CN115895914A - 高产三萜灵芝新菌株hmgim-d150696及其分子标记和人工栽培方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高产三萜灵芝新菌株HMGIM‑D150696及其分子标记和人工栽培方法。灵芝(Ganoderma lucidum)HMGIM‑D150696，保藏编号为GDMCC No：62403；其分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；其人工栽培方法包括菌丝培养、出芝管理和采收。本发明获得差异位点的方法与传统的采用随机引物扩增的方式相比，具有效率高、特异性位点丰富的优点，可更有效保护菌种。此外，由于该菌株采集自野外，具有丰富的遗传变异，与市场流通品种存在较远的亲缘关系，可为优良新品种的选育提供宝贵的种质资源。

Description

高产三萜灵芝新菌株HMGIM-D150696及其分子标记和人工栽培方法

技术领域

本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一种高产三萜灵芝新菌株及其分子标记、特异性引物对和人工栽培方法。

背景技术

灵芝[Ganoderma lucidum(Curtis)P.Karst.]是伞菌纲、多孔菌科、灵芝属真菌。据《神农本草经》记载，灵芝具有“安精魂，增智慧，益心气，坚筋骨、好颜色，久食轻身不老，延年神仙”等功效。现代药理学和临床研究表明，灵芝具有多种药理活性，已被广泛用于预防和治疗各种疾病，特别是在免疫调节、降血糖和抗肿瘤方面。目前已经确定灵芝子实体中含有400余种代谢产物，具有生理活性的成分有灵芝多糖、三萜类化合物、蛋白质、多肽、核苷类、呋喃类、甾醇、生物碱和氨基酸等。灵芝三萜类化合物是灵芝次级代谢中的一类重要活性物质，具有抗衰老、抗病毒、抗肿瘤、抗炎、降血压、降血糖、降血脂、免疫调节、镇痛、保肝等广泛的药理活性。针对灵芝三萜的药理活性已开发出相应的药品、药食同源产品。目前市场上一些高品质的灵芝类产品，会单独标注灵芝三萜的含量。灵芝三萜含量达到10％以上的孢子油产品才算达到行业水平。一些优质的灵芝孢子油产品，灵芝三萜含量可达到20％以上。《美国药典》也将灵芝三萜含量列为评价灵芝质量的标准。然而，灵芝三萜类化合物含量较低导致相关加工产品的价格居高不下，限制其推广应用。因此，选育高产三萜的灵芝菌株可成为推动灵芝加工业发展的有效途径。

灵芝自实现人工种植以来，主要以段木覆土方式进行栽培。随着劳动力成本大幅上涨、原料短缺、土地资源紧张及覆土带来的重金属、病虫害等安全问题日益严峻，传统的栽培方式受到严峻挑战，工厂化栽培是社会可持续发展的必然趋势。然而，灵芝成熟时会喷出大量的孢子，容易污染栽培车间环境及设备，引起工作人员呼吸系统疾病。已有研究表明，多次采收获得的未成熟子实体与单次采收成熟子实体产量相当，且未成熟子实体中三萜类化合物含量较成熟子实体高。多次采收要求菌株具有较强的原基再生能力。综上，选育原基长势好且再生能力强的菌株有助于解决灵芝工厂化栽培中遇到的问题，加快推进灵芝工厂化栽培进程。

品种选育是系统且需要长期坚持的工作，而灵芝可通过无性繁殖的方式复制生产用种，这在很大程度上打击了育种家的积极性，影响整个产业的发展，且造成菌种同物异名、同名异物的混乱现象。传统的食用菌菌种鉴定主要依赖菌丝体拮抗、子实体形态等方式。菌丝体拮抗现象的判断受人为因素影响较大，且亲缘关系较近的菌株之间拮抗线不明显，无法有效区分。子实体外观形态受环境因素(温度、湿度、光照、氧气)影响较大，且获得子实体耗时数月，不利于快速有效鉴别菌种。随着分子生物学技术的发展，DNA分子标记技术以其简单、快速、不受发育时期和环境因素限制的优点广泛应用于遗传育种和物种亲缘关系鉴别等方面。

