CN114196607A - 一种生产phb的运动发酵单胞菌的构建方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种生产PHB的运动发酵单胞菌的构建方法及其应用。本发明以运动发酵单胞菌ZM4为出发菌株，首先利用基因工程的手段改造菌株，引入密码子优化后的外源PHB合成的三个必需基因phaA，phaB，phaC，与四环素诱导型启动子(Ptet)一起构成操纵子整合到质粒上，然后以质粒的形式导入运动发酵单胞菌ZM4中，得到具备PHB生产能力的菌株，并测定含量。然后通过增加启动子强度及增加PHB合成基因拷贝数、过表达辅因子供给相关基因、引入外源乙醇利用途径来逐步提高PHB的含量。

Description

一种生产PHB的运动发酵单胞菌的构建方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种生产PHB的运动发酵单胞菌的构建方法及其应用。
背景技术
石油工业生产的塑料具有良好的柔韧性和轻盈等特性，已成为人们生活中不可缺少的商品。然而，石油来源的塑料生物降解性低、回收和分类复杂，存在严重的环境污染，尤其是对海洋生态系统。聚-β-羟丁酸(Poly-β-hydroxybutyric，PHB)是一类由微生物合成的高分子聚酯，具有生物可降解性和生物相容性，因而被认为是环境友好型材料，广泛应用于农业、环保、生物化工、医药、医用材料等领域。
PHB的生物合成主要是通过微生物自身代谢，其中最主要的是微生物发酵法，也是研究最为广泛的方法。但是现阶段，大多数的微生物发酵过程是需氧的，需要耗费大量的能量供氧。运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)作为一种兼性厌氧革兰氏阴性菌，具有许多独特的生理特点和优异的工业生产特性，是目前已知唯一能够在厌氧条件下利用2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸(Entner-Doudoroff，ED)途径的微生物，具有较高的糖吸收率、乙醇收率和乙醇耐受性等优良特性。目前已经在运动发酵单胞菌中实现了乳酸、2-3丁二醇，异丁醇等产品的生产。作为一种兼性厌氧生物，运动发酵单胞菌可以在厌氧条件下发酵，且相较于有氧条件表现更好，从而可以解决微生物发酵过程面临的供氧难题，如搅拌、通气以及空气灭菌等。此外，2006年的研究发现在运动发酵单胞菌异源表达PHB合成基因，能够积累0.7％的PHB，并能在一定程度上加快和促进乙醇的生产。
因此，通过基因工程，代谢工程等手段得到运动发酵单胞菌的PHB生产菌株，并结合过程工程手段如絮凝和发酵条件优化等方法进一步提高PHB产量，使运动发酵单胞菌成为乙醇和PHB生产的高效细胞工厂具有重要意义。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种生产PHB的运动发酵单胞菌的构建方法及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
本发明是这样实现的，一种生产PHB的运动发酵单胞菌的构建方法，包括以下步骤：将序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示的phaC、phaA和phaB，3个外源基因序列按照Ptet-phaC-RBS-phaA-RBS-phaB的顺序串联得到Ptet-phaCAB操纵子，序列如SEQ IDNO.6所示；利用基因编辑手段，将ZM4基因组上的ZMO0038基因用Ptet-phaCAB替换，得到菌株ZMPt。
与实施例1中构建的ZM4Pt相比，phaCAB操纵子位于染色体上比位于质粒中具有更好的生产效果。ZM4Pt的PHB的产量为0.24％DCW，而ZMPt的PHB的产量为2.07％DCW，产量提高了8.6倍。
进一步地，用强启动子Pgap替换Ptet-phaCAB中的Ptet启动子构建质粒pEZ-Pg，将质粒pEZ-Pg转入ZMPt感受态细胞中，得到ZMPtg菌株。
本申请中的实验数据证明，当同时含有2个phaCAB拷贝(一个在基因组上，一个在质粒上)时，PHB的产量大幅度提高，为16.99％DCW。
进一步地，分别将基因ZMO1329和ZMO0367与质粒pEZ-Pg相连构建重组质粒pEZ-PgN1和pEZ-PgN2，然后转入ZMPt感受态细胞，得到菌株ZMPtN1和ZMPtN2。
本申请中分别过表达辅因子供给相关基因Zwf和ppnK，结果证明，过表达Zwf的效果要优于ppnK。
进一步地，将ada、adh2基因构建到穿梭载体pEZ39p中，ada、adh2基因中间用RBS序列atcacagggtctagaaggaggtcgaa连接，得到质粒pE39p-PeEUP，分别将质粒转入ZMPtN1和ZMPtN2中，得到菌株ZMPtN1-EUP和ZMPtN2-EUP。
进一步地，pEZ39P是通过将pEZ15A中的复制子，替换成ZM4中39-032内源质粒中的复制子得到的。
进一步地，将Ptet-phaCAB操纵子与pEZ15A的载体连接，构建重组质粒pEZ-Pt，以pEZ-Pt质粒为模板，Pgap-CAB-F和phaB-R为引物，扩增phaCAB片段，与载体连接，构建质粒pEZ-Pg；
Pgap-CAB-F：CTTAATAAGTTAGGAGAATAAACATGGCCACCGGCAAAG；
phaB-R：GGCCGCTACTAGTTTAACCCATATGCAAGCCACCATTC。
进一步地，ada、adh2基因序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
本发明还提供了如上述的一种生产PHB的运动发酵单胞菌的构建方法在构建能够实现乙醇和PHB的共同生产的工程菌中的应用。
本发明还提供了上述的工程菌在同时生产乙醇和PHB中的应用。
进一步地，利用四环素诱导工程菌生产乙醇和PHB。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本发明构建了生产PHB的运动发酵单胞菌重组菌株，并公开了其构建过程和方法。该菌株有以下的优势：
(1)抗噬菌体污染，运动发酵单胞菌自身有强大的限制修饰系统，较大肠杆菌等常用工程菌株有更强的抗噬菌体能力。
(2)降低生产成本，由于运动发酵单胞菌为兼性厌氧微生物，在发酵过程中不需要额外的溶氧控制设备，可以有效降低生产的成本。
(3)本研究所得的运动发酵单胞菌PHB生产菌株，能够在积累PHB的同时积累乙醇，并且乙醇的积累不受PHB影响。
附图说明
图1是运动发酵单胞菌的基因工程、过程工程及连续循环发酵共产PHB和乙醇的操作流程图；
图2是运动发酵单胞菌PHB生产菌株的菌株构建流程图；
图3是质粒pEZ-Pt结构图；
图4是样品处理方法流程图；
图5是菌株ZM4Pt产量效果图；
图6是菌株ZM4Pg产量效果图；
图7是基因编辑整合原理图；
图8是菌株ZMPt产量效果图；
图9是ZMPtg产量效果图；
图10是质粒pEZ-PgN1，pEZ-PgN2结构图；
图11是菌株ZMPgN1，ZMPgN2产量效果图；
图12是菌株ZMPtN1-EUP和ZMPtN2-EUP产量效果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明披露了一种生产PHB的运动发酵单胞菌的构建方法及其应用。本发明的目的是以运动发酵单胞菌ZM4为出发菌株，通过基因工程的手段对菌株进行改造，引入特定的外源基因，实现PHB在运动发酵单胞菌中的生产，然后通过一系列基因工程和代谢工程改造提高PHB产量，最终实现乙醇和PHB的共同生产。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下：以运动发酵单胞菌ZM4为出发菌株，首先利用基因工程的手段改造菌株，引入密码子优化后的外源PHB合成的三个必需基因phaA，phaB，phaC，与四环素诱导型启动子(Ptet)一起构成操纵子整合到质粒上，然后以质粒的形式导入运动发酵单胞菌ZM4中，得到具备PHB生产能力的菌株，并测定含量。之后，通过增加启动子强度及增加PHB合成基因拷贝数、过表达辅因子供给相关基因、引入外源乙醇利用途径、优化发酵条件来逐步提高PHB的含量。
本发明中运动发酵单胞菌的基因工程、过程工程及连续循环发酵共产PHB和乙醇的操作流程如图1所示，运动发酵单胞菌PHB生产菌株的菌株构建流程如图2所示。
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1运动发酵单胞菌生产PHB菌株的构建
本实施例中首先将来源于真氧产碱杆菌(Ralstonia eutropha)H16的PHB合成酶(PhaC)、3-酮硫代酶(PhaA)、乙酰乙酰辅酶A还原酶(PhaB)三个酶的基因串联得到phaCAB操纵子，整合到质粒pEZ15a中，然后利用四环素诱导型启动子Ptet来控制基因表达量，得到重组质粒pEZ-Pt，将重组质粒转入到运动发酵单胞菌ZM4中，得到具备PHB合成能力的菌株ZM4Pt，发酵后，检测不同四环素诱导下的PHB和乙醇产量。
1、质粒构建
质粒构建以ZM4Pt(在运动发酵单胞菌中转入一个能够生产PHB的质粒)为例进行说明。
phaC(SEQ ID NO.1)，phaA(SEQ ID NO.2)，phaB(SEQ ID NO.3)。
将以上SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示的phaC、phaA和phaB，3个外源基因序列按照Ptet-phaC-RBS-phaA-RBS-phaB的顺序串联得到Ptet-phaCAB操纵子，详细序列如下(序列顺序为5’到3’，第1-624位为Ptet序列，第2395-2418以及第3601-3624位为RBS序列)(SEQID NO.6)。
本发明中，首先在ZM4中建立PHB合成途径，利用诱导型启动子Ptet驱动phaC、phaA、phaB 3个基因串联，得到以上Ptet-phaCAB操纵子，然后构建到质粒pEZ15A中得到质粒pEZ-Pt。构建方法如图3。
以南京金斯瑞公司合成的phaC、phaA、phaB(保菌于通用puc质粒载体)为DNA扩增模板，设计引物扩增得到目的片段(划线部分为同源臂)。
Ptet-F:cggccgcttctagagttaagacccactttcacatttaagttg
Ptet-R:GGgAGATCCtttctcctctttagatc
Ptet-CAB-F:GATCTCCCGGATCCATGGCCACCGGCAAAG
phaC-R:CTTACTTTCTCTAGATTATGGTTAGGCTTTAGCTTTAACATAACGACCAG
phaA-F:CCATAATCTAGAGAAAGTAAGCACATGACCGATGTTGTCATTGTCTCTG
phaA-R:GTGCTTACTTTCTCTAGATTATGGTTATTTGCGTTCAACGGCCAAAG
phaB-F:CTAGAGAAAGTAAGCACATGACCCAACGTATTGCCTATC
phaB-R:GGCCGCTACTAGTTTAACCCATATGCAAGCCACCATTC
利用overlap PCR将Ptet启动子、phaC、phaA、phaB三个DNA片段连接成一个长片段，得到Ptet-phaCAB操纵子。经设计，Ptet启动子的3’端与phaC基因的5’端拥有同源序列；phaC基因的3’端与phaA基因的5’端拥有同源序列；phaA基因的3’端与phaB的5’端拥有同源序列；phaB基因的3’端与pEZ15A载体拥有同源序列。根据overlap PCR利用同源序列两两连接的原理，将Ptet-phaC-phaA-phaB连接在一起(其中phaC与phaA,phaA与phaB之间的RBS序列带到phaC、phaA、phaB基因的同源序列中)。Overlap PCR体系如下：
