CN115698316A - 脂蛋白胆固醇的定量方法及试剂盒 - Google Patents

脂蛋白胆固醇的定量方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种不进行检体的预处理操作而使用自动分析装置通过两个工序定量脂蛋白中的胆固醇的方法及用于该方法的定量试剂盒、以及制备方法，所述方法抑制保存时试剂自然显色。一种被检体样品中的脂蛋白胆固醇的定量试剂盒，其特征在于，用于通过两个工序定量脂蛋白中的胆固醇的方法，包含：(1)第一试剂组合物，具有胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶，用于将测定对象以外的脂蛋白中的胆固醇导向反应体系外；和(2)第二试剂组合物，用于定量待测脂蛋白中的胆固醇，第一试剂组合物及第二试剂组合物的任意一者至少包含偶联剂、铁络合物、过氧化物酶、过氧化氢酶、氢供体及表面活性剂，偶联剂和氢供体不包含在同一试剂组合物中，在第一试剂组合物及第二试剂组合物的任一试剂组合物中，同一试剂组合物中不共存偶联剂、铁络合物及过氧化物酶。

Description

脂蛋白胆固醇的定量方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及一种脂蛋白中的胆固醇的测定方法及试剂。
背景技术
胆固醇是细胞的主要组成成分之一，过剩的胆固醇会在血管的内皮细胞下被巨噬细胞吸收，形成泡沫细胞，进而呈现动脉硬化的初始病变，因此胆固醇是临床上重要的成分。胆固醇以脂蛋白的形式在血液中运输，脂蛋白存在具有不同功能的VLDL、HDL、LDL等。另外，各种脂蛋白进一步分类为亚组分。作为脂蛋白亚组分，HDL分类为粒子尺寸较小的高密度HDL3和粒子尺寸较大的低密度HDL2。另外，HDL能够根据载脂蛋白E(apoE)的含有率差异分为含apoE HDL(apoE containing HDL)和apoE不足HDL(apoE deficient HDL)。VLDL中存在相对于通常的尺寸被脂蛋白脂肪酶分解而变小的残粒。
包含这些亚组分在内的脂蛋白中的胆固醇能够使用通用的自动分析装置来测定。
报道有脂蛋白中的胆固醇的测定技术(参见专利文献1～5)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：专利第3164829号公报
专利文献2：专利第3058602号公报
专利文献3：专利第5706418号公报
专利文献4：专利第5706418号公报
专利文献5：专利第6054051号公报
发明内容
作为包含脂蛋白亚组分在内的脂蛋白中的胆固醇的测定试剂盒，通常具有包括第一工序中使用的第一试剂和第二工序中使用的第二试剂的测定试剂盒，使测定所需的成分分为第一试剂组合物和第二试剂组合物存在。
然而，由于用于定量这些脂蛋白中的胆固醇的测定试剂盒中所含的试剂为液状，因此存在其随着时间经过会自然变为黄色的问题，因此，试剂的存储稳定性上存在问题。
本发明的目的在于提供一种无需进行检体的预处理操作而使用自动分析装置通过两个工序定量脂蛋白中的胆固醇的方法及用于该方法的定量试剂盒，所述方法抑制保存时试剂的自然显色。
本发明人等经过潜心研究，结果发现，通过控制第一工序中使用的第一试剂组合物及第二工序中使用的第二试剂组合物中所含的酶、氢供体、偶联剂、铁络合物的各种成分的组合，特别是能够抑制试剂中的自然显色，从而改善试剂稳定性。
即，本发明人等发现，通过在用于消除或保护测定对象以外的脂蛋白中的胆固醇的第一试剂组合物及用于定量待测脂蛋白中的胆固醇的第二试剂组合物中，使所述成分分别存在于两种试剂组合物中，同时使偶联剂、铁络合物、过氧化物酶不共存于同一试剂组合物中，特别是使偶联剂和铁络合物不共存于同一试剂组合物中，能够抑制试剂的自然显色，从而完成了本发明。
即，本发明如下所述。
[1]一种被检体样品中的脂蛋白胆固醇的定量试剂盒，用于通过两个工序定量脂蛋白中的胆固醇的方法，包含：
(1)第一试剂组合物，具有胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶，用于将测定对象以外的脂蛋白中的胆固醇引导至反应体系外；和
(2)第二试剂组合物，用于定量待测脂蛋白中的胆固醇，其特征在于，
第一试剂组合物及第二试剂组合物的任意一者至少包含偶联剂、铁络合物、过氧化物酶、氢供体及表面活性剂，偶联剂和氢供体不包含在同一试剂组合物中，在第一试剂组合物及第二试剂组合物的任一试剂组合物中，同一试剂组合物中不共存偶联剂、铁络合物及过氧化物酶。
[2]一种被检体样品中的脂蛋白胆固醇的定量试剂盒，用于通过两个工序定量脂蛋白中的胆固醇的方法，包含：
(1)第一试剂组合物，具有胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶，用于将测定对象以外的脂蛋白中的胆固醇导向反应体系外；和
