CN115990289A - 一种不完全脱钙骨诱导材料的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种不完全脱钙骨诱导材料的制备方法，包括如下步骤：A、制备动物骨支架材料；B、制备动物源性无机矿物溶液；C、将提取的无机矿物溶液浇筑在动物骨支架材料中，冷冻干燥；D、将提取的无机矿物溶液和六氟异丙醇溶液混合，得到纺丝溶液；E、将纺丝溶液通过静电纺丝技术制成纳米纤维，纺织在步骤C中冻干后的浇筑动物骨支架材料的六个面上；通过在动物源完全脱钙的支架材料的基础上通过纺丝技术和交联技术的联合使用，将骨中的无机矿物成分均匀的分散在完全脱钙的支架中，并且可以控制无机矿物成分在整个材料中的比例，同时提高了完全脱钙支架材料的机械强度，提高完全脱钙基质的骨诱导能力和临床应用范围。
Description
技术领域
本发明涉及一种不完全脱钙骨诱导材料的制备方法。
背景技术
骨是由无机或矿物相、有机基质相和水组成的复杂矿化体系。无机矿物相由结晶的磷酸钙盐组成，而有机质相主要由胶原蛋白质和其他非胶原蛋白质组成。目前临床中经常使用的骨组织替代物主要包括：自体骨组织、人工材料、天然材料及其衍生物以及它们的复合物。目前公认的骨组织修复最有效且原料来源广泛的方法是与人体骨相似的动物源骨诱导材料。这不仅和目前越来越成熟的动物源材料去抗原技术有关，还和动物源的骨组织的空间结构有关。动物源骨组织具有和人体骨类似的空间结构，其良好的孔间连通与宿主细胞匹配具有很大的优势。
因为骨组织是一种不断自我调整自身结构以适应应力的变化的组织，其调整时包括：破骨和成骨两个过程，骨再生也和骨改造的骨组织一样被破骨细胞吸收留下孔隙，该部位在成骨细胞的作用下形成新的骨细胞，达到修复宿主骨缺损的目的。显然与自身骨结构越类似的骨再生材料，越容易完成被宿主新骨代替的过程。其它的相关研究也证实三维多孔支架材料的结构、孔隙率、孔径、空间的连通性及孔间径大小是评价生物支架材料的重要指标。
骨中的结构、孔隙率、孔径和孔间的连通性主要取决于骨中的纤维结构，这些纤维结构是由骨中的蛋白质组成的，在专利申请CN112807490B中制备的完全脱矿的骨支架材料中的扫描电镜结果也证实这一点，完全脱钙后的支架材料的扫描电镜显示其保留了完成的三维空隙结构，有和人体骨类似的孔隙率、孔径和孔间的连通纤维。众多研究中也证明完全不脱钙的支架材料的骨再生诱导能力很低甚至没有，也再次证明了这一点。但是有三维结构的支架材料虽然能有利于细胞的迁移、生长、粘附、增值、分化以及细胞外基质的分泌和分布，但是也有自身的缺点：第一，完全脱钙的支架材料机械强度不够，在一些承重骨的骨再生方面很容易出现坍塌，影响修复效果，使完全脱钙骨基质只能应用在一些非承重骨的骨修复上；第二，越来越多的研究结果显示，无机含量在2％左右的生物材料的骨诱导能力强于完全脱钙和不脱钙产品，但是，由于骨自身结构的复杂性和个体间的差异性，简单的使用化学试剂进行脱钙处理很难让无机成分均匀的分在骨再生材料中，为此我们提出一种不完全脱钙骨诱导材料的制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种不完全脱钙骨诱导材料的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种不完全脱钙骨诱导材料的制备方法，包括如下步骤：
