CN115717150A - 一种穿梭质粒、构建方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及质粒技术领域，尤其涉及一种穿梭质粒、构建方法及应用。该穿梭质粒以pEZ15Asp为基础质粒，对其进行改造，通过对其复制子进行替换后，该穿梭质粒具有如SEQID NO.26～29任一所示的核苷酸序列所示。该穿梭质粒可以在运动发酵单胞菌和大肠杆菌中穿梭，第一复制起始区具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，第二复制起始区具有SEQ IDNO.3～8任一所示的核苷酸序列。其电转入得到的运动发酵单胞菌转化子，在稳定传代30代后生长速率无显著下降，并可与内源性质粒长期兼容，说明穿梭质粒的传代稳定性强，十分适合于构建重组菌株，进行运动发酵单胞菌代谢工程及基因功能的研究和应用。
Description
技术领域
本申请涉及质粒技术领域，尤其涉及一种穿梭质粒、构建方法及应用。
背景技术
运动发酵单胞菌菌株(Z.mobilis subsp.mobilis)CP4和ZM4逐渐被人们认为是乙醇发酵性能最为突出的。ZM4衍生于CP4，1998年，Yablonsky等根据内源质粒的类型，把Z.mobilis分为CP4和ZM4两种菌株。2005年，Seo等首次报道了Z.mobilis subsp.mobilisZM4(ATCC 31821)的基因组序列并对基因组序列进行注释。2009年，Yang等对运动发酵单胞菌菌株ZM4的基因组进行了进一步注释，另外，发现了ZM4有五个天然质粒(pZZM401～pZZM405)并报道了它们的序列与注释。这些质粒均为专门化的载体，不能满足运动发酵单胞菌代谢组学研究发展的需要，亟需发展具有稳定复制以及不易丢失的穿梭质粒，用于在大肠杆菌中扩增和表达基因，并应用在运动发酵单胞菌中进行代谢组学互补等方面的研究。另外，在使用含有某种筛选标记的质粒进行基因编辑后，若需再次对该基因编辑后的菌株中再次转化含有相同筛选标记的质粒继续编辑其它基因，含有相同筛选标记的质粒再次转化的宿主菌后很难进行下一步筛选。
发明内容
有鉴于此，本申请实施例提供了一类穿梭质粒的构建方法，以pEZ15Asp为基础质粒，对其进行改造，通过对其复制子进行替换后，得到了一类可以在运动发酵单胞菌和大肠杆菌中穿梭的质粒。其中一部分质粒电转入得到的运动发酵单胞菌转化子，在稳定传代30代后生长速率无显著下降，并可与内源性质粒长期兼容，说明穿梭质粒的传代稳定性强，十分适合于构建重组菌株，进行运动发酵单胞菌的代谢工程及基因功能的研究和应用。另一部分质粒电转入至运动发酵单胞菌ZM4中后，其得到的菌株同样以包含对照质粒的菌株的生长速率无显著差别，该穿梭质粒在传代9～13代后自行消除，十分适合于构建作为基因编辑质粒应用，比如构建适合于CRISPR/Cas9及内源CRISPR-Cas系统的基因编辑质粒。为此，本申请实施例至少公开了以下技术方案：
第一方面，本申请实施例公开了一种穿梭质粒的构建方法，包括：
获得基础质粒，所述基础质粒具有在大肠杆菌中的第一复制起始区和运动发酵单胞菌中的第三复制起始区；所述第一复制起始区具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述第三复制起始区具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
将第二复制起始区替代所述第三复制区，以得到所述穿梭质粒；所述第二复制起始区具有SEQ ID NO.3～8所示的核苷酸序列。
第二方面，本申请实施例公开了一种穿梭质粒，其具有如SEQ ID NO.24～29任一所示的核苷酸序列，所述穿梭质粒可以在运动发酵单胞菌和大肠杆菌中穿梭，所述穿梭质粒具有在大肠杆菌中的第一复制起始区和在运动发酵单胞菌中的第二复制起始区，所述第一复制起始区具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述第二复制起始区具有SEQ IDNO.3～8任一所示的核苷酸序列。
第三方面，本申请实施例公开了一种穿梭质粒，其具有如SEQ ID NO.24或25所示的核苷酸序列，所述穿梭质粒可以在运动发酵单胞菌和大肠杆菌中穿梭，所述穿梭质粒具有在大肠杆菌中的第一复制起始区和在运动发酵单胞菌中的第二复制起始区，所述第一复制起始区具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述第二复制起始区具有SEQ ID NO.3或4所示的核苷酸序列。