(2)第二试剂组合物，用于定量脂蛋白中的胆固醇，其特征在于，
第一试剂组合物及第二试剂组合物的任意一者至少包含偶联剂、铁络合物、过氧化物酶、氢供体及表面活性剂，偶联剂和氢供体不包含在同一试剂组合物中，在第一试剂组合物及第二试剂组合物的任一试剂组合物中，同一试剂组合物中不共存偶联剂及铁络合物。
[3]根据[1]或[2]的脂蛋白胆固醇的定量试剂盒，其特征在于，
第一试剂组合物包含过氧化氢酶及偶联剂，第二试剂组合物包含氢供体、铁络合物及过氧化物酶。
[4]根据[1]或[2]的脂蛋白胆固醇的定量试剂盒，其特征在于，
第一试剂组合物包含过氧化物酶及偶联剂，第二试剂组合物包含氢供体及铁络合物。
[5]根据[1]的脂蛋白胆固醇的定量试剂盒，其特征在于，
第一试剂组合物包含过氧化氢酶、偶联剂及铁络合物，第二试剂组合物包含氢供体及过氧化物酶。
[6]根据[1]的脂蛋白胆固醇的定量试剂盒，其特征在于，第一试剂组合物包含过氧化物酶及氢供体，第二试剂组合物包含偶联剂及铁络合物。
[7]根据[1]或[2]的脂蛋白胆固醇的定量试剂盒，其特征在于，
第一试剂组合物包含过氧化氢酶、氢供体及铁络合物，第二试剂组合物包含过氧化物酶及偶联剂。
[8]根据[1]或[2]的脂蛋白胆固醇的定量试剂盒，其特征在于，
第一试剂组合物包含过氧化物酶、氢供体及铁络合物，第二试剂组合物包含偶联剂。
[9]根据[4]、[6]及[8]中任一项的脂蛋白胆固醇的定量试剂盒，其特征在于，
第一试剂组合物进一步包含过氧化氢酶。
[10]根据[1]～[9]中任一项的脂蛋白胆固醇的定量试剂盒，其中，
第一试剂组合物进一步包含作用于脂蛋白以外的脂蛋白的表面活性剂，第二试剂组合物进一步包含至少作用于脂蛋白的表面活性剂。
[11]根据[1]～[10]中任一项的脂蛋白胆固醇的定量试剂盒，其中，待测的所述脂蛋白胆固醇为LDL胆固醇、HDL胆固醇、HDL3胆固醇、残粒胆固醇(remnant cholesterol)或含apoE HDL-胆固醇。
[12]根据[10]或[11]的脂蛋白胆固醇的定量试剂盒，其特征在于，
第一试剂组合物中所含的表面活性剂包含聚氧乙烯多环苯醚衍生物或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物。
[13]根据[12]的脂蛋白胆固醇的定量试剂盒，其中，
聚氧乙烯多环苯醚衍生物包含聚氧乙烯苄基苯醚衍生物及/或聚氧乙烯苯乙烯化苯醚衍生物。
[14]一种通过两个工序定量被检体样品中的脂蛋白胆固醇的方法，包括：
(1)第一工序，具有胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶，将测定对象以外的脂蛋白中的胆固醇导向反应体系外；和
(2)第二工序，定量所述第一工序中残存的待测脂蛋白中的胆固醇，其特征在于，
(1)的工序或(2)的工序中的任意一者中至少使用偶联剂、铁络合物、过氧化物酶、氢供体及表面活性剂，偶联剂和氢供体不用于同一工序，
(1)或(2)中的任一工序中，不同时使用偶联剂、铁络合物及过氧化物酶。
[15]一种通过两个工序定量被检体样品中的脂蛋白胆固醇的方法，包括：
(1)第一工序，在胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶的存在下，将测定对象以外的脂蛋白中的胆固醇导向反应体系外；和
(2)第二工序，定量所述第一工序中残存的待测脂蛋白中的胆固醇，其特征在于，
(1)或(2)中的任一工序中不同时使用偶联剂及铁络合物。
[16]根据[14]或[15]的脂蛋白胆固醇定量方法，其特征在于，第一工序中使用过氧化氢酶及偶联剂，第二工序中使用氢供体、铁络合物及过氧化物酶。
[17]根据[14]或[15]的脂蛋白胆固醇定量方法，其特征在于，第一工序中使用过氧化物酶及偶联剂，第二工序中使用氢供体及铁络合物。
[18]根据[14]的脂蛋白胆固醇定量方法，其特征在于，第一工序中使用过氧化氢酶、偶联剂及铁络合物，第二工序中使用氢供体及过氧化物酶。
[19]根据[14]的脂蛋白胆固醇定量方法，其特征在于，第一工序中使用过氧化物酶及氢供体，第二工序中使用偶联剂及铁络合物。
[20]根据[14]或[15]的脂蛋白胆固醇定量方法，其特征在于，第一工序中使用过氧化氢酶、氢供体及铁络合物，第二工序中使用过氧化物酶及偶联剂。
[21]根据[14]或[15]的脂蛋白胆固醇定量方法，其特征在于，第一工序中使用过氧化物酶、氢供体及铁络合物，第二工序中使用偶联剂。
[22]根据[17]、[19]及[21]中任一项的脂蛋白胆固醇定量方法，其特征在于，第一工序中进一步使用过氧化氢酶。
[23]根据[14]～[22]中任一项的脂蛋白胆固醇定量方法，其特征在于，第一工序中进一步包含作用于测定对象以外的脂蛋白的表面活性剂，第二工序中进一步使用至少作用于待测脂蛋白的表面活性剂。
