有害生物生物中或有害生物生物上存在的分子,并且当结合和/或抑制时,其杀死或终止、抑制或降低所述有害生物生物的生长或杀虫活性。对于技术人员来说,这些适合的靶标分子从已有文献或专利数据库是易得的并且无限制地包括作为根癌线虫的适合有害生物靶标分子的分泌的寄生蛋白,如16D10(Huang等人(2006)PNAS 103:14302-14306)、作为鞘翅类昆虫、半翅类昆虫、双翅昆虫和线虫的适合有害生物靶标分子的V-ATP酶质子泵(Knight AJ和Behm CA(2011)Ex.Parasitol.Sept 19)、作为灰葡萄孢(B.cinerea)和稻瘟病菌(M.grisea)的适合真菌有害生物靶标分子的跨膜四蛋白(tetraspanin)PLS1(Gourgues等人(2002)Biochem.Biophys.Res.Commun.297:1197)或者作为抗真菌靶标的质子泵ATP酶(ManavathuEK等人(1999)Antimicrob Agents and Chemotherapy,Dec p.2950)。应理解优选的有害生物靶标分子在胞外空间是可接近的(与胞内有害生物靶标相反)。
更具体地,如本文所公开的农用化学组合物的至少一种重链可变域结合的鞘脂靶标构成了独特的膜脂组,其特征为长链(单不饱和)二羟基胺结构(鞘氨醇)。鞘脂是细胞质膜的必需成分,其中它们通常存在于外叶(外片,outer leaflet)。它们是一些细菌分组(具体地,厌氧菌)的膜成分。这些分组包括拟杆菌属(Bacteroides)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、红棕色单胞菌属(Porphyromonas)、梭杆菌属(Fusobacterium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、蛭弧菌属(Bdellovibrio)、孢囊杆菌属(Cystobacter)、支原体(Mycoplasma)、弯杆菌属(Flectobacillus)和可能的醋杆菌属(Acetobacter)。其中已存在鞘脂的真菌包括酵母菌属(Saccharomyces)、念珠菌属(Candida)、组织胞浆菌属(Histoplasma)、疫霉属(Phytophthora)、隐球菌属(Cryptococcus)、曲霉属(Aspergillus)、脉孢菌属(Neurospora)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、壳梭孢属(Fusicoccum)、Shizophyllum、捕蝇蕈属(Amanita)、汉逊酵母属(Hansenula)、乳菇属(Lactarius)、香菇属(Lentinus)、青霉菌(Penicillium)、杯伞属(Clitocybe)、副球霉菌属(Paracoccidioides)、伞菌属(Agaricus)、孢子丝菌属(Sporothrix)和卵菌(oomycete)植物病原体。
真菌鞘脂的基本结构单元是二氢鞘氨醇(二氢神经鞘氨醇,sphinganine),其可以转化成神经酰胺并最后转化成单己糖神经酰胺(CMH;脑苷脂),或者转化成植物神经酰胺(phytoceramide)并最终转化成二己糖神经酰胺(CDH)或转化成葡萄糖肌醇磷酰神经酰胺(GIPC)。如本文所公开的组合物的至少一种重链可变抗体域所针对的鞘脂的非限制性实例包括(例如)9-甲基4,8-二氢鞘氨二烯醇(sphingadienine)、糖基神经酰胺、葡糖苷酰鞘氨醇、单葡糖基神经酰胺、寡葡糖基神经酰胺、神经节糖苷、硫脂、神经酰胺、鞘氨醇-1-磷酸酯、神经酰胺-1-磷酸酯、半乳糖基神经酰胺、肌醇-磷酰神经酰胺(IPC)、甘露糖基-肌醇-磷酰神经酰胺(MIPC)、半乳糖基-肌醇-磷酰神经酰胺、甘露糖基-(肌醇-磷酰基)2-神经酰胺(M(IP)2C)、二甘露糖基-肌醇-磷酰神经酰胺(M2IPC)、半乳糖基-二甘露糖基-肌醇-磷酰神经酰胺(GalM2IPC)、甘露糖基-二-肌醇-二磷酰神经酰胺、二-肌醇-二磷酰神经酰胺、三半乳糖基-糖基神经酰胺。
如本文所公开的组合物的至少一种重链可变抗体域所针对的鞘脂的非限制性实例包括(例如)糖基神经酰胺、葡糖苷酰鞘氨醇、鞘磷脂、单糖基神经酰胺、寡糖基神经酰胺、神经节糖苷、硫脂、神经酰胺、鞘氨醇-1-磷酸酯和神经酰胺-1-磷酸酯。
在某些具体的实施方式中,本发明所述的农用化学组合物中可变域所结合的靶标不是几丁质(chitin)。
在优选的实施方式中,如本文所公开的农用化学组合物或生物控制组合物所抵抗的植物有害生物是真菌,如植物病原真菌,如先前所定义的。真菌对于植物可以是高度有害的,并且可以导致作物收获显著损失。植物病原真菌包括死体营养型真菌(necrotrophicfungi)和活体营养型真菌(biotrophic fungi),并且包括子囊菌、担子菌和卵菌。
植物病原真菌的实例在本领域中是已知的并且包括(但不限于)选自下列属的那些:链格孢属(Alternaria)、壳二孢属(Ascochyta)、葡萄孢属(Botrytis)、尾孢属(Cercospora)、刺盘孢属(Colletotrichum)、色二孢属(Diplodia)、白粉菌属(Erysiphe)、镰刀菌属(Fusarium)、小球腔菌属(Leptosphaeria)、禾顶囊壳属(Gaeumannomyces)、长蠕孢属(Helminthosporium)、壳球孢属(Macrophomina)、丛赤壳属(Nectria)、霜霉属(Peronospora)、茎点霉属(Phoma)、瘤梗孢属(Phymatotrichum)、疫霉属(Phytophthora)、单轴霉属(Plasmopara)、叉丝单囊壳属(Podosphaera)、柄锈属(Puccinia)、腐霉属(Puthium)、核腔菌属(Pyrenophora)、梨孢属(Pyricularia)、腐霉属(Pythium)、丝核菌属(Rhizoctonia)、小菌核属(Scerotium)、核盘霉属(Sclerotinia)、壳针孢属(Septoria)、根串珠霉属(Thielaviopsis)、钩丝壳属(Uncinula)、黑星菌属(Venturia)、和轮枝孢菌属(Verticillium)。可以用本发明所述的农用化学组合物抵抗的植物真菌感染的具体实例包括谷类中的小麦白粉菌(Erysiphe graminis)、葫芦科植物中的菊科白粉菌(erysiphecichoracearum)和黄瓜白粉菌(Sphaerotheca fuliginea)、苹果中的叉丝单囊壳菌(podosphaera leucotricha)、葡萄中的葡萄钩丝壳菌(Uncinula necator)、谷类中的柄锈属(Puccinia)、棉花、马铃薯、水稻和草皮中的丝核菌(Rhizoctonia)、谷类和甘蔗中的黑粉菌属(Ustilago)、苹果中的苹果黑星菌(Venturia inaequalis)(痂斑(scab))、谷类中的长蠕孢属(Helminthosporium)、小麦中的颖枯壳针孢(Septoria nodorum)、小麦中的小麦壳针孢(Septoria tritici)、大麦上的黑麦喙孢(Rhynchosporium secalis)、草莓、番茄和葡萄中的灰葡萄孢(Botrytis cinerea)(灰色霉菌)、花生中的花生尾孢菌(Cercosporaarachidicola)、烟草中的烟草霜霉(Peronospora tabacina)或多种作物中的其它霜霉属(Peronospora)、小麦和大麦中的小麦基腐菌(Pseudocercosporella herpotrichoides)、大麦中的大麦网斑长蠕孢菌(Pyrenophera teres)、水稻中的稻梨孢菌(Pyriculariaoryzae)、马铃薯和番茄中的致病疫霉(Phytophthora infestans)、多种植物中的镰刀菌属(Fusarium)(如尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum))和轮枝孢菌属(Verticillium)、葡萄中的葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola)、水果和蔬菜中的链格孢属(Alternaria)、黄瓜中的古巴假霜霉菌(Pseudoperonospora cubensis)、香蕉中的斐济球腔菌(Mycosphaerellafijiensis)、鹰嘴豆中的壳二孢属(Ascochyta)、油菜上的小球腔菌属(Leptosphaeria)和多种作物中的炭疽菌属(Colletotrichum)。根据本发明所述的组合物对通常敏感和耐受的菌种以及对植物病原真菌生命周期中所有或一些阶段是有活性的。
在具体的实施方式中,如本文所公开的农用化学组合物抗来自下列属的植物病原真菌,所述属选自包括链格孢属(Alternaria)、壳二孢属(Ascochyta)、葡萄孢属(Botrytis)、尾孢属(Cercospora)、刺盘孢属(Colletotrichum)、色二孢属(Diplodia)、白粉菌属(Erysiphe)、镰刀菌属(Fusarium)、小球腔菌属(Leptosphaeria)、禾顶囊壳属(Gaeumannomyces)、长蠕孢属(Helminthosporium)、壳球孢属(Macrophomina)、丛赤壳属(Nectria)、青霉菌属(Penicillium)、霜霉属(Peronospora)、茎点霉属(Phoma)、瘤梗孢属(Phymatotrichum)、疫霉属(Phytophthora)、单轴霉属(Plasmopara)、叉丝单囊壳属(Podosphaera)、柄锈属(Puccinia)、核腔菌属(Pyrenophora)、梨孢属(Pyricularia)、腐霉属(Pythium)、丝核菌属(Rhizoctonia)、小菌核属(Scerotium)、核盘霉属(Sclerotinia)、壳针孢属(Septoria)、根串珠霉属(Thielaviopsis)、钩丝壳属(Uncinula)、黑星菌属(Venturia)、轮枝孢菌属(Verticillium)、大毁壳属(Magnaporthe)、布氏白粉菌属(Blumeria)、小球壳属(Mycosphaerella)、黑粉菌属(Ustilago)、无柄锈属(Melampsora)、层锈菌属(Phakopsora)、链核盘菌属(Monilinia)、毛霉菌属(Mucor)、根霉属(Rhizopus)和曲菌属(Aspergillus)的组。
在某些具体的实施方式中,如本文所公开的组合物至少包含特异性结合至下列真菌的鞘脂的重链可变域,所述真菌来自葡萄孢属(Botrytis)、镰刀菌属(镰刀霉属,Fusarium)或青霉菌(Penicillium)。在其它具体实施方式中,真菌鞘脂是神经酰胺,如,具体地,葡糖苷酰鞘氨醇。
实际上,在具体的实施方式中,本发明提供了农用化学组合物,其包含特异性抗真菌的结构分子成分,即,真菌鞘脂的重链可变域。本发明人意外地在鉴别这些重链可变域中获得成功,尽管在本领域中通常描述是(在技术上)难以产生与非蛋白分子结构具有唯一且特异性相互作用的蛋白质或氨基酸序列。
基于本发明的教导内容,本领域技术人员可以设想适合的真菌有害生物靶标分子的其它非限制性实例,并且所述实例包括(例如)几丁质合酶、β-1,3-葡聚糖合酶、琥珀酸脱氢酶、真菌糖基神经酰胺或跨膜四蛋白PLS1。
本文中还公开了植物病原细菌,其包括(但不限于)燕麦噬酸菌燕麦亚种(Acidovorax avenae subsp.avenae)(导致水稻细菌性棕色条纹)、燕麦噬酸菌卡特莱兰亚种(Acidovorax avenae subsp.cattleyae)(导致洋兰细菌性棕斑)、魔芋噬酸菌Konnyaku(Acidovorax konjaci Konnyaku)(导致细菌性叶片枯萎病)、发根植物单胞菌(发根植物农杆菌,Agrobacterium rhizogenes)(导致甜瓜毛状根)、根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)(导致冠瘿病)、须芒草伯克氏菌(Burkholderia andropogonis)(导致康乃馨细菌性斑)、石竹假单胞菌(Burkholderia caryophylli)(导致康乃馨细菌性萎蔫病)、洋葱球茎病伯克氏菌(Burkholderia cepacia)(导致兰花细菌性棕斑)、唐菖蒲伯克霍尔德菌唐菖蒲致病变种(Burkholderia gladioli pv.gladioli)(导致唐菖蒲颈腐病)、荚壳假单胞菌(Burkholderia glumae)(导致水稻细菌性谷枯病)、植物假单胞菌(Burkholderiaplantarii)(导致水稻细菌性籽枯萎病)、密执安棍状杆菌密执安亚种(Clavibactermichiganensis subsp.michiganensis)(导致番茄细菌性溃疡病)、密执安棒状杆菌坏腐亚种(Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus)(导致马铃薯环腐病)、梭状芽胞杆菌(Clostridium)(导致马铃薯软腐病)、萎蔫短小杆菌(curtobacterium flaccumfaciens)(导致洋葱细菌性溃疡病)、梨火疫病欧文氏菌(Erwinia amylovora)(导致梨火疫病)、菠萝欧氏杆菌(Erwinia ananas)(导致水稻细菌性内颖褐变病)、胡萝卜软腐欧文氏菌黑腐亚种(Erwinia carotovora subsp.atroseptica)(导致马铃薯黑胫病)、胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚(Erwinia carotovora subsp.carotovora)(导致蔬菜细菌性软腐病)、菊疫病欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)(导致芋头细菌性籽枯萎病)、菊欧文氏菌玉米致病变种(Erwinia chrysanthemi pv.zeae)(导致水稻细菌性根腐病)、草生欧文氏菌鸡血藤致病变种(Erwinia herbicola pv.millettiae)(导致紫藤细菌性瘿病)、菊苣叶斑病假单胞菌(Pseudomonas cichorii)(导致菊花细菌性斑)、皱纹假单胞菌Pith(Pseudomonascorrugate Pith)(导致番茄坏死)、褐鞘假单胞菌(Pseudomonas fuscovaginae)(导致水稻褐鞘病)、边缘假单胞菌边缘致病变种(Pseudomonas marginalis pv.marginalis)(导致卷心菜软腐病)、红苍白假单胞菌(Pseudomonas rubrisubalbicans)(导致甘蔗斑驳条纹)、丁香假单胞菌适合致病变种(Pseudomonas syringae pv.aptata)(导致甜菜细菌性枯萎病)、丁香假单胞菌绛红致病变种(Pseudomonas syringae pv.atropurpurea)(导致黑麦草光轮疫病)、丁香假单胞菌栗致病变种(Pseudomonas syringae pv.castaneae)(导致栗细菌性溃疡病)、丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)(导致大豆细菌性枯萎病)、丁香假单胞菌黄瓜致病变种(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)(导致黄瓜细菌性斑),丁香假单胞菌斑生致病变种(Pseudomonas syringae pv.maculicola)(导致卷心菜细菌性黑斑),丁香假单胞菌桑致病变种(Pseudomonas syringae pv.mori)(导致桑椹细菌性枯萎病)、丁香假单胞菌李致病变种(Pseudomonas syringaepv.morsprunorum)(导致李子细菌性溃疡病)、丁香假单胞菌水稻致病变种(Pseudomonassyringae pv.oryzae)(导致水稻光轮疫病)、丁香假单胞菌菜豆致病变种(Pseudomonassyringae pv.phaseolicola)(导致菜豆光轮疫病)、丁香假单胞菌豌豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.pisi)(导致豌豆细菌性枯萎病)、洋丁香叶斑病假单胞菌芝麻致病变种(Pseudomonas syringae pv.sesame)(导致芝麻细菌性斑)、丁香假单胞菌条纹致病变种(Pseudomonas syringae pv.striafaciens)(导致燕麦细菌性条纹枯萎病)、丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonas syringae pv.syringae)(导致小红珠细菌性棕斑)、丁香假单胞菌烟草致病变种(Pseudomonas syringae pv.tabaci)(导致烟草野火病)、丁香假单胞菌茶致病变种(Pseudomonas syringae pv.theae)(导致茶叶细菌性枝枯病)、丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)(导致番茄细菌性叶斑)、绿黄假单胞菌(Pseudomonas viridiflava)(导致菜豆细菌性棕斑)、青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)(导致细菌性萎蔫病)、拉氏拉氏杆菌(Rathayibacter rathayi)(导致果园草细菌性穗枯病),疮痂病链霉菌(Streptomyces scabies)(导致马铃薯常见的痂斑(scab)),甘薯链霉菌(Streptomyces ipomoea)(导致白薯土壤腐烂病),甘蔗鳞斑病黄单胞菌(Xanthomonas albilineans)(导致甘蔗白条病)、野油菜黄单胞菌谷物致病变种(Xanthomonas campestris pv.cerealis)(导致黑麦细菌性条斑病)、野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris)(导致黑腐病),野油菜黄单胞菌柑橘病原变种(Xanthomonas campestris pv.citri)(导致柑桔溃疡病),野油菜黄单胞菌黄瓜致病变种(Xanthomonas campestris pv.cucurbitae)(导致黄瓜细菌性棕斑),野油菜黄单胞菌大豆病原变种(Xanthomonas campestris pv.glycines)(导致大豆细菌性脓疱(pastule)),野油菜黄单胞菌兰香草致病变种(Xanthomonas campestris pv.incanae)(导致紫罗兰黑腐病),野油菜黄单胞菌致病变种(Xanthomonas campestris pv.)(导致锦葵科(malvacearum)棉花叶角斑病),野油菜黄单胞菌致病变种(Xanthomonas campestris pv.)(导致芒果细菌性溃疡病),野油菜黄单胞菌芒果致病变种致病变种烟草(Mangiferaeindicae Xanthomonas campestris pv.mellea)(导致烟草Wisconsin细菌性叶斑),野油菜黄单胞菌致病变种(Xanthomonas campestris pv.)(导致牛蒡的大黑斑细菌性斑)、野油菜黄单胞菌菜豆致病变种(Xanthomonas campestris pv.phaseoli)(导致菜豆细菌性脓疱(pastule)),野油菜黄单胞菌豌豆致病变种(Xanthomonas campestrispv.pisi)(导致菜豆细菌性茎腐病),野油菜黄单胞菌桃李致病变种(Xanthomonascampestris pv.pruni)(导致桃细菌性枝孔病(shoot hole)),野油菜黄单胞菌萝卜致病变种(Xanthomonas campestris pv.raphani)(导致日本萝卜的细菌性斑),野油菜黄单胞菌蓖麻致病变种(Xanthomonas campestris pv.ricini)(导致蓖麻油植物的细菌性斑)、野油菜黄单胞菌栖茶致病变种(Xanthomonas campestris pv.theicola)(导致茶叶溃疡病),野油菜黄单胞菌小麦致病变种(Xanthomonas campestris pv.translucens)(导致果园草的细菌性枯萎病),野油菜黄单胞菌疱病致病变种(Xanthomonas campestrispv.vesicatoria)(导致番茄细菌性斑),水稻黄单胞菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzaepv.oryzae)(导致水稻细菌性叶枯萎病)。