第四方面，本申请实施例公开了一种穿梭质粒，其具有如SEQ ID NO.26～29任一所示的核苷酸序列，所述穿梭质粒可以在运动发酵单胞菌和大肠杆菌中穿梭，所述穿梭质粒具有在大肠杆菌中的第一复制起始区和在运动发酵单胞菌中的第二复制起始区，所述第一复制起始区具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述第二复制起始区具有SEQ IDNO.5～8任一所示的核苷酸序列。
第五方面，本申请实施例公开了第三方面所述的穿梭质粒的应用，所述应用包括如下至少一项：
(I)构建表达异丁醇代谢途径的重组载体及重组微生物；
(II)构建表达PHB途径相关酶的重组载体及重组微生物。
第六方面，本申请实施例公开了第四方面所述的穿梭质粒在运动发酵单胞菌和/或大肠杆菌基因编辑中的应用。
附图说明
图1为本申请实施例提供的基础质粒的结构示意图；其中，P15A是大肠杆菌的第一复制起始区，Zymo-replication是运动发酵单胞菌的第一复制起始区，AddA是壮观霉素抗性。
图2为本申请实施例提供的穿梭质粒pE1的结构示意图；其中，绿色是运动发酵单胞菌的第二复制起始区(如SEQ ID NO.3所示)，AddA是壮观霉素抗性。
图3为本申请实施例提供的穿梭质粒pE2的结构示意图；其中，绿色是运动发酵单胞菌的第二复制起始区(如SEQ ID NO.4所示)，AddA是壮观霉素抗性。
图4为本申请实施例提供的穿梭质粒pE3的结构示意图；其中，绿色是运动发酵单胞菌的第二复制起始区(如SEQ ID NO.5所示)，AddA是壮观霉素抗性。
图5为本申请实施例提供的穿梭质粒pE4的结构示意图；其中，绿色是运动发酵单胞菌的第二复制起始区(如SEQ ID NO.6所示)，AddA是壮观霉素抗性。
图6为本申请实施例提供的穿梭质粒pE5的结构示意图；其中，绿色是运动发酵单胞菌的第二复制起始区(如SEQ ID NO.7所示)，AddA是壮观霉素抗性。
图7为本申请实施例提供的穿梭质粒pE6的结构示意图；其中，绿色是运动发酵单胞菌的第二复制起始区(如SEQ ID NO.8所示)，AddA是壮观霉素抗性。
图8为本申请实施例提供的对ZM4菌液进行PCR扩增得到的第二复制起始区的目的片段的凝胶电泳图。
图9为本申请实施例提高的携带具有Spe抗性基因的穿梭质粒pE1和pE2的ZM4阳性转化子的生长曲线。
图10为本申请实施例提供的携带具有Km抗性基因穿梭质粒pE3和pE4，以及携带具有Cm抗性基因穿梭质粒pE5和pE6的ZM4阳性转化子生长曲线图。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
本申请实施例公开了一种穿梭质粒的构建方法，包括：获得基础质粒，该基础质粒具有在大肠杆菌中的第一复制起始区和运动发酵单胞菌中的第三复制起始区；第一复制起始区具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，第三复制起始区具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；将第二复制起始区替代所述第三复制区，以得到所述穿梭质粒。其中，第二复制起始区具有SEQ ID NO.3～8任一所示的核苷酸序列。
在一些实施例中，“将第二复制起始区替代所述第三复制区，以得到所述穿梭质粒”的步骤包括：
利用第二引物对对运动发酵单胞菌ZM4菌株的菌液进行进行PCR扩增，以得到所述第二复制起始区的目的片段；
利用第三引物对所述基础质粒进行PCR扩增，以得到第三质粒片段；
将所述第二复制起始区的目的片段与所述第三质粒片段通过T5核酸外切酶连接，即得到所述穿梭质粒。
基于上述制备方法，本申请实施例公开了一种穿梭质粒，其具有如SEQ ID NO.24～29任一所示的核苷酸序列，所述穿梭质粒可以在运动发酵单胞菌和大肠杆菌中穿梭，所述穿梭质粒具有在大肠杆菌中的第一复制起始区和在运动发酵单胞菌中的第二复制起始区，所述第一复制起始区具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述第二复制起始区具有SEQ ID NO.3～8任一所示的核苷酸序列。