[24]根据[14]～[23]中任一项的脂蛋白胆固醇定量方法，其中，待测的所述脂蛋白胆固醇为LDL胆固醇、HDL胆固醇、HDL3胆固醇、残粒胆固醇或含apoE HDL-胆固醇。
本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请第2020-096248号的公开内容。
根据本发明，提供一种在将作为测定对象的脂蛋白中的胆固醇与其它测定对象以外的脂蛋白中的胆固醇分开分别测定的情况下，抑制两种试剂组合物在保存期间自然显色，改善稳定性，稳定地定量脂蛋白中的胆固醇的方法及用于该方法的定量试剂盒、以及用于实施该方法的制造方法。
附图说明
图1是示出比较例1中的第二试剂组合物刚刚制成后及保存后的吸收光谱的图。
图2是示出比较例2中的第一试剂组合物刚刚制成后及保存后的吸收光谱的图。
图3a是示出实施例1中的第一试剂组合物刚刚制成后及保存后的吸收光谱的图。
图3b是示出实施例1中的第二试剂组合物刚刚制成后及保存后的吸收光谱的图。
图4a是示出实施例2中的第一试剂组合物刚刚制成后及保存后的吸收光谱的图。
图4b是示出实施例2中的第二试剂组合物刚刚制成后及保存后的吸收光谱的图。
图5a是示出实施例3中的第一试剂组合物刚刚制成后及保存后的吸收光谱的图。
图5b是示出实施例3中的第二试剂组合物刚刚制成后及保存后的吸收光谱的图。
图6a是示出实施例4中的第一试剂组合物刚刚制成后及保存后的吸收光谱的图。
图6b是示出实施例4中的第二试剂组合物刚刚制成后及保存后的吸收光谱的图。
图7a是示出实施例5中的第一试剂组合物刚刚制成后及保存后的吸收光谱的图。
图7b是示出实施例5中的第二试剂组合物刚刚制成后及保存后的吸收光谱的图。
图8a是示出实施例6中的第一试剂组合物刚刚制成后及保存后的吸收光谱的图。
图8b是示出实施例6中的第二试剂组合物刚刚制成后及保存后的吸收光谱的图。
图9a是示出实施例7中的第一试剂组合物刚刚制成后及保存后的吸收光谱的图。
图9b是示出实施例7中的第二试剂组合物刚刚制成后及保存后的吸收光谱的图。
图10a是示出实施例8中的第一试剂组合物刚刚制成后及保存后的吸收光谱的图。
图10b是示出实施例8中的第二试剂组合物刚刚制成后及保存后的吸收光谱的图。
图11a是示出实施例9中的第一试剂组合物刚刚制成后及保存后的吸收光谱的图。
图11b是示出实施例9中的第二试剂组合物刚刚制成后及保存后的吸收光谱的图。
具体实施方式
下面，对本发明进行详细说明。
脂蛋白大致分为CM、VLDL、LDL及HDL，每种脂蛋白进一步分为亚组分。多个这些组分及亚组分能够通过粒子尺寸或比重来区分。其粒子尺寸的直径根据报告者的不用而不同，VLDL为30nm～80nm(30nm～75nm)，LDL为22nm～28nm(19nm～30nm)，HDL为直径7nm～12nm，作为HDL亚组分的HDL3的直径为7nm～8.5nm，HDL2的直径为8.5nm～10nm。VLDL的比重为1.006以下，LDL的比重为1.019～1.063，HDL的比重为1.063～1.21，HDL2的比重为1.063～1.125，HDL3的比重为1.125-1.210。粒子直径能够通过梯度凝胶电泳(GGE)(JAMA,260,p.1917-21,1988)，NMR(HANDBOOK OF LIPOPROTEIN TESTING 2nd Edition，Nader Rifai等人编著，AACC PRESS：TheFats of Life Summer2002，LVDD 15YEAR ANNIVERSARY ISSUE，Volume AVI No.3，p.15-16)测定，比重能够基于利用超离心的分析(Atherosclerosis,106,p.241-253,1994:Atherosclerosis,83,p.59,1990)来确定。HDL-胆固醇(HDL-C)、LDL胆固醇(LDL-C)能够通过自动分析装置测定。
HDL根据ApoE的含量比率的差异能够分离为ApoE-Containing HDL和ApoEdeficient HDL的亚组分。通常，ApoE-Containing HDL表示HDL中含有ApoE，ApoEdeficient HDL则表示不含有ApoE。有时将存在ApoE或其含量较多的HDL称为ApoE-richHDL，其也包括在ApoE-containing HDL中。HDL内部存在的ApoE的含量的分布是连续的，因此，并不能通过脂蛋白中的ApoE含有比明确区分ApoE-Containing HDL和ApoE deficientHDL，例如，通过从能够测定包括ApoE-Containing HDL-C在内的总HDL-C的13％PEG法(JLipid Research38,1204-16:1997)中减去不测定ApoE-Containing HDL-C而仅能够测定ApoE-deficient HDL-C的磷钨酸-硫酸葡聚糖-镁沉淀法(PT-DS-Mg法)(BIOCHEMICALMEDICINE AND METABOLIC BIOLOGY 46,329-343(1991))，能够定量含apoE HDL-胆固醇(含apoE HDL-C)。另外，还可以通过利用表面活性剂的浓度所引起的反应性的差异，通过自动分析装置测定含apoE HDL-C(Ann Clin Biochem 56,123-132(2019))。