本文中还公开了农业、园艺、森林、花园和休闲设施中出现的植物有害生物,如昆虫、蛛形类、蠕虫类、病毒、线虫和软体动物。根据本发明所述的组合物对通常敏感和耐受的物种以及对发育的所有或一些阶段是有活性的。这些植物有害生物包括:来自下列门的有害生物:节肢动物门(Arthropoda),具体地,来自蜘蛛纲的那些,例如,粉螨属(Acarusspp.)、柑橘瘤瘿螨(Aceria sheldoni)、刺皮节蜱属(Aculops spp.)、刺瘿螨属(Aculusspp.)、钝眼蜱属(Amblyomma spp.)、山楂叶螨(Amphitetranychus viennensis)、锐缘蜱属(Argas spp.)、方头蜱属(Boophilus spp.)、短须螨属(Brevipalpus spp.)、苜蓿苔螨(Bryobia praetiosa)、刺尾蝎属(Centruroides spp.)、皮螨(Chorioptes spp.)、鸡皮刺螨(Dermanyssus gallinae)、屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssius)、粉尘螨(Dermatophagoides farinae)、矩头蝉属(Dermacentor spp.)、始叶螨属(Eotetranychusspp.)、梨上瘿螨(Epitrimerus pyri)、真叶螨属(Eutetranychus spp.)、瘿螨属(Eriophyes spp.)、赤足夜螨(Halotydeus destructor)、半跗线螨属(Hemitarsonemusspp.)、玻眼蜱属(Hyalomma spp.)、硬蜱属(Ixodes spp.)、毒蛛属(Latrodectus spp.)、花蛛属(Loxosceles spp.)、全爪螨属(Metatetranychus spp.)、Nuphersa属、小爪螨属(Oligonychus spp.)、钝缘蜱属(Ornithodorus spp.)、禽刺螨属(Ornithonyssus spp.)、全爪螨属(Panonychus spp.)、柑桔锈螨(Phyllocoptruta oleivora)、侧多食跗线螨(Polyphagotarsonemus latus)、痒螨属(Psoroptes spp.)、扇头蜱属(Rhipicephalusspp.)、根嗜螨属(Rhizoglyphus spp.)、疥螨(Sarcoptes spp.)、暗蝎(Scorpio maurus)、狭趺线螨种(Stenotarsonemus spp.)、跗线螨属(Tarsonemus spp.)、叶螨属(Tetranychusspp.)、Vaejovis属、番茄斜背瘤瘿螨(Vasates lycopersici)。其它实例来自于虱目(虱目(Phthiraptera)),例如,啮虱属(Damalinia spp.)、血虱属(Haematopinus spp.)、长颚虱属(Linognathus spp.)、虱属(Pediculus spp.)、Ptirus pubis、啮毛虱属(Trichodectesspp.)。其它实例来自于唇足纲(Chilopoda)的目,例如,地蜈蚣属(Geophilus spp.)、蚰蜒属(Scutigera spp.)。
其它实例来自于鞘翅目(Coleoptera),例如,条纹南瓜甲(Acalymma vittatum)、菜豆象(Acanthoscelides obtectus)、喙丽金龟属(Adoretus spp.)、杨树萤叶甲(Agelastica alni)、叩甲属(Agriotes spp.)、步甲虫(Alphitobius diaperinus)、马铃薯鳃角金龟(Amphimallon solstitialis)、家具窃蠹(Anobium punctatum)、星天牛属(Anoplophora spp.)、花象属(Anthonomus spp.)、圆皮蠹属(Anthrenus spp.)、小象甲属(Apion spp.)、阿鳃金龟属(Apogonia spp.)、隐食甲属(Atomaria spp.)、毛皮蠹属(Attagenus spp.)、恶条豆象(Bruchidius obtectus)、豆象属(Bruchus spp.)、龟叶甲属(Cassida spp.)、菜豆莹叶甲(Cerotoma trifurcata)、龟象属(Ceutorrhynchus spp.)、跳甲属(Chaetocnema spp.)、方喙象属(Cleonus mendicus)、宽胸叩头虫属(Conoderusspp.)、根颈象属(Cosmopolites spp.)、褐新西兰肋翅鳃角金龟(Costelytrazealandica)、叩甲属(Ctenicera spp.)、象虫属(Curculio spp.)、杨干隐喙象(Cryptorhynchus lapathi)、细枝象属(Cylindrocopturus spp.)、皮蠹属(Dermestesspp.)、叶甲属(Diabrotica spp.)、蛀螟属(Dichocrocis spp.)、Diloboderus属、食植瓢虫属(Epilachna spp.)、毛跳甲属(Epitrix spp.)、Faustinus属、裸蛛甲(Gibbiumpsylloides)、菜心螟(Hellula undalis)、黑异爪蔗金龟(Heteronychus arator)、寡节鳃金龟属(Heteronyx spp.)、Hylamorpha elegans、北美家天牛(Hylotrupes bajulus)、紫苜蓿叶象(Hypera postica)、咪小蠹属(Hypothenemus spp.)、甘蔗大褐齿爪鳃金龟(Lachnosterna consanguinea)、负泥虫属(Lema spp.)、马铃薯甲虫(Leptinotarsadecemlineata)、潜叶蛾属(Leucoptera spp.)、稻根象(Lissorhoptrus oryzophilus)、简喙象属(Lixus spp.)、萤叶甲属(Luperodes spp.)、粉蠹属(Lyctus spp.)、美洲叶甲属(Megascelis spp.)、梳爪叩头虫属(Melanotus spp.)、油菜花露尾甲(Meligethesaeneus)、鳃角金龟属(Melolontha spp.)、Migdolus属、墨天牛属(Monochamus spp.)、Naupactus xanthographus、黄蛛甲(Niptus hololeucus)、椰蛀犀金龟(Oryctesrhinoceros)、锯谷盗(Oryzaephilus surinamensis)、Oryzaphagus oryzae、黑葡萄耳象(Otiorrhynchus spp.)、小青花金龟(Oxycetonia jucunda)、辣根猿叶虫(Phaedoncochleariae)、食叶鳃金龟属(Phyllophaga spp.)、黄条跳甲属(Phyllotreta spp.)、日本弧丽金龟(Popillia japonica)、象甲属(Premnotrypes spp.)、大谷蠹(Prostephanustruncatus)、油菜金头跳甲属(Psylliodes spp.)、蛛甲属(Ptinus spp.)、暗色瓢虫(Rhizobius ventralis)、谷蠹(Rhizopertha dominica)、谷象属(Sitophilus spp.)、尖隐喙象属(Sphenophorus spp.)、药材甲(Stegobium paniceum)、茎干象属(Sternechusspp.)、宽幅天牛属(Symphyletes spp.)、纤毛象属(Tanymecus spp.)、黄粉虫(Tenebriomolitor)、拟谷盗属(Tribolium spp.)、斑皮蠹属(Trogoderma spp.)、籽象属(Tychiusspp.)、脊虎天牛属(Xylotrechus spp.)、距步甲属(Zabrus spp.)。
其它实例来自于弹尾目(Collembola),例如,棘跳虫(Onychiurus armatus)。
其它实例来自于倍足目(Diplopoda),例如,具斑马陆(Blaniulus guttulatus)
其它实例来自于双翅目(Diptera),例如,伊蚊属(Aedes spp.)、潜蝇属(Agromyzaspp.)、按实蝇属(Anastrepha spp.)、按蚊属(Anopheles spp.)、瘿蚊属(Asphondyliaspp.)、实蝇属(Bactrocera spp.)、花园毛蚊(Bibio hortulanus)、天青丽蝇(Calliphoraerythrocephala)、地中海蜡实蝇(Ceratitis capitata)、摇蚊属(Chironomus spp.)、金蝇属(Chrysomyia spp.)、斑虻属(Chrysops spp.)、锥蝇属(Cochliomyia spp.)、康瘿蚊属(Contarinia spp.)、人皮蝇(Cordylobia anthropophaga)、库蚊属(Culex spp.)、库蠓属(Culicoides spp.)、脉毛蚊属(Culiseta spp.)、黄蝇属(Cuterebra spp.)、橄榄大实蝇(Dacus oleae)、叶瘿蚊属(Dasyneura spp.)、地种蝇属(Delia spp.)、人肤蝇(Dermatobiahominis)、果蝇属(Drosophila spp.)、稻象属(Echinocnemus spp.)、厕蝇属(Fanniaspp.)、胃蝇属(Gastrophilus spp.)、舌蝇属(Glossina spp.)、麻虻属(Haematopotaspp.)、毛眼水蝇属(Hydrellia spp.)、黑蝇属(Hylemyia spp.)、Hyppobosca属、皮蝇属(Hypoderma spp.)、斑潜蝇属(Liriomyza spp.)、绿蝇属(Lucilia spp.)、Lutzomia属、曼蚊属(Mansonia spp.)、家蝇属(Musca spp.)、绿蝽属(Nezara spp.)、狂蝇属(Oestrusspp.)、瑞典麦秆蝇(Oscinella frit)、藜泉蝇(Pegomyia spp.)、白蛉属(Phlebotomusspp.)、草种蝇属(Phorbia spp.)、伏蝇属(Phormia spp.)、Prodiplosis属、胡萝卜茎蝇(Psila rosae)、绕实蝇属(Rhagoletis spp.)、麻蝇属(Sarcophaga spp.)、蚋属(Simuliumspp.)、螫蝇属(Stomoxys spp.)、虻属(Tabanus spp.)、螗蜩属(Tannia spp.)、根斑蝇属(Tetanops spp.)、大蚊属(Tipula spp.)。
其它实例来自于异翅目(Heteroptera),例如,南瓜缘蝽(Anasa tristis)、拟丽蝽属(Antestiopsis spp.)、Boisea属、土长蝽属(Blissus spp.)、俊盲蝽属(Calocorisspp.)、斑腿微刺盲蝽(Campylomma livida)、异背长蝽属(Cavelerius spp.)、臭虫属(Cimex spp.)、Collaria属、盲蝽属(Creontiades dilutus)、胡椒缘蝽(Dasynuspiperis)、Dichelops furcatus、厚氏长棒网蝽(Diconocoris hewetti)、棉红蝽属(Dysdercus spp.)、美洲蝽属(Euschistus spp.)、扁盾蝽属(Eurygaster spp.)、刺盲蝽属(Heliopeltis spp.)、Horcias nobilellus、稻缘蝽属(Leptocorisa spp.)、叶喙缘蝽(Leptoglossus phyllopus)、草盲蝽属(Lygus spp.)、蔗黑长蝽(Macropes excavatus)、盲蝽科(Miridae)、金光绿盲蝽(Monalonion atratum)、绿蝽属(Nezara spp.)、稻蝽属(Oebalus spp.)、蝽科(Pentomidae)、方背皮蝽(Piesma quadrata)、壁蝽属(Piezodorusspp.)、杂盲蝽属(Psallus spp.)、Pseudacysta persea、红猎蝽属(Rhodnius spp.)、可可褐盲蝽(Sahlbergella singularis)、Scaptocoris castanea、黑蝽属(Scotinophoraspp.)、梨冠网蝽(Stephanitis nashi)、Tibraca属、维猎蝽属(Triatoma spp.)。
其它实例来自于同翅目(Homoptera),例如,例如,无网长管蚜属(Acyrthosiponspp.)、Acrogonia属、Aeneolamia属、隆脉木虱属(Agonoscena spp.)、Aleurodes spp.、蔗粉虱属(Aleurolobus barodensis)、Aleurothrixus spp.、杧果叶轉属(Amrasca spp.)、圆尾蚜属(Anuraphis cardui)、肾圆盾蚧属(Aonidiella spp.)、苏联黄粉蚜(Aphanostigmapiri)、蚜属(Aphis spp.)、葡萄叶蝉(Arboridia apicalis)、小圆盾蚧属(Aspidiellaspp.)、圆盾蚧属(Aspidiotus spp.)、Atanus属、茄沟无网蚜(Aulacorthum solani)、Bemisia spp.、李短尾蚜(Brachycaudus helichrysii)、Brachycolus属、甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae)、小褐稻虱(Calligypona marginata)、Carneocephalafulgida、甘蔗粉角蚜(Ceratovacuna lanigera)、沫蝉科(Cercopidae)、蜡蚧属(Ceroplastes spp.)、草莓钉蚜(Chaetosiphon fragaefolii)、蔗黄雪盾蚧(Chionaspistegalensis)、茶绿叶蝉(Chlorita onukii)、核桃黑斑蚜(Chromaphis juglandicola)、黑褐圆盾蚧(Chrysomphalus ficus)、玉米叶蝉(Cicadulina mbila)、Coccomytilus halli、软蚧属(Coccus spp.)、茶藨隐瘤蚜(Cryptomyzus ribis)、Dalbulus属、Dialeurodesspp.、Diaphorina spp.、白背盾蚧属(Diaspis spp.)、履绵蚧属(Drosicha spp.)、西圆尾蚜属(Dysaphis spp.)、灰粉蚧属(Dysmicoccus spp.)、小绿叶蝉属(Empoasca spp.)、绵蚜属(Eriosoma spp.)、斑叶蝉属(Erythroneura spp.)、Euscelis bilobatus、拂粉蚧属(Ferrisia spp.)、咖啡地粉蚧(Geococcus coffeae)、长尾蔗蝗属(Hieroglyphus spp.)、假桃病毒叶蝉(Homalodisca coagulata)、梅大尾蚜(Hyalopterus arundinis)、吹绵蚧属(Icerya spp.)、片角叶蝉属(Idiocerus spp.)、扁喙叶蝉属(Idioscopus spp.)、灰飞虱(Laodelphax striatellus)、蜡蚧属(Lecanium spp.)、蛎盾蚧属(Lepidosaphes spp.)、萝卜蚜(Lipaphis erysimi)、长管蚜属(Macrosiphum spp.)、Mahanarva属、高粱蚜(Melanaphis sacchari)、Metcalfiella属、麦无网蚜(Metopolophium dirhodum)、Monellia costalis、Monelliopsis pecanis、瘤蚜属(Myzus spp.)、莴苣衲长管蚜(Nasonovia ribisnigri)、黑尾叶蝉属(Nephotettix spp.)、褐飞虱(Nilaparvatalugens)、Oncometopia属、Orthezia praelonga、杨梅缘粉虱(Parabemisia myricae)、Paratrioza属、片盾蚧属(Parlatoria spp.)、瘿绵蚜属(Pemphigus spp.)、玉米蜡蝉(Peregrinus maidis)、绵粉蚧属(Phenacoccus spp.)、杨平翅绵蚜(Phloeomyzuspasserinii)、忽布疣蚜(Phorodon humuli)、葡萄根瘤蚜属(Phylloxera spp.)、苏铁褐点并盾蚧(Pinnaspis aspidistrae)、臀纹粉蚧属(Planococcus spp.)、梨形原绵蚧(Protopulvinaria pyriformis)、桑白盾蚧(Pseudaulacaspis pentagona)、粉蚧属(Pseudococcus spp.)、Psylla属、Pteromalus属、Pyrilla属、笠圆盾蚧属(Quadraspidiotus spp.)、Quesada gigas、平刺粉蚧属(Rastrococcus spp.)、缢管蚜属(Rhopalosiphum spp.)、黑盔蚧属(Saissetia spp.)、葡萄带叶蝉(Scaphoideustitanus)、麦二叉蚜(Schizaphis graminum)、苏铁刺圆盾蚧(Selenaspidusarticulatus)、长唇基飞虱属(Sogata spp.)、白背飞虱(Sogatella furcifera)、Sogatodes属、三角蝶(Stictocephala festina)、Tenalaphara malayensis、Tinocalliscaryaefoliae、广胸沫蝉属(Tomaspis spp.)、声蚜属(Toxoptera spp.)、Trialeurodesspp.、个木虱属(Trioza spp.)、小叶蝉属(Typhlocyba spp.)、尖盾蚧属(Unaspis spp.)、葡萄根瘤虱(Viteus vitifolii)、么叶蝉属(Zygina spp.)。