发明内容

本发明目的在于提供一种高产三萜的灵芝菌株HMGIM-D150696及其分子标记和人工栽培方法。

灵芝(Ganoderma lucidum)HMGIM-D150696，于2022年4月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为GDMCC No：62403。

本发明采用全基因组重测序技术获得了HMGIM-D150696菌株的基因组序列信息，通过生信分析获得InDel变异位点集，有针对性地设计了特异性引物，通过PCR扩增获得了野生灵芝菌株HMGIM-D150696的特异DNA片段，即为灵芝菌株HMGIM-D150696的分子标记。

所述的灵芝菌株HMGIM-D150696的分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQIDNO.2所示。

本发明还提供了鉴别灵芝菌株HMGIM-D150696的鉴别引物组：

包括如下任一引物对：

D696-F1：TCTCGCAAAATCAAATTCGCAG和D696-R1：TGGTTTGACTGGGATAACG ATGT；

D696-F2：GATGTGAAGACGCCCTGAGAA和D696-R2：CCGGGTAAAGGTGGTTGAA GTT。

D696-YF:GACGTCTGCAGTGATTCTGGAAC和D696-YR:TCATTATCTTATGGCGTTA GCAGG

本发明还提供了灵芝菌株HMGIM-D150696的分子标记或上述鉴别引物组在鉴别灵芝菌株HMGIM-D150696中的应用。

本发明还提供了一种鉴别灵芝菌株HMGIM-D150696的方法，提取待测灵芝的基因组DNA，用上述D696-F1/R1引物对进行PCR扩增，如果能扩增出一条特异性DNA片段则为灵芝菌株HMGIM-D150696，否则则不是；或用上述D696-F2/R2引物对进行PCR扩增，如果能扩增出两条特异性DNA片段为灵芝菌株HMGIM-D150696，否则则不是；或用上述D696-YF/YR引物对进行qPCR扩增，如果循环数小于30时可激发荧光为灵芝菌株HMGIM-D150696，否则则不是。

具体地，所述的一条特异性DNA片段的大小为250-300bp。

具体地，所述的两条特异性DNA片段的大小为100-250bp和300-400bp。

本发明还提供上述灵芝菌株HMGIM-D150696的栽培方法，包括步骤：灵芝菌株HMGIM-D150696菌丝培养、出芝管理和采收。

优选，具体步骤为：

一、培养基配方

母种培养基：按质量分数计，包括马铃薯20％+葡萄糖2％+蛋白胨1％+琼脂2％+磷酸二氢钾0.3％+硫酸镁0.15％+维生素B1 0.001％；

生产种培养基：按质量分数计，包括98-99％高粱+1-2％碳酸钙，pH自然；

栽培料：按质量分数计，包括50％杂木屑，38％棉籽壳，10％麦麸，2％碳酸钙，含水量60-65％，pH自然；

二、栽培流程

菌丝培养：在无菌操作条件下取HMGIM-D150696保藏种菌块接种于母种培养基，湿度50％-60％，黑暗培养8-12天至菌丝体长满斜面；将母种菌丝体转接至生产种培养基进行扩大培养，黑暗培养至菌丝体长满袋；随后将生产种菌丝体接种于栽培料，黑暗培养，湿度60％-70％，定时换气以保持二氧化碳浓度4000ppm以下，培养18-20天至菌丝长满袋后，同条件培养7-10天进行后熟期培养；

出芝管理：菌丝后熟期满后进行催蕾，打开栽培袋盖子，把栽培袋竖排放置，26～28℃，空气相对湿度90％～95％，散射光光照8h/d；出芝管理后在栽培料开口位置开始形成原基，调整湿度为80～90％，待菌盖开始分化时，每天换新风；子实体边缘生长点消失，开始喷粉前调节空气湿度至80％；