在一些实施例中，该穿梭质粒具有如SEQ ID NO.24或25所示的核苷酸序列所示。本申请得到的穿梭质粒，可以在运动发酵单胞菌和大肠杆菌中穿梭，而且将其电转入至运动发酵单胞菌ZM4中后得到的菌株具有与包含对照质粒的菌株的生长速率无显著差别，传代30代后，菌株的生长速率无显著下降，说明本申请实施例提高的穿梭质粒的传代稳定性强以及可以与内源性质粒长期兼容，十分适合于构建重组菌株，进行运动发酵单胞菌代谢工程及基因功能研究和应用。例如，利用该穿梭质粒作为载体构建异丁醇代谢途径的重组菌株以合成燃料异乙醇；例如利用该穿梭质粒作为载体构建PHB代谢途径的重组菌株，以生成生物塑料PHB。
在一些实施例中，如图2～7所示，该穿梭质粒具有在大肠杆菌中的第一复制起始区和在运动发酵单胞菌中的第二复制起始区，第一复制起始区具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述第二复制起始区具有SEQ ID NO.3～8任一所示的核苷酸序列。
在一些实施例中，如图2～7所示，该穿梭质粒还具有位于第一复制起始区的复制终端与第二复制起始区的复制终端之间的多克隆位点，多克隆位点用于插入标记基因或表达基因。在一些实施例中，标记基因选自抗性基因或报告基因。在一些实施例中，该穿梭质粒通过其多克隆位点用于插入异丁醇代谢途径相关酶的表达基因，这些酶包括Als、IlvC和IlvD；多克隆位点还可用于插入酶切位点(例如BsaI酶切位点)，还可以用于插入CRISPR表达盒，用于相关基因编辑。
在一些实施例中，该穿梭质粒具有如SEQ ID NO.26～29任一所示的核苷酸序列，所述穿梭质粒可以在运动发酵单胞菌和大肠杆菌中穿梭。而且该穿梭质粒电转入至运动发酵单胞菌ZM4中后，其得到的菌株同样以包含对照质粒的菌株的生长速率无显著差别，该穿梭质粒在传代9～13代后自行消除，十分适合于构建作为基因编辑质粒应用，比如构建适合于CRISPR/Cas9的基因编辑质粒。
在本申请实施例中，所述穿梭质粒具有在大肠杆菌中的第一复制起始区和在运动发酵单胞菌中的第二复制起始区，所述第一复制起始区具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述第二复制起始区具有SEQ ID NO.5～8任一所示的核苷酸序列。
在一些实施方式中，如图1～7所示，该穿梭质粒还具有抗性筛选标记和多克隆位点。抗性筛选标记选自TetR、Spe、Cm和Kana。多克隆位点可以用于插入CRISPR表达盒，用于相关基因编辑。
为此，在一些实施例中，该穿梭质粒还具有位于第一复制起始区的复制终端与第二复制起始区的复制终端之间的多克隆位点。该多克隆位点用于插入标记基因或表达基因。
在一些实施例中，该穿梭质粒通过其多克隆位点用于插入异丁醇代谢途径相关酶的表达基因，这些酶包括Als、IlvC和IlvD；多克隆位点还可用于插入酶切位点(例如BsaI酶切位点)，还可以用于插入CRISPR表达盒，用于相关基因编辑。
在本申请中，该“标记基因”是指其表达可以被选择或富集的任何标记物基因，即当该标记基因在宿主中表达时，可以通过一定方式选择和富集表达该标记物基因的宿主菌株或细菌。可用于本申请的标记物基因包括在表达后可以用于分选或筛选的报告基因，或者可以利用抗生素进行筛选的抗性基因，或者表达后可以被对应抗体识别并通过免疫染色或磁珠吸附进行筛选的蛋白基因。
在本申请中，“抗性基因”选自氨苄青霉素、四环素、氯霉素、链霉素、潮霉素、壮观霉素、卡那霉素、杀稻瘟菌素遗传霉素、潮霉素、霉酚酸、嘌呤霉素、博莱霉素或新霉素的抗性基因中的一种。例如，“抗性基因”为氯霉素乙酰转移酶基因(Cat基因)，如SEQ ID NO.30所示。
在本申请实施例中，“报告基因”选自氯霉素乙酰转移酶基因、β-葡萄糖苷酸酶基因、萤火虫荧光素酶基因、海洋腔肠荧光素酶基因、分泌型碱性磷酸酶基因、人生长激素的编码基因、绿色荧光蛋白的编码基因、蓝色荧光蛋白的编码基因、黄色荧光蛋白的编码基因、橙色荧光蛋白的编码基因、红色荧光蛋白的编码基因、远红色荧光蛋白(Far-RedFluorescent)的编码基因或可切换荧光蛋白的编码基因中的一种。例如，“报告基因”为卡那霉素抗性基因(Km基因)，如SEQ ID NO.31所示。
在下方描述更具体的实施例是用于说明的目的。除非另有规定或从内容明显看出，否则所记载的与一个实施方案有关的任何特征可以与任何其他实施方案来结合使用。本申请设计的实验方法均为常规分子生物学方法，可参见分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)。