A、制备动物骨支架材料；
B、制备动物源性无机矿物溶液；
C、将提取的无机矿物溶液浇筑在动物骨支架材料中，冷冻干燥；
D、将提取的无机矿物溶液和六氟异丙醇溶液混合，得到纺丝溶液；
E、将纺丝溶液通过静电纺丝技术制成纳米纤维，纺织在步骤C中冻干后的浇筑动物骨支架材料的六个面上，完成后进行真空干燥；
F、干燥后的产品放入京尼平溶液中交联，交联完成后进行冷冻干燥。
优选的，在步骤A中，具体制备步骤为：
A1、将冷冻的幼龄生物骨原材料在常温下化冻，并切割成条状骨原料，长宽高的尺寸可以根据临床用途确定，反复冲洗切割后的条状骨原料，直至没有明显血水和油脂；
A2、将清洗后的条状骨原料倒入NaOH溶液中，搅拌、浸泡后捞出，在长流水状态下清洗并甩干，进行去病毒，将去病毒后的条状骨原料倒入到三氯甲烷-甲醇混合溶液中，搅拌、浸泡后捞出，真空干燥脱除残留的三氯甲烷和甲醇；
A3、将脱脂后的条状骨原料倒入到胰蛋白酶溶液中，搅拌、浸泡后捞出，再使用NaOH溶液浸泡一段时间进行第二次去病毒，然后在长流水状态下清洗并甩干，将二次去病毒后的条状骨原料倒入盐酸溶液中，搅拌、浸泡、后捞出，在长流水状态下清洗并甩干；
A4、然后将条状骨原料倒入双氧水溶液中，搅拌、浸泡成后捞出，以备去内毒，将脱细胞后的条状骨原料用倒入到注射用水中，反复浸泡清洗；
A5、条状骨原料平铺于容器中，使用冻干机进行冻干。
优选的，在步骤B中，具体制备步骤为：
B1、按照步骤A1、A2制备脱脂后的条状骨原料；
B2、将脱脂后的条状骨原料倒入到胶原蛋白酶溶液中，搅拌、37℃恒温浸泡后捞出制成脱蛋白材料，然后进行干燥，干燥完成后去除乙醇残留；
B3、使用机械研磨，研磨成粉末状，将粉末状的脱蛋白材料溶于提取剂中进行无机矿物成分的提取，；
B4、利用高速冷冻离心机在1-5℃的温度下高速离心；
B5、离心完后去除下层厚重的液体，得到提取的动物骨中的无机矿物溶液。
优选的，在步骤A2中，所述NaOH的浓度：0.1～3mol/L，其浸泡的时间为1～4h。
优选的，在步骤A2中，所述三氯甲烷-甲醇混合溶液中三氯甲烷与甲醇的混合体积比为2～3:1，其浸泡的时间为24～72h。
优选的，在步骤A3中，
所述配制的胰蛋白酶溶液浓度为0.1％～1％；其浸泡的时间为2～4h；所述NaOH溶液的浓度为0.5mol/L，浸泡的时间为30min；
优选的，在步骤B3中，所述提取剂是氯化胆碱：甘油混合物或脯氨酸：甘油混合物，其中氯化胆碱或脯氨酸：甘油的摩尔比为1：(2～6)；
在步骤B5中，所述厚重的液体为脂肪和有机物。
优选的，在步骤C中，
无机矿物溶液和动物骨支架材料的比例为10～20ml:0.1g；
冻干条件为：-20℃下预冻12～18h，-60℃下冻干48～72h，反复浇筑、冻干两遍。
优选的，在步骤D中，所述无机矿物溶液与六氟异丙醇溶液的混合比例为(4-7)：1。
优选的，在步骤F中，京尼平溶液浓度为0.5-2％，交联时间为60-90h；