采收：菌盖背面大量弹射孢子时采收子实体。

进一步优选，所述的栽培流程为：

菌丝培养：在无菌操作条件下取HMGIM-D150696保藏种菌块接种于母种培养基，湿度50％-60％，25℃恒温黑暗培养8-12天至菌丝体长满斜面；将母种菌丝体转接至生产种培养基进行扩大培养，25℃恒温黑暗培养至菌丝体长满袋；随后将生产种菌丝体接种于栽培料，25℃恒温黑暗培养，湿度60％-70％，定时换气以保持二氧化碳浓度4000ppm以下，培养18-20天至菌丝长满袋后，同条件培养7-10天进行后熟期培养；

出芝管理：菌丝后熟期满后进行催蕾，打开栽培袋盖子，把栽培袋竖排放置，26～28℃，空气相对湿度保持在90％～95％条件下，散射光光照8h/d，出芝管理6天左右在栽培料开口位置开始形成原基，调整湿度为80～90％，待菌盖开始分化时，每天换新风2次，每次1h，子实体边缘生长点消失，开始喷粉前调节空气湿度至80％；

采收：菌盖背面大量弹射孢子时采收子实体，每袋子实体鲜重为46.83-61.77g，菌盖直径为7.75-11.40cm,菌柄高度为1.32-3.02cm，菌盖厚度为8.90-10.81mm。

本发明获得差异位点的方法与传统的采用随机引物扩增的方式相比，具有效率高、特异性位点丰富的优点，可更有效保护菌种。本发明的检测方法与常规的子实体形态和菌丝体拮抗线观察相比，具有检测时间短，检测结果客观真实、准确性高的优点。

灵芝菌株HMGIM-D150696为野生灵芝菌株，经过本团队分离纯化、驯化栽培研究和活性成分含量评价后，发现其具有较强的原基分化能力及再生能力，且成熟子实体三萜类化合物含量高等优点，代料栽培子实体三萜含量可达25.1mg/g，可为以灵芝三萜为主要成分的药品或药食同源产品的开发提供原材料，具有较好的食用与药用开发价值。此外，由于该菌株采集自野外，具有丰富的遗传变异，与市场流通品种存在较远的亲缘关系，可为优良新品种的选育提供宝贵的种质资源。

Ganoderma lucidum HMGIM-D150696于2022年4月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为GDMCC No：62403。

附图说明

图1是灵芝菌株HMGIM-D150696(Ganoderma lucidum)野外采集图。

图2是基于ITS序列构建HMGIM-D150696与灵芝属其他物种的系统发育树结果图，从左到右分别基于邻接法和最大似然法。

图3是灵芝菌株HMGIM-D150696驯化子实体表型。

图4是D696-F1/R1引物对在HMGIM-D150696(D696)及市场种中的扩增结果图。

图5是D696-F2/R2引物对在HMGIM-D150696(D696)及市场种中的扩增结果图。

图6是D696-YF/YR引物对在HMGIM-D150696(D696)及市场种中的扩增结果图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是本发明的限制。

实施例1：野生灵芝菌株的获得与鉴定

2015年8月4日，广东省微生物研究所食用菌研究发展中心科研人员在湖南省国家级自然保护区采集到一株灵芝标本，该菌散生于向阳的枯木上(图1)。经分离、纯化，鉴定为灵芝(Ganoderma lucidum)HMGIM-D150696，于2022年4月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为GDMCC No：62403。

1、组织分离与纯化

将野外采集获得的灵芝子实体用75％酒精擦拭表面，在无菌环境下撕开并夹取0.2-0.5mm×0.2-0.5mm的内部菌肉组织接入加富综合PDA培养基。置于25℃培养箱中恒温暗培养，待菌丝长满斜面后取尖端菌丝转接纯化培养。

2、鉴定

2.1传统鉴定——宏观和微观鉴定

野生HMGIM-D150696子实体具侧生柄，新鲜时软木栓质，干燥后为木栓质，菌盖平展盖形，直径约为3.6cm，菌柄长度约为9cm；菌盖大部分为红褐色，管口表面浅黄色，近圆形，每毫米5-6个菌孔，菌肉褐色，上层菌肉颜色较浅，下层菌肉颜色深，软木栓质，菌孔颜色比菌肉深。担孢子椭圆形，顶端平截，双层壁，外壁透明、平滑，内壁褐色或淡褐色，具小刺，非淀粉质，中央具一油滴，8.5-10.7微米×5.5-7.5微米。