1、扩增得到第二复制起始区的目的片段
运动发酵单胞菌ZM4菌株(ATCC31821，购自美国ATCC菌种保藏中心)，将其真空冻干管的菌株活化后的菌液转接至摇瓶中30℃静置培养，显微镜观察期菌体符合ZM4典型形态特征，并且液体生长过程产生气体，生长稳定，待其产生絮凝沉淀后(或者OD600达到1.0以上)，即可收获其液体培养液，采用不同的第二引物对对ZM4菌液进行PCR扩增，以分别得到如SEQ ID NO.3～8所示的第二复制起始区的目的片段。
在一个实施例中，扩增反应体系包括：第二引物对(上下游)各2.4μL、模板1.2μL、PrimeSTAR(用于片段扩增的DNA聚合酶PrimerSTAR Max DNA Polymerase为Takara公司产品)30μL、双蒸水24μL。例如，如图8所示，采用第二引物对(如SEQ ID NO.9～10所示)扩增运动发酵单胞菌ZM4菌株得到如SEQ ID NO.3所示的第二复制起始区的目的片段；采用第二引物对(如SEQ ID NO.11～12所示)扩增得到如SEQ ID NO.4所示的第二复制起始区的目的片段。
2、穿梭质粒的构建
在本申请实施例中所用到的材料包括：基础质粒pEZ15Asp(如SEQ ID NO.33所示，结构如图1所示，第一复制起始区为156-1069bp之间，第三复制起始区位于2142～3015b之间)参照“Metabolic engineering of Zymomonas mobilis for 2,3-butanediolproduction from lignocellulosic biomass sugars[J]Biotechnol Biofuels.2016；9(1):189.Published online 2016 Sep 2.doi:10.1186/s13068-016-0606-y.”获得。为获得不同抗性基因的基础质粒pEZ15Asp，可以参照“质粒pUC19-CM-D的构建及应用[J]安徽农业科学，2010年，公开的方法，第19期”在其中插入不同标记基因。
在一些实施例中，采用不同的第三引物对对基础质粒pEZ15Asp进行PCR扩增，可以得到不同的第三质粒片段。
在一个实施例中，采用如SEQ ID NO.21(上游)所示和如SEQ ID NO.22所示(下游)的第三引物对对基础质粒pEZ15Asp进行PCR扩增，得到的第三质粒片段。采用如SEQ IDNO.9～10所示核苷酸序列的第二引物对对运动发酵单胞菌ZM4菌株的菌液进行进行PCR扩增，以得到如SEQ ID NO.3所示的第二复制起始区的目的片段。将第三质粒片段与如SEQ IDNO.3所示的第二复制起始区的目的片段摩尔浓度比为1:3的比例混合进行酶切连接反应，以得到重组穿梭质粒pE1。
在一个实施例中，采用如SEQ ID NO.23所示(上游)和如SEQ ID NO.22所示(下游)的第三引物对对基础质粒pEZ15Asp进行PCR扩增，得到的第三质粒片段。采用如SEQ IDNO.11～12所示核苷酸序列的第二引物对对运动发酵单胞菌ZM4菌株的菌液进行进行PCR扩增，以得到如SEQ ID NO.4所示的第二复制起始区的目的片段。将第三质粒片段与如SEQ IDNO.4所示的第二复制起始区的目的片段摩尔浓度比为1:3的比例混合进行酶切连接反应，以得到重组穿梭质粒pE2。
在一个实施例中，采用如SEQ ID NO.21所示(上游)和如SEQ ID NO.22所示(下游)的第三引物对对基础质粒pEZ15Asp进行PCR扩增，得到的第三质粒片段。采用如SEQ IDNO.13～14所示核苷酸序列的第二引物对对运动发酵单胞菌ZM4菌株的菌液进行进行PCR扩增，以得到如SEQ ID NO.5所示的第二复制起始区的目的片段。将第三质粒片段与如SEQ IDNO.5所示的第二复制起始区的目的片段摩尔浓度比为1:3的比例混合进行酶切连接反应，以得到重组穿梭质粒pE3。
在一个实施例中，采用如SEQ ID NO.21所示(上游)和如SEQ ID NO.22所示(下游)的第三引物对对基础质粒pEZ15Asp进行PCR扩增，得到的第三质粒片段。采用如SEQ IDNO.15～16所示核苷酸序列的第二引物对对运动发酵单胞菌ZM4菌株的菌液进行进行PCR扩增，以得到如SEQ ID NO.6所示的第二复制起始区的目的片段。将第三质粒片段与如SEQ IDNO.6所示的第二复制起始区的目的片段摩尔浓度比为1:3的比例混合进行酶切连接反应，以得到重组穿梭质粒pE4。