残粒(残粒样脂蛋白：RLP)是代谢综合征等中脂质代谢停滞时所产生的特殊脂蛋白，它是CM及VLDL通过脂蛋白脂肪酶的作用被分解后的代谢产物。它不能通过特定的尺寸或比重来定义，但能够使用针对脂蛋白中的组分载脂蛋白的抗体的固定凝胶及磷脂质分解酶或表面活性剂等进行定量。另外，还可以利用胆固醇酯酶的分子量所引起的反应性的差异，通过自动分析装置测定RLP-胆固醇(RLP-C)(J Applied Laboratory Medicine 3,26-36,(2018))。
在本发明中，HDL-胆固醇(HDL-C)、LDL-胆固醇(LDL-C)、HDL3-胆固醇(HDL3-C)、(RLP-C)、及含apoE HDL-C是测定对象。
本发明的各种脂蛋白定量试剂盒用于通过两个工序定量脂蛋白中的胆固醇的方法。在本发明的定量试剂盒中，第一试剂组合物用于第一工序，第二试剂组合物用于第二工序。
本发明的脂蛋白中的胆固醇的定量试剂盒中的第一试剂组合物包含胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶，在胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶存在下，将测定对象以外的脂蛋白中的胆固醇导向反应体系外。
作为第一试剂组合物的成分，能够使用例如白蛋白、缓冲液、表面活性剂、过氧化氢酶、过氧化物酶、由聚氧乙烯衍生物构成的表面活性剂、氢供体、偶联剂等，但不限定于此。
本发明的脂蛋白中的胆固醇的定量试剂盒中的第二试剂组合物包含用于定量待测脂蛋白中的胆固醇的成分。第二试剂组合物的成分根据第一试剂组合物而不同，但只要是能够定量脂蛋白中的胆固醇的成分，则不受特别限定，能够使用公知的物质。
作为第二试剂组合物的成分，能够使用例如过氧化物酶、聚氧乙烯衍生物、氢供体、偶联剂，但不限定于此。
本发明的方法由两个工序构成，第一工序中，使能够作用于测定对象以外的脂蛋白的表面活性剂在胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶存在下作用于被检体样品，使从脂蛋白中游离产生的胆固醇与胆固醇氧化酶反应，并将其导向反应体系外。此时，能够防止待测脂蛋白胆固醇在保护测定对象的表面活性剂的存在下导向反应体系外。并且，第二工序中，定量第一工序中未反应而残存的脂蛋白中的胆固醇。
第一试剂组合物及第二试剂组合物中的任意一者至少包含偶联剂、铁络合物、过氧化物酶、过氧化氢酶、氢供体及表面活性剂，偶联剂和氢供体不包含在同一试剂组合物中。
本发明的方法通常在自动分析装置内进行。
在本发明的方法中，定量脂蛋白胆固醇的浓度时，使氢供体和偶联剂在过氧化物酶存在下进行偶联反应，通过所生成的色素测定特定波长的吸光度。此时，使用铁络合物作为反应促进剂。然而，若偶联剂和过氧化物酶、铁络合物存在于同一试剂组合物中，则存在试剂会逐渐自然显色，进而影响脂蛋白胆固醇的定量的问题。所以，在本发明中，通过使偶联剂、过氧化物酶及铁络合物中的任意一者存在于与其它成分不同的试剂组合物中，可以抑制试剂的自然显色并使其稳定。其中，“存在过氧化物酶”是指存在具有过氧化物酶活性的酶，能够产生由过氧化物酶催化的反应。也可以将“存在过氧化物酶”这一语句称为“存在过氧化物酶活性”。胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化氢酶也相同。在包含过氧化物酶、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化氢酶的情况下，通过它们的活性起作用，产生测定所需的催化反应。因此，能够通过测定以上酶活性来证明这些酶的存在。
在本发明的方法中，如下使偶联剂、过氧化物酶活性及铁络合物分开存在于第一工序中使用的第一试剂组合物和第二工序中使用的第二试剂组合物。
(1)使第一工序中使用的第一试剂组合物中存在偶联剂，第二工序中使用的第二试剂组合物中存在过氧化物酶活性及铁络合物。
(2)使第一试剂组合物中存在偶联剂及过氧化物酶活性，第二试剂组合物中存在铁络合物。
(3)使第一试剂组合物中存在过氧化物酶活性，第二试剂组合物中存在偶联剂及铁络合物。
(4)使第一试剂组合物中存在偶联剂及铁络合物，第二试剂组合物中存在过氧化物酶活性。
(5)使第一试剂组合物中存在过氧化物酶活性及铁络合物，第二试剂组合物中存在偶联剂。
(6)使第一试剂组合物中存在铁络合物，第二试剂组合物中存在过氧化物酶活性及偶联剂。
并且，优选偶联剂和氢供体分来存在于不同试剂组合物中。