其它实例来自于膜翅目(Hymenoptera),例如,切叶蚁属(Acromyrmex spp.)、菜叶蜂属(Athalia spp.)、Atta属、松叶蜂属(Diprion spp.)、实叶蜂属(Hoplocampa spp.)、毛蚁属(Lasius spp.)、小家蚁(Monomorium pharaonis)、红火蚁(Solenopsis invicta)、蚁属(Tapinoma spp.)、胡蜂属(Vespa spp.)。
其它实例来自于等足目(Isopoda),例如,鼠妇(Armadillidium vulgare)、栉水虱(Oniscus asellus)、球鼠妇(Porcellio scaber)。
其它实例来自于等翅目(Isoptera),例如,家白蚁属(Coptotermes spp.)、堆角白蚁(Cornitermes cumulans)、湿木白蚁(Cryptotermes spp.)、楹白蚁(Incisitermesspp.)、甘蔗白蚁(Microtermes obesi)、土白蚁属(Odontotermes spp.)、散白蚁属(Reticulitermes spp.)。
其它实例来自于鳞翅目(Lepidoptera),例如,桑剑纹夜蛾(Acronicta major)、卷叶蛾属(Adoxophyes spp.)、烦夜蛾(Aedia leucomelas)、地老虎属(Agrotis spp.)、波纹夜蛾属(Alabama spp.)、脐橙螟蛾(Amyelois transitella)、麦蛾属(Anarsia spp.)、干煞夜蛾属(Anticarsia spp.)、条小卷蛾属(Argyroploce spp.)、甘蓝夜蛾(Barathrabrassicae)、籼弄蝶(Borbo cinnara)、棉潜蛾(Bucculatrix thurberiella)、松尺蠖(Bupalus piniarius)、蛀褐夜蛾属(Busseola spp.)、卷叶蛾属(Cacoecia spp.)、茶细蛾(Caloptilia theivora)、烟卷蛾(Capua reticulana)、苹果小卷蛾(Carpocapsapomonella)、蛀果蛾(Carposina niponensis)、冬尺蛾(Cheimatobia brumata)、禾草螟属(Chilo spp.)、枞色卷蛾(Choristoneura spp.)、葡萄果蠹蛾(Clysia ambiguella)、纵卷叶野螟属(Cnaphalocerus spp.)、云卷蛾属(Cnephasia spp.)、Conopomorpha属、球颈象属(Conotrachelus spp.)、Copitarsia属、小卷蛾属(Cydia spp.)、Dalaca noctuides、绢野螟属(Diaphania spp.)、蔗螟(Diatraea saccharalis)、埃及金刚钻属(Earias spp.)、Ecdytolopha aurantium、小玉米螟(Elasmopalpus lignosellus)、非洲蔗螟(Eldanasaccharina)、粉斑螟属(Ephestia spp.)、叶小卷蛾属(Epinotia spp.)、苹果褐卷蛾(Epiphyas postvittana)、荚斑螟属(Etiella spp.)、金茅属(Eulia spp.)、女贞细卷蛾(Eupoecilia ambiguella)、黄毒蛾属(Euproctis spp.)、切根虫属(Euxoa spp.)、脏切夜蛾属(Feltia spp.)、大蜡螟(Galleria mellonella)、细蛾属(Gracillaria spp.)、小食心虫属(Grapholitha spp.)、蚀叶野螟属(Hedylepta spp.)、铃夜蛾属(Helicoverpa spp.)、实夜蛾属(Heliothis spp.)、褐织蛾(Hofmannophila pseudospretella)、同斑螟属(Homoeosoma spp.)、茶长卷蛾(Homona spp.)、苹果巢蛾(Hyponomeuta padella)、柿蒂虫(Kakivoria flavofasciata)、贪夜蛾属(Laphygma spp.)、梨小食心虫(Laspeyresiamolesta)、茄黄斑螟(Leucinodes orbonalis)、潜蛾属(Leucoptera spp.)、苹细蛾(Lithocolletis spp.)、绿果冬夜蛾(Lithophane antennata)、花翅小蛾属(Lobesiaspp.)、豆白隆切根虫(Loxagrotis albicosta)、毒蛾属(Lymantria spp.)、潜蛾属(Lyonetia spp.)、黄褐天幕毛(Malacosoma neustria)、豆荚野螟(Maruca testulalis)、甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)、稻毛胫夜蛾(Mocis spp.)、粘虫(Mythimna separata)、萍螟属(Nymphula spp.)、Oiketicus属、麦秆夜蛾属(Oria spp.)、瘤丛螟属(Orthagaspp.)、秆野螟属(Ostrinia spp.)、稻负泥虫(Oulema oryzae)、小眼夜蛾(Panolisflammea)、稻弄蝶属(Parnara spp.)、红铃虫(Pectinophora spp.)、Perileucoptera属、麦娥属(Phthorimaea spp.)、桔潜蛾(Phyllocnistis citrella)、小潜细蛾属(Phyllonorycter spp.)、菜粉蝶属(Pieris spp.)、荷兰石竹小卷蛾(Platynotastultana)、印度谷螟(Plodia interpunctella)、金翅夜蛾属(Plusia spp.)、菜蛾(Plutella xylostella)、小白巢蛾属(Prays spp.)、斜纹夜蛾属(Prodenia spp.)、烟草天蛾属(Protoparce spp.)、黏虫属(Pseudaletia spp.)、大豆夜蛾(Pseudoplusiaincludens)、玉米螟(Pyrausta nubilalis)、Rachiplusia nu、禾螟属(Schoenobiusspp.)、白禾螟属(Scirpophaga spp.)、黄地老虎(Scotia segetum)、蛀茎夜蛾属(Sesamiaspp.)、长须卷蛾属(Sparganothis spp.)、灰翅夜蛾属(Spodoptera spp.)、展足蛾属(Stathmopoda spp.)、花生麦蛾(Stomopteryx subsecivella)、透翅蛾属(Synanthedonspp.)、安第斯马铃薯块茎蛾(Tecia solanivora)、干煞夜蛾(Thermesia gemmatalis)、袋谷蛾(Tinea pellionella)、幕谷蛾(Tineola bisselliella)、栎绿卷蛾(Tortrix spp.)、毛毡衣蛾(Trichophaga tapetzella)、粉夜蛾属(Trichoplusia spp.)、番前斑潜绳(Tutaabsoluta)、灰蝶属(Virachola spp.)。
其它实例来自于直翅目(Orthoptera),例如,家蟋蟀(Acheta domesticus)、东方蠊(Blatta orientalis)、德国小蠊(Blattella germanica)、Dichroplus属、蝼蛄属(Gryllotalpa spp.)、马得拉非蠊(Leucophaea maderae)、飞蝗属(Locusta spp.)、黑蝗属(Melanoplus spp.)、大蠊属(Periplaneta spp.)、人蚤(Pulex irritans)、沙漠蝗(Schistocerca gregaria)、长须蜚蠊(Supella longipalpa)。
其它实例来自于蚤目(Siphonaptera),例如,角叶属(Ceratophyllus spp.)、栉头蚤属(Ctenocephalides spp.)、穿皮潜蚤(Tunga penetrans)、东方鼠蚤(Xenopsyllacheopis)。
其它实例来自于综合纲目(Symphyla),例如,么蚰(Scutigerella spp.)。
其它实例来自于缨翅目(Thysanoptera),例如,玉米黄呆蓟马(Anaphothripsobscurus)、稻蓟马(Baliothrips biformis)、葡萄链蓟马(Drepanothris reuteri)、Enneothrips flavens、花蓟马属(Frankliniella spp.)、网蓟马属(Heliothrips spp.)、温室条篱蓟马(Hercinothrips femoralis)、葡萄蓟马(Rhipiphorothrips cruentatus)、硬蓟马属(Scirtothrips spp.)、Taeniothrips cardamoni、蓟马属(Thrips spp.)。
其它实例来自于衣鱼目(Zygentoma)(=缨尾目(Thysanura)),例如,衣鱼(Lepisma saccharina)、小灶衣鱼(Thermobia domestica),例如,衣鱼(Lepismasaccharina)、小灶衣鱼(Thermobia domestica)。在另一个实施方式中,软体动物门(Mollusca)的有害生物,具体地,来自双壳纲(Bivalvia)的有害生物,例如,拙氏蛤属(Dreissena spp.)也是重要的植物有害生物。
在另一个实施方式中,腹足纲(Gastropoda)的有害生物是重要的植物有害生物,例如,阿勇蛞蝓属(Arion spp.)、双脐螺属(Biomphalaria spp.)、小泡螺属(Bulinusspp.)、野蛞蝓属(Deroceras spp.)、土蜗属(Galba spp.)、椎实螺属(Lymnaea spp.)、钉螺属(Oncomelania spp.)、福寿螺属(Pomacea spp.)、琥泊螺属(Succinea spp.)。
在另一个实施方式中,植物有害生物来自于线虫纲(Nematoda),并且是重要的植物有害生物,即植物寄生线虫,因此表示对植物引起损害的植物寄生线虫。植物线虫包括植物寄生线虫和生活在土壤中的线虫。植物寄生线虫包括(但不限于)外寄生虫,如剑线虫属(Xiphinema spp.)、长针线虫属(Longidorus spp.)和毛刺线虫属(Trichodorus spp.);半寄生虫,如半穿刺线虫属(Tylenchulus spp.);迁移性体内寄生虫,如短体线虫属(Pratylenchus spp.)、穿孔线虫属(Radopholus spp.)和Scutellonerna属;固着性寄生虫,如异皮线虫属(Heterodera spp.)、球异皮线虫属(Globodera spp.)和根结线虫属(Meloidogyne spp.),和茎叶内寄生虫,如茎线虫属(Ditylenchus spp.)、滑刃线虫属(Aphelenchoides spp.)和Hirshmaniella属。另外,有害的根寄生土壤线虫是异皮线虫属(Heterodera)或球异皮线虫属(Globodera)的胞囊形成线虫,和/或根结线虫属(Meloidogyne)的根癌线虫。例如,这些属的有害种为南方根结线虫(Meloidogyneincognata)、大豆胞囊线虫(Heterodera glycines,大豆胞囊线虫)、马铃薯白线虫(Globodera pallida)和马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)(马铃薯胞囊线虫)。作为植物有害生物重要的其它重要属包括肾形线虫属(Rotylenchulus spp.)、Paratriclodorus属、穿刺短体线虫(Pratylenchus penetrans)、相似穿孔线虫(Radopholus simuli)、起绒草茎线虫(Ditylenchus dispaci)、柑橘半穿刺线虫(Tylenchulus semipenetrans)、剑线虫属(Xiphinema spp.)、伞滑刃线虫属(Bursaphelenchus spp.)等,具体地,滑刃线虫属(Aphelenchoides spp.)、伞滑刃线虫属(Bursaphelenchus spp.)、茎线虫属(Ditylenchus spp.)、球异皮线虫属(Globoderaspp.)、异皮线虫属(Heterodera spp.)、长针线虫属(Longidorus spp.)、根结线虫属(Meloidogyne spp.)、短体线虫属(Pratylenchus spp.)、相似穿孔线虫(Radopholussimilis)、毛刺线虫属(Trichodorus spp.)、柑橘半穿刺线虫(Tylenchulussemipenetrans)、剑线虫属(Xiphinema spp.)。
本文中还公开了作为植物有害生物的植物病毒,所述植物病毒选自苜蓿花叶病毒属(alfamovirus)、青葱X病毒属(allexivirus)、α潜隐病毒属(alphacryptovirus)、环斑病毒属(anulavirus)、苹果北美疤类病毒属(apscaviroid)、黄金葛病毒属(aureusvirus)、燕麦属病毒属(avenavirus)、aysunviroid、杆状DNA病毒属(badnavirus)、菜豆金黄花叶病毒属(begomovirus)、甜菜坏死黄脉病毒属(benyvirus)、β潜隐病毒属(betacryptovirus)、乙型线形病毒(betaflexiviridae)、雀麦花叶病毒(bromovirus)、大麦黄花叶病毒(bymovirus)、发状病毒(capillovirus)、香石竹潜病毒(carlavirus)、香石竹斑驳病毒(carmovirus)、花椰菜花叶病毒(caulimovirus)、木薯脉花叶病毒(cavemovirus)、樱桃锉叶病毒(cheravirus)、线形病毒(closterovirus)、椰子死亡类病毒(cocadviroid)、锦紫苏类病毒(coleviroid)、豇豆花叶病毒(comovirus)、毛形病毒(crinivirus)、毛形病毒(cucumovirus)、甜菜曲顶病毒(curtovirus)、质型弹状病毒(cytorhabdovirus)、香石竹病毒(dianthovirus)、碗豆耳突花叶病毒(enamovirus)、幽影病毒和B-型卫星病毒(umbravirus&B-type satellite virus)、蚕豆病毒(fabavirus)、斐济病毒(fijivirus)、真菌传棒状病毒(furovirus)、大麦条纹花叶病毒(hordeivirus)、啤酒花矮化类病毒(hostuviroid)、悬钩子病毒(idaeovirus)、等轴不稳环斑病毒属(ilarvirus)、甘薯病毒(ipomovirus)、黄矮病毒(luteovirus)、玉米褪绿斑驳病毒(machlomovirus)、柘橙病毒(macluravirus)、玉米雷亚朵非纳病毒(marafivirus)、玉米线条病毒(mastrevirus)、矮缩病毒(nanovirus)、坏死病毒(necrovirus)、线虫传多面体病毒(nepovirus)、核弹状病毒属(nucleorhabdovirus)、油橄榄病毒(oleavirus)、柑橘鳞皮病毒(ophiovirus)、水稻病毒(oryzavirus)、黍花叶病毒(panicovirus)、花生皱丛簇病毒(pecluvirus)、碧冬茄病毒(petuvirus)、植物呼肠病毒(phytoreovirus)、马铃薯卷叶病毒(polerovirus)、马铃薯帚顶病毒属(pomovirus)、铃薯纺锤形块茎类病毒(pospiviroid)、马铃薯X病毒(potexvirus)、马铃薯Y病毒(potyvirus)、呼肠孤病毒(reovirus)、弹状病毒(rhabdovirus)、黑麦草花叶病毒属(rymovirus)、温州蜜柑矮缩病毒(sadwavirus)、SbCMV-样病毒(SbCMV-like virus)、伴生病毒(sequivirus)、南方菜豆花叶病毒组(sobemovirus)、纤细病毒(tenuivirus)、TNsatV-样卫星病毒(TNsatV-like satellitevirus)、烟草花叶病毒(tobamovirus)、番茄伪曲顶病毒(topocuvirus)、番茄斑萎病毒(tospovirus)、发状病毒(trichovirus)、花叶病毒(tritimovirus)、东格鲁病毒(tungrovirus)、芜菁黄花叶病毒(tymovirus)、幽影病毒(umbravirus)、叶脉曲张病毒(varicosavirus)、葡萄病毒(vitivirus)或矮化病毒(waikavirus)。
[靶标抗原的形式]
基于本文的公开内容,将理解对于农用化学品和生物控制应用,如本文所公开的组合物的重链可变域在原理上将针对或特异性结合至一些不同形式的鞘脂靶标。还预期如本文所公开的组合物的重链可变域将结合至它们的鞘脂靶标的一些天然存在的或合成的类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段。更具体地,预期如本文所公开的组合物的重链可变域将至少结合至(仍)含有那些重链可变域所结合的天然鞘脂靶标的结合位点、部分或域的鞘脂靶标的那些类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段。
[制剂]
设想包含在如本文所公开的农用化学品或生物控制组合物中的多肽含量可以在广泛的范围内改变,并且它通常根据要减弱的特定作物有害生物由生产商决定以改变特定多肽的浓度范围。
在具体的实施方式中,本发明提供了包含至少一种重链可变域的农用化学组合物,其中所述重链可变域以对于保护或治疗植物或所述植物的一部分抵抗感染或与所述植物病原体的其它生物相互作用有效的量存在。
在具体的实施方式中,包含在农用化学组合物中的重链可变域或多肽的浓度可以从按重量计的0.0001%至50%。
在具体的实施方式中,本发明提供了包含至少一种重链可变域的农用化学组合物,其中所述农用化学组合物中的至少一种可变域的浓度在按重量计0.001%至50%的范围内。
在另一个具体的实施方式中,包含在农用化学组合物中的重链可变域或多肽的浓度可以从按重量计的0.001%至50%。在另一个具体的实施方式中,包含在农用化学组合物中的重链可变域或多肽的浓度可以从按重量计的0.01%至50%。在另一个具体的实施方式中,包含在农用化学组合物中的重链可变域或多肽的浓度可以从按重量计的0.1%至50%。