2.2分子鉴定

2.2.1ITS鉴定方法

将纯化后的菌丝转接至表面盖有塞洛芬薄膜的加富综合PDA平板培养基，置于25℃恒温避光培养，待菌丝长满平板后收集新鲜菌丝常温研磨，利用全自动核酸提取仪配套使用磁珠法基因组DNA提取试剂盒(广州迈宝生物科技有限公司，货号DNF628-05B)进行DNA基因组的提取，得到的DNA溶液(DNA模板)冷藏于-20℃备用。通过真菌核糖体基因间隔区通用引物ITS1/ITS4(ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4：TCCTCCGCTTATTGAT ATGC，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)进行ITS-PCR实验，扩增在BioRad PCR仪上进行，PCR反应液组成(共30μl)如表1和表2.

相关试剂(商品编号P111-01)购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。PCR产物直接送华大基因进行双向测序。

表1真菌ITS PCR体系

表2真菌ITS PCR扩增程序

2.2.2分类学地位确定

将测序结果(TGCACTTACTGTGGGCTTCAGATTGCGAGGCACGCTCTTTACCGGGCTTGCGGAGCATATCTGT GCCTGCGTTTATCACAAACTCTATAAAGTAACAGAATGTGTATTGCGATGTAACACATCTATATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAAATCCTCAACCTACAAGCTTTTGTGGTTTGTAGGCTTGGACTTGGAGGCTTGTCGGCCGT)在NCBIGenBank进行序列比对，ITS鉴定结果表示该菌株为灵芝(Ganoderma lingzhi)菌株。为进一步确认其品种，应用最大似然法(ML)和邻接法(NJ)构建系统发育树，以云芝(Trametesversicolor)作为外群，分别进行了系统发育树的构建。在两个算法建成的系统发育树中，HMGIM-D150696与Ganoder ma lingzhi均处于同一分枝内，聚为一类，亲缘关系接近，可以确定HMGIM-D150696为灵芝(Ganoderma lingzhi)菌株(图2)。我国药典记载的灵芝为多孔菌科真菌赤芝G.lucidu m或紫芝G.sinense的干燥子实体，但随着系统发育研究的发展，2013年我国分类学专家戴玉成教授的研究表明，我国广泛分布和栽培的灵芝与产于欧洲的G.lucidum不同，Wasser et al.(2006)和Wasser(2011)也指出G.lucidum这一名称被错误地使用到药用真菌灵芝中。实际上中国灵芝(俗称赤芝)为一个新种：Ganoderma lingzhiS.H.Wu,Y.Cao&Y.C.Dai(Cao et al.2012)，因此中国药典记载的赤芝拉丁名应为G.lingzhi，而非G.lucidum，本专利保护的菌株是中国本土的灵芝G.lingzhi野生菌株，但是由于目前药典仍在使用G.lucid um作为灵芝的拉丁名，本专利保护的菌株保藏物种名暂定为G.lucidum，待药典修改后更正。将其命名为灵芝(Ganoderma lucidum)HMGIM-D150696，于2022年4月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为GDMCC No：62403。

实施例2：野生灵芝菌株驯化与系统选育

(一)野生灵芝菌株驯化栽培

1、培养基配方及配置

1.1母种培养基(加富综合PDA)：按质量分数计，包括马铃薯20％+葡萄糖2％+蛋白胨1％+琼脂2％+磷酸二氢钾0.3％+硫酸镁0.15％+维生素B1 0.001％，余量为水，其配制方法是：先将马铃薯洗净去皮，再称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂(煮沸20～30分钟，玻璃棒可戳破)，用八层纱布过滤，滤液中加入葡萄糖20g、蛋白胨10g、琼脂20g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g、维生素B1 0.01g，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，分装于玻璃试管中(18×180mm)，0.11MPa、121℃高温高压湿热灭菌30min，灭菌结束后培养基未凝固前及时置于斜面上冷却定型。冷却后无菌操作接入分离成功的灵芝菌种HMGIM-D150696。置于25℃培养箱中恒温暗培养，待菌丝长满斜面后(8-12d左右)则可进行转接。