下面，对各个工序进行详细叙述。
本发明的试剂盒包含将测定对象以外的脂蛋白中的胆固醇导向反应体系外的工序中使用的第一试剂产物、及测定待测脂蛋白中的胆固醇的工序中使用的第二试剂产物。
在将测定对象以外的脂蛋白中的胆固醇导向反应体系外的工序中，能够使用将测定对象以外的脂蛋白中的胆固醇消除并导向反应体系外的公知的技术，例如，使测定对象以外的脂蛋白内部凝聚，或抑制测定对象以外的脂蛋白，以使其在之后的工序不进行反应等。
将测定对象以外的脂蛋白中的胆固醇消除并导向反应体系外的工序即第一工序通过以下任一方法进行。
(1)通过胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶由这些脂蛋白中的胆固醇中生成过氧化氢，并在过氧化氢酶存在下，将过氧化氢分解为水和氧；
(2)在由胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶产生的过氧化氢以及偶联剂或者氢供体的存在下形成无色醌；以及
(3)在过氧化氢酶的存在下分解过氧化氢，并同时在偶联剂或氢供体的存在下形成无色醌。
在过氧化氢酶的存在下分解过氧化氢的方法(1)中，需要实施第一工序的第一试剂组合物中存在过氧化氢酶。另外，形成无色醌的方法(2)中，需要第一试剂组合物中至少存在偶联剂、氢供体中的一种，并且需要第一试剂组合物中存在过氧化物酶。通过过氧化氢酶分解过氧化氢，并同时在偶联剂或氢供体存在下形成无色醌的方法(3)中，需要第一试剂组合物中存在过氧化氢酶及过氧化物酶以及偶联剂或者氢供体。
作为本发明中使用的偶联反应所使用的偶联剂，能够使用例如4-氨基安替比林、氨基安替比林衍生物、香草醛二胺磺酸、甲基苯并噻唑啉酮腙、磺化甲基苯并噻唑啉酮腙等，但不限定于此。
作为本发明中使用的氢供体，优选苯胺衍生物，作为苯胺衍生物，可列举：N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOPS)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N-(3-磺丙基)苯胺(HALPS)、N-(3-磺丙基)-3-甲氧基-5-苯胺(HMMPS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-4-氟-3,5-二甲氧基苯胺(FDAOS)、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-琥珀基乙二胺(EMSE)等。氢供体的使用浓度以反应液中的最终浓度计优选01～8mmol/L。
作为用于本发明的铁络合物，可列举：亚铁氰化钾、亚铁氰化钠、卟啉铁络合物、EDTA-铁络合物等。铁络合物的浓度优选0.001～0.05mmol/L。
本发明的方法中，用于将测定对象以外的脂蛋白中的胆固醇消除并导向反应体系外的第一工序中，使用由聚氧乙烯衍生物构成的表面活性剂。并且，在本发明中测定HDL3-C、RLP-C时，第一工序中使用的第一试剂组合物中可以存在神经磷脂酶。“存在神经磷脂酶”是指存在具有神经磷脂酶活性的酶，能够产生分解鞘磷脂的反应。也可以将“存在神经磷脂酶”这一语句称为“存在神经磷脂酶活性”。在磷脂酶C及磷脂酶D等磷脂酶具有神经磷脂酶活性的情况下，则也包括这些酶。神经磷脂酶在试剂中的浓度优选0.1～100U/mL，更优选0.2～20U/mL。反应时反应液中的浓度优选0.05～100U/mL，更优选0.1～20U/mL。作为神经磷脂酶的优选具体例，可列举：SPC(旭化成公司制)、源自蜡样牙孢杆菌(bacillus cereus)的鞘磷脂酶、源自金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)的鞘磷脂酶(SIGMA公司制)等，但并不限定于此。
在将测定对象以外的脂蛋白中的胆固醇消除的工序中，在作用于测定对象以外的脂蛋白，但不会与待测脂蛋白反应的表面活性剂的存在下，消除测定对象以外的脂蛋白胆固醇。作为作用于测定对象以外的脂蛋白并与之反应的表面活性剂，可列举聚氧乙烯衍生物。作为聚氧乙烯衍生物的示例，能够列举：聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯多环苯醚衍生物、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物。作为聚氧乙烯多环苯醚衍生物的优选例，可列举：聚氧乙烯苄基苯基衍生物及其硫酸酯盐或聚氧乙烯苯乙烯化苯醚衍生物及其硫酸酯盐、特殊苯酚乙氧基化物。