在另一个具体的实施方式中,包含在农用化学组合物中的重链可变域或多肽的浓度可以从按重量计的1%至50%。在另一个具体的实施方式中,包含在农用化学组合物中的重链可变域或多肽的浓度可以从按重量计的10%至50%。在另一个具体的实施方式中,包含在农用化学组合物中的重链可变域或多肽的浓度可以从按重量计的0.0001%至40%。在另一个具体的实施方式中,包含在农用化学组合物中的重链可变域或多肽的浓度可以从按重量计的0.001%至40%。在另一个具体的实施方式中,包含在农用化学组合物中的重链可变域或多肽的浓度可以从按重量计的0.01%至40%。在另一个具体的实施方式中,包含在农用化学组合物中的重链可变域或多肽的浓度可以从按重量计的0.1%至40%。在另一个具体的实施方式中,包含在农用化学组合物中的重链可变域或多肽的浓度可以从按重量计的1%至40%。在另一个具体的实施方式中,包含在农用化学组合物中的重链可变域或多肽的浓度可以从按重量计的0.0001%至30%。在另一个具体的实施方式中,包含在农用化学组合物中的重链可变域或多肽的浓度可以从按重量计的0.001%至30%。在另一个具体的实施方式中,包含在农用化学组合物中的重链可变域或多肽的浓度可以从按重量计的0.01%至30%。在另一个具体的实施方式中,包含在农用化学组合物中的重链可变域或多肽的浓度可以从按重量计的0.1%至30%。在另一个具体的实施方式中,包含在农用化学组合物中的重链可变域或多肽的浓度可以从按重量计的1%至30%。在另一个具体的实施方式中,包含在农用化学组合物中的重链可变域或多肽的浓度可以从按重量计的0.0001%至10%。在另一个具体的实施方式中,包含在农用化学组合物中的重链可变域或多肽的浓度可以从按重量计的0.001%至10%。在另一个具体的实施方式中,包含在农用化学组合物中的重链可变域或多肽的浓度可以从按重量计的0.01%至10%。在另一个具体的实施方式中,包含在农用化学组合物中的重链可变域或多肽的浓度可以从按重量计的0.1%至10%。在另一个具体的实施方式中,包含在农用化学组合物中的重链可变域或多肽的浓度可以从按重量计的1%至10%。在另一个具体的实施方式中,包含在农用化学组合物中的重链可变域或多肽的浓度可以从按重量计的0.0001%至1%。在另一个具体的实施方式中,包含在农用化学组合物中的重链可变域或多肽的浓度可以从按重量计的0.001%至1%。在另一个具体的实施方式中,包含在农用化学组合物中的重链可变域或多肽的浓度可以从按重量计的0.01%至1%。在另一个具体的实施方式中,包含在农用化学组合物中的重链可变域或多肽的浓度可以从按重量计的0.1%至1%。
在具体的实施方式中,本文所公开的农用化学组合物包含至少一种重链可变域,其在水溶液中配制。
在其它具体实施方式中,本文所公开的农用化学组合物包含至少一种重链可变域并且还包含农用化学适合的载体和/或一种或多种适合的佐剂。
除如上所述的抗有害生物可变域之外,根据本发明所述的组合物可以包含在植物和/或植物的一部分的有害生物治疗中可用的固体或液体载体和/或在植物和/或植物的一部分的有害生物治疗中也可用的表面活性剂。具体地,可以使用惰性的并且常用的载体和常用的表面活性剂。这些组合物不但涵盖了准备通过浸没或使用适合的装置应用于要治疗的植物和/或植物的一部分的组合物,而且还涵盖了在应用于植物和/或植物的一部分之前必需稀释的商品化浓缩组合物。
根据本发明的这些农用化学组合物还可以含有任何种类的其它成分,如(例如)保护性胶体、粘合剂、增稠剂、触变剂、渗透剂、稳定剂、多价螯合剂(sequestrant)、凸纹剂(texturing agent)、调味剂、增味剂、糖、甜味剂、着色剂等。更一般地,根据常用制剂技术,活性物质(即至少一个重链可变域)可以与任何固体或液体添加剂混合。
在本发明公开中,术语“载体”表示天然或合成有机或无机物质,抗有害生物活性物质与其混合以有利于其向植物和/或一个或多个植物部分应用。因此,该载体通常是惰性的并应在农业部门是可接受的。所述载体可以是固体(粘土、天然或合成硅酸盐、二氧化硅、树脂、蜡、固体肥料等)或液体(水、醇,具体地丁醇等)。
表面活性剂可以是离子或非离子型乳化剂、分散剂或润湿剂或者这些表面活性剂的混合物。可以提及(例如)聚丙烯酸盐、木素磺酸盐、苯酚磺酸或萘磺酸盐、环氧乙烷与脂质醇或与脂质酸或与脂质胺的缩聚物、取代酚(具体地,烷基酚或芳基酚)、磺基琥珀酸酯的盐、牛磺酸的衍生物(具体地,烷基牛磺酸酯)、聚氧乙基化(聚氧乙撑化,polyoxyethylated)的酚或醇的磷酸酯、脂质酸和多元醇的酯、上述化合物含有硫酸盐、磺酸盐和磷酸盐官能团的衍生物。当惰性载体不溶于水并且当用于应用的载体剂是水时,至少一种表面活性剂的存在通常是必需的。
如本文所公开的农用化学组合物本身处于相当不同的固体或液体形式。
作为固体组合物形式,可能提及可撒粉剂(活性物质含量可以多至100%)和颗粒剂,具体地通过挤出、通过压制、通过造粒载体的浸没、通过使用粉剂作为起始材料的造粒所获得的那些(对于这些随后的情况,这些颗粒剂中活性物质的含量在0.5至80%之间)。可以任选地以液体形式使用这些固体组合物,根据所需的应用类型,例如,通过在水中稀释,所述液体是不同程度粘稠的。
作为液体组合物形式或意欲在应用期间构成液体组合物的形式,可以提及溶液,具体地水溶性浓缩液、乳液、混悬浓缩液、可湿性粉剂(或喷雾粉剂)、油剂和蜡。制备了可以通过喷雾应用的混悬浓缩液,以获得不形成沉淀的稳定液体产物,并且它们通常含有10至75%的活性物质、0.5至15%的表面活性剂、0.1至10%的触变剂、0至10%的适合的添加剂,如消泡剂、腐蚀抑制剂、稳定剂、渗透剂和粘合剂以及作为载体其中活性物质不溶或不易溶的水或有机液体:一些有机固体或无机盐可以溶于载体以帮助防止沉淀或用作水的抗凝胶。
如本文所公开的农用化学组合物可以以它们的制剂形式或者作为从中所制备的使用形式使用,如气雾分散剂(aerosol dispenser)、胶囊悬浮剂、冷雾浓缩剂、热雾浓缩剂、包封颗粒剂、细粒剂、用于种子处理的可流动浓缩剂、即用溶液、可撒粉剂、可乳化的浓缩剂、水包油乳剂、油包水乳剂、大粒剂、微粒剂、油可分散粉剂、油可混溶可流动浓缩剂、油可混溶液体、泡沫剂(froth)、膏剂、杀虫剂涂覆的种衣剂(seed coated with apesticide)、混悬浓缩剂(可流动浓缩剂)、混悬液-乳液-浓缩剂、可溶性浓缩剂、混悬剂、可溶性粉剂、颗粒剂、水溶性颗粒剂或片剂、用于种子处理的水溶性粉剂、可湿性粉剂、经活性化合物浸没的天然和合成材料、聚合物材料和种子包衣中的微囊剂以及ULV-冷雾和热雾制剂、气体(在压力下)、产气产物、植物药签剂(plant rodlet)、用于干种子处理的粉剂、用于种子处理的溶液、超小体积(ULV)液体、超小体积(ULV)混悬液、水可分散颗粒剂或片剂、用于浆液处理的水可分散粉剂。
通过将活性化合物或活性化合物组合与常用添加剂混合以已知方式制备这些制剂,所述添加剂如(例如)常用的膨胀剂(增补剂,extender)以及溶剂或稀释剂、乳化剂、分散剂和/或粘结剂或固定剂、润湿剂、防水剂,如果适合,干燥剂(siccative)和UV稳定剂、着色剂、颜料、消泡剂、防腐剂、辅助增稠剂、粘合剂、赤霉素(gibberellins)和水以及其它加工助剂。
这些组合物不但包括准备好通过适合的装置(如喷雾或喷洒(dusting)装置)应用于待处理的植物或种子的组合物,而且还包括在应用于作物前必须稀释的浓缩商品化组合物。
[植物保护或治疗的方法]
在某些方面,本发明提供了保护或治疗植物或植物的一部分抵抗感染或与植物有害生物的其它生物相互作用的方法,所述方法至少包括以下步骤:在对于保护或治疗所述植物或所述植物的一部分抵抗该感染或与植物病原体的生物相互作用有效的条件下,将如本文所公开的农用化学组合物直接或间接应用于所述植物或所述植物的一部分。
在具体的实施方式中,这些方法包括将如本文所公开的农用化学组合物以高于50g农用化学组合物/公顷的应用量直接或间接应用于植物或植物的一部分,如(但不限于)高于75g农用化学组合物/公顷的应用量,如高于100g农用化学组合物/公顷的应用量,或者具体地高于200g农用化学组合物/公顷的应用量。
在具体的实施方式中,这些方法包括将如本文所公开的农用化学组合物以50g至100g农用化学组合物/公顷的应用量直接或间接应用于植物或植物的一部分,如(但不限于)50g至200g农用化学组合物/公顷的应用量,具体地75g至175g农用化学组合物/公顷的应用量,如75g至150g农用化学组合物/公顷或75g至125g/公顷。
在另一个实施方式中,本发明提供了抵抗植物有害生物的方法,所述方法包括以低于50g所述多肽/公顷的应用量将根据本发明的农用化学或生物控制组合物应用于植物(如作物)或者植物或作物的一部分。在具体的实施方式中,所述应用量低于45g/ha、低于40g/ha、低于35g/ha、低于30g/ha、低于25g/ha、低于20g/ha、低于15g/ha、低于10g/ha、低于5g/ha、低于1g/ha或甚至更低的多肽量/ha。
应理解根据作物和植物有害生物的环境压力,农民可以改变应用量。在与特定农用化学组合物一起递送的技术资料中指明了这些应用量变化。
在另一个实施方式中,本发明提供了本发明所述的农用化学或生物控制组合物用于抵抗植物有害生物的应用。
可以使用对于将农用化学或生物控制组合物应用于作物适合的任何方法,将根据本发明的农用化学或生物控制组合物应用于作物,所述方法包括(但不限于)喷雾(包括大体积(HV)、小体积(LV)和超小体积(ULV)喷雾)、刷涂、涂敷、滴涂、涂覆、浸涂、浸没、涂布、生雾(fogging),作为小液滴、雾或气雾剂应用。
因此,在具体的实施方式中,如本文所公开的保护或治疗植物或植物的一部分抵抗感染或与植物有害生物的其它生物相互作用的方法包括通过喷雾、雾化、起泡、生雾(fogging)、在水培法中培养、在水耕法中培养、涂覆、浸没和/或结壳将所述农用化学组合物直接或间接应用于植物或植物的一部分。
在某些具体的实施方式中,本发明提供了抑制、防止、降低或控制植物病原体生长的方法,其包括至少以下步骤:将如本文所公开的农用化学组合物直接或间接应用于植物或所述植物的一部分。
在某些其它实施方式中,本发明提供了杀死植物病原体的方法,其包括至少以下步骤:将如本文所公开的农用化学组合物直接或间接应用于植物或所述植物的一部分。
根据本发明的农用化学组合物的应用量(表示应用于作物的农用化学组合物的量)使得将包含在根据本发明所述的农用化学或生物控制组合物中的小于50g、45g、40g、35g、30g、25g、20g、20g、15g、10g、5g、1g或甚至低于1g的多肽应用于每公顷的作物。
根据如本文所公开的方法,可以将农用化学或生物控制组合物应用于作物一次,或者可以将其应用两次或更多次,每次应用之后具有处于每两次应用之间的间隔。根据本发明所述的方法,可以将根据本发明的农用化学或生物控制组合物单独或与其它材料(优选地其它农用化学或生物控制组合物)混合应用于作物;作为另外一种选择,可以将根据本发明所述的农用化学或生物控制组合物与其它材料(优选地其它农用化学或生物控制组合物)分别应用于作物,在不同时间应用于相同作物。根据本发明所述的方法,可以将根据本发明的农用化学或生物控制组合物预防性地应用于作物,或者作为另外一种选择,一旦在要治疗的特定作物上鉴别出靶标有害生物,则可以应用所述组合物。
可以通过上述方法将如本文所公开的农用化学组合物直接应用于植物、作物或所述植物的一个或多个部分,如在收获前或收获后阶段直接应用于整个植物或直接应用于所述植物的一个或多个部分。在某些其它实施方式中,可以通过上述方法将如本文所公开的农用化学组合物直接应用于植物的一个或多个部分,如直接应用于杆、叶、块茎、茎、芽、种子、果实、根、花、谷粒、芽等。
如本文所公开的治疗方法还可以在保护储存货物抵抗植物病原体攻击的领域中使用。根据本发明,术语“储存货物”应理解为表示蔬菜或动物来源的天然物质以及它们的加工形式,其取自自然生命循环并且需要长期保护。可以以新鲜采收状态或以加工形式(如预干燥、潮湿、粉碎、磨碎、压榨或烘烤)保护蔬菜来源的存储货物,如植物或其部分,例如,杆、叶、块茎、种子、果实或谷粒。木材也属于存储货物的定义,无论以粗木材的形式,如建筑用木材、电线杆和围栅,或者以成品形式,如家具或由木材制造的物品。动物来源的存储货物是生皮、皮革、皮草、毛发等。根据本发明的组合可以防止不利影响,如腐烂、褪色或发霉。优选地,“存储货物”应理解为表示植物来源的天然物质以及它们的加工形式,更优选地,水果以及它们的加工形式,如仁果(pomes)、核果(stone fruits)、软果和柑桔类水果以及它们的加工形式。
还可以通过上述方法将如本文所公开的农用化学组合物间接应用于植物、作物或所述植物的一个或多个部分,如在收获前或收获后阶段间接应用于整个植物或间接应用于所述植物的一个或多个部分。因此,在某些实施方式中,可以通过上述方法将如本文所公开的农用化学组合物间接应用于植物、作物或植物的一个或多个部分,如通过将所述农用化学组合物应用于植物或植物的一个或多个部分生长或储存的环境或介质,如(例如,但不限于)植物或植物的一个或多个部分生长或储存的空气、土壤、溶液培养基、水培培养基或液体培养基,如(例如)含水液体培养基或水。
因此,在本发明申请的背景中,通常应理解直接实施使用如本文所公开的农用化学组合物对植物和植物部分的处理,或者以正常处理方法,例如,通过浇水(喷淋)、滴灌、喷雾、汽化、雾化、撒播(broadcasting)、抛撒(dusting)、起泡、涂布以及作为粉剂通过对它们的环境、栖息地或存储区的作用来实施。还可能通过超小体积法应用所述组合物,或将活性化合物制剂或活性化合物本身注射到土壤中。
在具体的实施方式中,用于保护或处理植物或植物部分抵抗感染或与如本文所公开的植物病原体的其它生物相互作用的方法包括在收获前或收获后阶段将所述农用化学组合物直接或间接应用于植物或植物的一部分。
根据具体的实施方式,收获的产品是果实、花、坚果或蔬菜、具有不可食外皮的水果或蔬菜,其优选地选自鳄梨、香蕉、车前草、柠檬、葡萄柚、甜瓜、橙、菠萝、奇异果、番石榴、桔、芒果,并且南瓜是优选的,更优选地香蕉、橙、柠檬和桃,具体地香蕉。根据其它具体的实施方式,收获的产品是来自装饰植物的切花,其优选地选自六出花属、康乃馨、菊花、小苍兰属、大丁草、唐菖蒲、满天星(满天星种)、向日葵、八仙花属、百合属、洋桔梗、玫瑰和夏花。
可以应用如本文所公开的农用化学组合物的植物物种可以是(例如,但不限于)玉米、大豆、苜蓿、棉花、向日葵、芸苔属油料种子,如芜菁甘蓝(Brassica napus)(例如,油菜、菜籽)、芜菁(Brassica rapa)、芥菜(B.juncea)(例如,(田)芥菜)和埃塞俄比亚芥(Brassica carinata)、棕榈科(例如,油棕、椰子)、水稻、小麦、甜菜、甘蔗、燕麦、黑麦、大麦、粟和高粱、黑小麦、亚麻、坚果、葡萄和藤以及来自多个植物学分类单元的多种水果和蔬菜,例如,蔷薇科(Rosaceae sp.)(例如,仁果类,如苹果和梨,以及核果类,如杏、樱桃、杏、李子和桃,和浆果类,如草莓、树莓、红醋栗和黑加仑以及醋栗)、Ribesioidae科、胡桃科(Juglandaceae sp.)、桦科(Betulaceae sp.)、漆树科(Anacardiaceae sp.)、山毛榉科(Fagaceae sp.)、桑科(Moraceae sp.)、木犀科(Oleaceae sp.)(例如,油橄榄树)、猕猴桃科(Actinidaceae sp.)、樟科(Lauraceae sp.)(例如,鳄梨、肉桂、樟脑)、芭蕉科(Musaceaesp.)(例如,香蕉树和种植园)、茜草科(Rubiaceae sp.)(例如,咖啡)、茶科(Theaceae sp.)(例如,茶)、梧桐科(Sterculiceae sp.)、芸香科(Rutaceae sp.)(例如,柠檬、橙、桔和葡萄柚);茄科(Solanaceae sp.)(例如,番茄、马铃薯、胡椒、辣椒、茄、烟草)、百合科(Liliaceaesp.)、菊科(Compositae sp.)(例如,莴苣、朝鲜蓟和菊苣-包括菊苣(root chicory)、苦苣或菊苣(common chicory))、伞形科(Umbelliferae sp.)(例如,胡萝卜、欧芹、芹菜和块根芹)、葫芦科(Cucurbitaceae sp.)(例如,黄瓜-包括小黄瓜、南瓜、西瓜、葫芦和甜瓜)、葱科(Alliaceae sp.)(例如,韭菜和洋葱)、十字花科(Cruciferae sp.)(例如,白球甘蓝、红甘蓝、茎椰菜、花椰菜、抱子甘蓝、白菜、大头菜、萝卜、辣根、水芹和大白菜)、豆科(Leguminosae sp.)(例如,花生、豌豆类、小扁豆和豆类—例如,刀豆和蚕豆)、藜科(Chenopodiaceae sp.)(例如,厚皮菜、饲用甜菜、菠菜、甜菜根)、亚麻科(Linaceae sp.)(例如,大麻)、Cannabeacea科(例如,大麻)、锦葵(Malvaceae sp.)(例如,秋葵、可可)、罂粟科(Papaveraceae)(例如,罂粟)、天门冬科(Asparagaceae)(例如,芦笋);花园和木材中有用的植物和装饰植物,包括草皮、草地、草和甜菊(Stevia rebaudiana);和在所有情况下,这些植物的遗传修饰类型。
在本文所公开的处理方法的优选实施方式中,所述作物选自大田作物、草、果实和蔬菜、草地、树和装饰植物。
在某些方面,本发明因此还提供了保护或治疗收获的植物或植物收获的部分抵抗感染或与植物病原体的其它生物相互作用的收获后处理方法,所述方法至少包括以下步骤:在对于保护或治疗所述收获的植物或所述植物收获的部分抵抗感染或与植物病原体的生物相互作用有效的条件下,将如本文所公开的农用化学组合物直接或间接应用于所述收获的植物或所述植物收获的部分。根据具体的实施方式,收获的产品是果实、花、坚果或蔬菜、具有不可食外皮的水果或蔬菜,其优选地选自鳄梨、香蕉、车前草、柠檬、葡萄柚、甜瓜、橙、菠萝、奇异果、番石榴、桔、芒果,并且南瓜是优选的,更优选地香蕉、橙、柠檬和桃,具体地香蕉。根据其它具体的实施方式,收获的产品是来自装饰植物的切花,其优选地选自六出花属、康乃馨、菊花、小苍兰属、大丁草、唐菖蒲、满天星(满天星种)、向日葵、八仙花属、百合属、洋桔梗、玫瑰和夏花。根据其它具体实施方式,收获的产物是收割的草或木材。