1.2生产种培养基：按质量分数计，包括99％高粱+1％碳酸钙，pH自然。称取所需比例的高粱，浸泡过夜后煮熟至透心，取出过滤弃去多余水分，按比例加入碳酸钙拌匀，装入13cm×25cm耐高温的透明聚丙烯袋中，折合每袋装干料200-250g。0.11MPa、121℃高温高压湿热灭菌30min。取出冷却后无菌操作接入生产母种。接种时确保母种料块埋入生产种料中。把已接种的生产种置于25℃培养箱中恒温暗培养，待菌丝吃满料后(8-12d左右)则可作为生产种使用接入栽培袋中。

1.3栽培袋制作：按质量分数计，包括50％杂木屑，38％棉籽壳，10％麦麸，2％碳酸钙，pH自然。取上述配方充分混合并加水至含水量为60-65％，堆置过夜后再次翻堆拌匀，再次调节含水量至60～65％，装入17cm×35cm耐高温的透明聚丙烯菌种袋，折合每袋装干料400-420g。装好料后用打孔棒在袋料中打洞，洞深至袋底，然后在袋口套上塑料环，扣上配套的盖子，即得一个制好的栽培袋料。在0.147MPa大气压、128℃高温高压湿热灭菌90min，取出冷却后无菌操作接入生产种，25℃恒温黑暗培养，湿度60％-70％，定时换气以保持二氧化碳浓度4000ppm以下，培养18-20天至菌丝长满袋后，同条件培养7-10天进行后熟期培养，长满时间大约为18-20d。

2、栽培管理

栽培袋接种后在25℃±1℃、空气相对湿度60-70％的培养室中避光培养。待栽培袋中的菌丝长满袋中栽培料后，打开栽培袋盖子去掉菌环，把栽培袋竖排放置(袋与袋之间应留有空隙)，置于26-28℃，空气相对湿度90-95％，散射光照射8h/d，6d左右开始形成原基。形成菌盖后每天换新风，早晚各1次，每次1h，调节空气湿度至85％～90％，子实体边缘生长点消失，开始喷粉前调节空气湿度至80％，菌盖背面大量弹射孢子时采收。

(二)系统选育获得优良菌株及其子实体特性

待形成子实体后，选择生长健壮的子实体再次进行组织分离纯化获得备选灵芝菌株，保存并依次制备母种、生产种，栽培出菇，根据备选菌株在栽培过程中的生长周期、抗杂菌能力，形成子实体的能力优中选优进行组织分离，获得纯化菌丝，以此为循环，选育稳定、生长速度快、抗菌活力强的菌株。最终保存的优良菌株进行栽培管理。开袋散射光照射6天即可形成原基，且原基数量较多，长势较好，同等栽培条件下，市场种韩芝203需要8-10天才开始形成原基。在幼嫩子实体阶段进行修枝，修枝后切口可再形成原基长出完整子实体，表明HMGIM-D150696具有较强的再生能力，适合工厂化多次采收模式。驯化子实体性状：子实体圆肾型，菌盖直径为7.75-11.40cm，菌柄高度为1.32-3.02cm，菌盖厚度为8.90-10.81mm。孢子未喷射之前菌盖正面为黄色，有明显的同心环纹和放射性纵脊，成熟后子实体为黄褐色，有光泽，腹面浅黄色，菌管明显，菌柄红褐色(图3)。单朵子实体鲜重为46.83-61.77g，干重为19.67-24.77g。