Figure BDA0003442870030000041
第一步以以上体系进行。PCR条件为98℃预变性3min；98℃变性10s，47℃退火10s，72℃延伸40s，共10个循环。第二步将第一步完成的混合物取出，加上所需引物Ptet-CAB-F和phaB-R各1.5μL进行扩增，PCR条件为98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸40s，共26个循环。PCR完成后进行DNA电泳验证，验证正确后进行DNA回收得到片段phaCAB。
将phaCAB与Ptet启动子利用overlap PCR相连，PCR体系如下。
Figure BDA0003442870030000042
第一步以以上体系进行。PCR条件为98℃预变性3min；98℃变性10s，47℃退火10s，72℃延伸45s，共10个循环。第二步将第一步完成的混合物取出，加上所需引物Ptet-F和phaB-R各1.5μL进行扩增，PCR条件为98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸45s，共26个循环。PCR完成后进行DNA电泳验证，验证正确后进行DNA回收得到Ptet-phaCAB操纵子。与pEZ15A的载体骨架通过吉布森装配的方法转到大肠杆菌DH5α细胞感受态中，PCR验证平板上的阳性克隆，过夜培养后提取其中的质粒(质粒提取按照质粒提取试剂盒标准步骤)。为提高质粒电转化效率，将得到的大肠杆菌DH5α目的菌株的质粒提取后转化到去甲基化大肠杆菌trans110细胞感受态中，PCR验证平板上的阳性克隆，过夜培养后提取其中的质粒。
构建质粒时将获取的Ptet-phaCAB操纵子和载体按照3:1的摩尔比例进行混合，按照下表反应体系配制完成后，在冰上静置5分钟，然后添加化学感受态，进行化学转化。利用壮观霉素抗性(100μg/mL)平板进行筛选，挑取单菌落用pEZ15A载体上的一对引物pEZ15A-F和pEZ5A-R对重组菌株进行菌落PCR检测，PCR扩增程序设置为：98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸80s，共30个循环，条带大小与预期一致的通过测序进行验证。
Figure BDA0003442870030000051
2、将重组质粒构建到目的运动发酵单胞菌中
①目的运动发酵单胞菌菌株感受态的制备
用接种环挑取适量运动发酵单胞菌ZM4甘油菌在RMG5固体培养基(RMG5:50g/L葡萄糖,10g/L酵母提取物，2g/L KH2PO4，3g/L琼脂)平板上划线，30℃倒置培养2～3天活化；挑取活化的单菌落转接至含有10mL左右的RMG5(RMG5:50g/L葡萄糖,10g/L酵母提取物,2g/LKH2PO4)液体培养基中，于30℃静置培养至对数中期用作种子液；转接种子液至含有200mLRMG5液体培养基的250mL蓝盖瓶中，控制初始OD600nm数值在0.025～0.03之间。30℃静置培养至OD＝0.4～0.6；将装有菌液的蓝盖瓶放至冰上冷却30min后，用预冷的50mL离心管于4000rpm，离心10min收集菌体，弃上清；向离心管中加入30mL预冷的无菌水重悬洗涤菌体，混合均匀后，4000rpm离心10min弃上清；向离心管中加入30mL预冷的10％甘油重悬洗涤菌体，混合均匀后，4000rpm离心10min弃上清，并重复该步骤一次；加入1％(体积比)的预冷的10％甘油重悬菌体，缓慢混合均匀后于冰上进行分装，每50μL分装至无菌的1.5mL离心管中，置于液氮中速冻后于-80℃保存。
②将重组质粒转入目的运动发酵单胞菌感受态细胞中
取运动发酵单胞菌ZM4感受态细胞于冰上，待感受态细胞融化后取50μL加入电转杯中，并在电转杯中加入1μg质粒。电转条件为1600V，25μF，200Ω。电转完毕后于RMG5液体培养基中于30℃培养箱复苏。复苏4-6小时的培养物于6000rpm，1min离心，除去部分上清。悬浮菌体取100μL涂布于100μg/mL壮观霉素抗性平板，30℃培养2天。
待有菌落生长出来之后，用pEZ15A载体上的一对引物pEZ15A-F和pEZ5A-R对重组菌株进行菌落PCR检测，菌落PCR的引物序列pEZ15A-F和pEZ5A-R如下：
pEZ15A-F：GGCAAAGCCACCCTATTTTTAG
pEZ5A-R：CACTTCACTGACACCCTCAT
PCR扩增程序设置为：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸(根据片段长度按照10s/kb进行设置)，共30个循环；循环反应结束后72℃保持5min。反应体系：
Figure BDA0003442870030000052
Figure BDA0003442870030000061
将获得的正确阳性克隆在所带抗性液体RMG5培养基中活化后，甘油保菌。
3、菌株发酵测试
将所得到的的目的菌株ZM4Pt在RMG5中进行发酵测试。首先取一定量甘油菌接种到含有1mL RMG5(加有1μL壮观霉素)的冻存管中，于30℃培养箱静置活化至浑浊后，倒入含有适量培养基的容器中作为发酵种子液于30℃培养箱静置培养至对数中后期，接种到RMG5以80％装瓶量于100mL三角瓶的培养基中，以不同四环素浓度(0,0.2,0.8,1.2μg/mL)进行诱导发酵。在OD600nm处控制初始OD为0.1。在发酵过程中，用紫外分光光度计测量OD600nm处的光密度，测定不同时间点的细胞生长，并将不同时间点取得的发酵液收集，后用于HPLC(高效液相色谱仪)中检测葡萄糖和乙醇的含量。采用岛津商贸有限公司Agilent 1100系列高效液相色谱仪(LC-20AD)；检测器为示差折光检测器(RID-10A)；色谱柱为有机酸色谱柱(Bio-Rad Aminex HPX-87H，300mm×7.8mm)；池温度为40℃，柱温箱温度为60℃；流动相为5mM的硫酸，流速为0.5mL/min，仪器运行时初始流速设置为0.2mL/min，待柱压稳定后以0.1mL/min的流速逐渐增加至0.5mL/min；进样量为20μL。
流动相的配置：取1.41mL色谱级浓硫酸至5L的蓝盖瓶中，用超纯水定容至5L后混合均匀，使用0.45μm孔径的水相滤膜进行过滤。将过滤后的流动相分装至1L流动相蓝盖瓶中进行超声脱气20～30min。等恢复至室温后即可使用。
4、PHB样品的处理及测定
①PHB样品的处理
PHB定量是基于用热浓硫酸将PHB聚合物转化为巴豆酸的方法。将发酵终点的培养物用50mL离心管于冷冻离心机在25℃，4000rpm，离心8-10min收集菌体。去掉上清液，将收集完的菌体用纯水洗两次，每次洗菌同样于冷冻离心机在25℃，4000rpm，离心8-10min。将最后得到的去除上清的菌体放于65℃烘箱过夜烘干菌体。得到的干菌体研磨成粉，取20mg粉状菌体倒入25mL玻璃具塞比色管中，加入5mL浓硫酸，置于90℃下加热1h。取出冷却后在室温下，将混合物用5mM 2％硫酸稀释100倍，通过0.22μm过滤器(默克米勒孔，MA，美国)过滤，取400μL到HPLC进样瓶中。样品处理方法示意如图4。
②PHB的测定
PHB不能直接用于HPLC测量，需要将其用热浓硫酸转化为巴豆酸，检测巴豆酸的含量间接得到PHB的产量，由于PHB标准曲线的制作也是同样的处理方法，所以此检测方法能够直接得到PHB的产量。巴豆酸的测试使用aminexHPX-87H离子交换柱(Bio-Rad，CA，USA)进行分离，利用SPD-20A，紫外检测器检测。在25℃下进行，5mM硫酸为流动相，流速为0.6mL/min。每个样品中进行了三次重复分析。
检测不同四环素诱导浓度(0,0.2,0.8,1.2μg/mL)下的PHB和乙醇产量如图5。经测试在四环素1.2μg/mL的浓度下，PHB的产量为0.24％DCW。
实施例2增加启动子强度及增加PHB合成基因拷贝数
1、替换强启动子
1)将pEZ-Pt质粒的诱导型启动子Ptet替换为强启动子Pgap得到质粒pEZ-Pg。将pEZ-Pg质粒转入运动发酵单胞菌ZM4的感受态细胞中，得到菌株ZM4Pg。
Ptet启动子(SEQ ID NO.7)，Pgap启动子(SEQ ID NO.8)。
以下列引物进行DNA扩增：
Pgap-CAB-F：CTTAATAAGTTAGGAGAATAAACATGGCCACCGGCAAAG
phaB-R：GGCCGCTACTAGTTTAACCCATATGCAAGCCACCATTC
用Pgap-CAB-F和phaB-R为引物，以pEZ-Pt质粒为DNA模板进行扩增，得到Pgap启动子与phaCAB拥有同源臂的phaCAB片段。再用该phaCAB片段与Pgap启动子进行overlap PCR连接得到Pgap-phaCAB片段。将Pgap-phaCAB片段与pEZ15A载体骨架(含壮观霉素筛选抗性基因)按照3:1的摩尔比例进行吉布森组装，具体比例参照下表。该体系在冰上静置5分钟，然后添加大肠杆菌DH5α感受态细胞，进行化学转化。利用壮观霉素抗性(100μg/mL)平板进行筛选，挑取单菌落，进行PCR验证，用pEZ15A载体上的一对引物pEZ15A-F和pEZ5A-R对单菌落进行菌落PCR检测。PCR扩增程序设置为：98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸40s，共30个循环，条带大小与预期一致的通过测序进行验证。
Figure BDA0003442870030000071
利用壮观霉素抗性(100μg/mL)平板进行筛选，挑取单菌落，进行PCR验证，用pEZ15A载体上的一对引物pEZ15A-F和pEZ5A-R对单菌落进行菌落PCR检测。菌落PCR的引物序列pEZ15A-F和pEZ5A-R如下：
pEZ15A-F：GGCAAAGCCACCCTATTTTTAG
pEZ5A-R：CACTTCACTGACACCCTCAT
PCR扩增程序设置为：98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸40s，共30个循环，条带大小与预期一致的通过测序进行验证。验证得到正确的转化子命名为pEZ-Pg。
将pEZ-Pg质粒电转入运动发酵单胞菌ZM4的感受态细胞中，待有菌落生长出来之后，用上述pEZ15A载体上的一对引物pEZ15A-F和pEZ5A-R进行菌落PCR检测，PCR扩增程序设置为：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸(根据片段长度按照10s/kb进行设置)，共30个循环；循环反应结束后72℃保持5min。
2)、菌株发酵测试
将所得到的的目的菌株ZM4Pg在RMG5中进行发酵测试。首先取一定量甘油菌接种到含有1mL RMG5(加有1μL壮观霉素)的冻存管中，于30℃培养箱静置活化至浑浊后，倒入含有适量培养基的容器中作为发酵种子液于30℃培养箱静置培养至对数中后期，接种到RMG5以80％装瓶量于100mL三角瓶的培养基中进行发酵。在OD600nm处控制初始OD为0.1。在发酵过程中，用紫外分光光度计测量OD值600nm处的光密度，测定不同时间点的细胞生长，并将不同时间点取得的发酵液收集，后用于HPLC(高效液相色谱仪)中检测葡萄糖和乙醇的含量。采用岛津商贸有限公司Agilent 1100系列高效液相色谱仪(LC-20AD)；检测器为示差折光检测器(RID-10A)；色谱柱为有机酸色谱柱(Bio-Rad Aminex HPX-87H，300mm×7.8mm)；池温度为40℃，柱温箱温度为60℃；流动相为5mM的硫酸，流速为0.5mL/min，仪器运行时初始流速设置为0.2mL/min，待柱压稳定后以0.1mL/min的流速逐渐增加至0.5mL/min；进样量为20μL。