收获后病症是(例如)皮孔斑病、枯黄、衰老降解、苦陷病、褐斑、水心病、褐变、维管破环、CO2损伤、CO2或O2缺乏和软化。真菌疾病可以由(例如)以下真菌造成:小球壳属(Mycosphaerella spp.),香蕉叶斑病菌(Mycosphaerella musae)、Mycosphaerellafragaae、柑橘球腔菌(Mycosphaerella citri);毛霉菌属(Mucor spp.),例如,梨形毛霉菌(Mucor piriformis);链核盘菌属(Monilinia spp.),例如,桃褐腐病菌(Moniliniafructigena)、核果链核盘菌(Monilinia laxa);拟点霉属(Phomopsis spp.),Phomopsisnatalensis;刺盘孢属(Colletotrichum spp.),例如,香蕉炭疽菌(Colletotrichummusae)、胶胞炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、粒状体刺盘抱(Colletotrichumcoccodes);轮枝孢菌属(Verticillium spp.),例如,VerticiHium theobromae;黑孢属(Nigrospora spp.);葡萄孢属(Botrytis spp.),例如,灰葡萄孢(Botrytis cinerea);色二孢属(Diplodia spp.),例如,柑桔色二孢(Diplodia citri);无柄盘菌属(Peziculaspp.);链格孢属(Alternaria spp.),例如,柑桔链格孢(Alternaria citri)、隔交链格孢(Alternaria alternata);壳针孢属(Septoria spp.),例如Septoria depressa;黑星菌属(Venturia spp.),例如,苹果黑星菌(Venturia inaequalis)、梨黑星菌(Venturiapyrina);根霉属(Rhizopus spp.),例如,葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)、米根霉(Rhizopus oryzae);小从壳属(Glomerella spp.),例如,围小从壳(Glomerellacingulata);核盘霉(Sclerotinia spp.),例如,果生核盘菌(Sclerotinia fruiticola);长喙壳属(Ceratocystis spp.),例如,奇异长喙壳菌(Ceratocystis paradoxa);镰刀菌属(Fusarium spp.),例如,半裸镰刀菌(Fusarium semitectum)、串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme)、茄病镰刀菌(Fusarium solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum);芽枝霉属(Cladosporium spp.),例如、黄枝孢(Cladosporium fulvum),Cladosporiumcladosporioides、瓜枝孢(Cladosporium cucumerinum)、香蕉芽枝霉(Cladosporiummusae);青霉菌属(Penicillium spp.),例如,绳状青霉(Penicillium funiculosum)、扩展青霉(Penicillium expansum)、指状笔霉(Penicillium digitatum)、意大利青霉(Penicillium italicum);疫霉属(Phytophthora spp.),例如,柑桔褐腐疫霉(Phytophthora citrophthora)、草莓疫莓(Phytophthora fragariae)、恶疫霉(Phytophthora cactorum)、寄生疫霉(Phytophthora parasitica);星裂壳孢属(Phacydiopycnis spp.),例如,Phacydiopycnis malirum;盘长孢属(Gloeosporiumspp.),例如,白盘长孢(Gloeosporium album)、Gloeosporium perennans、果生盘长孢(Gloeosporium fructigenum)、Gloeosporium singulata;地霉属(Geotrichum spp.),例如,白地霉(Geotrichum candidum);壳蛇孢属(Phlyctaena spp.),例如,Phlyctaenavagabunda;柱孢属(Cylindrocarpon spp.),例如,苹果柱孢(Cylindrocarpon mali);匍柄霉属(Stemphyllium spp.),例如,黄花菜匍柄霉菌(stemphyllium vesicarium);根串珠霉属(Thielaviopsis spp.),例如,奇异根串株霉(Thielaviopsis paradoxy);曲霉属(Aspergillus spp.),例如,黑曲霉(Aspergillus niger)、炭黑曲霉(Aspergilluscarbonarius);丛赤壳属(Nectria spp.),例如,干癌丛赤壳菌(Nectria galligena);尾孢属(Cercospora spp.),例如,Cercospora angreci、芹菜尾孢(Cercospora apii)、黑线尾孢(Cercospora atrofiliformis)、芭蕉尾孢(Cercospora musae)、玉蜀黍尾孢(Cercospora zeaemaydis)。
在其它方面,本发明提供了如本文所公开的农用化学组合物作为抗有害生物试剂的应用,如(例如),生物抑制剂或杀虫剂,其包括(但不限于)抑真菌剂或杀真菌剂。
在具体的实施方式中,根据本发明所述的方法抵抗的植物有害生物是植物病原真菌,如先前所定义的。由于应用根据本发明所述的方法,病变数、病变大小和真菌病原体孢子形成程度均可降低。
[重链可变域序列的产生和生产方法]
本发明还提供了制备或产生所述重链可变域序列的方法,和用于产生编码这些重链可变域的核酸的方法,以及包含这些重链可变域序列的宿主细胞、产物和组合物。根据本文的进一步描述,这些方法的一些优选但非限制性实例将更加清晰。
如对于技术人员将清楚的是,制备如本文所公开的重链可变域序列的一个特别有用的方法通常包括以下步骤:
(a)表达编码如本文所公开的重链可变域序列的核苷酸序列或包含编码该重链可变域序列的核苷酸序列的载体或遗传构建体,和
(b)任选地分离和/或纯化所述重链可变域序列。
在本文设想的具体实施方式中,可以通过以下方法获得有害生物特异性重链可变域序列,所述方法包括:产生随机氨基酸序列文库并对该文库筛选能够特异性结合至鞘脂靶标的氨基酸序列。
因此,在具体的实施方式中,制备如本文所公开的重链可变域序列的方法包括以下步骤:
a)提供重链可变域序列的氨基酸序列组、集合或文库;和
b)对所述氨基酸序列组、集合或文库筛选可以结合至鞘脂靶标和/或对鞘脂靶标具有亲合力的氨基酸序列。
和
c)分离可以结合至鞘脂靶标和/或对鞘脂靶标具有亲合力的氨基酸序列。
在该方法中,所述氨基酸序列组、集合或文库可以是任何适合的氨基酸序列组、集合或文库。例如,氨基酸序列组、集合或文库可以是(如本文所述的)免疫球蛋白片段序列组、集合或文库,如免疫球蛋白片段序列的初始型(naive)组、集合或文库;免疫球蛋白片段序列的合成或半合成组、集合或文库;和/或已进行亲合力成熟的免疫球蛋白片段序列组、集合或文库。
在该方法的具体实施方式中,所述氨基酸序列组、集合或文库可以是免疫球蛋白片段序列的免疫组、集合或文库,例如,来源于已用鞘脂靶标或用基于其或来源于其的适合的抗原决定簇(如其抗原部分、片段、区、域、环或其它表位)适当免疫的哺乳动物。在一个具体方面,所述抗原决定簇可以是胞外部分、区、域、环或其它胞外表位。
在上述方法中,所述氨基酸序列组、集合或文库可以在噬菌体、噬粒(phagemid)、核糖体或适合的微生物(如酵母)上展示以例如有利于筛选。例如,根据本文中进一步的公开内容,用于展示和筛选氨基酸序列(组、集合或文库)的适合的方法、技术和宿主生物将对本领域技术人员是清楚的。参考Hoogenboom在Nature Biotechnology,23,9,1105-1116(2005)中的综述。
在其它实施方式中,用于产生如本文所公开的重链可变域序列的方法包括至少以下步骤:
a)提供表达重链可变域氨基酸序列的细胞集合或样品;
b)对所述细胞集合或样品筛选表达可以结合至鞘脂靶标和/或对鞘脂靶标具有亲合力的氨基酸序列的细胞;
和
c)(i)分离所述氨基酸序列;或(ii)从所述细胞分离编码所述氨基酸序列的核酸序列,然后表达所述氨基酸序列。
例如,细胞集合或样品可以是B细胞集合或样品。另外,在该方法中,所述细胞样品可以来源于已用真菌靶标或用基于其或来源于其的适合的抗原决定簇(如其抗原部分、片段、区、域、环或其它表位)适当免疫的哺乳动物。在一个具体的实施方式中,所述抗原决定簇可以是胞外部分、区、域、环或其它胞外表位。
在其它实施方式中,用于产生针对鞘脂靶标的重链可变域序列的方法可包括至少以下步骤:
a)提供编码重链可变域氨基酸序列的核酸序列组、集合或文库;
b)对所述核酸序列组、集合或文库筛选编码可以结合至鞘脂靶标和/或对鞘脂靶标具有亲合力的氨基酸序列的核酸序列;
和
c)分离所述核酸序列,然后表达所述氨基酸序列。
在上述方法中,编码氨基酸序列的核酸序列组、集合或文库可以(例如)是编码免疫球蛋白片段序列的初始型(naive)组、集合或文库的核酸序列组、集合或文库;编码免疫球蛋白片段序列的合成或半合成组、集合或文库的核酸序列组、集合或文库;和/或编码已进行亲合力成熟的免疫球蛋白片段序列组、集合或文库的核酸序列组、集合或文库。
具体地,在该方法中,所述核酸序列组、集合或文库编码重链可变域组、集合或文库(如VH域或VHH域)。例如,所述核酸序列组、集合或文库可以编码域抗体或单域抗体的组、集合或文库,或者能够用作域抗体或单域抗体的氨基酸序列组、集合或文库。在具体的实施方式中,核苷酸序列组、集合或文库编码VHH序列组、集合或文库。
在上述方法中,所述核苷酸序列组、集合或文库可以在噬菌体、噬粒、核糖体或适合的微生物(如酵母)上展示以例如有利于筛选。例如,根据本文中进一步的公开内容,用于展示和筛选编码氨基酸序列的核苷酸序列(组、集合或文库)的适合的方法、技术和宿主生物将对本领域技术人员是清楚的。参考Hoogenboom在Nature Biotechnology,23,9,1105-1116(2005)中的综述。
本发明还涉及通过上述方法,或者作为另外一种选择通过包含上述方法之一和另外至少以下步骤的方法可获得或获得的氨基酸序列,所述步骤为:确定所述免疫球蛋白序列的核苷酸序列或氨基酸序列;和以本身已知的方式表达或合成所述氨基酸序列,如通过在适合的宿主细胞或宿主生物中表达或通过化学合成。
[重链可变域的分离]
在一些情况下,如本文所设想的用于产生特异性结合至真菌靶标的氨基酸序列的方法还可以包括以下步骤:从所述氨基酸序列文库中分离至少一种对鞘脂靶标具有可检测的结合亲合力或对鞘脂靶标具有可检测的体外作用的重链可变域。
这些方法还可以包括以下步骤:扩增编码至少一种对鞘脂靶标具有可检测的结合亲合力或对鞘脂靶标的活性具有可检测的体外作用的重链可变域的序列。例如,可以通过细菌寄主(宿主细菌,host bacteria)的再感染和在生长培养基中的培育扩增得自本文所述方法的选择步骤的展示特定氨基酸序列的噬菌体克隆。
在具体的实施方式中,这些方法可以涵盖确定能够结合至鞘脂靶标的一种或多种氨基酸序列的序列。
当在适合的细胞或噬菌体或颗粒上展示包含在氨基酸序列组、集合或文库中的重链可变域序列时,有可能从所述细胞或噬菌体或颗粒中分离编码该氨基酸序列的核苷酸序列。以这种方法,可以通过常规测序方法确定所选的氨基酸序列文库成员的核苷酸序列。
在其它具体实施方式中,如本文所设想的产生重链可变域的方法包括以下步骤:在适合的条件下在宿主生物中表达所述核苷酸序列以获得确实需要的氨基酸序列。可以通过本领域技术人员已知的方法进行该步骤。
另外,任选地在已鉴别它们的序列之后,可以作为可溶性蛋白构建体合成对鞘脂靶标具有可检测的结合亲合力或对鞘脂靶标的活性具有可检测的体外作用的所得重链可变域序列。
例如,可以使用本领域中已知的重组或化学合成方法合成通过上述方法获得、可获得或选择的重链可变域序列。另外,可以通过基因工程技术产生通过上述方法获得、可获得或选择的氨基酸序列。因此,用于合成通过上述方法获得、可获得或选择的重链可变域序列的方法可以包括用编码对鞘脂靶标具有可检测的结合亲合力或对鞘脂靶标的活性具有可检测的体外作用的氨基酸序列的核酸或载体转化或感染宿主细胞。因此,可以通过重组DNA方法制备对鞘脂靶标具有可检测的结合亲合力或对鞘脂靶标的活性具有可检测的体外作用的氨基酸序列。可以使用常规程序容易地合成编码所述氨基酸序列的DNA。一旦制备,可以将所述DNA引入至表达载体,然后可以将所述载体转化或转染到宿主细胞(如大肠杆菌(E.coli))或任何适合的表达系统中,从而在重组宿主细胞和/或这些重组宿主细胞所存在的培养基中获得氨基酸序列的表达。
如蛋白质表达和纯化领域技术人员已知的,应理解可以用(例如)His-标签或易于纯化的其它序列标签标记(通常在氨基酸序列的N末端或C末端)使用适合表达系统从表达载体中产生的重链可变域。
可以通过本领域技术人员已知的多种方式完成核酸或载体向宿主细胞的转化或转染,所述方式包括:磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、聚凝胺-介导的转染(polybrene-mediated transfection)、电穿孔、微注射、脂质体融合、脂质转染、原生质体融合、反转录病毒感染和基因枪(生物弹道,biolistics)。
无论位于体外或体内,用于所需重链可变域序列表达的适合的宿主细胞可以是任何真核或原核细胞(例如,细菌细胞,如大肠杆菌(E.coli)、酵母细胞、哺乳动物细胞、鸟类细胞、两栖动物细胞、植物细胞、鱼类细胞和昆虫细胞)。例如,宿主细胞可以位于转基因植物中。
因此,本发明申请还提供了用于产生对鞘脂靶标具有可检测的结合亲合力或对鞘脂靶标的活性具有可检测的体外作用的重链可变域序列的方法,其包括用编码这些氨基酸序列的核酸序列或载体转化、转染或感染宿主细胞并在适合的条件下表达所述氨基酸序列。
在另一个实施方式中,本发明还提供了用于生产(或者它的产生是等价措辞)如本文所公开的农用化学或生物控制组合物的方法。
在具体的实施方式中,本发明提供了用于产生如本文所公开的农用化学组合物的方法,其至少包括以下步骤:
—获得特异性结合至植物病原体的鞘脂的抗体的至少一个重链可变域(VHH或VH)或其功能性片段,和
—在农用化学组合物中配制所述重链可变域或其功能性片段。
在这些方法的具体实施方式中,获得特异性结合至植物病原体的鞘脂的至少一个重链可变域或其功能性片段的步骤包括:
(a)表达编码特异性结合至植物病原体的鞘脂的重链可变域或其功能性片段的核苷酸序列,和任选地
(b)分离和/或纯化所述重链可变域或其功能性片段。
在这些方法的其它具体实施方式中,获得特异性结合至植物病原体的鞘脂的至少一个重链可变域或其功能性片段的步骤包括:
a)提供重链可变域序列或重链可变域序列的功能性片段的组、集合或文库;和
b)对所述重链可变域序列或其功能性片段序列的组、集合或文库筛选特异性结合至植物病原体的鞘脂和/或对植物病原体的鞘脂具有亲合力的序列,和任选地
c)分离特异性结合至植物病原体的鞘脂和/或对植物病原体的鞘脂具有亲合力的重链可变域序列或其功能性片段序列。
本发明申请还公开了生产(或者它的产生是等价表达)如本文所公开的农用化学或生物控制组合物的方法,其包括将如本文先前所定义的具有杀虫活性的80至200个氨基酸或其它适合的子区间的氨基酸序列或多肽与至少一种常用的农用化学品助剂一起配制。
适合的生产方法在本领域中是已知的并且包括(但不限于)高或低剪切力混合、湿磨或干磨、滴铸、包封、乳化、涂覆、结壳、成丸(pilling)、挤出成粒、流化床成粒、共挤出、喷雾干燥、喷雾冷冻、雾化、加成聚合或缩合聚合、界面聚合、原位聚合、凝聚(coacervation)、喷雾包封、冷却熔融分散体、溶剂蒸发、相分离、溶剂提取、溶胶-凝胶聚合、流化床涂布、锅涂(pan coating)、熔融、被动或主动吸收或吸附。
具体地,可以通过化学合成制备如本文所公开的80至200个氨基酸或如本文先前所定义的其它适合的子区间的氨基酸序列或多肽。
还公开了可以通过体外重组微生物表达系统制备如本文先前所定义的80至200个氨基酸或其它适合的子区间的氨基酸序列或多肽并分离用于进一步的使用。这些氨基酸序列或多肽可以处于粗细胞裂解液、混悬液、胶体等中,或者作为另外一种选择可以在与常用农用化学品助剂一起配制前进行纯化、精制、缓冲和/或进一步处理。
具体地,重组方法通常包括将表达所关心的氨基酸序列、蛋白质或多肽的DNA分子插入到对该DNA分子是异源(即通常不存在于所述宿主中)的表达系统中。以适当的正义方向和正确的阅读框将所述异源DNA分子插入表达系统或载体。所述载体含有用于插入的蛋白质-编码序列的转录和翻译的必需元件。DNA的转录取决于启动子的存在。类似地,原核生物中mRNA的翻译基于不同于真核生物中的那些的正确的原核信号的存在。对于基因表达最大化的综述,参见Roberts和Lauer,Methods in Enzymology 68:473(1979)。不考虑所使用的具体调控序列,使用本领域中的标准克隆程序将DNA分子克隆到载体中,如Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Springs Laboratory,Cold SpringsHarbor,N.Y.(1989)所述。一旦将编码该蛋白质的分离的DNA分子克隆到表达系统中,则它准备好引入到宿主细胞中。基于载体/宿主细胞系统,可以通过多种转化形式进行这种引入。适合的宿主细胞包括(但不限于)细菌、病毒、酵母、哺乳动物细胞、昆虫、植物等。任选地,重组宿主细胞可以是表达天然或重组的功能性III型分泌系统的宿主细胞。在US6596509中详细描述了该内容。由于表达功能性III型分泌系统,所述细胞将表达多肽,然后将蛋白分泌到培养基中。这可以简化多肽的分离和纯化。优选地在使宿主细胞的生长和多肽的表达最优化的温度和营养条件下,可以将所述重组宿主细胞在适当的发酵室中生长。本领域的技术人员能够鉴别特定宿主细胞的优化条件。发酵后,例如,可以将细菌悬液在(例如)约2至5倍体积的缓冲液中稀释以调节至约5.5至10之间的pH,更优选地,约7至9之间的pH,并且甚至更优选地,约8.0的pH。适合的缓冲液是本领域中熟知的并且可以包括(例如)磷酸钾缓冲液或Tris-EDTA缓冲液。缓冲液的浓度可以为约0.001mM至约0.5M。调节pH后,将(细菌)混悬液溶液热处理至约60-130℃的温度,优选地,约95-125℃的温度。可以将热处理进行任何适合的时间段。在一个实施方式中,将热处理进行约5分钟至约30分钟的一段时间。然后,将加热的混悬液溶液冷却。适合的冷却温度(无限制地)为约35-55℃,优选地约45℃。冷却后,如果需要,将细菌悬液中的细菌细胞裂解以释放所述多肽。可以(例如)通过将细菌悬液与溶菌酶接触来进行细胞裂解。溶菌酶(lysozyme)的浓度可以是约2ppm至100ppm之间的任何数值。作为另外一种选择,细胞裂解可以包括非化学法,如高压或超声处理,两者都是本领域技术人员熟知的。在细胞裂解之后,培育细菌悬液可以是所期望的。适合的培育时间可以是不同的。例如,可以期望在约40-42℃的温度下将细菌悬液培育约30-45分钟的一段时间。裂解后,可以通过除去细胞碎片以及由先前热处理步骤所产生的变性蛋白来进一步提取所期望的多肽。在一个实施方式中,将提取液离心约10-20分钟以除去一些细胞碎片。适合的离心速度可以为约4000至20000rpm并且停转时间(spinning downtime)可以为约10分钟至20分钟。然后,可以通过热处理并将上清液离心来除去其它细胞碎片以获得除去了大于约60%、70%、80%、90%或95%的总固体的基本不含细胞碎片的液体提取物。可以在约60℃的温度下进行该后续热处理长达约2小时,在约100℃进行约10分钟,或在约121℃(具有15psi的压力)进行约5分钟。根据其它条件,可以改变这些温度和时间。制备含有如本文所公开的氨基酸序列或多肽的稳定液体组合物的方法还包括向液体提取物引入杀虫剂和任选地蛋白酶抑制剂和非离子型表面活性剂中的一种或两者,借此获得包含所述多肽的液体组合物。在一个实施方式中,向液体提取物引入蛋白酶抑制剂而不引入非离子型表面活性剂。在另一个实施方式中,向液体提取物引入非离子型表面活性剂而不引入蛋白酶抑制剂。在其它实施方式中,向液体提取物引入蛋白酶抑制剂和非离子型表面活性剂两者。在另一个实施方式中,向液体提出物中既不引入蛋白酶抑制剂也不引入非离子型表面活性剂。作为另外一种选择,可以使用(例如)HPLC分析或可以鉴别特定蛋白质或多肽的量的其它适合的程序评价如本文所公开的液相组分的稳定性。可以通过将久放的液相组分中蛋白质的量与最近制备的液相组分中蛋白质的量或与先前对相同组分进行的定量相比较来确定如本文所公开的组合物中氨基酸序列或多肽的稳定性。蛋白质稳定性的测量与其活性的保留强烈相关。