冷冻干燥条件为-20℃下预冻12～18h，-60℃下冻干48～72h。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明通过在动物源完全脱钙的支架材料的基础上通过纺丝技术和交联技术的联合使用，将骨中的无机矿物成分均匀的分散在完全脱钙的支架中，且材料中的有机成分和无机成分仍然是动物骨中的原有成分，三维结构和组成成分均和天然骨相同，与宿主骨更为相似，有利于骨再生，并且可以控制无机矿物成分在整个材料中的比例，制备的不完全脱钙骨诱导材料中的无机成分均匀的分散在有机骨支架材料中，使在临床使用的整个过程中的骨诱导能力都维持在最佳水平，同时提高了完全脱钙支架材料的机械强度，提高完全脱钙基质的骨诱导能力和临床应用范围。
附图说明
图1为本发明的脱钙骨支架示意图；
图2为本发明的抗压强度测试示意图；
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明提供一种技术方案：一种不完全脱钙骨诱导材料的制备方法，包括如下步骤：
A、制备动物骨支架材料；
A1、将冷冻的幼龄生物骨原材料在常温下化冻，并切割成条状骨原料，长宽高的尺寸可以根据临床用途确定，反复冲洗切割后的条状骨原料，直至没有明显血水和油脂；
A2、将清洗后的条状骨原料倒入NaOH溶液中，NaOH的浓度：0.1mol/L，其浸泡的时间为1h，搅拌、浸泡后捞出，在长流水状态下清洗并甩干，进行去病毒，将去病毒后的条状骨原料倒入到三氯甲烷-甲醇混合溶液中，三氯甲烷-甲醇混合溶液中三氯甲烷与甲醇的混合体积比为2:1，其浸泡的时间为24h，搅拌、浸泡后捞出，真空干燥脱除残留的三氯甲烷和甲醇；
A3、将脱脂后的条状骨原料倒入到胰蛋白酶溶液中，配制的胰蛋白酶溶液浓度为0.1％；其浸泡的时间为2h，搅拌、浸泡后捞出，再使用NaOH溶液浸泡一段时间进行第二次去病毒，NaOH溶液的浓度为0.5mol/L，浸泡的时间为30min，然后在长流水状态下清洗并甩干，将二次去病毒后的条状骨原料倒入盐酸溶液中，盐酸溶液浓度为0.5mol/L，其浸泡的时间为12h，搅拌、浸泡、后捞出，在长流水状态下清洗并甩干；
A4、然后将条状骨原料倒入双氧水溶液中，配制的双氧水溶液浓度为1％，搅拌、浸泡成后捞出，以备去内毒，将脱细胞后的条状骨原料用倒入到注射用水中，反复浸泡清洗；
A5、条状骨原料平铺于容器中，使用冻干机进行冻干，冻干条件设定为-20℃下预冻12h，-60℃下冻干48h；
B、制备动物源性无机矿物溶液；
B1、按照步骤A1、A2制备脱脂后的条状骨原料；
B2、将脱脂后的条状骨原料倒入到胶原蛋白酶溶液中，搅拌、37℃恒温浸泡后捞出制成脱蛋白材料，然后通过乙醇梯度脱水进行干燥，干燥完成后在-0.08MPa真空挥发10h去除乙醇残留；
B3、使用机械研磨，研磨成粉末状，将粉末状的脱蛋白材料溶于提取剂中进行无机矿物成分的提取，提取剂是氯化胆碱：甘油混合物或脯氨酸：甘油混合物，其中氯化胆碱或脯氨酸：甘油的摩尔比为1：2；
B4、利用高速冷冻离心机在1℃的温度下高速离心，离心的转速10000r/min,离心时间90min；
B5、离心完后去除下层厚重的液体，厚重的液体为脂肪和有机物，得到提取的动物骨中的无机矿物溶液；