作为聚氧乙烯多环苯醚衍生物的具体例，可列举：EMULGENA-60、EMULGENA-500、EMULGENB-66、EMULGENA-90(以上由花王公司制)、NEWCOL 703、NEWCOL 704、NEWCOL 706、NEWCOL 707、NEWCOL 708、NEWCOL 709、NEWCOL710、NEWCOL 711、NEWCOL 712、NEWCOL 714、NEWCOL 719、NEWCOL 723、NEWCOL 729、NEWCOL 733、NEWCOL 740、NEWCOL747、NEWCOL 780、NEWCOL 610、NEWCOL 2604、NEWCOL 2607、NEWCOL 2609、NEWCOL 2614(以上日本乳化剤公司制)、NOIGEN EA-87、NOIGEN EA-137、NOIGEN EA-157、NOIGEN EA-167、NOIGEN EA-177、NOIGEN EA-197D、NOIGEN EA-207D(以上由第一工业制药公司制)、BLAUNON DSP-9、BLAUNONDSP-12.5、BLAUNON TSP-7.5、BLAUNON TSP-16、BLAUNON TSP-50(以上由青木油脂公司制)等。作为聚氧乙烯多环苯醚硫酸酯盐的具体例，可列举：HITENOL NF-08、HITENOL NF-13、HITENOL NF-17、HITENOL NF0825(以上由第一工业制药公司制)、NEWCOL 707-SF、NEWCOL707-SFC、NEWCOL 707-SN、NEWCOL 714-SF、NEWCOL 714-SN、NEWCOL 723-SF、NEWCOL740-SF、NEWCOL780-SF、NEWCOL 2607-SF、2614-SF(以上由日本乳化剤公司制)等。表面活性剂在试剂中的浓度优选0.3～5％(w/v)，更优选0.5～3％(w/v)。反应时反应液中的浓度优选0.15～5％，更优选0.25～3％(w/v)。需要说明的是，试剂中的表面活性剂能够通过利用IR、NMR、LC-MS等的组合进行分析的方法来鉴定。作为确认表面活性剂的离子型(非离子型、阴离子型、阳离子性)的方法，可列举：在酸性或碱性条件利用有机溶剂进行的提取法、固相提取法。作为确定表面活性剂的结构的方法，可列举：使用LC-MSMS、NMR分析的方法。
将上述测定对象以外的脂蛋白中的胆固醇消除的工序中，在作用于测定对象以外的脂蛋白并与之反应的表面活性剂存在下，胆固醇酯酶作用于测定对象以外的脂蛋白，使所产生的胆固醇在胆固醇氧化酶等与胆固醇反应的酶的存在下进行反应而消除，从而将这些脂蛋白中的胆固醇导向反应体系外。其中，“表面活性剂作用(反应)”是指表面活性剂分解脂蛋白，使脂蛋白中的胆固醇游离。例如在称为“作用(反应)于测定对象以外的脂蛋白的表面活性剂”的情况下，并不要求表面活性剂完全不作用于脂蛋白，只要主要作用于测定对象以外的脂蛋白即可。“消除”表示分解被检体样品中的物质，使该分解物在下面的工序不能检测到。即，“将测定对象以外的脂蛋白中的胆固醇消除”是指分解被检体样品中的测定对象以外的脂蛋白，使其分解产物即这些脂蛋白中的胆固醇在后面的工序不能检测到。
本发明中，“导向反应体系外”是指，使胆固醇消除、凝聚、或抑制胆固醇以使其在后面的工序中不进行反应等，以保证测定对象以外的脂蛋白中所含的胆固醇不会对待测脂蛋白中的胆固醇的定量产生影响。
本领域技术人员能够适当选择合适的表面活性剂来将各待测脂蛋白胆固醇以外的脂蛋白胆固醇导向反应体系外。例如，针对每种待测定的脂蛋白胆固醇，优选使用下面的表面活性剂。HDL-C：聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物
LDL-C：聚氧乙烯多环苯醚
HDL3-C：聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物
残粒-C：聚氧乙烯多环苯醚
含apoE HDL-C：聚氧乙烯多环苯醚
在上述表面活性剂存在下，使胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶发挥作用，从而由胆固醇产生过氧化氢，并消除所产生的过氧化氢。反应液中的胆固醇酯酶浓度优选10～1000U/L左右。另外，胆固醇氧化酶还能够使用来自细菌及酵母的酶，反应液中的胆固醇氧化酶的浓度优选100～3500U/L左右。并且，过氧化氢酶在反应液中的浓度优选40～2500U/L左右。另外，将过氧化氢向无色醌转换时反应液中的过氧化物酶的浓度优选400～2000U/L。
将测定对象以外的脂蛋白中的胆固醇消除的工序中，与上述表面活性剂及胆固醇酯酶作用、反应的脂蛋白中的胆固醇能够与胆固醇氧化酶等胆固醇反应酶反应而导向反应体系外。通过这样的反应将测定对象以外的脂蛋白中的胆固醇导向反应体系外，使后面的工序中，反应液中脂蛋白仅剩测定对象。在本发明中，这样将测定对象以外的脂蛋白消除并导向反应体系外，以使后面的工序中不能检测到测定对象以外的脂蛋白的胆固醇有时称为“将测定对象以外的脂蛋白与待测脂蛋白区分”。
另外，将测定对象以外的脂蛋白中的胆固醇消除的工序中，可以不完全消除测定对象以外的脂蛋白中的胆固醇，在该情况下，定量待测脂蛋白中的胆固醇的工序中，使用选择性测定脂蛋白中的胆固醇的表面活性剂即可。