流动相的配置：取1.41mL色谱级浓硫酸至5L的蓝盖瓶中，用超纯水定容至5L后混合均匀，使用0.45μm孔径的水相滤膜进行过滤。将过滤后的流动相分装至1L流动相蓝盖瓶中进行超声脱气20～30min。等恢复至室温后即可使用。
3)、PHB样品的处理及测定
①PHB样品的处理
PHB定量是基于用热浓硫酸将PHB聚合物转化为巴豆酸的方法。将发酵终点的培养物用50mL离心管于冷冻离心机在25℃，4000rpm，离心8-10min收集菌体。去掉上清液，将收集完的菌体用纯水洗两次，每次洗菌同样于冷冻离心机在25℃，4000rpm，离心8-10min。将最后得到的去除上清的菌体放于65℃烘箱过夜烘干菌体。得到的干菌体研磨成粉，取20mg粉状菌体倒入25mL玻璃具塞比色管中，加入5mL浓硫酸，置于90℃下加热1h。取出冷却后在室温下，将混合物用5mM 2％硫酸稀释100倍，通过0.22μm过滤器(默克米勒孔，MA，美国)过滤，取400μL到HPLC进样瓶中。样品处理方法示意如图4。
②PHB的测定
PHB不能直接用于HPLC测量，需要将其用热浓硫酸转化为巴豆酸，检测巴豆酸的含量间接得到PHB的产量，由于PHB标准曲线的制作也是同样的处理方法，所以此检测方法能够直接得到PHB的产量。巴豆酸的测试使用aminexHPX-87H离子交换柱(Bio-Rad，CA，USA)进行分离，利用SPD-20A，紫外检测器检测。在25℃下进行，5mM硫酸为流动相，流速为0.6mL/min。每个样品中进行了三次重复分析。
检测PHB和乙醇产量如图6。
2、将phaCAB片段整合到ZM4基因组
利用运动发酵单胞菌内源Crispr-Cas技术将Ptet-phaCAB操纵子片段整合到运动发酵单胞菌ZM4基因组上ZMO0038基因的位置。整合原理如图7。
编辑质粒所用的扩增引物如下：
0038-gr1-F:gaaagcgtccagcaaaatacgccttctattgatgaa
0038-gr1-R:gaacttcatcaatagaaggcgtattttgctggacgc
0038-up-F:caccagctcaccgtctgctttttgccgacaaagcg
0038-up-R:tcacgcccgacgccagacgggattagaaattttgtcg
0038-up-Ptet-F:ggcgtcgggcgtgattaagacccactttcacatttaagttgtttttctaatc
phaB-down-R:cgtctatctgaatatttaacgattaacccatatgcaagccacc
0038-down-F:tcgttaaatattcagatagacggagataataaacgggagagaggtcg
0038-down-R:gctcgagatctgatatcactcaacagatcaacc
0038-up-Pgap-F:ggcgtcgggcgtgagttcgatcaacaacccgaatcctatc
Crispr-反扩-F:gtgATatCAGATCTcgagctcggtacccgggtttgac
Crispr-反扩-R:gacggtgagctggtgacctgccttatctctttcccc
测-0038-F:tgccagcttctgttggagaaaacagg
测-0038-R:cgcaagccaagctgcgt
菌株的稳定性是工业发酵生产应用的关键，而质粒往往容易从菌株中丢失，因此这里进一步将生产PHB的途径整合在基因组。将操纵子Ptet-phaCAB整合到ZM4菌株染色体ZMO0038位置(经实验室证明该位置的变化对菌株生长没有影响)。
将空载编辑质粒pL2R(该质粒构建参考Zheng et al.,Nucleic Acids Research47：11461-11475)在37℃处进行过夜酶切。酶切体系如下：
Figure BDA0003442870030000091
过夜酶切，将酶切产物进行DNA回收。基因编辑工作所构建的编辑质粒，由一个间隔区间spacer引导Cas蛋白靶向目的基因处进行编辑工作。该间隔区包含一个5‘-CCC-3’PAM位点的整个32bp序列。将间隔区设计为两条正反引物用于退火(0038-gr1-F,0038-gr1-R)，将反应混合物加热到95℃，退火5min，然后逐渐冷却到室温。退火体系如下：
Figure BDA0003442870030000092
退火后的间隔区spacer取2μL，在18℃与线性酶切后的pL2R载体与T4连接酶进行过夜酶连，以插入将替换片段与ZM4基因组连接的donor(供体DNA)片段。酶连体系如下：
Figure BDA0003442870030000093
过夜酶连，将酶连产物进行DNA回收。得到的回收产物转化到大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞中，涂平板于LB加壮观霉素的固体培养基中，隔天挑取单菌落进行菌落PCR验证寻找正确的转化子称之为gRNA。验证引物为(0038-gr1-F,pEZ15A-R)。
Donor的设置由所替换的ZMO0038上下游500bp(分别称之为up stream和downstream端)，序列如下：
0038-up stream：
tcacgcccgacgccagacgggattagaaattttgtcgataaacgcgccgtgacgcaataattcttgtgggctggcctcgtggggtcttggttgtcttttgacctttttattacgaggtagaccggaaaccgtgttcggggcagacaagcgtccatcggatgggccgttattgtcatccaaggccataccgatttgccgtccgcctgtcagttcaacataaagctgtgccagcaattcggcatcgagcaaggcgccatgtttgacgcgatggctgcggtcaataccgtagcgggtacataatgcgtcaagggtatgtttggcaccgggatgtttgccgcgcgcaatcgccaaggtatcgaccattcgggtcatacaaatggtcggaaggccgcatttatccaattcgtaattcaaaaagccgaaatcgaaggccgcattatgggcgaccaaaggcgacaatttgataaaggaaagcagttcttgcgctttgtcggcaaaaag
0038-down stream：
caacagatcaaccggcaatttatccacggcatcaaattcgatcggttctttcaggcggacaaaaaagccggagacttttttcaggctgtcgagcttgccatgtggtatcgcaataccatgaccaaaacctgtcgaaccgagcgtttctctttcatgtaaccgttcggcgataaccttggggttaattagaaattctcgcccagcccattgggcaacctgctggaagagtgtttttttgttagaaggattgaaattcacctcaatcctgtccggcgcgattatatcggccagttcattcatgttttttcgcctttatatgcccacgattgcaaagatcgcagcatcagacattttctgaaagacacagcctttcagaaaataaagtcaaaattctagcaatattccttccggaaacgggggagaggggtcgataattctcttgaaaagagggagcgacctctctcccgtttattatctccgtctatctgaatatttaacga
在其中间插上替换片段Ptet-phaCAB，将三个片段通过overlap PCR连接成donor(up stream-Ptet CAB-down stream)。然后将该donor与gRNA质粒的反向扩增片段(以Crispr-反扩-F，Crispr-反扩-R为引物进行扩增)构建成质粒。构建过程如下；
反向扩增gRNA质粒，体系入下：
Figure BDA0003442870030000101
将得到的gRNA反向扩增产物按试剂盒步骤进行DNA胶回收。
吉布森组装构建质粒：
将donor(up stream-Ptet CAB-down stream)与gRNA质粒的反向扩增片段(含壮观霉素筛选抗性基因)按照3:1的摩尔比例进行吉布森组装，具体比例参照下表。该体系在冰上静置5分钟，然后添加大肠杆菌DH5α感受态细胞，进行化学转化。利用壮观霉素抗性(100μg/mL)平板进行筛选，挑取单菌落，进行PCR验证，用pEZ15A载体上的一对引物pEZ15A-F和pEZ5A-R对单菌落进行菌落PCR检测。PCR扩增程序设置为：98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸20s，共30个循环，条带大小与预期一致的通过测序进行验证。
Figure BDA0003442870030000102
得到所得正确转化子后培养，提取所得编辑质粒。将该编辑质粒转化进ZM4菌株，通过菌落PCR验证寻找到正确的转化子，以ZMO0038的前后500bp外围引物(测-0038-F，测-0038-R)进行菌落PCR，若所得PCR产物通过DNA凝胶电泳验证出大小为Ptet-phaCAB将ZMO0038成功替换的大小，则认为是编辑成功，将PCR原液送给公司测序。若得到已经编辑成功的菌株(Ptet-phaCAB成功替换ZM4基因组上ZMO0038基因)，将该菌株在RMG5培养基中传代至菌株能在RMG5生长但不能在RMG5添加壮观霉素的环境下生长，以丢掉编辑质粒。得到ZMPt菌株后，在100mL三角瓶中进行80％RMG5液体培养基装瓶量的发酵，以0、0.4、0.8、1.2μg/mL四环素浓度与ZM4Pt对照试验，每隔3小时在超净工作台中取出1mL样品收集，测量发酵过程中的乙醇与葡萄糖的量和最后的PHB产量，经测试在四环素1.2μg/mL的浓度下，ZMPt菌株的PHB产量为2.07％DCW。
本实施例中利用运动发酵单胞菌内源CRISPR-Cas技术Ptet驱动的phaCAB片段整合到运动发酵单胞菌ZM4基因组ZMO0038的位点，得到菌株ZMPt，发酵检测PHB和乙醇产量如图8。用同样的方法将Pgap-phaCAB整合到运动发酵单胞菌ZM4基因组ZMO0038基因的位置，得到菌株ZMPg。
3、多拷贝菌株的构建
在菌株ZMPg基础上，转入Pgap驱动的phaCAB质粒pEZ-Pg，得到含有2个phaCAB拷贝的(一个在基因组ZMO0038基因的位置上，一个在质粒上)菌株ZMPgg。
本实施例中将所得强启动子Pgap驱动的phaCAB质粒pEZ-Pg，电转入ZMPt感受态细胞中，得到含有2个phaCAB拷贝的(一个在基因组ZMO0038基因的位置上，一个在质粒上)菌株ZMPtg菌株，经测试，在四环素1.2μg/mL的浓度下，PHB的产量为16.99％DCW。发酵检测PHB和乙醇产量如图9。
实施例3过表达辅因子供给相关基因
由于PHB积累过程中，乙酰乙酰辅酶a还原酶PhaB催化的步骤依赖于NADPH的消耗供能。因此通过过表达运动发酵单胞菌内源的葡萄糖-6磷酸脱氢酶(Zwf，ZMO0367)和NAD+激酶(ppnK，ZMO1329)的基因来增强NADPH供应，帮助提高PHB产量。