采用高效液相色谱对驯化栽培得到的灵芝子实体进行三萜含量测定，共有45个标准品，包括灵芝酸类、灵芝醇类、灵芝烯酸类、灵芝醛、灵芝酮、灵芝内酯等三萜类化合物，检测方法参照上海市农业科学院食用菌研究所冯娜博士所建立的检测流程(CN202011236775.0、CN202111210687.8)。测定结果表明，HMGIM-D150696子实体中三萜类化合物含量是市场流通品种沪农一号及韩芝203的1.7-1.9倍，表明该菌株高产三萜类物质(见表3)，可为以灵芝三萜为主要成分的药用和保健食品的开发提供原材料，具有较好的食用与药用开发价值。

表3HMGIM-D150696与其他菌株三萜类化合物含量的比较

综合HMGIM-D150696有较强的原基分化能力及再生能力、三萜类化合物含量高等突出优点，可望通过诱变育种、杂交育种、原生质体融合育种等方式选育更多优良新菌株。

实施例3：菌株特异分子标记开发

将应用广泛的商品菌种沪农一号、韩芝203及野生灵芝菌株HMGIM-D150696菌株接种于平板培养基(加富综合PDA)上，收集菌丝体并提取总DNA，基因组DNA检测合格后，用超声波将DNA片段化，然后对片段化的DNA进行片段纯化、末端修复、3′端加A、连接测序接头，再用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，进行PCR扩增形成测序文库，建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用Illumina进行双端测序，测序序列读长150bp，产生5G以上的数据。测序得到的原始测序序列(Raw Reads)含有带接头的、低质量的Reads，为了保证信息分析质量，对Raw Reads进行过滤，得到Clean Reads，用于后续信息分析。数据过滤的主要步骤如下：(1)去除带接头(adapter)的reads；(2)过滤N含量超过10％的reads；(3)去除质量值低于10的碱基超过50％的reads。使用BWA软件将得到的clean reads定位到本团队自测的灵芝基因组上，使用GATK的HaplotypeCaller(局部单体型组装)算法进行InDel变异检测，得到最终的变异位点集。选择沪农一号、韩芝203与参考基因组一致，HMGIM-D150696存在20bp以上片段插入的变异位点，并从中选择变异位点的覆盖度与基因型质量值高的位点进行引物设计。引物信息如下，D696-F1：TCTCGCAAAATCAAATTCGCAG和D696-R1：TGGTTTGACTGGGATAACGATGT。D696-F2：GATGTGAAGACGCCCTGAGAA和D696-R2：CCGGGTAAAGGTGGTTGAAGTT。引物对由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR扩增时加入了国内选育的龙芝和泉芝。PCR扩增在BioRad PCR仪上进行，PCR反应液组成(共30μl)如表4所示：

表4 HMGIM-D150696分子标记PCR体系

PCR程序为：95℃预变性，95℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，GOTOstep2，执行35个循环，72℃延伸5min，12℃保存结束程序。将PCR产物置于1-1.5％琼脂糖凝胶上电泳(5v/cm)25min，置于凝胶成像系统中拍照，结果如图4和图5所示。

D696-F1/R1引物对只在HMGIM-D150696(D696)得到有效扩增(图4)。用该引物对所扩增出来的核苷酸片段大小为250-300bp，所述大小为250-300bp的特异DNA片段是本发明灵芝新菌株HMGIM-D150696的InDel分子标记。将PCR产物送华大基因进行双端测序获得具体的序列信息，具体序列如SEQ ID NO.1所示。

D696-F2/R2引物对在HMGIM-D150696(D696)中扩增可获得两条条带，大小分别为100-250bp及300-400bp(图5)，其余灵芝菌株仅能扩增出一条100-250bp的条带，所述大小为300-400bp的特异核苷酸片段是本发明灵芝新菌株HMGIM-D150696的InDel分子标记。将300-400bp的PCR产物送华大基因进行正向单端测序获得具体的序列信息，具体序列如SEQID NO.2所示。