在一个实施例中，采用如SEQ ID NO.23所示(上游)和如SEQ ID NO.22所示(下游)的第三引物对对基础质粒pEZ15Asp进行PCR扩增，得到的第三质粒片段。采用如SEQ IDNO.17～18所示核苷酸序列的第二引物对对运动发酵单胞菌ZM4菌株的菌液进行进行PCR扩增，以得到如SEQ ID NO.7所示的第二复制起始区的目的片段。将第三质粒片段与如SEQ IDNO.7所示的第二复制起始区的目的片段摩尔浓度比为1:3的比例混合进行酶切连接反应，以得到重组穿梭质粒pE5。
在一个实施例中，采用如SEQ ID NO.23所示(上游)和如SEQ ID NO.22所示(下游)的第三引物对对基础质粒pEZ15Asp进行PCR扩增，得到的第三质粒片段。采用如SEQ IDNO.19～20所示核苷酸序列的第二引物对对运动发酵单胞菌ZM4菌株的菌液进行进行PCR扩增，以得到如SEQ ID NO.8所示的第二复制起始区的目的片段。将第三质粒片段与如SEQ IDNO.8所示的第二复制起始区的目的片段摩尔浓度比为1:3的比例混合进行酶切连接反应，以得到重组穿梭质粒pE6。
一个酶切连接反应的实施例中，将第二复制起始区的目的片段与第三质粒片段以摩尔浓度比为3:1的比例混入1.5mL EP管，反应体系包括：目的片段0.12pM、第三质粒片段0.04pM、10×Buffer4(NEB公司)0.5μL、T5核酸外切酶(NEB)0.5μL，补充双蒸水至5μL。于冰上反应5min后，加入E.coli感受态细胞，混匀，静置30min，42℃热激45s，冰上冷却3min，加入LB液体培养基，37℃，250rpm摇菌约1h；LB平板(添加200mg/mL壮观霉素(Spe))上涂布，37℃倒置培养。收获具有Spe抗性的阳性克隆的转化子，挑取菌落，参照上述方法提取其中的穿梭质粒(pE1～pE6)，并进行Sanger测序鉴定，其序列分别如SEQ NO.24～29所示。
3、穿梭质粒在传代稳定性检测
将上述构建的穿梭质粒pE1和pE2与对照质粒pEZ15Asp分别电转到ZM4，涂布在RMG2添加抗生素(添加200mg/mL壮观霉素Spe)的平板上，通过菌落PCR验证得到正确的转化子(pE1-ZM4、pE2-ZM4以及pEZ15Asp-ZM4)，使用Bioscreen C自动生长曲线分析仪对包含穿梭质粒的重组菌株进行了生长测试。结果如图9所示，将具有Spe抗性基因的穿梭质粒pE1和pE2的导入对ZM4中其生长趋势与包含对照质粒的菌株基本一样，生长速率都约在0.255～0.305之间，说明对宿主菌的生长无明显影响。
进一步地，以穿梭质粒pE1和pE2为基本骨架，经过反向PCR扩增，再与扩增的Ptet-opmCherry片段通过T5核酸外切酶DNA组装的方法进行连接，得到了携带荧光报告基因的pE1和pE2。将携带荧光报告基因的pE1和pE2分别电转入ZM中，将得到的阳性转化子在添加有相应抗生素(添加100mg/mL壮观霉素Spe)的新鲜RMG2液体培养基进行孵育，24h后按1:100转移到无抗性的RMG2液体培养基进行培养。每24h进行一次传代培养，分别在第1、10、15、20和30代使用流式细胞仪检测荧光强度通过发光细胞数占细胞总数的比例判断质粒稳定性。结果如表1所示。包含穿梭质粒pE1、pE2以及对照质粒pEZ15Asp的ZM4转化子稳定性较好，可以在无抗性RMG2液体培养基稳定存在30代左右。
表1 荧光比例
另外，如上结果可知，pE1和pE2在分别转入ZM4菌株后得到的阳性转化子，仍然能够稳定传代30代，说明该类穿梭质粒能够与ZM4内源性质粒例如(pZZM401～pZZM405)可以在无抗性的RMG2液体培养基稳定兼容共存30代，这对穿梭质粒在代谢工程中的应用具有重要意义。
由此说明，本申请实施例构建的穿梭质粒pE1和pE2的在运动发酵单胞菌和大肠杆菌中穿梭、稳定传代以及与内源性质粒长期兼容，适合于构建重组菌株，进行运动发酵单胞菌的相关代谢组学的研究和应用。
为此，本申请实施例还公开了所述的穿梭质粒的应用，所述应用包括如下至少一项：
(I)构建表达异丁醇代谢途径的重组载体及重组微生物；
(II)构建表达PHB途径相关酶的重组载体及重组微生物；