本发明先分别构建ZMO1329和ZMO0367与pEZ-Pg质粒进行连接，得到重组质粒pEZ-PgN1(Pgap-ZMO1329-phaCAB)和pEZ-PgN2(Pgap-ZMO0367-phaCAB)，然后转入ZMPt细胞感受态得到菌株ZMPtN1，ZMPtN2，发酵检测PHB和乙醇产量。pEZ-PgN1，pEZ-PgN2质粒构建如图10。
相关引物如下：
ppnK-phaC-F：GTTAAAAAGAGGAGAAAGGATCTCCCATGGCCACCGGCAAAG
ppnK-R：TCCTTTCTCCTCTTTTTAACATAAGCGAAATTGTTCGCG
zwf-F：ATGACAAATACCGTTTCGACGATG
zwf-R：GAGATCCTTTCTCCTCTTTTCAGTCATACCAAGTTACTCCATCAC
zwf-phaC-F：AAAGAGGAGAAAGGATCTCCCATGGCCACCGGCAAAGG
phaB-R：GGCCGCTACTAGTTTAACCCATATGCAAGCCACCATTC
以ppnK-phaC-F和ppnK-R为一对引物，以zwf-F和zwf-R为一对引物，分别用ZM4为模板扩增50μL ppnk和zwf基因片段后进行DNA回收(按试剂盒的方法进行)。然后分别用ppnK-phaC-F和zwf-phaC-F与phaB-R扩增50μL pEZ-Pg质粒上的phaCAB片段，进行DNA回收。PCR体系如下。
Figure BDA0003442870030000111
Figure BDA0003442870030000121
将所得ppnk和zwf片段与phaCAB片段进行overlap PCR连接后进行DNA胶回收得到ppnk-phaCAB，zwf-phaCAB。将ppnk-phaCAB，zwf-phaCAB与反向扩增的pEZ-15A载体连接构建质粒pEZ-PgN1，pEZ-PgN2。将pEZ-PgN1，pEZ-PgN2分别转入ZMPt感受态细胞，得到菌株ZMPtN1，ZMPtN2。
本实施例中先分别构建含有ZMO1329和ZMO0367与Pgap驱动的phaCAB质粒相连的重组质粒pEZ-PgN1和pEZ-PgN2，将phaCAB与pEZ15A载体骨架分别与ZMO1329和ZMO0367基因进行吉布森组装构建质粒。然后转入ZMPt菌株得到菌株ZMPtN1，ZMPtN2，发酵检测PHB和乙醇产量如图11。经测试在四环素1.2μg/mL的浓度下，PHB的产量分别为19.97％DCW，24.22％DCW。
实施例4引入外源乙醇利用途径
外源乙醇利用途径(EUP)是一种由来自酿酒酵母的adh2和ada基因编码的利用乙醇的途径。它可以将1分子乙醇转化为乙酰辅酶A并产生2个NADH，而不消耗ATP来提供乙酰辅酶a依赖的生物化学物质。pEZ39P是将pEZ15A中的复制子，替换成ZM4中39-032内源质粒中的复制子。通过T5外切酶依赖的DNA组装(TEDA)方法，将39-032复制子片段克隆到pEZ15Asp载体得到pEZ39P。39-032复制子序列如下(SEQ ID NO.9)：
pEZ39p质粒的构建如下：
①扩增ZM4菌株内源质粒p39上的39-032复制子片段
以ZM4菌株为DNA扩增模板，体系如下：
Figure BDA0003442870030000122
将所得PCR原液进行DNA溶液回收。
②反向扩增pEZ15A质粒上的载体片段
以pEZ15A质粒为DNA扩增模板，体系如下
Figure BDA0003442870030000123
将所得RCR原液进行DNA胶回收。
③将回收后的39-032复制子片段与pEZ15A质粒上的载体片段通过吉布森组装构建质粒
将39-032复制子片段与pEZ15A质粒上的载体片段(含壮观霉素筛选抗性基因)按照3:1的比例进行吉布森组装，具体比例参照下表。该体系在冰上静置5分钟，然后添加大肠杆菌DH5α感受态细胞，进行化学转化。利用壮观霉素抗性(100μg/mL)平板进行筛选，挑取单菌落，进行PCR验证，用pEZ15A载体上的一对引物39-032-seq-F和pEZ5A-R对单菌落进行菌落PCR检测。PCR扩增程序设置为：98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸12s，共30个循环，条带大小与预期一致的通过测序进行验证。
Figure BDA0003442870030000131
所用的引物序列如下：
39-032-p-spe-F：TTCCGTAGTGAGTACTGAATctatcgaaaggcaaatttctttctcg
39-032-p-spe-R：agaagcggccgcgaattcAGtcagaaccggcgccc
pEZ-dp-反扩-F：CTgaattcgcggccgc
pEZ-反扩-R：ATTCAGTACTCACTACGGAATTGC
39-032-seq-F：cggctctaaccgaccag
本申请中首先将EUP途径的ada-adh2串联基因(以Peno启动子驱动)构建到运动发酵单胞菌质粒pEZ39p中得到质粒pE39p-PeEUP。构建过程如下：
由于构建的EUP途径的质粒需转入带有壮观霉素抗性质粒的菌株中，因此需要把构建好的pEZ39p质粒载体中间的壮观霉素抗性基因换成卡纳霉素抗性基因。质粒pE39p-PeEUP的构建由pEZ39p质粒的反扩载体片段(抗性基因前端，抗性基因后端)、卡纳霉素抗性基因、Peno-ada-adh2操纵子构成。
①pEZ39p质粒的反扩载体片段(抗性基因前端)的扩增：以pEZ39p质粒为DNA扩增模板反向扩增
Figure BDA0003442870030000132
pEZ39p质粒的反扩载体片段(抗性基因后端)的扩增：以pEZ39p质粒为DNA扩增模板反向扩增
Figure BDA0003442870030000141
卡纳霉素抗性基因的扩增：以ZM4菌株为DNA扩增模板
Figure BDA0003442870030000142
所得PCR原液均进行DNA溶液回收。
②将得到的pEZ39p质粒的反扩载体片段(抗性基因前端，抗性基因后端)、卡纳霉素抗性基因三个片段通过overlap PCR连接成一个片段。经设计，pEZ39p质粒的反扩载体片段(抗性基因前端)的3’端与卡纳霉素基因的5’端拥有同源序列；卡纳霉素基因的3’端与pEZ39p质粒的反扩载体片段(抗性基因后端)的5’端拥有同源序列。根据overlap PCR利用同源序列两两连接的原理，将pEZ39p质粒的反扩载体片段(抗性基因前端)-卡纳霉素-pEZ39p质粒的反扩载体片段(抗性基因后端)连接在一起。Overlap PCR体系如下：
Figure BDA0003442870030000143
第一步以以上体系进行。PCR条件为98℃预变性3min；98℃变性10s，47℃退火10s，72℃延伸40s，共10个循环。第二步将第一步完成的混合物取出，加上所需引物39质粒反扩-F和39P反扩后端-R各1.5μL进行扩增，PCR条件为98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸40s，共26个循环。PCR完成后进行DNA电泳验证，验证正确后进行DNA回收得到pEZ39p质粒(带卡纳霉素抗性基因)的反扩载体片段。
③Peno-ada-adh2操纵子的构建
ada-adh2串联基因由ZM4基因组上的Peno启动子驱动，首先需要以ZM4菌株为DNA扩增模板扩增出Peno启动子：
Figure BDA0003442870030000151
所得PCR原液进行DNA溶液回收得到Peno启动子，将Peno启动子与所得ada-adh2串联基因进行overlap PCR连接成Peno-ada-adh2操纵子：
将得到的Peno启动子、ada-adh2串联基因通过overlap PCR连接成一个片段。经设计，Peno启动子的3’端与ada-adh2串联基因的5’端拥有同源序列。根据overlap PCR利用同源序列两两连接的原理，将Peno-ada-adh2连接在一起。Overlap PCR体系如下：
Figure BDA0003442870030000152
第一步以以上体系进行。PCR条件为98℃预变性3min；98℃变性10s，47℃退火10s，72℃延伸20s，共10个循环。第二步将第一步完成的混合物取出，加上所需引物39质粒反扩-F和39P反扩后端-R各1.5μL进行扩增，PCR条件为98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸20s，共26个循环。PCR完成后进行DNA电泳验证，验证正确后进行DNA回收得到Peno-ada-adh2操纵子。
③pE39p-PeEUP质粒的构建
将Peno-ada-adh2操纵子片段与pEZ39p质粒(带卡纳霉素抗性基因)的反扩载体片段按照3:1的摩尔比例进行吉布森组装，具体比例参照下表。该体系在冰上静置5分钟，然后添加大肠杆菌DH5α感受态细胞，进行化学转化。利用卡纳霉素抗性(200μg/mL)平板进行筛选，挑取单菌落，进行PCR验证，用pEZ15A载体上的一对引物测39-F和pEZ5A-R对单菌落进行菌落PCR检测。PCR扩增程序设置为：98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸25s，共30个循环，条带大小与预期一致的通过测序进行验证。
Figure BDA0003442870030000153
Figure BDA0003442870030000161
所用引物如下：
39质粒反扩-F：CGTCCCATagatctcGAGC
39质粒反扩-R：gatgtttaactcctgaattaagccgc
39P反扩后端-F：TGTCTAACAATTCGTTCAAGCCGACGC
39P反扩后端-R：cTCgagAGATCTGatATcactctag
Kana-F：GCTTAATTCAGGAGTTAAACATCatgagccatattcaacgggaaacg
Kana-R：ttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgc
Peno-F：TGTCTATACTCCAGTTACTCAATACGTAACAATAATCAGTTTATCCTAAC
Peno-R：ATCGAAACCTTTCTTAAAATCTTTTAGACGAG
测39-F：ggctctaaagaaaagacagaggc
pEZ5A-R：CACTTCACTGACACCCTCAT
然后将pE39p-PeEUP质粒转入ZMPtN1和ZMPtN2，分别得到菌株ZMPtN1-EUP和ZMPtN2 -EUP。所得菌株在100mL三角瓶中以80％装瓶量，RMG5为培养基，四环素诱导剂浓度为1.2μg/mL,控制初始OD600nm为0.1在30℃，100rpm摇床进行发酵测试。发酵检测PHB和乙醇产量如图12。经测试，在该条件下ZMPtN1-EUP和ZMPtN2-EUP的PHB的产量分别为26.15％DCW，37.68％DCW。
我们将由南京金斯瑞公司合成的adh2和ada基因引入PHB菌株。基因序列如下：
ada(SEQ ID NO.4)，adh2(SEQ ID NO.5)。
将上述ada和adh2基因通过RBS序列(第1381-1406位)连接，得到如下序列片段(SEQ ID NO.10)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖北大学
<120> 一种生产PHB的运动发酵单胞菌的构建方法及其应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1770
<212> DNA
<213> 真养产碱杆菌(Ralstonia eutropha H16)