C、将提取的无机矿物溶液浇筑在动物骨支架材料中，无机矿物溶液和动物骨支架材料的比例为10ml:0.1g，冷冻干燥，冻干条件为：-20℃下预冻12h，-60℃下冻干48h，反复浇筑、冻干两遍；
D、将提取的无机矿物溶液和六氟异丙醇溶液混合，无机矿物溶液与六氟异丙醇溶液的混合比例为4：1，得到纺丝溶液；
E、将纺丝溶液通过静电纺丝技术制成纳米纤维，静电纺丝就是高分子流体静电雾化的特殊形式，此时雾化分裂出的物质不是微小液滴，而是聚合物微小射流，可以运行相当长的距离，最终固化成纤维，纺织在步骤C中冻干后的浇筑动物骨支架材料的六个面上，完成后进行真空干燥，制备的不完全脱钙骨诱导材料中的无机成分均匀的分散在有机骨支架材料中，使在临床使用的整个过程中的骨诱导能力都维持在最佳水平；
F、干燥后的产品放入京尼平溶液中交联，京尼平溶液浓度为0.5％，京尼平相对于其他化学交联剂毒性较小，较安全，交联时间为60h，完全脱钙骨基质的机械性能差，通过交联无机矿物成分增加了完全脱钙骨基质的机械性能，制备出的骨诱导材料也可以用于承重骨的骨再生，交联完成后进行冷冻干燥，冷冻干燥条件为-20℃下预冻12h，-60℃下冻干48h，采用静电纺丝技术和交联技术结合的方式，将无机成分稳定在有机骨支架材料中，使无机成分和有机知己材料一起在宿主体内稳定且持续的发挥骨诱导能力，制备的不完全脱钙骨诱导材料是将动物源的无机矿物成分和有机支架材料复合而成，且材料中的有机成分和无机成分仍然是动物骨中的原有成分，三维结构和组成成分均和天然骨相同，与宿主骨更为相似，有利于骨再生。
实施例2
一种不完全脱钙骨诱导材料的制备方法，包括如下步骤：
A、制备动物骨支架材料；
A1、将冷冻的幼龄生物骨原材料在常温下化冻，并切割成条状骨原料，长宽高的尺寸可以根据临床用途确定，反复冲洗切割后的条状骨原料，直至没有明显血水和油脂；
A2、将清洗后的条状骨原料倒入NaOH溶液中，NaOH的浓度：3mol/L，其浸泡的时间为4h，搅拌、浸泡后捞出，在长流水状态下清洗并甩干，进行去病毒，将去病毒后的条状骨原料倒入到三氯甲烷-甲醇混合溶液中，三氯甲烷-甲醇混合溶液中三氯甲烷与甲醇的混合体积比为3:1，其浸泡的时间为72h，搅拌、浸泡后捞出，真空干燥脱除残留的三氯甲烷和甲醇；
A3、将脱脂后的条状骨原料倒入到胰蛋白酶溶液中，配制的胰蛋白酶溶液浓度为1％；其浸泡的时间为4h，搅拌、浸泡后捞出，再使用NaOH溶液浸泡一段时间进行第二次去病毒，NaOH溶液的浓度为0.5mol/L，浸泡的时间为30min，然后在长流水状态下清洗并甩干，将二次去病毒后的条状骨原料倒入盐酸溶液中，盐酸溶液浓度为3mol/L，其浸泡的时间为24h，搅拌、浸泡、后捞出，在长流水状态下清洗并甩干；
A4、然后将条状骨原料倒入双氧水溶液中，配制的双氧水溶液浓度为10％，搅拌、浸泡成后捞出，以备去内毒，将脱细胞后的条状骨原料用倒入到注射用水中，反复浸泡清洗；
A5、条状骨原料平铺于容器中，使用冻干机进行冻干，冻干条件设定为-20℃下预冻18h，-60℃下冻干72h；
B、制备动物源性无机矿物溶液；
B1、按照步骤A1、A2制备脱脂后的条状骨原料；
B2、将脱脂后的条状骨原料倒入到胶原蛋白酶溶液中，搅拌、37℃恒温浸泡后捞出制成脱蛋白材料，然后通过乙醇梯度脱水进行干燥，干燥完成后在-0.18MPa真空挥发4h去除乙醇残留；