根据D696-F1/R1引物对所扩增PCR产物测序获得的序列信息，利用在线引物设计网站(https://primer3.ut.ee/)设计用于定量检测HMGIM-D150696的特异性引物对，信息如下：D696-YF/YR(5’->3’)GACGTCTGCAGTGATTCTGGAAC/TCATTATCTTATGGCGTTAGC AGG。引物对由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。利用qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号：Q111)，进行荧光定量PCR反应，以HMGIM-D150696，沪农一号，龙芝，韩芝，泉芝的基因组DNA为模板，分别使用引物对D696-YF/YR进行扩增，每个反应3个技术重复。反应体系为20μL总体积：qPCR SYBR Gr een Master Mix 10μL，PCR primer 1(10μmol/L)1μL，PCR primer 2(10μmol/L)1μL，模板DNA 2μL，加ddH ₂O至20μL。反应程序为95℃2min预变性，95℃15s，58℃15s，72℃20s，36个循环。使用荧光定量PCR仪(Applied Biosystems QuantStudio 6&7Real Ti me PCR System,Thermo Fisher公司)进行反应。结果如图6所示，扩增曲线表明循环数小于30时，D696-YF/YR只在HMGIM-D150696DNA存在的情况下激发荧光信号，其他灵芝菌株在30-34循环时出现较弱的荧光或者没有荧光。

综上，D696-F1/R1,D696-F2/R2和D696-YF/YR可分别通过琼脂糖凝胶电泳及荧光PCR的方式实现HMGIM-D150696的专一性检测。

SEQ ID NO.1

TCTCGCAAAATCAAATTCGCAGTCTTGGTAGAGCCGATCACGGCCGGTGATGACGACGA

ATGGAGATTGATTGGTATAGTACAAAGCAGAGAAAATGTTCGGCACAAGAAGGAACGAT

CTTCGTGTGCATACGACAGCAACAGGATGAAAGACGTCTGCAGTGATTCTGGAACACGT

GCACCGACGACGCCAATGTCATCAGGCGATGGATGTGAAGACGCCCTGAGAAGACTATT

ACTACCTGCTAACGCCATAAGATAATGAGAAACATACGACATCGTTATCCCAGTCAAACC

A

SEQ ID NO.2

GGGGCATTGGATTTGAGTTGAGCGCTGTCCTAACGTTTGGGAGCCAACTAGTTCGATATT

GGGTCTCGCATGCCGCCCGGGTAGTATATGCCCGCACGCCATCTCAGCGAGTACTAACCT

AGTATACTATGTAACTAAGTAATCAAAGCGAAAAACGTTTTGAACCTATAATATATGTATA

TGAGGGCGCGGTGGCTGTGAACGATGATAATACTTACATACTTGCTTAGTCAGCTCAGTT

GCTAGCTCTCGCTCGCGGCGACTCAGAGGCGTCCGTCCCGTCAGCCTTTCAACTTCAAC

CACCTTTACCCGG

Claims (10)

1.灵芝菌株(Ganoderma lucidum)HMGIM-D150696，保藏编号为GDMCC No：62403。

2.一种权利要求1所述的灵芝菌株HMGIM-D150696的分子标记，其特征在于，所述的灵芝菌株HMGIM-D150696的分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

3.一种鉴别权利要求1所述的灵芝菌株HMGIM-D150696的鉴别引物组，其特征在于，如如下任一引物对所示：

D696-F1：TCTCGCAAAATCAAATTCGCAG和D696-R1：TGGTTTGACTGGGATAACG ATGT；

D696-F2：GATGTGAAGACGCCCTGAGAA和D696-R2：CCGGGTAAAGGTGGTTGAA GTT；

D696-YF:GACGTCTGCAGTGATTCTGGAAC和D696-YR:TCATTATCTTATGGCGTTA GCAGG。

4.权利要求2所述的灵芝菌株HMGIM-D150696的分子标记或权利要求3所述的鉴别引物组在鉴别权利要求1所述的灵芝菌株HMGIM-D150696中的应用。

5.一种鉴别权利要求1所述的灵芝菌株HMGIM-D150696的方法，其特征在于，提取待测灵芝的基因组DNA，用权利要求3中的D696-F1/R1引物对进行PCR扩增，如果能扩增出一条特异性DNA片段则为灵芝菌株HMGIM-D150696，否则则不是；或用权利要求3中的D696-F2/R2引物对进行PCR扩增，如果能扩增出两条特异性DNA片段为灵芝菌株HMGIM-D150696，否则则不是；或用权利要求3中的D696-YF/YR引物对进行qPCR扩增，如果循环数小于30时可激发荧光为灵芝菌株HMGIM-D150696，否则则不是。