将测定对象以外的脂蛋白中的胆固醇消除并导向反应体系外的工序中，胆固醇酯酶在反应液中的浓度优选10U/L～10000U/L，进一步优选300U/L～2500U/L，特别优选600U/L～2000U/L。作为本发明中的胆固醇酯酶，只要是能够水解胆固醇酯的酶，则不受特别限定，能够使用来自动物或微生物的胆固醇酯酶。
将测定对象以外的脂蛋白中的胆固醇消除的工序中，也可以任选向反应液中加入脂蛋白分解酶，以调节对于各种脂蛋白的作用。脂蛋白分解酶能够使用脂蛋白脂肪酶。脂蛋白脂肪酶只要为具有分解脂蛋白质能力的酶，则不受特别限定，能够使用来自动物或微生物的脂蛋白脂肪酶。脂蛋白脂肪酶在反应液中的浓度优选10～10000U/L，进一步优选10～5000U/L，特别优选10～1000U/L。
本发明中，将测定对象以外的脂蛋白中的胆固醇导向反应体系外的工序中未反应而残存的脂蛋白中的胆固醇在之后的第二工序中定量。该定量工序中，能够使用过去使用的定量方法。具有例如如下方法：通过比浊测定来定量添加凝聚剂所形成的特异性凝聚物的含量的方法、利用特异性抗体进行抗原抗体反应的方法、使用酶来定量分解产物的方法等。其中，优选使用酶来定量分解产物。
该方法中，加入胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶等用于测定胆固醇的酶，使脂蛋白的胆固醇游离、分解，进而定量其反应产物。该定量工序中，在第一工序中将测定对象以外的脂蛋白胆固醇导出至反应体系外的情况下，为了定量待测定脂蛋白中的胆固醇，只要使用至少作用于待测脂蛋白的表面活性剂即可。至少作用于待测脂蛋白的表面活性剂可以为仅作用于待测脂蛋白的表面活性剂，也可以为除待测脂蛋白以外还作用于其它脂蛋白的表面活性剂、作用于全部脂蛋白的表面活性剂。
在测定对象以外的脂蛋白中的胆固醇未在第一工序中未被消除而残留的情况下，第二工序中需要使用仅与残留脂蛋白中的待测定脂蛋白反应的表面活性剂。
作用于全部脂蛋白的表面活性剂能够列举聚氧乙烯衍生物，只要为用于市售的用于测定总胆固醇的试剂等的表面活性剂，则均可使用。具体而言，可列举例如：聚氧乙烯烷基苯醚(EMULGEN909(花王公司制)，TritonX100)、聚氧乙烯烷基醚(EMULGEN707(花王公司制)、EMULGEN709(花王公司制))等。
脂蛋白定量工序中使用的表面活性剂在反应液中的浓度优选为0.01～10％(w/v)左右，进一步优选为0.1～5％(w/v)左右。
本发明中使用的胆固醇酯酶活性、胆固醇氧化酶活性、神经磷脂酶活性、过氧化物酶活性、过氧化氢酶活性能够通过下面的方法测定。下面的记载仅为示例，可以通过任意公知的方法来测定。
测定胆固醇氧化酶活性时，使用6mM胆固醇溶液(溶于异丙醇)作为底物液。向测定对象中加入稀释液(0.1M磷酸缓冲液、TritonX100，pH7.0)，使其为2-4U/mL，将3mL稀释后的溶液在37℃下加热5分钟后，加入0.05mL底物液。然后，使混合液在37℃下反应，并测定波长240nm的吸光度变化量。本发明中，在37℃下反应后，测定2分～7分的吸光度变化量，计算胆固醇氧化酶活性。如果由如上测定的吸光度变化量所换算得到的单位量的酶活性为3U/L以上，则认为测定对象存在胆固醇氧化酶活性，换而言之，包含“胆固醇氧化酶”。
测定胆固醇酯酶活性时，使用底物(0.04％亚麻酸胆固醇、1％TritonX100、0.6％胆酸钠溶液)、300U/mL胆固醇氧化酶溶液、酶稀释液(20mM磷酸缓冲液、0.5mM EDTA·2Na、2mM MgCl2、0.2％ BSA，pH7.5)、反应液(0.06％4氨基安替比林、0.4％苯酚、7.5KU/L 过氧化物酶)。将1.75mL反应液和1.0mL底物液混合后，在37℃下加热5分钟，加入0.1mL胆固醇氧化酶溶液。加入0.1mL在37℃下加热2分钟后用稀释液稀释后的测定对象，使混合液在37℃下反应，并测定波长500nm的吸光度变化量。本发明中，在37℃下反应后，测定0分～3.5分的吸光度变化量，计算胆固醇酯酶活性。如果由如上测定的吸光度变化量所换算得到的单位量的酶活性为8U/L以上，则认为测定对象存在胆固醇酯酶活性，换而言之，包含“胆固醇酯酶”。
测定过氧化物酶活性时，使用反应液1(1.5mM HDAOS、0.05％TritonX100、50mM磷酸缓冲液，pH7.0)、反应液2(5mM 4氨基安替比林、0.05％ TritonX100、1％过氧化氢、50mM磷酸缓冲液，pH7.0)、稀释液(50mM磷酸缓冲液，pH7.0)。将0.3mL反应液1和0.08mL用稀释液稀释后的测定对象混合，在37℃下加热5分钟。然后，加入0.1mL反应液2，使其在37℃下反应，并测定主波长600nm、副波长700nm的吸光度变化量。本发明中，在37℃下反应后，测定2分钟～5分钟的吸光度变化量，计算过氧化物酶活性。如果由如上测定的吸光度变化量所换算得到的单位量的酶活性为10U/L以上，则认为测定对象存在过氧化物酶活性，换而言之，包含“过氧化物酶”。