B3、使用机械研磨，研磨成粉末状，将粉末状的脱蛋白材料溶于提取剂中进行无机矿物成分的提取，提取剂是氯化胆碱：甘油混合物或脯氨酸：甘油混合物，其中氯化胆碱或脯氨酸：甘油的摩尔比为1：6；
B4、利用高速冷冻离心机在5℃的温度下高速离心，离心的转速2000r/min,离心时间40min；
B5、离心完后去除下层厚重的液体，厚重的液体为脂肪和有机物，得到提取的动物骨中的无机矿物溶液；
C、将提取的无机矿物溶液浇筑在动物骨支架材料中，无机矿物溶液和动物骨支架材料的比例为20ml:0.1g，冷冻干燥，冻干条件为：-20℃下预冻18h，-60℃下冻干72h，反复浇筑、冻干两遍；
D、将提取的无机矿物溶液和六氟异丙醇溶液混合，无机矿物溶液与六氟异丙醇溶液的混合比例为7：1，得到纺丝溶液；
E、将纺丝溶液通过静电纺丝技术制成纳米纤维，纺织在步骤C中冻干后的浇筑动物骨支架材料的六个面上，完成后进行真空干燥；
F、干燥后的产品放入京尼平溶液中交联，京尼平溶液浓度为0.5％，京尼平相对于其他化学交联剂毒性较小，较安全，交联时间为60h，交联完成后进行冷冻干燥，冷冻干燥条件为-20℃下预冻18h，-60℃下冻干72h。
对比例1
A、制备动物骨支架材料；
A1、将冷冻的幼龄生物骨原材料在常温下化冻，并切割成条状骨原料，长宽高的尺寸可以根据临床用途确定，反复冲洗切割后的条状骨原料，直至没有明显血水和油脂；
A2、将清洗后的条状骨原料倒入NaOH溶液中，NaOH的浓度：3mol/L，其浸泡的时间为4h，搅拌、浸泡后捞出，在长流水状态下清洗并甩干，进行去病毒，将去病毒后的条状骨原料倒入到三氯甲烷-甲醇混合溶液中，三氯甲烷-甲醇混合溶液中三氯甲烷与甲醇的混合体积比为3:1，其浸泡的时间为72h，搅拌、浸泡后捞出，真空干燥脱除残留的三氯甲烷和甲醇；
A3、将脱脂后的条状骨原料倒入到胰蛋白酶溶液中，配制的胰蛋白酶溶液浓度为1％；其浸泡的时间为4h，搅拌、浸泡后捞出，再使用NaOH溶液浸泡一段时间进行第二次去病毒，NaOH溶液的浓度为0.5mol/L，浸泡的时间为30min，然后在长流水状态下清洗并甩干，将二次去病毒后的条状骨原料倒入盐酸溶液中，盐酸溶液浓度为3mol/L，其浸泡的时间为24h，搅拌、浸泡、后捞出，在长流水状态下清洗并甩干；
A4、然后将条状骨原料倒入双氧水溶液中，配制的双氧水溶液浓度为10％，搅拌、浸泡成后捞出，以备去内毒，将脱细胞后的条状骨原料用倒入到注射用水中，反复浸泡清洗；
A5、条状骨原料平铺于容器中，使用冻干机进行冻干，冻干条件设定为-20℃下预冻18h，-60℃下冻干72h。
对比例2
A、制备动物骨支架材料；
A1、将冷冻的幼龄生物骨原材料在常温下化冻，并切割成条状骨原料，长宽高的尺寸可以根据临床用途确定，反复冲洗切割后的条状骨原料，直至没有明显血水和油脂；
A2、将清洗后的条状骨原料倒入NaOH溶液中，NaOH的浓度：3mol/L，其浸泡的时间为4h，搅拌、浸泡后捞出，在长流水状态下清洗并甩干，进行去病毒，将去病毒后的条状骨原料倒入到三氯甲烷-甲醇混合溶液中，三氯甲烷-甲醇混合溶液中三氯甲烷与甲醇的混合体积比为3:1，其浸泡的时间为72h，搅拌、浸泡后捞出，真空干燥脱除残留的三氯甲烷和甲醇；