在一些实施例中，利用该穿梭质粒构建表达木糖代谢途径相关酶的重组载体，例如，所述异丁醇代谢途径相关酶包括Als、IlvC和Ilvd；将重组载体转入至运动发酵单胞菌中，以获得具有异丁醇代谢途径的重组运动发酵单胞菌，从而能够利用该菌生物合成燃料异乙醇，实现能用再生和环保利用，具有十分重要的应用价值。
将上述构建的穿梭质粒pE3、pE4、pE5和pE6与对照质粒pEZ15Asp分别电转到ZM4，涂布在RMG2添加抗生素(添加300mg/mL卡那霉素Kana或100mg/mL氯霉素Cm)的平板上，通过菌落PCR验证得到正确的转化子(ZM4-pE3、ZM4-pE4、ZM4-pE5、ZM4-pE6)，使用Bioscreen C自动生长曲线分析仪对包含穿梭质粒的重组菌株进行了生长测试。结果如图10所示，穿梭质粒的导入对宿主菌生长无明显影响，其生长趋势与包含对照质粒的菌株基本一样，生长速率都约在0.242～0.301之间。
进一步地，分别以穿梭质粒pE3、pE4、pE5和pE6为基本骨架，经过反向PCR扩增，再与扩增的Ptet-opmCherry片段(SEQ ID NO.32所示)通过T5核酸外切酶DNA组装的方法进行连接，得到了携带荧光报告基因的pE3、pE4、pE5和pE6。将携带荧光报告基因的pE3、pE4、pE5和pE6分别电转入ZM4菌株和大肠杆菌DH5ɑ中，将得到的阳性转化子在添加有抗生素(添加300mg/mL卡那霉素Kana或100mg/mL氯霉素Cm)的新鲜RMG2液体培养基进行孵育，24h后按1:100转移到无抗性的RMG2液体培养基进行培养。每24h进行一次传代培养，分别在第1、10、20和30代使用流式细胞仪检测荧光强度通过发光细胞数占总细胞数的比值判断质粒稳定性。结果如表2所示，包含穿梭质粒pE3、pE4、pE5和pE6的转化子经10代传代后，其细胞荧光百分比仅约为第1代的1.35％和1.95％，并且相较对照质粒pEZ15Asp的荧光百分比显著降低，在第20代时，约为第1代的0.44％和1.06％，说明pE3、pE4、pE5和pE6在10代左右大部分已经丢失，其稳定性较差。
表2 荧光比例
另外，将上述pE3、pE4、pE5和pE6电转到ZM4中，对宿主的生长无影响，并且对其内源性质粒无影响，说明其可以与ZM4菌株内源性质粒兼容，这对穿梭质粒在代谢工程中的应用具有重要意义。
由此说明，本申请实施例构建的穿梭质粒在运动发酵单胞菌和大肠杆菌中穿梭、稳定传代以及与内源性质粒长期兼容，适合于构建重组菌株，进行运动发酵单胞菌的相关基因编辑的研究和应用。
为此，本申请实施例还公开了所述的穿梭质粒的应用，在运动发酵单胞菌基因编辑中的应用，例如，在该穿梭质粒的多克隆位点中插入CRISPR表达盒，用于相关基因编辑，转入宿主筛选阳性克隆后，得到的重组菌株进行多次传代后自行消除，以实现“无痕”基因编辑。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种穿梭质粒的构建方法，包括：
获得基础质粒，所述基础质粒具有在大肠杆菌中的第一复制起始区和运动发酵单胞菌中的第三复制起始区；所述第一复制起始区具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述第三复制起始区具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
将第二复制起始区替代所述第三复制区，以得到所述穿梭质粒；所述第二复制起始区具有SEQ ID NO.3～8所示的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的构建方法，其中，“将第二复制起始区替代所述第三复制区，以得到所述穿梭质粒”的步骤包括：
利用第二引物对对运动发酵单胞菌ZM4菌株的菌液进行进行PCR扩增，以得到所述第二复制起始区的目的片段；
利用第三引物对所述基础质粒进行PCR扩增，以得到第三质粒片段；
将所述第二复制起始区的目的片段与所述第三质粒片段通过T5核酸外切酶连接，即得到所述穿梭质粒。
3.如权利要求2所述的构建方法，其中，当所述第二复制起始区具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，所述第二引物对具有如SEQ ID NO.9～10所示核苷酸序列，所述第三引物对具有如SEQ ID NO.21～22所示核苷酸序列；或者