常用的农用化学品助剂在本领域中是熟知的并且包括(但不限于)水性或有机溶剂、缓冲剂、酸化剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、增粘剂、粘着剂、载体、填充剂、增稠剂、乳化剂、分散剂、多价螯合剂、防沉剂、聚结剂、流变改性剂、消泡剂、光保护剂、抗冻剂、杀菌剂、渗透剂、矿物油或植物油、颜料和漂移控制剂或其任意适合的组合。
在另一个实施方式中,本发明提供了80至200个氨基酸或本文之前所公开的子范围的多肽,所述多肽是通过对某些植物有害生物靶标的亲合力选择获得的,其能够以约0.00001至1μΜ的最低抑制浓度抑制植物有害生物的生长和/或活性。
在如本文所公开的方法的具体实施方式中,为了保护、预防、治愈或治疗植物抵抗真菌感染或与真菌的另一种生物相互作用,通过喷雾、雾化、起泡、生雾(fogging)、水培法/水耕法、涂覆、浸没和/或结壳将如本文所公开的重链可变域序列、多肽或组合物直接或间接应用于植物。
[核酸序列]
在另一个方面,在如本文所公开的组合物中,本发明提供了编码重链可变域氨基酸序列的核酸序列(或其适合的片段)。这些核酸序列还可以处于载体或遗传构建体或多核苷酸的形式。如本文所公开的核酸序列可以是合成或半合成序列,分离自文库(并且具体地,表达文库)的核苷酸序列、使用重叠引物通过PCR制备的核苷酸序列或者使用本身已知的用于DNA合成的技术制备的核苷酸序列。
[构建体、载体、宿主细胞]
如本文所公开的遗传构建体可以是DNA或RNA,并且优选地是双链DNA。本发明的遗传构建体还可以处于适合于预期宿主细胞或宿主生物转化的形式,或者处于适合于整合至预期宿主细胞的基因组DNA的形式,或者处于适合于在预期宿主生物中独立复制、维持和/或遗传的形式。例如,本发明的遗传构建体可以处于载体的形式,如(例如)质粒、粘粒、YAC、病毒载体或转座子。具体地,所述载体可以是表达载体,即,可以提供用于体外和/或体内表达的载体(例如,在适合的宿主细胞、宿主生物和/或表达系统中)。
因此,在另一个其它方面,本发明还提供了包含一种或多种本发明的核酸序列的载体。
在其它方面,本发明提供了表达或能够表达一种或多种如本文所公开的氨基酸序列的宿主或者宿主细胞。对于技术人员来说,用于本发明的氨基酸序列、多肽的表达的宿主或宿主细胞的适合的实例将是清楚的。
本发明申请还公开了80至200个氨基酸或本文先前讨论的子范围内的多肽,其在如所定义的农用化学或生物控制组合物中保持稳定,这表示在所述农用化学组合物的储存和/或使用条件下维持了如所定义的多肽的完整性和杀虫活性,所述条件可以包括高温、冻融循环、pH或离子强度的变化、紫外线照射、有害化学品的存在等。最优选地,当将所述农用化学组合物在环境温度储存两年的一段时间或者当将所述农用化学组合物在54℃储存两周的一段时间时,这些80至200个氨基酸的多肽在所述农用化学组合物中保持稳定。具体地,在将所述农用化学组合物在环境温度储存两年的一段时间或者当将含有所述多肽的农用化学组合物在54℃储存两周的一段时间后,包含在农用化学组合物中的80至200个氨基酸的多肽保留了至少约70%的活性,更具体地,至少约70%至80%的活性,最具体地,约80%至90%的活性。
在另一个实施方式中,对在本文所公开的方法中的应用,本发明申请公开了编码80至200个氨基酸的多肽的核酸序列,其中所述多肽是通过对特定植物致病靶标的亲合力选择获得的,所述多肽能够以约0.00001至1μΜ的最低抑制浓度抑制作物有害生物的生长和/或活性。
还公开了包含以下可操纵连接的DNA元件的嵌合基因:a)植物可表达启动子,b)转录时获得能够翻译成多肽的mRNA分子的DNA区和c)包含在所述植物细胞中起作用的转录终止和多腺苷酸化信号的3'端区。
“嵌合基因”或“嵌合构建体”是重组核酸序列,其中启动子(例如,植物可表达启动子)或调控核酸序列可操纵地连接至或结合至编码mRNA的核酸序列,从而当引入至细胞(如植物细胞)时,所述调控核酸序列能够调控所结合的核酸编码序列的转录或表达。嵌合基因的调控核酸序列通常不会可操纵地连接至自然界中存在的结合的核酸序列。
本发明中,“植物启动子”包含调控元件,其调节植物细胞中编码序列部分的表达。对于植物中的表达,核酸分子必须可操纵地连接至或包含在正确时间点并以所需的空间表达类型表达基因的适合的启动子。
如本文所使用的,术语“可操纵地连接”是指启动子序列和所关心的基因之间的功能连接,从而启动子序列能够起始所关心的基因的转录。
植物可表达的启动子包括能够指导植物中转基因表达的核酸序列。植物可表达的启动子的实例是组成型启动子,其在至少一种细胞、组织或器官中,在生长发育的大部分(但不必需是全部)阶段并且在大部分环境条件下是转录活性的,其它启动子是诱导型启动子,其它实例为组织特异性启动子,其它实例是非生物应激诱导型启动子。
当在植物中转化时,嵌合基因(或表达盒)表达导致蛋白质表达的核酸。
还公开了重组载体,其包含如本文先前描述的表达盒(或嵌合基因)。
术语“终止子”涵盖了作为转录单元末端的DNA序列的控制序列,其信号控制初级转录本的3'加工和多腺苷酸化以及转录终止。终止子可以来源于天然基因、多种其它植物基因或T-DNA。要添加的终止子可以来源于(例如)胭脂氨酸合酶或章鱼碱合酶基因,或作为另外一种选择来源于另一种植物基因,或不太优选地,来源于任何其它真核基因。
“可选择标志物”、“可选择标志物基因”或“报告基因”包括赋予细胞表型的任何基因,其中所述基因表达以有利于用本发明的核酸构建体转染或转化的细胞的鉴别和/或选择。这些标志物基因(标记基因)能够通过一系列不同的原理鉴别核酸分子的成功转移。适合的标志物(标记)可以选自赋予抗生素或除草剂耐受性的标志物,其引入了新的代谢特性或者允许目视选择。可选择标志物基因的实例包括赋予抗生素耐受性的基因(如使新霉素和卡那霉素磷酸化的nptll,或磷酸化潮霉素的hpt,或赋予对(例如)博来霉素、链霉素、四环素、氯霉素、氨苄西林、庆大霉素、遗传霉素(G418)、大观霉素或杀稻瘟菌素的耐受性的基因),赋予除草剂耐受性的基因(例如,提供对的耐受性的bar;提供对草甘膦的耐受性的aroA或gox,或赋予对(例如)咪唑啉酮、草丁膦或磺酰脲的耐受性的基因),或者提供代谢特性的基因(如允许植物使用甘露糖作为唯一碳源的manA,或者用于木糖利用的木糖异构酶,或者抗营养标志物,如对2-脱氧葡萄糖的耐受性)。目视标志物基因的表达导致形成了颜色(例如,β-葡糖醛酸酶、GUS或使用其有色底物(例如,X-Gal)的β-半乳糖苷酶)、发光性(如荧光素/荧光素酶系统)或者荧光(绿色荧光蛋白GFP及其衍生物)。该列举仅表示少量可能的标志物。技术人员熟悉这些标志物。根据生物和选择方法,不同的标志物是优选的。
已知根据所使用的表达载体和所使用的转染技术,核酸一旦稳定或瞬时整合至植物细胞,则仅有少数细胞吸收外源DNA,并且如果需要,将其整合至其基因组。为了鉴别和选择这些整体要素(integrant),通常将编码可选择标志物的基因(如,如上所述的那些)与所关心的基因一起引入宿主细胞。例如,可以在突变体中使用这些标志物,其中通过(例如)常规方法的缺失,这些基因不是功能性的。此外,可以在包含编码本发明的多肽的序列或者在本发明所述的方法中使用的相同载体上或者在单独的载体中将编码可选择标志物的核酸分子引入宿主细胞。可以(例如)通过选择(例如,整合了可选择标志物的细胞存活,而其它细胞死亡)鉴别用引入的核酸稳定转染的细胞。
由于不再需要标志物基因,具体地用于抗生素和除草剂的耐受性的基因,或者一旦成功引入核酸,则在转基因宿主细胞中标志物基因是不期望的,因此根据本发明的用于引入核酸的方法有利地使用了使得能够除去或去除这些标志物基因的技术。一种这种方法是作为共转化已知的方法。共转化法使用了同时用于转化的两种载体,一种载体具有根据本发明的核酸而第二种载体具有标志物基因。大部分转化体接收或就植物来说包含(多至40%或更多的转化体)两种载体。在用农杆菌转化时,转化体通常仅接收载体的一部分,即T-DNA侧接的序列,其通常表示表达盒。随后,可以通过进行杂交将标志物基因从转化的植物中除去。在另一种方法中,将整合到转座子中的标志物基因用于和所需核酸一起转化(被称为Ac/Ds技术)。所述转化体可以与转座酶源杂交,或者用赋予转座酶瞬时或稳定表达的核酸构建体转化所述转化体。在一些情况下(约10%),一旦成功发生转化,则转座子从宿主细胞基因组跳出并丢失。在其它一些情况下,转座子跳至不同位置。在这些情况下,必须通过进行杂交消除标志物基因。在微生物学中,开发了使得这些事件的检测成为可能或有利于这些事件检测的技术。其它有利的方法依赖于作为重组系统已知的方法;其优势在于可以省去通过杂交的消除。熟知的这类系统是作为Cre/lox系统已知的系统。Cre1是除去位于loxP序列间的序列的重组酶。如果标志物基因整合在loxP序列之间,则一旦成功发生转化,则将通过重组酶的表达将其除去。其它重组系统为HIN/HIX、FLP/FRT和REP/STB系统(Tribble等人,J.Biol.Chem.,275,2000:22255-22267;Velmurugan等人,J.Cell Biol.,149,2000:553-566)。将根据本发明的核酸序列位点特异性整合至植物基因组是可能的。
出于本发明的目的,对于(例如)核酸序列,“转基因的”、“转基因”或“重组”表示包含所述核酸序列的表达盒、基因构建体或载体或用根据本发明的核酸序列、表达盒或载体转化的生物。
出于本发明的目的,因此如上所述,转基因植物将被理解为表示在本发明所述的方法中使用的核酸不存在于或来源于所述植物的基因组,或者存在于所述植物的基因组但不在所述植物基因组中它们的天然位点,这对于核酸的同源或异源表达是可能的。然而,如所提及的,转基因还表示尽管根据本发明或在本发明方法中使用的核酸在植物基因组中处于其自然位置,但是对于天然序列,已修饰了所述序列和/或已修饰了天然序列的调控序列。优选地,将转基因理解为表示位于基因组中非天然位置的根据本发明的核酸的表达,即发生了核酸的同源或异源表达。在本文中提及了优选的转基因植物。术语“表达”或“基因表达”表示一种或多种特异性基因或特异性遗传构建体的转录。具体地,术语“表达”或“基因表达”表示基因或遗传构建体向结构RNA(rRNA、tRNA)或mRNA的转录,而具有或不具有后者向蛋白质的后续翻译。该方法包括DNA的转录和所得mRNA产物的加工。
如本文所使用的术语“提高的表达”或“过表达”表示对于原始野生型表达水平来说是额外的任何表达形式。出于本发明的目的,原始野生型表达水平还可以为零,即没有表达或不可测量的表达。
在本领域中很好地记录了用于提高基因或基因产物表达的方法,并且所述方法包括(例如)通过适当的启动子(如本文先前所述)驱动的过表达,转录增强子或翻译增强子的使用。可以在多核苷酸的非异源形式的适当位置(通常上游)引入用作启动子或增强子元件的分离的核酸以上调编码所关心的多肽的核酸的表达。如果多肽表达是所需的,则通常期望在多核苷酸编码区的3'-端包括多腺苷酸化区。多腺苷酸化区可以来源于天然基因、多种其它植物基因或T-DNA。要添加的3'端序列可以来源于(例如)胭脂氨酸合酶或章鱼碱合酶基因,或作为另外一种选择来源于另一种植物基因,或不太优选地,来源于任何其它真核基因。
还可以将内含子序列添加至部分编码序列的5'未翻译区(UTR)或编码序列以提高胞液中积累的成熟信息(message)的量。植物和动物表达构建体中的转录单元中可剪接内含子的包含显示在mRNA和蛋白水平将基因表达提高多至1000倍(Buchman和Berg(1988)Mol.Cell biol.8:4395-4405;Callis等人.(1987)Genes Dev 1:1183-1200)。当位于转录单元5'端附近时,这种基因表达的内含子提高通常是最大的。玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6以及Bronze-1内含子的使用在本领域中是已知的。对于常规信息,参见:The MaizeHandbook,第116章,Freeling和Walbot主编,Springer,N.Y.(1994)。
如本文所提及的术语“引入”或“转化”涵盖了外源多核苷酸或嵌合基因(或者表达盒)向宿主细胞的转移,而不管用于转移的方法。无论是通过器官发生还是通过胚胎发生,可以用本发明的遗传构建体转化能够进行后续克隆增殖的植物组织以及从中再生的完整植物。根据对于要转化的特定物种可用的并且最适合的克隆增殖系统,所选的特定组织将是不同的。示例性组织靶标包括叶盘(leaf disk)、花粉、胚芽(embryos)、子叶、胚轴、大配子体、愈伤组织、已有的分生组织(例如,顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(例如,子叶分生组织和胚轴分生组织)。多核苷酸可以瞬时或稳定引入到宿主细胞并且可以(例如)作为质粒维持非整合。作为另外一种选择,可以将其整合到宿主基因组。然后,所得的转化植物细胞可以以本领域技术人员已知的方式用于再生转化植物。
外源基因向植物基因组的转移被称为转化。目前,植物种的转化是相当常规的技术。有利地,可以使用任何一些转化方法将所关心的基因引入到适合的祖细胞。可以使用对于来源于植物组织或植物细胞的植物的转化和再生所述的方法以用于瞬时或稳定转化。转化方法包括脂质体、电穿孔、提高游离DNA吸收的化学品、DNA直接向植物的注射、颗粒枪轰击、使用病毒或花粉转化和显微投影(微注射,microprojection)的使用。方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇法(Krens,F.A.等人,(1982)Nature296,72-74;Negrutiu I等人.(1987)Plant Mol Biol 8:363-373);原生质体的电穿孔(Shillito R.D.等人(1985)Bio/Technol 3,1099-1102);向植物材料的微注射(Crossway A等人,(1986)Mol.GenGenet 202:179-185);DNA或RNA-涂敷颗粒轰击(Klein TM等人,(1987)Nature 327:70)用(非整合)病毒感染等。优选地通过农杆菌介导的转化生产转基因植物,包括转基因作物植物。有利的转化方法是植物中的转化。出于这个目的,有可能(例如)允许农杆菌对植物种子进行作用或用农杆菌接种植物分生组织。根据本发明,已证明使转化的农杆菌的混悬液对完整植物或至少对花原基进行作用是特别有利的。然后,植物生长直至获得所处理的植物的种子(Clough and Bent,Plant J.(1998)16,735-743)。用于水稻的农杆菌介导转化的方法包括熟知的用于水稻转化的方法,如任何下列文献中所述的那些:欧洲专利申请EP1198985、Aldemita和Hodges(Planta 199:612-617,1996);Chan等人(Plant Mol Biol22(3):491-506,1993)、Hiei等人(Plant J 6(2):271-282,1994),以上文献的公开内容如充分说明的一样作为参考并入本文。对于玉米转化来说,在Ishida等人(Nat.Biotechnol14(6):745-50,1996)或Frame等人(Plant Physiol 129(1):13-22,2002)中描述了优选的方法,以上文献的公开内容如充分说明的一样作为参考并入本文。通过以下文献中的实例,进一步描述了所述方法:B.Jenes等人,Techniques for Gene Transfer,in:TransgenicPlants,第1卷,Engineering and Utilization,S.D.Kung和R.Wu主编,Academic Press(1993)128-143和Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)。优选地,将要表达的核酸或构建体克隆至载体,所述载体适合于转化根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens),例如,pBin19(Bevan等人(1984)Nucl.Acids Res.12-8711)。然后,可以以已知方式将通过该载体转化的农杆菌用于植物转化,如用作模型的植物,如拟南芥(拟南芥(Arabidopsis thaliana)在本发明的范围内,并且不认为是作物植物),或者作物植物,举例来说,烟叶,例如,通过将擦伤的叶片或切碎的叶片浸没在农杆菌溶液中,然后将它们在适合的培养基中培养。通过根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的植物转化在(例如)Hofgen和Willmitzer,Nucl.Acid Res.(1988)16,9877中有所描述,或特别地根据F.F.White,Vectors for Gene Transfer in Higher Plants;in Transgenic Plants,第1卷,Engineering and Utilization,S.D.Kung和R.Wu主编,Academic Press,1993,第15-38页是已知的。