6.根据权利要求5所述的鉴别灵芝菌株HMGIM-D150696的方法，其特征在于，所述的一条特异性DNA片段的大小为250-300bp。

7.根据权利要求5所述的鉴别灵芝菌株HMGIM-D150696的方法，其特征在于，所述的两条特异性DNA片段的大小为100-250bp和300-400bp。

8.一种权利要求1所述的灵芝菌株HMGIM-D150696的栽培方法，其特征在于，包括步骤：灵芝菌株HMGIM-D150696菌丝培养、出芝管理和采收。

9.根据权利要求8所述的栽培方法，其特征在于，具体步骤为：

一、培养基配方

母种培养基：按质量分数计，包括马铃薯20％+葡萄糖2％+蛋白胨1％+琼脂2％+磷酸二氢钾0.3％+硫酸镁0.15％+维生素B1 0.001％；

生产种培养基：按质量分数计，包括98-99％高粱+1-2％碳酸钙，pH自然；

栽培料：按质量分数计，包括50％杂木屑，38％棉籽壳，10％麦麸，2％碳酸钙，含水量60-65％，pH自然；

二、栽培流程

菌丝培养：在无菌操作条件下取HMGIM-D150696保藏种菌块接种于母种培养基，湿度50％-60％，黑暗培养8-12天至菌丝体长满斜面；将母种菌丝体转接至生产种培养基进行扩大培养，黑暗培养至菌丝体长满袋；随后将生产种菌丝体接种于栽培料，黑暗培养，湿度60％-70％，定时换气以保持二氧化碳浓度4000ppm以下，培养18-20天至菌丝长满袋后，同条件培养7-10天进行后熟期培养；

出芝管理：菌丝后熟期满后进行催蕾，打开栽培袋盖子，把栽培袋竖排放置，26～28℃，空气相对湿度90％～95％，散射光光照8h/d；出芝管理后在栽培料开口位置开始形成原基，调整湿度为80～90％，待菌盖开始分化时，每天换新风；子实体边缘生长点消失，开始喷粉前调节空气湿度至80％；

采收：菌盖背面大量弹射孢子时采收子实体。

10.根据权利要求9所述的栽培方法，其特征在于，所述的栽培流程为：

菌丝培养：在无菌操作条件下取HMGIM-D150696保藏种菌块接种于母种培养基，湿度50％-60％，25℃恒温黑暗培养8-12天至菌丝体长满斜面；将母种菌丝体转接至生产种培养基进行扩大培养，25℃恒温黑暗培养至菌丝体长满袋；随后将生产种菌丝体接种于栽培料，25℃恒温黑暗培养，湿度60％-70％，定时换气以保持二氧化碳浓度4000ppm以下，培养18-20天至菌丝长满袋后，同条件培养7-10天进行后熟期培养；

出芝管理：菌丝后熟期满后进行催蕾，打开栽培袋盖子，把栽培袋竖排放置，26～28℃，空气相对湿度保持在90％～95％条件下，散射光光照8h/d，出芝管理6天左右在栽培料开口位置开始形成原基，调整湿度为80～90％，待菌盖开始分化时，每天换新风2次，每次1h，子实体边缘生长点消失，开始喷粉前调节空气湿度至80％；

采收：菌盖背面大量弹射孢子时采收子实体，每袋子实体鲜重为46.83-61.77g，菌盖直径为7.75-11.40cm，菌柄高度为1.32-3.02cm，菌盖厚度为8.90-10.81mm。

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