A3、将脱脂后的条状骨原料倒入到胰蛋白酶溶液中，配制的胰蛋白酶溶液浓度为1％；其浸泡的时间为4h，搅拌、浸泡后捞出，再使用NaOH溶液浸泡一段时间进行第二次去病毒，NaOH溶液的浓度为0.5mol/L，浸泡的时间为30min，然后在长流水状态下清洗并甩干，将二次去病毒后的条状骨原料倒入盐酸溶液中，盐酸溶液浓度为3mol/L，其浸泡的时间为24h，搅拌、浸泡、后捞出，在长流水状态下清洗并甩干；
A4、然后将条状骨原料倒入双氧水溶液中，配制的双氧水溶液浓度为10％，搅拌、浸泡成后捞出，以备去内毒，将脱细胞后的条状骨原料用倒入到注射用水中，反复浸泡清洗；
A5、条状骨原料平铺于容器中，使用冻干机进行冻干，冻干条件设定为-20℃下预冻18h，-60℃下冻干72h；
B、制备动物源性无机矿物溶液；
B1、按照步骤A1、A2制备脱脂后的条状骨原料；
B2、将脱脂后的条状骨原料倒入到胶原蛋白酶溶液中，搅拌、37℃恒温浸泡后捞出制成脱蛋白材料，然后通过乙醇梯度脱水进行干燥，干燥完成后在-0.18MPa真空挥发4h去除乙醇残留；
B3、使用机械研磨，研磨成粉末状，将粉末状的脱蛋白材料溶于提取剂中进行无机矿物成分的提取，提取剂是氯化胆碱：甘油混合物或脯氨酸：甘油混合物，其中氯化胆碱或脯氨酸：甘油的摩尔比为1：6；
B4、利用高速冷冻离心机在5℃的温度下高速离心，离心的转速2000r/min,离心时间40min；
B5、离心完后去除下层厚重的液体，厚重的液体为脂肪和有机物，得到提取的动物骨中的无机矿物溶液；
C、将提取的无机矿物溶液浇筑在动物骨支架材料中，无机矿物溶液和动物骨支架材料的比例为20ml:0.1g，冷冻干燥，冻干条件为：-20℃下预冻18h，-60℃下冻干72h，反复浇筑、冻干两遍。
对比例3
A、制备动物骨支架材料；
A1、将冷冻的幼龄生物骨原材料在常温下化冻，并切割成条状骨原料，长宽高的尺寸可以根据临床用途确定，反复冲洗切割后的条状骨原料，直至没有明显血水和油脂；
A2、将清洗后的条状骨原料倒入NaOH溶液中，NaOH的浓度：3mol/L，其浸泡的时间为4h，搅拌、浸泡后捞出，在长流水状态下清洗并甩干，进行去病毒，将去病毒后的条状骨原料倒入到三氯甲烷-甲醇混合溶液中，三氯甲烷-甲醇混合溶液中三氯甲烷与甲醇的混合体积比为3:1，其浸泡的时间为72h，搅拌、浸泡后捞出，真空干燥脱除残留的三氯甲烷和甲醇；
A3、将脱脂后的条状骨原料倒入到胰蛋白酶溶液中，配制的胰蛋白酶溶液浓度为1％；其浸泡的时间为4h，搅拌、浸泡后捞出，再使用NaOH溶液浸泡一段时间进行第二次去病毒，NaOH溶液的浓度为0.5mol/L，浸泡的时间为30min，然后在长流水状态下清洗并甩干，将二次去病毒后的条状骨原料倒入盐酸溶液中，盐酸溶液浓度为3mol/L，其浸泡的时间为24h，搅拌、浸泡、后捞出，在长流水状态下清洗并甩干；
A4、然后将条状骨原料倒入双氧水溶液中，配制的双氧水溶液浓度为10％，搅拌、浸泡成后捞出，以备去内毒，将脱细胞后的条状骨原料用倒入到注射用水中，反复浸泡清洗；
A5、条状骨原料平铺于容器中，使用冻干机进行冻干，冻干条件设定为-20℃下预冻18h，-60℃下冻干72h；