当所述第二复制起始区具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，所述第二引物对具有如SEQ ID NO.11～12所示核苷酸序列，所述第三引物对具有如SEQ ID NO.22～23所示核苷酸序列；或者
当所述第二复制起始区具有SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，所述第二引物对具有如SEQ ID NO.13～14所示核苷酸序列，所述第三引物对具有如SEQ ID NO.21～22所示核苷酸序列；或者
当所述第二复制起始区具有SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，所述第二引物对具有如SEQ ID NO.15～16所示核苷酸序列，所述第三引物对具有如SEQ ID NO.21～22所示核苷酸序列；或者
当所述第二复制起始区具有SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列，所述第二引物对具有如SEQ ID NO.17～18所示核苷酸序列，所述第三引物对具有如SEQ ID NO.22～23所示核苷酸序列；或者
当所述第二复制起始区具有SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列，所述第二引物对具有如SEQ ID NO.19～20所示核苷酸序列，所述第三引物对具有如SEQ ID NO.22～23所示核苷酸序列。
4.一种穿梭质粒，其具有如SEQ ID NO.24～29任一所示的核苷酸序列，所述穿梭质粒可以在运动发酵单胞菌和大肠杆菌中穿梭，所述穿梭质粒具有在大肠杆菌中的第一复制起始区和在运动发酵单胞菌中的第二复制起始区，所述第一复制起始区具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述第二复制起始区具有SEQ ID NO.3～8任一所示的核苷酸序列。
5.一种穿梭质粒，其具有如SEQ ID NO.24或25所示的核苷酸序列，所述穿梭质粒可以在运动发酵单胞菌和大肠杆菌中穿梭，所述穿梭质粒具有在大肠杆菌中的第一复制起始区和在运动发酵单胞菌中的第二复制起始区，所述第一复制起始区具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述第二复制起始区具有SEQ ID NO.3或4所示的核苷酸序列。
6.一种穿梭质粒，其具有如SEQ ID NO.26～29任一所示的核苷酸序列，所述穿梭质粒可以在运动发酵单胞菌和大肠杆菌中穿梭，所述穿梭质粒具有在大肠杆菌中的第一复制起始区和在运动发酵单胞菌中的第二复制起始区，所述第一复制起始区具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述第二复制起始区具有SEQ ID NO.5～8任一所示的核苷酸序列。
7.如权利要求4～6任一所述的穿梭质粒，所述穿梭质粒还具有位于所述第一复制起始区的复制终端与所述第二复制起始区的复制终端之间的多克隆位点，所述多克隆位点用于插入克隆位点用于插入标记基因或表达基因；
可选地，所述标记基因选自抗性基因或报告基因；
可选地，所述抗性基因选自氨苄青霉素、四环素、氯霉素、链霉素、潮霉素、壮观霉素、卡那霉素、杀稻瘟菌素遗传霉素、潮霉素、霉酚酸、嘌呤霉素、博莱霉素或新霉素的抗性基因中的至少一种；
可选地，所述报告基因选自氯霉素乙酰转移酶基因、β-葡萄糖苷酸酶基因、萤火虫荧光素酶基因、海洋腔肠荧光素酶基因、分泌型碱性磷酸酶基因、人生长激素基因、绿色荧光蛋白基因、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、橙色荧光蛋白、红色荧光蛋白、远红色荧光蛋白或可切换荧光蛋白中的至少一种；
可选地，所述标记基因为卡那霉素抗性基因，如SEQ ID NO.30所示；
可选地，所述标记基因为氯霉素乙酰转移酶基因，如SEQ ID NO.31所示。
8.一种如权利要求5所述的穿梭质粒的应用，所述应用包括如下至少一项：
(I)构建表达异丁醇代谢途径相关酶的重组载体及重组微生物；
(II)构建表达PHB途径相关酶的重组载体及重组微生物；
可选地，所述异丁醇代谢途径相关酶包括Als、IlvC和IlvD；
具体地，(I)项所述的应用包括利用该穿梭质粒构建表达异丁醇代谢途径相关酶的重组载体；以及将所述重组载体转入至运动发酵单胞菌中，以获得具有异丁醇代谢途径的重组运动发酵单胞菌。