除了随后必需在完整植物中再生的体细胞的转化外,还可能转化植物分生组织的细胞,并且具体地,发展成配子的那些细胞。在这种情况下,转化的配子按照天然植物进行发育,从而产生转基因植物。因此,例如,用农杆菌处理拟南芥的种子,并且从其中转化了一定比例并因此是转基因的发育的植物获得种子[Feldman,KA和Marks MD(1987)。Mol GenGenet 208:1-9;Feldmann K(1992).In:C Koncz,N-H Chua和J Shell主编,Methods inArabidopsis Research.Word Scientific,Singapore,第274-289页]。替代方法基于花序的反复去除以及瓣状体中心切除位点与转化的农杆菌的培育,其中在较迟的时间点同样可以获得转化的种子(Chang(1994).Plant J.5:551-558;Katavic(1994).Mol Gen Genet,245:363-370)。然而,特别有效的方法是真空侵入法以及它的改变形式,如“花序浸渍(floral dip)”法。就拟南芥的真空侵入(真空渗透,vacuum infiltration)来说,在减压下用农杆菌混悬液处理完整植物[Bechthold,N(1993).CR Acad Sci Paris Life Sci,316:1194-1199],而就“花序浸渍法”来说,将发育的花组织简短地与表面活性剂处理的农杆菌混悬液一起培育[Clough,SJ and Bent AF(1998)The Plant J.16,735-743]。在两种情况下,收获一定比例的转基因种子,并且通过在上述选择条件下生长,这些种子可以不同于非转基因种子。另外,质体的稳定转化是有利的,这是因为在大部分作物中质体是通过母体遗传的,从而降低或消除了通过花粉的转基因流动的风险。通常,通过Klaus等人,2004[Nature Biotechnology 22(2),225-229]示意性显示的方法实现了叶绿体基因组的转化。简要地,将要转化的序列与可选择标志物基因一起克隆至与叶绿体基因组同源的侧接序列之间。这些同源侧接序列指导向原质体系(plastome)的位点特异性整合。已对多种不同植物种描述了质体转化,并且在Bock(2001)Transgenic plastids in basic research andplant biotechnology.J Mol Biol.2001Sep21;312(3):425-38或Maliga,P(2003)Progress towards commercialization of plastid transformationtechnology.Trends Biotechnol.21,20-28中提供了综述。最近,报道了处于可以通过瞬时共整合的标志物基因产生的不含标志物的质体转化体形式的进一步的生物技术进展(Klaus等人,2004,Nature Biotechnology 22(2),225-229)。
可以通过技术人员熟悉的所有方法再生遗传修饰的植物细胞。适合的方法可见于S.D.Kung和R.Wu、Potrykus或Hofgen和Willmitzer等人的上述出版物。
通常,在转化后,对于与所关心的基因共转移的植物可表达基因编码的一种或多种标志物的存在性,选择植物细胞或细胞分组,然后将转化的材料再生至完整植物。为了选择转化的植物,通常,对在转化中获得的植物材料施加选择性条件,从而转化的植物可以不同于未转化的植物。例如,可以种植以上述方式获得的种子,并且在初始生长期之后,通过喷雾对种子进行适合的选择。其它可能性在于如果在灭菌后适合,使用适合的选择试剂使种子在琼脂平板上生长,从而仅转化的种子可以生长成植物。作为另外一种选择,对于可选择标志物(如,如上所述的那些)的存在性筛选转化的植物。在DNA转移和再生后,还可以(例如)使用Southern(DNA印迹)分析,评价推定转化的植物所关心的基因存在性、拷贝数和/或基因组组织。作为另外一种选择或者另外,可以使用Northern(RNA印迹)和/或Western(蛋白印迹)分析监控新引入的DNA的表达水平,这两种技术对于本领域技术人员是熟知的。
可以通过多种方式增殖所产生的转化植物,如通过克隆增殖或经典的育种技术。例如,第一代(或T1)转化植物可以是自花授粉的,并且纯合的第二代(或T2)转化体可以是选择的,并且然后T2植物可以通过经典育种技术进一步增殖。所产生的转化生物可以具有多种形式。例如,它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体;克隆转化体(例如,转化所有细胞以包含表达盒);转化和未转化组织的嫁接(例如,在植物中,转化的根茎嫁接至未转化的幼枝)。
以下非限制性实施例描述了根据本发明的方法和方式。除非在实施例中另有说明,否则所有技术根据本领域中的规程标准进行。包括了下列实施例以描述本发明的实施方式。根据本发明公开,本领域技术人员应理解可以在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下在所公开的具体实施方式中做出多种改变并仍获得类似或相似的结果。更具体地,显而易见的是可以用化学和生理学相关的某些试剂替代本文所述的试剂并同时实现相同或相似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有这些相似的替代和改变被视为包含在如所附权利要求所定义的本发明的精神、范围和概念之内。
因此,仅提供附图、序列表和实验部分/实施例以进一步描述本发明,并且除非在本文中明确说明,否则不应将其理解为或视为以任何方式对本发明和/或所附权利要求范围的限制。
现将通过以下非限制性实施例和附图进一步描述上述公开。
实施例以及材料和方法
实施例1
编码对真菌葡糖苷酰鞘氨醇具有亲合力的肽的核酸序列的分离
动物免疫:从真菌葡糖苷酰鞘氨醇(GlcCer)免疫的美洲驼(llamas)产生VHH's。根据标准规程,使用6次加强的来自金顶侧耳(pleurotus citrinopileatus)(NacalaiTesque)的薄层色谱法(TLC)-纯化(99%)的葡糖苷酰鞘氨醇(GlcCer)免疫美洲驼。将纯化的GlcCer溶于水:甲醇:氯仿混合物并在TLC二氧化硅玻璃板上点板。从板上刮下具有吸附的GlcCer的二氧化硅并悬浮在磷酸盐缓冲液中。将混悬液超声处理,与弗氏不完全佐剂混合,并用于皮下注射。还从天然萌发的真菌或卵菌孢子免疫的美洲驼产生VHH。根据标准规程,通过皮下注射使用6次加强的灰葡萄孢(Botrytis cinerea)或致病疫霉(Phytophthorainfestans)的天然萌发孢子免疫美洲驼。在整个免疫过程中,所有美洲驼保持健康并且在免疫前后采集血液样品。
文库构建:抗体的噬菌体文库是其中作为嵌合pIII蛋白的一部分,每个单个噬菌体在其表面显示唯一抗原-结合抗体域的噬菌体群体。根据生产商的说明,使用Ficoll-Hypaque从免疫的美洲驼的血液样品制备周围血单核细胞。从这些细胞提取总RNA并用作RT-PCR的起始材料以扩增VHH编码基因片段。将这些片段克隆到噬粒载体pASF20。pASF20是来源于pUC119的表达载体,其含有lacZ启动子、合成前导序列、多克隆位点、大肠杆菌噬菌体pIII蛋白编码序列、氨苄西林的抗性基因和用于单链产生的M13噬菌体起点。在具有VHH编码序列的框中,所述载体编码C末端(His)6肽标签和c-myc肽标签。根据标准方法制备噬菌体(Phage Display of Peptides and Proteins:A Laboratory Manual;Brian K.Kay,Jill Winter,Dr.John McCafferty)。获得了克隆多样性分别等于或大于1E+08的4个文库并且产生噬菌体,从而确保出现抗体多样性。
通过噬菌体展示的VHH选择:通过在文库中选择结合至抗原的噬菌体,分离了表达对特定抗原特异的抗原-结合抗体域的噬菌体。通过将真菌GlcCer以不同浓度溶解于水:甲醇:氯仿混合物或甲醇中,将溶解的真菌GlcCer加入至多孔板的孔中,并且使其在室温下干燥过夜,将真菌GlcCer固定在聚苯乙烯Maxisorp多孔板上。清洗具有涂覆的真菌GlcCer的孔,并在通过噬菌体展示的VHH选择的制备中用1%鱼胶封闭。在室温下,使VHH文库噬菌体与涂覆了真菌GlcCer的96孔板的孔结合2小时。为了特异性选择与真菌GlcCer结合的噬菌体,将噬菌体与1%鱼胶和/或BSA和/或脱脂乳和/或植物GlcCer和/或哺乳动物GlcCer预培育。通过彻底清洗除去未结合的噬菌体,并且通过与RsAFP2(Osborn等人,1995)或与胰蛋白酶的竞争性洗脱来洗脱结合的噬菌体。连续进行1至3轮选择,并且将来自真菌GlcCer-涂覆的孔的噬菌体滴度分别与来自空白孔的噬菌体的滴度以及非靶标病原体鞘脂的滴度比较富集和特异性。在第一轮和后续轮选择中观察富集,并且在一轮或多轮选择后,噬菌体群体已在ELISA中显示出对真菌GlcCer的特异性(未显示)。从第1、第2和/或第3轮选择中挑选单个克隆以通过序列分析和初级结合测定进一步鉴定。
通过测序和结合测定的VHH鉴定:可以使用高通量DNA测序快速确定所得抗体或抗体域群体的多样性并且其允许对克隆多样性进行精确定量。可以在与抗原结合的测定中分析抗体或抗体域结合以及与该抗原结合的特异性,并且可以将其与相关及非相关对照进行比较。每个抗体或抗体域可以结合至特定抗原并且可能结合至该抗原的抗原性变体。特异性是抗体或抗体域结合区分抗原性变体的程度。从第1、第2或第3轮噬菌体展示选择中挑选的单个VHH克隆,将DNA在集落PCR中扩增,并通过Sanger-测序对PCR产物测序。在序列分析后并基于序列多样性,选择VHH进行进一步鉴定。为了检验物种特异性,在结合测定中使用来自靶标和非靶标种的真菌和非真菌GlcCer。用来自甘蓝链格孢菌(A.brassicicola)、灰葡萄孢(B.cinerea)、甜菜生尾孢(C.beticola)、黄色镰刀菌(F.culmorum)、禾谷镰刀菌(F.graminearum)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、金顶侧耳(P.citrinopileatus)、指状青霉(P.digitatum)、扩展青霉(P.expansum)或大丽花轮枝孢菌(V.dahlia)的TLC-纯化的(99%)GlcCer或GlcCer-富集的鞘糖脂(GSL)部分进行鉴别功能上选自该文库的克隆的初级结合测定(如Ternes等人,2011 JBC 286:11401-14中所述制备)。来自大豆的GlcCer和猪GlcCer购自Avanti Polar Lipids。在96孔深孔板中产生了VHH,并且在ELISA形式中评价稀释的含有VHH的粗胞质提取物(periplasmic extracts)的结合谱。同样地,用纯化的VHH进行结合测定。
根据初级结合测定,130个含有VHH的胞质提取物显示以比不相关VHH_A、不相关VHH_B和空白高的OD 405nm值结合真菌GlcCer。图1中显示了表示这些真菌GlcCer结合VHH's中一些的特异性结合的OD 405nm值。序列分析显示了来自鉴别的抗-GlcCer VHH组的84个独特序列。
通过差异结合筛选的进一步鉴定:对于进一步鉴定,根据标准程序,在培养瓶中的大肠杆菌(E.coli)中产生了属于上述主要组(lead panel)的VHH。根据生产商的说明,用TALON金属亲合树脂(Clontech)从胞质提取物中纯化了六组氨酸-标记的VHH。将纯化的VHH浓缩并对PBS透析。还使用固定化镍IMAC和脱盐柱的组合,使用自动纯化系统纯化VHH。随后,测试了在初级结合测定中评分为正的主要组的VHH对来自不同真菌植物病原体的GlcCer或细胞壁部分的特异性。
如图2、3A、3B和3C所示,GlcCer-特异性VHH显示对真菌GlcCer(金顶侧耳(pleurotus citrinopileatus)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum))的特异性结合并且对其它非真菌GlcCer或空白未涂覆孔无特异性结合。
表面等离子体共振:在Biacore 3000仪器中通过表面等离子体共振表征VHH与真菌GlcCer的结合。抗-GlcCer VHH 41 D01或不相关VHH_A通过胺偶联共价结合至CM5传感器芯片表面直至达到提高1000个响应单位。将剩余的反应性基团失活。将溶液中一定范围浓度的根据Salio等人,2013 PNAS 110,E4753-E4761制备的尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)GlcCer以30μl/min的流速注射2分钟以使得结合至芯片结合的VHH。以相同流速,在芯片上方注射无GlcCer的运行缓冲液以使得结合的真菌GlcCer自发解离10分钟。根据使用1:1郎格缪尔解离全局拟合模型对不同真菌GlcCer浓度获得的传感图(sensorgram)计算Koff值。
对于抗-GlcCer VHH,计算了4.86*1E-4/s的缓慢解离速率。如图4所示,不相关VHH不结合真菌GlcCer。
将溶液中的植物(大豆)、哺乳动物(猪肉)和真菌(尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum))GlcCer以30μl/min的流速顺序注射2分钟以使得结合至芯片结合的VHH(抗-GlcCer VHH 41 D01或不相关VHH_A)。在每次注射之间,以相同流速,在芯片上方注射无GlcCer的运行缓冲液以使得结合的GlcCer自发解离。
未观察到植物或哺乳动物GlcCer结合至抗-GlcCer VHH 41 D01或不相关VHH_A。对抗-GlcCer VHH 41 D01观察到真菌GlcCer的特异性结合,但对不相关VHH_A未观察到。
对不同真菌脂质提取物的差异结合:与不相关化合物相比,抗-GlcCer VHH组分与不同真菌脂质提取物的结合。
根据Rodrigues等人.2000 Infection and Immunity 68(12):7049-60,制备了真菌提取物。简要地,从琼脂平板中生长的真菌收获来自灰葡萄孢(Botrytis cinerea)B05-10、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)MUCL401、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)R16、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)(自有梨分离菌)、黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)MUCL555、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)MUCL53451、指状笔霉(Penicillium digitatum)MUCL43-410、指状笔霉(Penicillium digitatum)(自有柠檬分离菌)或扩展青霉(Penicilliumexpansum)CBS 146.45的菌丝体,并用氯仿/甲醇2:1(vol/vol)和1:2(vol/vol)提取脂质;根据Folch等人,1957.Journal of Biological Chemistry 226(1):497-509分配粗脂质提取物。从Folch's下相回收真菌脂质提取物。评价抗-GlcCer VHH 41 D01(0.1μg/ml)和抗-GlcCer VHH 56F11(1μg/ml)与提取的真菌脂质(每个1/20稀释)、纯化的尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)GlcCer、纯化的金顶侧耳(pleurotus citrinopileatus)GlcCer和非相关化合物:苹果果胶(苹果果胶,高酯化70-75%,Sigma,cat#:76282)、柑桔果胶(柑桔果胶,低酯化20-34%,Sigma,cat#P9311)或马铃薯凝集素(马铃薯(Solanum Tuberosum)凝集素,Vector labs,cat#:L-1160)涂覆的孔或空白未涂覆孔的结合。在与酶-结合的检测抗体连续培育、加入底物并测量405nm的吸光度后测量结合。条棒代表平均OD 405nm值,误差线代表n=2的平均标准误差。
如图5所示,抗-GlcCer VHH 41 D01和56F11特异性识别所有测试的真菌脂质提取物。抗-GlcCer VHH 41 D01和56F11不显示与不相关的涂覆化合物或非涂覆孔的结合。抗-GlcCer VHH组分与广泛的真菌脂质提取物的结合强化了如本文所公开的抗-GlcCer VHH组分抵抗不同真菌的多种应用。
在不同的水性组合物中,抗-GlcCer VHH与真菌GlcCer的结合:
制备了含有抗-GlcCer VHH 41 D01和/或蛋白酶抑制剂和/或非离子型表面活性剂和/或防腐剂的水性组合物。组合物A1(蛋白酶抑制剂:0.06μg/ml抑肽酶(Roche,cat#:10236624001)、0.5μg/ml亮肽素(Roche,cat#:11017101001)、24μg/ml 4-苯磺酰氟化物盐酸盐(Sigma,A8456)、1mM EDTA(Carl-Roth,cat#8040.1)和非离子型表面活性剂:0.00001%的聚山梨酯20(Tween20,Sigma,cat#P2287);组合物A2(蛋白酶抑制剂:1μg/ml抑肽酶、2.5μg/ml亮肽素、100μg/ml 4-苯磺酰氟化物盐酸盐、1mM EDTA和非离子型表面活性剂:0.05%聚山梨酯20);组合物A3(蛋白酶抑制剂:2μg/ml抑肽酶、5μg/ml亮肽素、240μg/ml4-苯磺酰氟化物盐酸盐、1mM EDTA和非离子型表面活性剂:5%聚山梨酯20)、组合物B1(非离子型表面活性剂:0.0001%%聚山梨酯20)、组合物B2(非离子型表面活性剂:0.05%聚山梨酯20)、组合物B3(非离子型表面活性剂:5%聚山梨酯20)和组合物C1(防腐剂:0.05%苯甲酸钠(Sigma,cat#B3420))。在具有来自尖孢镰刀菌(F.oxysporum)的涂覆的GlcCer的ELISA中测试了不同水性组合物中抗-GlcCer VHH(0.1μg/ml)与真菌GlcCer的结合并与空白未涂覆孔相比较。在与酶-结合的检测抗体连续培育、加入底物并测量405nm的吸光度后测量结合。
在图6中,将不同组合物中GlcCer-特异性VHH 41 D01的值与无其它添加剂的溶液中的41 D01相比较。图6显示在所有试验组合物中GlcCer-特异性VHH 41 D01能够特异性结合至真菌GlcCer。
实施例2
抗-GlcCer VHH组合物的抗真菌活性的体外评价
VHH的抗真菌活性的体外评价:如以下文献所述,在液体培养基中和琼脂平板上使用抗真菌测定测试抗-GlcCer-VHH的抗真菌活性,所述文献如:Thevissen等人,2011,Bioorg.Med.Chem.Lett.21(12):3686-92;Frangois等人,2009,J.Biol.Chem.284(47):32680-5;Aerts等人,2009,FEBS Lett.583(15):25143-6。确定VHH对灰葡萄孢(Botrytiscinerea)和致病疫霉(Phytophthora infestans)体外生长的最小抑菌浓度(MIC)。
还可以使用测试96孔板形式中液体培养基中真菌生长的体外测定来直接筛选抗完整(integral)真菌材料产生的以及抗分子抗原选择的不同于GlcCer的不同VHH的抗真菌活性。对其中产生VHH的大肠杆菌(E.coli)细胞的含VHH粗胞质提取物或使用纯化的VHH进行这种筛选。
抗-GlcCer VHH组合物对不同植物病原真菌的抗真菌活性的体外评价:体外评价了抗-GlcCer VHH组合物对一些植物病原真菌的抗真菌活性并与不相关VHH的抗真菌活性相比较。