<400> 1
atggccaccg gcaaaggtgc cgctgcctct acccaggaag gcaaaagcca accttttaaa 60
gtcaccccgg gtccttttga tccggctacc tggttggaat ggtctcgcca gtggcaaggc 120
accgaaggca atggtcatgc tgccgctagc ggcattcctg gtttggatgc tttggccggc 180
gttaaaattg ctccggccca gttgggtgat atccagcaac gttatatgaa agatttctct 240
gccttgtggc aagctatggc cgaaggcaaa gctgaagcca ccggtccttt gcatgatcgt 300
cgctttgctg gtgatgcctg gcgcaccaat ttgccgtatc gttttgccgc tgccttttat 360
ttgttgaatg ctcgcgcctt gaccgaattg gctgatgccg tcgaagctga tgccaaaacc 420
cgtcagcgca ttcgttttgc catttctcaa tgggttgatg ccatgagccc ggctaatttt 480
cttgccacca atcctgaagc ccagcgtttg ttgattgaat ctggtggcga aagcttgcgc 540
gctggcgtcc gtaatatgat ggaagatttg acccgcggta aaatttctca aaccgatgaa 600
agcgcctttg aagttggccg taatgttgcc gtcaccgaag gtgctgttgt cttcgaaaat 660
gaatatttcc agttgttgca atataaaccg ttgaccgata aagtccatgc tcgccctttg 720
ttgatggttc cgccttgtat caataaatat tatatcttgg atttgcagcc tgaatctagc 780
ttggtccgcc atgttgtcga acaaggccat accgtctttt tggtctcttg gcgtaatccg 840
gatgcttcta tggccggtag cacctgggat gattatattg aacatgctgc cattcgcgct 900
attgaagttg cccgtgatat tagcggccag gataaaatca atgttttggg tttctgtgtc 960
ggtggcacca ttgtttctac cgctttggct gtcttggctg ctcgtggtga acatcctgct 1020
gctagcgtta ccttgttgac caccttgttg gattttgccg ataccggcat tttggatgtt 1080
tttgtcgatg aaggtcatgt tcaattgcgt gaagctacct tgggtggtgg tgctggtgct 1140
ccttgcgctt tgttgcgcgg tttggaattg gctaatacct ttagcttttt gcgtccgaat 1200
gatttggtct ggaattatgt tgtcgataat tatttgaaag gtaatacccc ggttcctttt 1260
gatttgttgt tttggaatgg cgatgccacc aatttgccgg gtccttggta ttgttggtat 1320
ttgcgccata cctatttgca gaatgaattg aaagtcccgg gcaaattgac cgtttgcggt 1380
gttcctgtcg atttggcctc tattgatgtc ccgacctata tttatggcag ccgtgaagat 1440
catattgttc cgtggaccgc tgcctatgct tctaccgcct tgttggctaa taaattgcgc 1500
tttgtcttgg gcgccagcgg tcatattgct ggtgttatta atccgcctgc caaaaataaa 1560
cgttctcatt ggaccaatga tgctttgccg gaaagccctc agcaatggtt ggctggcgcc 1620
attgaacatc atggtagctg gtggcctgat tggaccgcct ggttggctgg tcaagctggt 1680
gctaaacgtg ctgctcctgc caattatggc aatgctcgct atcgtgccat tgaaccggct 1740
cctggtcgtt atgttaaagc taaagcctaa 1770
<210> 2
<211> 1182
<212> DNA
<213> 真养产碱杆菌(Ralstonia eutropha H16)
<400> 2
atgaccgatg ttgtcattgt ctctgccgct cgtaccgccg ttggtaaatt tggtggcagc 60
ttggccaaaa ttccggctcc tgaattgggc gccgttgtca ttaaagccgc tttggaacgt 120
gctggtgtta aaccggaaca ggtctctgaa gttattatgg gccaagtctt gaccgctggt 180
agcggtcaga atcctgctcg tcaagccgct attaaagccg gtttgccggc tatggtccct 240
gccatgacca ttaataaagt ttgtggctct ggtttgaaag ccgtcatgtt ggccgctaat 300
gctattatgg ccggcgatgc tgaaattgtt gtcgctggtg gccaggaaaa tatgtctgcc 360
gctccgcatg ttttgcctgg cagccgtgat ggttttcgca tgggcgatgc caaattggtc 420
gataccatga ttgttgatgg tttgtgggat gtttataatc agtatcatat gggcatcacc 480
gctgaaaatg tcgccaaaga atatggtatt acccgcgaag cccaagatga atttgctgtt 540
ggtagccaga ataaagccga agccgctcaa aaagctggca aatttgatga agaaattgtc 600
ccggttttga ttcctcagcg taaaggtgat ccggttgcct ttaaaaccga tgaatttgtc 660
cgccaaggtg ctaccttgga ttctatgagc ggcttgaaac ctgcttttga taaagccggc 720
accgttaccg ccgctaatgc ctctggtttg aatgatggcg ccgctgccgt tgtcgttatg 780
agcgctgcca aagccaaaga attgggtttg accccgttgg ctaccattaa atcttatgct 840
aatgccggcg tcgatcctaa agttatgggc atgggtccgg ttcctgcttc taaacgtgcc 900
ttgagccgcg ctgaatggac cccgcaggat ttggatttga tggaaattaa tgaagccttt 960
gctgcccaag ctttggccgt ccatcagcaa atgggttggg atacctctaa agtcaatgtt 1020
aatggtggcg ctattgccat tggccatcct attggcgcca gcggttgtcg tattttggtt 1080
accttgttgc atgaaatgaa acgtcgcgat gccaaaaaag gcttggctag cttgtgcatt 1140
ggtggcggta tgggtgtcgc tttggccgtt gaacgcaaat aa 1182
<210> 3
<211> 741
<212> DNA
<213> 真养产碱杆菌(Ralstonia eutropha H16)
<400> 3
atgacccaac gtattgccta tgttaccggt ggcatgggtg gcattggcac cgccatttgt 60
cagcgtttgg ctaaagatgg ttttcgcgtt gtcgccggtt gcggcccgaa ttctcctcgt 120
cgcgaaaaat ggttggaaca gcaaaaagct ttgggctttg attttattgc ctctgaaggc 180
aatgttgctg attgggatag caccaaaacc gcctttgata aagttaaatc tgaagtcggc 240
gaagttgatg tcttgatcaa taatgctggt atcacccgcg atgttgtctt tcgtaaaatg 300
acccgcgccg attgggatgc tgtcattgat accaatttga ccagcttgtt caatgttacc 360
aaacaagtca tcgatggcat ggccgatcgt ggttggggcc gcattgttaa tatttctagc 420
gtcaatggtc agaaaggcca atttggtcag accaattatt ctaccgccaa agctggcttg 480
catggtttta ccatggcctt ggctcaagaa gtcgctacca aaggcgttac cgtcaatacc 540
gttagcccgg gttatattgc caccgatatg gtcaaagcta ttcgtcagga tgttttggat 600
aaaattgtcg ccaccattcc ggttaaacgc ttgggcttgc ctgaagaaat tgcctctatt 660
tgtgcttggt tgtctagcga agaatctggc tttagcaccg gtgctgattt tagcttgaat 720
ggtggcttgc atatgggtta a 741
<210> 4
<211> 1380
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 4
atggaacata gcgttattga accgaccgtt ccgatgccga tgccggctat gtttgatgcg 60
ccgtctggta tttttgatag cttggatgat gcggttcagg cggccgttta tgcgcaacaa 120
cagttaaatt ctgttgaatt gcgtcagcag gttattaaag ctattcgtgt tgccggtgaa 180
cgttatgcgc aggttttggc tgaaatggct gttgccgaaa ccggtatggg tcgtgtcgtt 240
gataaatata ttaaaaatgt ttctcaagct cgtcatacgc cgggtattga atgtttgtct 300
gccgaagttt tgaccggtga taatggtttg accttgattg aaaatgctcc ttggggtgtt 360