B、制备动物源性无机矿物溶液；
B1、按照步骤A1、A2制备脱脂后的条状骨原料；
B2、将脱脂后的条状骨原料倒入到胶原蛋白酶溶液中，搅拌、37℃恒温浸泡后捞出制成脱蛋白材料，然后通过乙醇梯度脱水进行干燥，干燥完成后在-0.18MPa真空挥发4h去除乙醇残留；
B3、使用机械研磨，研磨成粉末状，将粉末状的脱蛋白材料溶于提取剂中进行无机矿物成分的提取，提取剂是氯化胆碱：甘油混合物或脯氨酸：甘油混合物，其中氯化胆碱或脯氨酸：甘油的摩尔比为1：6；
B4、利用高速冷冻离心机在5℃的温度下高速离心，离心的转速2000r/min,离心时间40min；
B5、离心完后去除下层厚重的液体，厚重的液体为脂肪和有机物，得到提取的动物骨中的无机矿物溶液；
C、将提取的无机矿物溶液浇筑在动物骨支架材料中，无机矿物溶液和动物骨支架材料的比例为20ml:0.1g，冷冻干燥，冻干条件为：-20℃下预冻18h，-60℃下冻干72h，反复浇筑、冻干两遍；
D、将提取的无机矿物溶液和六氟异丙醇溶液混合，无机矿物溶液与六氟异丙醇溶液的混合比例为7：1，得到纺丝溶液；
E、将纺丝溶液通过静电纺丝技术制成纳米纤维，纺织在步骤C中冻干后的浇筑动物骨支架材料的六个面上，完成后进行真空干燥。
效果例
抗压强度测试：取样品分别测量试样的长度、宽度、厚度，使用单立柱台式试验机，在试验机软件上设置试样变形量，按照10mm/min的速度进行试验，当试验机停止时，记录试样力值，计算抗压强度。
骨诱导能力试验：小鼠常规麻醉消毒，将实施例1、实施例2、对比例1、对比例2、对比例3材料经小鼠右大腿后外侧直切口植入肌袋内，缝合肌膜层及皮肤，放回笼内分组饲养。术后观察小鼠饮食、活动和切口反应情况，取材后注意有无炎性反应，材料有无排出以及成骨情况。对术后4周的骨痂标本，将其表面软组织剔除，测定骨痂湿重。
试验结果汇总如下：
由上表可知，实施例1与实施例2通过静电纺丝技术和交联技术结合，能有效提高骨支架的强度及骨诱导能力，对比例1是完全脱钙的骨支架，骨支架及骨诱导能力最差，对比例2是浇筑无机矿物溶液的骨支架，但是仅通过简单浇筑，无机矿物溶液分布不均，骨支架的强度及骨诱导能力达不到实施例1与实施例2的效果，对比例3虽然通过静电纺丝使无机矿物溶液分布均匀，但是没有经过交联，其骨支架与无机矿物溶液结合效果不佳，也达不到实施例1与实施例2的效果。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种不完全脱钙骨诱导材料的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
A、制备动物骨支架材料；
B、制备动物源性无机矿物溶液；
C、将提取的无机矿物溶液浇筑在动物骨支架材料中，冷冻干燥；
D、将提取的无机矿物溶液和六氟异丙醇溶液混合，得到纺丝溶液；
E、将纺丝溶液通过静电纺丝技术制成纳米纤维，纺织在步骤C中冻干后的浇筑动物骨支架材料的六个面上，完成后进行真空干燥；
F、干燥后的产品放入京尼平溶液中交联，交联完成后进行冷冻干燥。
2.根据权利要求1所述的一种不完全脱钙骨诱导材料的制备方法，其特征在于：在步骤A中，具体制备步骤为：