9.一种如权利要求6所述的穿梭质粒在运动发酵单胞菌和/或大肠杆菌基因编辑中的应用。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104031932A (zh) * | 2014-06-27 | 2014-09-10 | 四川大学 | 运动发酵单胞菌-大肠杆菌穿梭载体pSUZM系列及其构建方法 |
| WO2021110993A1 (en) * | 2019-12-04 | 2021-06-10 | Synbionik Gmbh | An efficient shuttle vector system for the expression of heterologous and homologous proteins for the genus zymomonas |
| CN114196608A (zh) * | 2021-12-29 | 2022-03-18 | 湖北大学 | 一种生产phb的自絮凝运动发酵单胞菌的构建方法及其应用 |
| CN114196607A (zh) * | 2021-12-29 | 2022-03-18 | 湖北大学 | 一种生产phb的运动发酵单胞菌的构建方法及其应用 |
-
2022
- 2022-08-25 CN CN202211027828.7A patent/CN115717150B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104031932A (zh) * | 2014-06-27 | 2014-09-10 | 四川大学 | 运动发酵单胞菌-大肠杆菌穿梭载体pSUZM系列及其构建方法 |
| WO2021110993A1 (en) * | 2019-12-04 | 2021-06-10 | Synbionik Gmbh | An efficient shuttle vector system for the expression of heterologous and homologous proteins for the genus zymomonas |
| CN114196608A (zh) * | 2021-12-29 | 2022-03-18 | 湖北大学 | 一种生产phb的自絮凝运动发酵单胞菌的构建方法及其应用 |
| CN114196607A (zh) * | 2021-12-29 | 2022-03-18 | 湖北大学 | 一种生产phb的运动发酵单胞菌的构建方法及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| KIM等: "Zymomonas mobilis strain ZM481 plasmid pZM33, complete sequence", pages 1 - 16, Retrieved from the Internet <URL:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/CP083901.1> * |
| YANG等: "Complete genome sequence and the expression pattern of plasmids of the model ethanologen Zymomonas mobilis ZM4 and its xylose-utilizing derivatives 8b and 2032", 《BIOTECHNOL BIOFUELS》, vol. 11, no. 125, pages 1 - 20 * |
| YANG等: "Metabolic engineering of Zymomonas mobilis for 2,3-butanediol production from lignocellulosic biomass sugars", 《BIOTECHNOL BIOFUELS》, vol. 9, no. 1, pages 3 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| CN115717150B (zh) | 2023-08-29 |
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