gttgcctctg ttaccccgtc taccaatccg gctgccaccg ttattaataa tgccatttct 420
atgatcgccg ccggtaattc tgttgttttt gccccgcatc cgtctgccaa aaatgttagc 480
ttgcgtacca tttctctttt gaataaagcc attgttgcga ccggcggtcc ggaaaatttg 540
ttggtttctg tttctgatcc gaatattgaa accgcccaac gtttatttcg ttatccgggt 600
attggcctgt tggttgttac gggtggtgaa gccgttgttg aagctgcccg tcgtcatacc 660
gataaacgtt tgattgccgc cggcgccggt aatcctcctg ttgttgttga tgaaacggcg 720
gatattccga aagccgcccg tgctattgtt aaaggtgcct cttttgataa taatatcatc 780
tgcgccgatg aaaaagtttt gattgttgtt gatagcgttg ccgatgcctt gttggccgaa 840
atgcagcgta atcatgctgt tttgttgacg ccggcccaga ccgaacagtt gttgcctgct 900
ttgttgtctg atattgatga acagggtaaa ggtcgtgtta atcgtgatta tgttggtcgt 960
gatgccacca aattggccga agccattggt ttagaagtta atgaatatac gcgtttgttg 1020
ttggccgaaa ccgatgccag ccatccgttt gctgttaccg aattgatgat gccggttttg 1080
ccggttgttc gtgttaaatc tgttgatgat gccattgcct tggccctgaa attggaaaat 1140
ggttgtcgcc ataccgccgc catgcattct accaatattc gtaatttgaa tcgtatggct 1200
aatgccatta atacctccat ttttgttaaa aatggtccgt gtattgccgg tttgggtttg 1260
ggtggtgaag gttggacctc tatgaccatt tctaccccga ccggtgaagg tgtcacctct 1320
gctcgtacgt ttgttcgttt gcgtcgttgt gttttggttg atatgtttcg tattgcttaa 1380
<210> 5
<211> 1047
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 5
atgagcattc cggaaaccca gaaagcgatt attttttatg aaagcaatgg caaattggaa 60
cataaagata ttccggttcc gaaaccgaaa ccgaatgaat tgttgattaa tgttaaatat 120
tctggtgttt gtcataccga tttgcatgcc tggcatggtg attggccgtt gcctaccaaa 180
ttgcctttag ttggtggtca tgaaggtgcc ggtgttgttg ttggtatggg tgaaaatgtt 240
aaaggttgga aaattggtga ttatgccggt attaaatggt tgaatggttc ttgtatggct 300
tgtgaatatt gtgaattggg taatgaatct aattgcccgc atgccgattt gtctggttat 360
acgcatgatg gttcttttca ggaatatgcc accgctgatg ccgttcaggc tgctcatatt 420
ccgcagggta ccgatttggc cgaagtcgct cctattttgt gtgccggtat tacggtctat 480
aaagccttga aatctgccaa tttgcgtgcc ggtcattggg ccgctatttc tggtgctgcc 540
ggtggtttgg gttctttggc tgttcagtat gctaaagcta tgggttatcg cgttcttggt 600
attgatggtg gtccgggtaa agaagaattg tttacgtctt tgggtggtga agtttttatt 660
gattttacga aagaaaaaga tatcgtttcc gctgttgtta aagccacgaa tggtggtgct 720
catggtatta ttaatgttag cgtttctgaa gccgctattg aagcttctac ccgttattgt 780
cgtgccaatg gtaccgttgt tttggttggt ttgccggctg gtgctaaatg ttcttctgat 840
gtttttaatc atgttgtcaa aagcatctct atcgtcggct cttatgttgg taatcgtgct 900
gatacgcgtg aagccttgga tttttttgct cgtggtttgg ttaaatctcc cattaaagtt 960
gttggtttat cttctttgcc ggaaatttat gaaaaaatgg aaaaaggtca gattgccggt 1020
cgttatgttg ttgatacctc taaataa 1047
<210> 6
<211> 4365
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttaagaccca ctttcacatt taagttgttt ttctaatccg catatgatca attcaaggcc 60
gaataagaag gctggctctg caccttggtg atcaaataat tcgatagctt gtcgtaataa 120
tggcggcata ctatcagtag taggtgtttc cctttcttct ttagcgactt gatgctcttg 180
atcttccaat acgcaaccta aagtaaaatg ccccacagcg ctgagtgcat ataatgcatt 240
ctctagtgaa aaaccttgtt ggcataaaaa ggctaattga ttttcgagag tttcatactg 300
tttttctgta ggccgtgtac ctaaatgtac ttttgctcca tcgcgatgac ttagtaaagc 360
acatctaaaa cttttagcgt tattacgtaa aaaatcttgc cagctttccc cttctaaagg 420
gcaaaagtga gtatggtgcc tatctaacat ctcaatggct aaggcgtcga gcaaagcccg 480
cttatttttt acatgccaat acaatgtagg ctgctctaca cctagcttct gggcgagttt 540
acgggttgtt aaaccttcga ttccgacctc attaagcagc tctaatgcgc tgttaatcac 600
tttactttta tctaatctgg acatatggcc accggcaaag gtgccgctgc ctctacccag 660
gaaggcaaaa gccaaccttt taaagtcacc ccgggtcctt ttgatccggc tacctggttg 720
gaatggtctc gccagtggca aggcaccgaa ggcaatggtc atgctgccgc tagcggcatt 780
cctggtttgg atgctttggc cggcgttaaa attgctccgg cccagttggg tgatatccag 840
caacgttata tgaaagattt ctctgccttg tggcaagcta tggccgaagg caaagctgaa 900
gccaccggtc ctttgcatga tcgtcgcttt gctggtgatg cctggcgcac caatttgccg 960
tatcgttttg ccgctgcctt ttatttgttg aatgctcgcg ccttgaccga attggctgat 1020
gccgtcgaag ctgatgccaa aacccgtcag cgcattcgtt ttgccatttc tcaatgggtt 1080
gatgccatga gcccggctaa ttttcttgcc accaatcctg aagcccagcg tttgttgatt 1140
gaatctggtg gcgaaagctt gcgcgctggc gtccgtaata tgatggaaga tttgacccgc 1200
ggtaaaattt ctcaaaccga tgaaagcgcc tttgaagttg gccgtaatgt tgccgtcacc 1260
gaaggtgctg ttgtcttcga aaatgaatat ttccagttgt tgcaatataa accgttgacc 1320
gataaagtcc atgctcgccc tttgttgatg gttccgcctt gtatcaataa atattatatc 1380
ttggatttgc agcctgaatc tagcttggtc cgccatgttg tcgaacaagg ccataccgtc 1440
tttttggtct cttggcgtaa tccggatgct tctatggccg gtagcacctg ggatgattat 1500
attgaacatg ctgccattcg cgctattgaa gttgcccgtg atattagcgg ccaggataaa 1560
atcaatgttt tgggtttctg tgtcggtggc accattgttt ctaccgcttt ggctgtcttg 1620
gctgctcgtg gtgaacatcc tgctgctagc gttaccttgt tgaccacctt gttggatttt 1680
gccgataccg gcattttgga tgtttttgtc gatgaaggtc atgttcaatt gcgtgaagct 1740
accttgggtg gtggtgctgg tgctccttgc gctttgttgc gcggtttgga attggctaat 1800
acctttagct ttttgcgtcc gaatgatttg gtctggaatt atgttgtcga taattatttg 1860
aaaggtaata ccccggttcc ttttgatttg ttgttttgga atggcgatgc caccaatttg 1920
ccgggtcctt ggtattgttg gtatttgcgc catacctatt tgcagaatga attgaaagtc 1980
ccgggcaaat tgaccgtttg cggtgttcct gtcgatttgg cctctattga tgtcccgacc 2040
tatatttatg gcagccgtga agatcatatt gttccgtgga ccgctgccta tgcttctacc 2100