在96孔微量滴定板中制备了水性VHH组合物在水中的两倍稀释液(起始于1.5mgVHH/ml)。向20μl的这些稀释液和作为对照的20μl水中加入80μl真菌孢子混悬液(1E+05个孢子/ml,半强度(strength)马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)中)。真菌测试菌株为甘蓝链格孢菌(Alternaria brassicicola)MUCL20297、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)R16、甜菜生尾孢(Cercospora beticola)(自有甜菜分离菌)、黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)MUCL555和大丽花轮枝孢(Verticillium dahliae)MUCL6963。将测试板在室温下,在黑暗中培育72h,并且通过显微镜对测试化合物的抗真菌活性评分并基于照相标准定量,其中分别将0或100的得分称为无或最大真菌生长。所有测试至少进行2次重复。
如图7A、7B、7C、8A、8B、8C和8D中所示,抗真菌活性测定的结果表明了生长抑制类型(模式)之间明显的差异,其表示为作为抗-GlcCer VHH(包括41 D01、56F11、56E05或57A06)和不相关VHH(VHH_A和VHH_B)的VHH浓度(μg/ml)的函数的真菌生长%。不管测试真菌的菌种,该差异是明显的。通常,在100μg/ml的测试浓度,所有抗-GlcCer VHH不允许大于20%的真菌生长,而在100μg/ml,不相关VHH显示出非常弱或无抗真菌活性(80%或更高的真菌生长)。根据所有不同的测试的抗-GlcCer VHH,41 D01显示出最显著的抗真菌活性,对于一些测试菌株,甚至在低于50μg/ml的测试浓度,真菌生长小于20%。
结果显示了与不相关VHH相比的抗-GlcCer VHH的抗真菌效力。此外,结果显示抗-GlcCer VHH组合物对至少5种不同的真菌植物病原体的广谱抗真菌活性并且表明所选抗-GlcCer VHH的抗真菌活性谱可以扩展至其它植物病原真菌。
使用发光性的抗-GlcCer VHH组合物对扩展青霉(Penicillium expansum)的抗真 菌活性的体外评价:使用发光性作为读数,评价了抗-GlcCer VHH 41 D01组合物对植物病原体真菌扩展青霉(Penicillium expansum)CBS 146.45的体外抗真菌活性,并将其与作为对照的不相关VHH_A、小鼠单克隆抗-GlcCer抗体(小鼠MAb抗-GlcCer)、人免疫球蛋白G(hlgG)或牛血清白蛋白(BSA)的抗真菌活性相比较。
在96孔微量滴定板中制备了所有测试组合物在水中的两倍连续稀释液(起始于1.5mg/ml)。向20μl的这些稀释液和作为对照的20μl的水中加入80μl真菌孢子混悬液(1E+03个孢子/ml,在4倍PDB中)。将测试板在室温下,在黑暗中培育24h,并在接种后24(hpi),根据供应商的说明(BacTiter Glo;Promega),使用发光性确定孢子存活力。确定相对光单位(RLU)(Tecan光度计),并将对于抗-GlcCer VHH 41 D01、不相关VHH_A、hlgG、小鼠MAb抗-GlcCer或者BSA处理的真菌孢子测量的RLU相对于对未处理的真菌孢子确定的RLU表示为%RLU。测试包括4个重复(n=4)。
如图9所示,对抗-GlcCer VHH 41 D01组合物处理确定的RLU%明显不同于对不相关VHH_A、小鼠MAb抗-GlcCer、hlgG或BSA处理记录的RLU%。具体地,在300μg/ml或150μg/ml的41 D01,相对于未处理对照表示为RLU%的41 D01处理对真菌孢子的作用小于25%,并且在75μg/ml、37.5μg/ml和19μg/ml,小于50%。相反,对于所有测试浓度,相对于未处理对照表示为RLU%的所有其它测试组合物的作用通常为100%。
这些结果显示在低至19μg/ml,特异性抗-GlcCer VHH 41 D01组合物对植物病原真菌扩展青霉(Penicillium expansum)具有明显的抗真菌作用,并且优于不相关VHH_A、小鼠MAb抗-GlcCer、hlgG或BSA。照此,抗-GlcCer VHH组合物可以用于保护植物抵抗植物病原真菌。
实施例3
VHH向农业制剂的配制
在适合的大肠杆菌(E.coli)生产菌株中,作为重组蛋白产生了抗-GlcCer VHH。从培养基和/或外周胞质纯化抗-GlcCer VHH,和/或将大肠杆菌(E.coli)细胞杀死并在发酵过程结束时裂解。还可以在巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中作为重组蛋白产生抗-GlcCer VHH并分泌到发酵培养基中。然后,通过渗滤从培养基成分和细胞组成中纯化抗-GlcCer VHH。
将所得蛋白质溶液在适合的缓冲液(如磷酸盐缓冲盐水)中稀释以调节pH至约7。任选地,将浓度约0.0001%至0.1%的杀生物剂(如叠氮化钠)和浓度约0.0001%至5%的非离子型洗涤剂(如Tween20)加入至缓冲的蛋白质溶液中。
作为另外一种选择,在喷雾干燥成可湿润颗粒前,在存在常用填充材料的情况下,将所得蛋白质溶液与适合的润湿剂和分散剂混合。
实施例4
VHH对作物抗真菌活性的评价
在植物中,通过对(1)从番茄和马铃薯植物脱离的叶片和(ii)温室生长的番茄和马铃薯植物的疾病生物测定进一步评价对灰葡萄孢(B.cinerea)和致病疫霉(P.infestans)具有有效体外抗真菌活性的VHH的效力。
通过使用模型病理体系番茄-灰葡萄孢(S.cinerea)和马铃薯-致病疫霉(P.infestans)进行脱离叶片疾病测定。在喷雾室中以相当于300升/ha的体积并以低于50gVHH每公顷的应用量用VHH水溶液对温室生长的番茄和马铃薯植物喷雾。喷雾后,使喷雾附着物(spray deposit)在植物上干燥,随后将复合叶片从植物脱离并放置在水琼脂板上。在不同时间点,将灰葡萄孢(B.cinerea)或致病疫霉(P.infestans)的孢子悬液(5×105个孢子/ml)滴加接种在水琼脂板上的叶片上。分别通过目视和/或通过测量病变直径和图像分析软件数字监控疾病发展(Assess,Lamari 2002,St.Paul,Minnesota,USA:APS Press)。
实施例5
植物(planta)中抗-GlcCer VHH组合物对保护作物抵抗真菌感染的抗真菌活性评价
抗-GlcCer VHH组合物对接种了灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的番茄叶片的效 力:预防性处理:评价了使用抗-GlcCer VHH组合物的预防性处理对接种了灰葡萄孢(Botrytis cinerea)B05-10的番茄叶片的疾病严重性的影响,并与不相关VHH、水或配制的商品化化学杀菌剂的影响相比较。
用10μl水性VHH组合物(抗-GlcCer或不相关VHH,5mg/ml)和作为对照的水和Scala(1mg嘧霉胺(pyrimethanil)/ml,如生产商所推荐的)处理温室生长的番茄植物的脱离叶片。一旦所应用的组合物干燥,则将10μl的灰葡萄孢(Botrytis cinerea)孢子悬液(6E+06个孢子/ml,4倍稀释的PDB)滴应用于处理表面。在高相对湿度和室温下,在小植物繁殖体(propagator)中培育处理和接种的叶片。在接种后6天(dpi),通过测量双向直径对疾病严重性评分。
如图10所示,使用抗-GlcCer VHH组合物的预防处理导致得到了6mm(+/-1.4mm)的平均病变直径,而使用不相关VHH或水的处理显示平均病变直径分别为13.4mm(+/-4mm)或15mm(+/-4mm)。在使用配制的商品化化学杀菌剂的对照处理中,有效保护了番茄叶片抵抗灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的感染(无可见病变)。
还如图10所示,与使用不相关VHH或水的处理相比,通过应用抗-GlcCer VHH组合物的番茄叶片的预防处理明显导致疾病严重性降低2倍。因此,作为未配制水性组合物(5mg/ml)应用的特异性抗-GlcCer VHH显示了用作抗真菌化合物的特异性抗-GlcCer VHH在农业应用中保护作物抵抗真菌病原体的效力。
抗-GlcCer VHH组合物对接种了灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的番茄叶片的效 力:治愈性处理:评价了使用抗-GlcCer VHH组合物的治愈性处理对接种了灰葡萄孢(Botrytis cinerea)B05-10的番茄叶片的疾病严重性的影响,并与不相关VHH、牛血清白蛋白(BSA)或配制的商品化化学杀菌剂的影响相比较。
对温室生长的番茄植物的脱离叶片接种10μl灰葡萄孢(Botrytis cinerea)孢子悬液((6E+06个孢子/ml),在4倍稀释的马铃薯葡萄糖肉汤中)滴。接种后1小时,用10μl水性VHH组合物(抗-GlcCer和不相关VHH,1.6mg/ml)和作为对照的BSA(1.6mg/ml)和Scala(1mg嘧霉胺/ml,如生产商所推荐的)处理叶片上的接种点。在高相对湿度和室温下,在小植物繁殖体中培育接种和处理的叶片。在5dpi,通过测量双向直径对疾病严重性评分。
如图11所示,使用抗-GlcCer VHH组合物的治愈性处理导致得到了3mm(+/-0.8mm)的平均病变直径,而使用不相关VHH或BSA的处理显示平均病变直径分别为15mm(+/-3.5mm)或13mm(+/-3.5mm)。在使用配制的商品化化学杀菌剂的对照处理中,有效保护了番茄叶片抵抗灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的感染(无可见病变)。
还如图11所示,与不相关VHH或BSA的处理相比,通过应用抗-GlcCer VHH组合物的番茄叶片的治愈性处理明显导致疾病严重性降低4倍。因此,作为未配制水性组合物(1.6mg/ml)应用的特异性抗-GlcCer VHH显示了用作抗真菌化合物的特异性抗-GlcCerVHH在农业应用中保护作物抵抗真菌病原体的效力。
抗-GlcCer VHH组合物对接种了灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的梨的效力:预防性处理:评价了使用抗-GlcCer VHH组合物的预防性处理对接种了灰葡萄孢(Botrytiscinerea)(来自梨的自有分离菌)的梨的疾病严重性的影响,并与不相关VHH、水或配制的商品化化学杀菌剂的影响相比较。
用10μl水性VHH组合物(含有抗-GlcCer VHH或不相关VHH,5mg/ml)和作为对照的水和Scala(1mg嘧霉胺/ml,如生产商所推荐的)处理先前确认为未处理的来自生物农业的梨(Williams品种)。一旦所应用的溶液干燥,则将10μl的灰葡萄孢(Botrytis cinerea)孢子悬液(1E+04个孢子/ml,在水中)滴应用于处理表面。在高相对湿度和室温下,在小型容器内培育处理和接种的梨。在4dpi,通过测量双向直径对疾病严重性评分。
如图12所示,使用抗-GlcCer VHH组合物的预防性处理导致得到了3mm(+/-2mm)的平均病变直径,而使用不相关VHH或水的处理显示平均病变直径分别为9.6mm(+/-0.8mm)或6.6mm(+/-1.6mm)。在使用配制的商品化化学杀菌剂的对照预防性处理中,有效保护了梨抵抗灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的感染(无可见病变)。
还如图12所示,与不相关VHH或水的处理相比,通过应用抗-GlcCer VHH组合物的梨的预防性处理明显导致疾病严重性降低至少2倍。因此,作为未配制水溶液(5mg/ml)应用的特异性抗-GlcCer VHH显示了用作抗真菌化合物的特异性抗-GlcCer VHH在农业应用中保护作物抵抗真菌病原体的效力。
抗-GlcCer VHH组合物保护植物种子抵抗真菌感染:可以如下所示评价抗-GlcCerVHH组合物对保护植物种子抵抗病原真菌的作用。将用抗-GlcCer VHH、不相关VHH、水或配制的商品化化学杀菌剂处理的表面无菌的植物种子放置在含有1E+03个测试真菌禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)孢子/ml的马铃薯葡萄糖琼脂板上。将测试平板在室温下培育,并且可以测量种子周围真菌生长抑菌圈(mm),从而允许比较不同处理的作用。
在水耕法中,抗-GlcCer VHH组合物保护植物根部抵抗真菌感染:可以如下所示评价抗-GlcCer VHH组合物对保护植物根部抵抗病原真菌以及对植物一般健康状况的作用。将根部置于分别补充或浸透了抗-GlcCer VHH组合物、不相关VHH、水或配制的商品化化学杀菌剂的矿质营养素溶液中或惰性介质上(如珍珠岩),使番茄植物生长。可以将大丽花轮枝孢(Verticillium dahliae)(1E+03个孢子/ml)用于接种植物根部,并且基于疾病种类的议定等级:0=无症状,1=叶片稍微变黄、枯萎或萎蔫,2=叶片中度变黄、枯萎或萎蔫,3=叶片严重变黄、枯萎或萎蔫,和4=叶片死亡,通过测量植物疾病严重性,在收获时对不同处理的作用评分(如Fakhro等人,2010所述)。
抗-GlcCer VHH组合物保护植物花抵抗真菌感染:可以使用谷物或拟南芥(Arabidopsis thaliana)和使用黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)或禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)作为测试真菌评价抗-GlcCer VHH组合物对保护植物花抵抗病原真菌的作用(如Urban等人,2002所述)。简言之,用1E+05个黄色镰刀菌(Fusariumculmorum)或禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)孢子/ml喷雾接种有花植物,然后用抗-GlcCer VHH组合物、不相关VHH、水或配制的商品化化学杀菌剂处理(治愈性处理),或反之亦然(预防性处理)。如Urban等人(2002)所述,培育植物并进行疾病评分,对不同处理的作用定量。
Claims (15)
1.包含特异性结合至植物病原体的鞘脂的抗体的至少一个重链可变域或其功能性片段的农用化学组合物。
2.根据权利要求1所述的农用化学组合物,其中抗体的所述重链可变域或其功能性片段是重链抗体的重链可变域或其功能性片段。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的农用化学组合物,其中所述鞘脂是葡糖苷酰鞘氨醇。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的农用化学组合物,其中所述植物病原体是植物病原真菌。
5.根据权利要求4所述的农用化学组合物,其中所述植物病原真菌的属选自包括链格孢属(Alternaria)、壳二孢属(Ascochyta)、葡萄孢属(Botrytis)、尾孢属(Cercospora)、刺盘孢属(Colletotrichum)、色二孢属(Diplodia)、白粉菌属(Erysiphe)、镰刀菌属(Fusarium)、小球腔菌属(Leptosphaeria)、禾顶囊壳属(Gaeumanomyces)、长蠕孢属(Helminthosporium)、壳球孢属(Macrophomina)、丛赤壳属(Nectria)、青霉菌属(Penicillium)、霜霉属(Peronospora)、茎点霉属(Phoma)、瘤梗孢属(Phymatotrichum)、疫霉属(Phytophthora)、单轴霉属(Plasmopara)、叉丝单囊壳属(Podosphaera)、柄锈属(Puccinia)、核腔菌属(Pyrenophora)、梨孢属(Pyricularia)、腐霉属(Pythium)、丝核菌属(Rhizoctonia)、小菌核属(Scerotium)、核盘霉属(Sclerotinia)、壳针孢属(Septoria)、根串珠霉属(Thielaviopsis)、钩丝壳属(Uncinula)、黑星菌属(Venturia)、轮枝孢菌属(Verticillium)、大毁壳属(Magnaporthe)、布氏白粉菌属(Blumeria)、小球壳属(Mycosphaerella)、黑粉菌属(Ustilago)、无柄锈属(Melampsora)、层锈菌属(Phakopsora)、链核盘菌属(Monilinia)、毛霉菌属(Mucor)、根霉属(Rhizopus)和曲霉菌属(Aspergillus)的组。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的农用化学组合物,其中所述至少一个重链可变域以对保护或治疗植物或所述植物的一部分抵抗感染或与所述植物病原体的其它生物相互作用有效的量存在。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的农用化学组合物,其中所述农用化学组合物中的所述至少一个重链可变域的浓度处于按重量计0.0001%至50%的范围内。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的农用化学组合物,其还包含农用化学适合的载体和/或一种或多种适合的佐剂。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的农用化学组合物,其中所述至少一个VHH包括
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10.根据权利要求1-9中任一项所述的农用化学组合物,其中所述至少一个VHH包含选自由SEQ ID NO:1-84组成的组的氨基酸序列。
11.一种用于保护或治疗植物或所述植物的一部分抵抗感染或与植物病原体的其它生物相互作用的方法,至少包括以下步骤:在对于保护或治疗所述植物或所述植物的一部分抵抗所述感染或与所述植物病原体的生物相互作用有效的条件下,将根据权利要求1-10中任一项所述的农用化学组合物直接或间接应用于所述植物或所述植物的一部分。
12.根据权利要求11所述的方法,其中通过喷雾、雾化、起泡、生雾、在水培法中培养、在水耕法中培养、涂覆、浸没和/或结壳将所述农用化学组合物直接或间接应用于所述植物或所述植物的一部分。
13.一种用于保护或治疗收获的植物或所述植物的收获部分抵抗感染或与植物病原体的其它生物相互作用的收获后处理方法,至少包括以下步骤:在对于保护或治疗所述收获的植物或所述植物的收获部分抵抗所述感染或与所述植物病原体的生物相互作用有效的条件下,将根据权利要求1-10中任一项所述的农用化学组合物直接或间接应用于所述收获的植物或所述植物的收获部分。
14.根据权利要求1-10中任一项所述的农用化学组合物作为抗有害生物试剂的应用。
15.一种抑制生长或杀死植物病原体的方法,至少包括以下步骤:将根据权利要求1-10中任一项所述的农用化学组合物直接或间接应用于植物或所述植物的一部分。
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