A1、将冷冻的幼龄生物骨原材料在常温下化冻，并切割成条状骨原料，长宽高的尺寸可以根据临床用途确定，反复冲洗切割后的条状骨原料，直至没有明显血水和油脂；
A2、将清洗后的条状骨原料倒入NaOH溶液中，搅拌、浸泡后捞出，在长流水状态下清洗并甩干，进行去病毒，将去病毒后的条状骨原料倒入到三氯甲烷-甲醇混合溶液中，搅拌、浸泡后捞出，真空干燥脱除残留的三氯甲烷和甲醇；
A3、将脱脂后的条状骨原料倒入到胰蛋白酶溶液中，搅拌、浸泡后捞出，再使用NaOH溶液浸泡一段时间进行第二次去病毒，然后在长流水状态下清洗并甩干，将二次去病毒后的条状骨原料倒入盐酸溶液中，搅拌、浸泡、后捞出，在长流水状态下清洗并甩干；
A4、然后将条状骨原料倒入双氧水溶液中，搅拌、浸泡成后捞出，以备去内毒，将脱细胞后的条状骨原料用倒入到注射用水中，反复浸泡清洗；
A5、条状骨原料平铺于容器中，使用冻干机进行冻干。
3.根据权利要求2所述的一种不完全脱钙骨诱导材料的制备方法，其特征在于：在步骤B中，具体制备步骤为：
B1、按照步骤A1、A2制备脱脂后的条状骨原料；
B2、将脱脂后的条状骨原料倒入到胶原蛋白酶溶液中，搅拌、37℃恒温浸泡后捞出制成脱蛋白材料，然后进行干燥，干燥完成后去除乙醇残留；
B3、使用机械研磨，研磨成粉末状，将粉末状的脱蛋白材料溶于提取剂中进行无机矿物成分的提取；
B4、利用高速冷冻离心机在1-5℃的温度下高速离心；
B5、离心完后去除下层厚重的液体，得到提取的动物骨中的无机矿物溶液。
4.根据权利要求3所述的一种不完全脱钙骨诱导材料的制备方法，其特征在于：在步骤A2中，所述NaOH的浓度：0.1～3mol/L，其浸泡的时间为1～4h。
5.根据权利要求3所述的一种不完全脱钙骨诱导材料的制备方法，其特征在于：在步骤A2中，所述三氯甲烷-甲醇混合溶液中三氯甲烷与甲醇的混合体积比为2～3:1，其浸泡的时间为24～72h。
6.根据权利要求2所述的一种不完全脱钙骨诱导材料的制备方法，其特征在于：在步骤A3中，
所述配制的胰蛋白酶溶液浓度为0.1％～1％；其浸泡的时间为2～4h；所述NaOH溶液的浓度为0.5mol/L，浸泡的时间为30min。
7.根据权利要求3所述的一种不完全脱钙骨诱导材料的制备方法，其特征在于：
在步骤B3中，所述提取剂是氯化胆碱：甘油混合物或脯氨酸：甘油混合物，其中氯化胆碱或脯氨酸：甘油的摩尔比为1：(2～6)；
在步骤B5中，所述厚重的液体为脂肪和有机物。
8.根据权利要求1所述的一种不完全脱钙骨诱导材料的制备方法，其特征在于：在步骤C中，
无机矿物溶液和动物骨支架材料的比例为10～20ml:0.1g；
冻干条件为：-20℃下预冻12～18h，-60℃下冻干48～72h，反复浇筑、冻干两遍。
9.根据权利要求1所述的一种不完全脱钙骨诱导材料的制备方法，其特征在于：
在步骤D中，所述无机矿物溶液与六氟异丙醇溶液的混合比例为(4-7)：1。
10.根据权利要求1所述的一种不完全脱钙骨诱导材料的制备方法，其特征在于：在步骤F中，
京尼平溶液浓度为0.5-2％，交联时间为60-90h；
冷冻干燥条件为-20℃下预冻12～18h，-60℃下冻干48～72h。
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