gccttgttgg ctaataaatt gcgctttgtc ttgggcgcca gcggtcatat tgctggtgtt 2160
attaatccgc ctgccaaaaa taaacgttct cattggacca atgatgcttt gccggaaagc 2220
cctcagcaat ggttggctgg cgccattgaa catcatggta gctggtggcc tgattggacc 2280
gcctggttgg ctggtcaagc tggtgctaaa cgtgctgctc ctgccaatta tggcaatgct 2340
cgctatcgtg ccattgaacc ggctcctggt cgttatgtta aagctaaagc ctaaccataa 2400
tctagagaaa gtaagcacat gaccgatgtt gtcattgtct ctgccgctcg taccgccgtt 2460
ggtaaatttg gtggcagctt ggccaaaatt ccggctcctg aattgggcgc cgttgtcatt 2520
aaagccgctt tggaacgtgc tggtgttaaa ccggaacagg tctctgaagt tattatgggc 2580
caagtcttga ccgctggtag cggtcagaat cctgctcgtc aagccgctat taaagccggt 2640
ttgccggcta tggtccctgc catgaccatt aataaagttt gtggctctgg tttgaaagcc 2700
gtcatgttgg ccgctaatgc tattatggcc ggcgatgctg aaattgttgt cgctggtggc 2760
caggaaaata tgtctgccgc tccgcatgtt ttgcctggca gccgtgatgg ttttcgcatg 2820
ggcgatgcca aattggtcga taccatgatt gttgatggtt tgtgggatgt ttataatcag 2880
tatcatatgg gcatcaccgc tgaaaatgtc gccaaagaat atggtattac ccgcgaagcc 2940
caagatgaat ttgctgttgg tagccagaat aaagccgaag ccgctcaaaa agctggcaaa 3000
tttgatgaag aaattgtccc ggttttgatt cctcagcgta aaggtgatcc ggttgccttt 3060
aaaaccgatg aatttgtccg ccaaggtgct accttggatt ctatgagcgg cttgaaacct 3120
gcttttgata aagccggcac cgttaccgcc gctaatgcct ctggtttgaa tgatggcgcc 3180
gctgccgttg tcgttatgag cgctgccaaa gccaaagaat tgggtttgac cccgttggct 3240
accattaaat cttatgctaa tgccggcgtc gatcctaaag ttatgggcat gggtccggtt 3300
cctgcttcta aacgtgcctt gagccgcgct gaatggaccc cgcaggattt ggatttgatg 3360
gaaattaatg aagcctttgc tgcccaagct ttggccgtcc atcagcaaat gggttgggat 3420
acctctaaag tcaatgttaa tggtggcgct attgccattg gccatcctat tggcgccagc 3480
ggttgtcgta ttttggttac cttgttgcat gaaatgaaac gtcgcgatgc caaaaaaggc 3540
ttggctagct tgtgcattgg tggcggtatg ggtgtcgctt tggccgttga acgcaaataa 3600
ccataatcta gagaaagtaa gcacatgacc caacgtattg cctatgttac cggtggcatg 3660
ggtggcattg gcaccgccat ttgtcagcgt ttggctaaag atggttttcg cgttgtcgcc 3720
ggttgcggcc cgaattctcc tcgtcgcgaa aaatggttgg aacagcaaaa agctttgggc 3780
tttgatttta ttgcctctga aggcaatgtt gctgattggg atagcaccaa aaccgccttt 3840
gataaagtta aatctgaagt cggcgaagtt gatgtcttga tcaataatgc tggtatcacc 3900
cgcgatgttg tctttcgtaa aatgacccgc gccgattggg atgctgtcat tgataccaat 3960
ttgaccagct tgttcaatgt taccaaacaa gtcatcgatg gcatggccga tcgtggttgg 4020
ggccgcattg ttaatatttc tagcgtcaat ggtcagaaag gccaatttgg tcagaccaat 4080
tattctaccg ccaaagctgg cttgcatggt tttaccatgg ccttggctca agaagtcgct 4140
accaaaggcg ttaccgtcaa taccgttagc ccgggttata ttgccaccga tatggtcaaa 4200
gctattcgtc aggatgtttt ggataaaatt gtcgccacca ttccggttaa acgcttgggc 4260
ttgcctgaag aaattgcctc tatttgtgct tggttgtcta gcgaagaatc tggctttagc 4320
accggtgctg attttagctt gaatggtggc ttgcatatgg gttaa 4365
<210> 7
<211> 727
<212> DNA
<213> 启动子(Ptet)
<400> 7
ttaagaccca ctttcacatt taagttgttt ttctaatccg catatgatca attcaaggcc 60
gaataagaag gctggctctg caccttggtg atcaaataat tcgatagctt gtcgtaataa 120
tggcggcata ctatcagtag taggtgtttc cctttcttct ttagcgactt gatgctcttg 180
atcttccaat acgcaaccta aagtaaaatg ccccacagcg ctgagtgcat ataatgcatt 240
ctctagtgaa aaaccttgtt ggcataaaaa ggctaattga ttttcgagag tttcatactg 300
tttttctgta ggccgtgtac ctaaatgtac ttttgctcca tcgcgatgac ttagtaaagc 360
acatctaaaa cttttagcgt tattacgtaa aaaatcttgc cagctttccc cttctaaagg 420
gcaaaagtga gtatggtgcc tatctaacat ctcaatggct aaggcgtcga gcaaagcccg 480
cttatttttt acatgccaat acaatgtagg ctgctctaca cctagcttct gggcgagttt 540
acgggttgtt aaaccttcga ttccgacctc attaagcagc tctaatgcgc tgttaatcac 600
tttactttta tctaatctgg acatcattaa ttcctaattt ttgttgacac tctatcgttg 660
atagagttat tttaccactc cctatcagtg atagagaaaa gtattcaaat gatctaaaga 720
ggagaaa 727
<210> 8
<211> 305
<212> DNA
<213> 启动子(Pgap)
<400> 8
gttcgatcaa caacccgaat cctatcgtaa tgatgttttg cccgatcagc ctcaatcgac 60
aattttacgc gtttcgatcg aagcagggac gacaattggc tgggaacggt atactggaat 120
aaatggtctt cgttatggta ttgatgtttt tggtgcatcg gccccggcga atgatctata 180
tgctcatttc ggcttgaccg cagtcggcat cacgaacaag gtgttggccg cgatcgccgg 240
taagtcggca cgttaaaaaa tagctatgga atatagtagc tacttaataa gttaggagaa 300
taaac 305
<210> 9
<211> 1434
<212> DNA
<213> 复制子(pEZ15A)
<400> 9
ctatcgaaag gcaaatttct ttctcgccga gcctgtgagc gaagcgagca gcgccgagag 60
attaacgggc ggtgggcttt gagaaggatc gctatcaggc tttcgattat aaatagcgtc 120
tacactgtct gcggcaggag cagtgcagtc cttatcttct tctttggttt ttagttttgt 180
atggtcgcta ttagataaat aagtataaca ggatagagta taagaattga actcgcgttg 240
attgtccgag atttggggct tttttgaggt atcctccttg gaggttttag aagatatttt 300
aacctcttcc tgatcagtct gtgctgcctt cttagcctga gcttcttgtt cccgttgttc 360
cgcccgctcg atagatttgg cgagctgtat gagcgaatcc gttagctctg ttggttcttt 420
attgtccgat atcgctttga cgaaatcttc gggaggcaag ctttcaacga tagccttggt 480
ttcggctttg tccgcctctt gggcgtggtc aatatcgtca ggaataggcg cattcctccg 540
gcgcatgacg cgctcgaaaa cctgtctggc caactctggc caatccttgg gagacaagaa 600
gccgtaggcg ttactggtct gcttacggcg ggggcctttg ccatccgccg tgatcttgat 660
tgatcggcgt atccagcgga tgaagcctaa atcctgtaat tgccgcagta atttgacgac 720
cgtcgcacgg gcatagccga cacgatcgca tattgtgtcg agggtcggct ctaaccgacc 780
agttttaaag tcgaccatcc gaaacagcat ctttagaagg cgaacggcct tatcgcttaa 840
gcccttggtt ttgatcgaat attgatcgac cgcttccaga taggcaccga tctcttgcgg 900
attgaccggc ttccagaccg acttctcgcg ttcgccaacc tcataagaat cccgatgcac 960
aggatcagga gtttgacggc gggttttata gcgaatggct cgttcgagag ggtctctacg 1020
tctcgcaata gctgttttgc gagcaatatc tgcagcggtt tcaggatcac atccgctaga 1080
taccatctga tcaaaatatt ctatctcgtc gaaatctgat gcggaggctg taacctcact 1140
attggtattt gaggccggaa tttcgggatg agcgctattg gccaaggaca ttgatttaga 1200
gaatgcacgg tctattttat gctgttctgc ggctcgatct gccataatct ttgcgctatc 1260
atatggcata cccgtttcaa ccaacatggc tcgataagtg ccacgcttga aacggcctag 1320
cctgtcgata aaaggactgg ttacgggcgt cgtttgttca aaagacgcag agacaggctc 1380
taaagaaaag acagaggcat ccgagagtgt cgctgaagag gaagaggcag tcat 1434
<210> 10
<211> 2453
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atggaacata gcgttattga accgaccgtt ccgatgccga tgccggctat gtttgatgcg 60
ccgtctggta tttttgatag cttggatgat gcggttcagg cggccgttta tgcgcaacaa 120
cagttaaatt ctgttgaatt gcgtcagcag gttattaaag ctattcgtgt tgccggtgaa 180
cgttatgcgc aggttttggc tgaaatggct gttgccgaaa ccggtatggg tcgtgtcgtt 240
gataaatata ttaaaaatgt ttctcaagct cgtcatacgc cgggtattga atgtttgtct 300
gccgaagttt tgaccggtga taatggtttg accttgattg aaaatgctcc ttggggtgtt 360
gttgcctctg ttaccccgtc taccaatccg gctgccaccg ttattaataa tgccatttct 420
atgatcgccg ccggtaattc tgttgttttt gccccgcatc cgtctgccaa aaatgttagc 480
ttgcgtacca tttctctttt gaataaagcc attgttgcga ccggcggtcc ggaaaatttg 540
ttggtttctg tttctgatcc gaatattgaa accgcccaac gtttatttcg ttatccgggt 600
attggcctgt tggttgttac gggtggtgaa gccgttgttg aagctgcccg tcgtcatacc 660
gataaacgtt tgattgccgc cggcgccggt aatcctcctg ttgttgttga tgaaacggcg 720
gatattccga aagccgcccg tgctattgtt aaaggtgcct cttttgataa taatatcatc 780
tgcgccgatg aaaaagtttt gattgttgtt gatagcgttg ccgatgcctt gttggccgaa 840
atgcagcgta atcatgctgt tttgttgacg ccggcccaga ccgaacagtt gttgcctgct 900
ttgttgtctg atattgatga acagggtaaa ggtcgtgtta atcgtgatta tgttggtcgt 960
gatgccacca aattggccga agccattggt ttagaagtta atgaatatac gcgtttgttg 1020
ttggccgaaa ccgatgccag ccatccgttt gctgttaccg aattgatgat gccggttttg 1080
ccggttgttc gtgttaaatc tgttgatgat gccattgcct tggccctgaa attggaaaat 1140
ggttgtcgcc ataccgccgc catgcattct accaatattc gtaatttgaa tcgtatggct 1200
aatgccatta atacctccat ttttgttaaa aatggtccgt gtattgccgg tttgggtttg 1260
ggtggtgaag gttggacctc tatgaccatt tctaccccga ccggtgaagg tgtcacctct 1320
gctcgtacgt ttgttcgttt gcgtcgttgt gttttggttg atatgtttcg tattgcttaa 1380
atcacagggt ctagaaggag gtcgaaatga gcattccgga aacccagaaa gcgattattt 1440
tttatgaaag caatggcaaa ttggaacata aagatattcc ggttccgaaa ccgaaaccga 1500
atgaattgtt gattaatgtt aaatattctg gtgtttgtca taccgatttg catgcctggc 1560
atggtgattg gccgttgcct accaaattgc ctttagttgg tggtcatgaa ggtgccggtg 1620
ttgttgttgg tatgggtgaa aatgttaaag gttggaaaat tggtgattat gccggtatta 1680
aatggttgaa tggttcttgt atggcttgtg aatattgtga attgggtaat gaatctaatt 1740
gcccgcatgc cgatttgtct ggttatacgc atgatggttc ttttcaggaa tatgccaccg 1800
ctgatgccgt tcaggctgct catattccgc agggtaccga tttggccgaa gtcgctccta 1860
ttttgtgtgc cggtattacg gtctataaag ccttgaaatc tgccaatttg cgtgccggtc 1920
attgggccgc tatttctggt gctgccggtg gtttgggttc tttggctgtt cagtatgcta 1980
aagctatggg ttatcgcgtt cttggtattg atggtggtcc gggtaaagaa gaattgttta 2040
cgtctttggg tggtgaagtt tttattgatt ttacgaaaga aaaagatatc gtttccgctg 2100
ttgttaaagc cacgaatggt ggtgctcatg gtattattaa tgttagcgtt tctgaagccg 2160
ctattgaagc ttctacccgt tattgtcgtg ccaatggtac cgttgttttg gttggtttgc 2220
cggctggtgc taaatgttct tctgatgttt ttaatcatgt tgtcaaaagc atctctatcg 2280
tcggctctta tgttggtaat cgtgctgata cgcgtgaagc cttggatttt tttgctcgtg 2340
gtttggttaa atctcccatt aaagttgttg gtttatcttc tttgccggaa atttatgaaa 2400
aaatggaaaa aggtcagatt gccggtcgtt atgttgttga tacctctaaa taa 2453

Claims (10)

1.一种生产PHB的运动发酵单胞菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示的phaC、phaA和phaB，3个外源基因序列按照Ptet-phaC-RBS-phaA-RBS-phaB的顺序串联得到Ptet-phaCAB操纵子，序列如SEQ ID NO.6所示；利用基因编辑手段，将ZM4基因组上的ZMO0038基因用Ptet-phaCAB替换，得到菌株ZMPt。
2.根据权利要求1所述的一种生产PHB的运动发酵单胞菌的构建方法，其特征在于：用强启动子Pgap替换Ptet-phaCAB中的Ptet启动子构建质粒pEZ-Pg，将质粒pEZ-Pg转入ZMPt感受态细胞中，得到ZMPtg菌株。
3.根据权利要求2所述的一种生产PHB的运动发酵单胞菌的构建方法，其特征在于：分别将基因ZMO1329和ZMO0367与质粒pEZ-Pg相连构建重组质粒pEZ-PgN1和pEZ-PgN2，然后转入ZMPt感受态细胞，得到菌株ZMPtN1和ZMPtN2。
4.根据权利要求3所述的一种生产PHB的运动发酵单胞菌的构建方法，其特征在于：通过将pEZ15A中的复制子，替换成ZM4中39-032内源质粒中的复制子得到穿梭载体pEZ39p；39-032内源质粒中的复制子序列如SEQ ID NO.9所示。
5.根据权利要求4所述的一种生产PHB的运动发酵单胞菌的构建方法，其特征在于：将ada、adh2基因构建到穿梭载体pEZ39p中，ada、adh2基因中间用RBS序列atcacagggtctagaaggaggtcgaa连接，得到质粒pE39p-PeEUP，分别将质粒转入ZMPtN1和ZMPtN2中，得到菌株ZMPtN1-EUP和ZMPtN2-EUP。
6.根据权利要求2所述的一种生产PHB的运动发酵单胞菌的构建方法，其特征在于：将Ptet-phaCAB操纵子与pEZ15A的载体连接，构建重组质粒pEZ-Pt，以pEZ-Pt质粒为模板，Pgap-CAB-F和phaB-R为引物，扩增phaCAB片段，与载体连接，构建质粒pEZ-Pg；
Pgap-CAB-F：CTTAATAAGTTAGGAGAATAAACATGGCCACCGGCAAAG；
phaB-R：GGCCGCTACTAGTTTAACCCATATGCAAGCCACCATTC。
7.根据权利要求4所述的一种生产PHB的运动发酵单胞菌的构建方法，其特征在于：ada、adh2基因序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
8.如权利要求1-7任一所述的一种生产PHB的运动发酵单胞菌的构建方法在构建能够实现乙醇和PHB的共同生产的工程菌中的应用。
9.利用权利要求1-7任一所述的方法构建的工程菌在同时生产乙醇和PHB中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：利用四环素诱导工程菌生产乙醇和PHB。
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