测定过氧化氢酶活性时，使用底物(0.06％过氧化氢、50mM磷酸缓冲液，pH7.0)。将2.9mL底物溶液在25℃下预热后，与0.1mL测定对象混合，测定240nm处的吸光度变化量。本发明中，在25℃下反应后，测定0分钟～3分钟的吸光度变化量，计算过氧化氢酶活性。如果由如上测定的吸光度变化量所换算得到的单位量的酶活性为100U/L以上，则认为测定对象存在过氧化氢酶活性，换而言之，包含“过氧化氢酶”。
测定神经磷脂酶活性时，使用反应液(0.008％鞘磷脂、0.05％TritonX100溶液、10U/mL碱性磷酸酶、10U/mL胆固醇氧化酶、2U/mL过氧化物酶、0.02％4氨基安替比林、0.02％ TODB混合液)、反应终止液(1％十二烷基硫酸钠溶液)、稀释液(10mM Tris缓冲液、0.1％ TritonX100，pH8.0)。将0.08mL反应液和0.003mL用稀释液稀释后的测定对象混合，在37℃下加热5分钟后，加入0.16mL反应终止液。反应停止后，测定主波长546nm、副波长700nm的吸光度变化量，计算神经磷脂酶活性。如果由如上测定的吸光度变化量所换算得到的单位量的酶活性为2U/L以上，则认为测定对象存在神经磷脂酶活性，换而言之，包含“神经磷脂酶”。
本发明的方法中，将测定对象以外的脂蛋白中的胆固醇消除并导出反应体系外的工序中，能够进一步使用一价阳离子及/或二价阳离子或它们的盐作为离子强度调节剂。通过添加离子强度调节剂，容易区别待测脂蛋白和此外的其它脂蛋白。具体而言，能够使用氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化锰、氯化钙、氯化锂、氯化铵、硫酸钠、硫酸镁、硫酸钾、硫酸锂、硫酸铵、醋酸镁等。反应时离子强度调节剂的浓度优选0～100mM。
需要说明的是，试剂中的酶也可以通过下面的方法鉴定。即，用混合型质谱仪检测包含标靶酶的样品经胰蛋白酶分解而得到的片段肽。将通过质谱仪得到的肽的质量及通过在质谱仪内与氩气撞击得到的碎片离子的光谱(MS/MS数据)进行数据库检索(例如Mascot检索)，由此能够鉴定蛋白质。在来自样品中的氨基酸序列的片段肽的序列作为独特的序列与数据库中已注册的氨基酸序列一致的情况下，则视作包含目标酶。
另外，试剂中的酶能够通过利用下面的方法进行定量来鉴定。即，将通过用胰蛋白酶分解标靶酶而得到的片段肽中对于标靶酶显示特异性且质谱中获得强信号的肽选作待定量肽。作为待定量肽，通过化学合成制作作为非标记肽及内标的经稳定同位素标记的肽。将包含标靶酶的样品用胰蛋白酶完全消化，添加已知量的稳定同位素标记肽，通过连接于HPLC的三级四极型质谱仪(LC-MS/MS)在MRM模式(多反应监测模式)下进行测定。同样测定待定量肽的非标记肽与已知量的稳定同位素标记肽的混合液，并制作内标的浓度比和峰面积比的校正曲线，计算样品中的待定量肽的绝对量，由此能够定量标靶酶。
本发明的各工序优选在反应温度2℃～45℃下进行，进一步优选在25℃～40℃下进行。
各工序的反应时间均优选为1～10分钟，进一步优选为3～7分钟。
本发明的被检体样品能够使用血清、血浆，但不限定于此。
作为本发明中使用的自动分析装置，可列举例如：TBA-120FR·200FR(东芝)、JCA-BM1250·1650·2250(日本电子)、HITACHI7180·7170(日立)、AU2700·5800·680(OLYMPUS)、cobas c501·701(Roche)等。
在具有将测定对象以外的脂蛋白中的胆固醇消除并导向反应体系外的工序和测定待测脂蛋白的工序这两个工序的情况下，用于将测定对象以外的脂蛋白中的胆固醇消除并导向反应体系外的工序中使用的试剂组合物包含与测定对象以外的脂蛋白反应的表面活性剂。将脂蛋白以外的脂蛋白中的胆固醇消除的试剂组合物只要进一步包含胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶等分解胆固醇的酶、氢供体或偶联剂中的任意一者、消除过氧化氢的过氧化氢酶等即可。测定待测脂蛋白的工序中使用的试剂组合物中能够包含仅与待测脂蛋白反应的表面活性剂或者作用于全部脂蛋白的表面活性剂、氢供体或偶联剂，其在将脂蛋白以外的脂蛋白中的胆固醇消除并导向反应体系外的工序中未使用。此时，可以根据需要向第一试剂组合物或第二试剂组合物添加一价阳离子、二价阳离子或者它们的盐、或聚阴离子。另外，第一试剂组合物或第二试剂组合物中可以包含血清白蛋白。各试剂组合物的pH在中性附近，例如pH6～pH8，优选为pH6.5～7.5，添加缓冲液调节pH即可。
在按照将测定对象以外的脂蛋白中的胆固醇消除并导向反应体系外的工序、测定待测脂蛋白的工序的顺序进行本发明的方法的情况下，通过向被检体样品中添加将测定对象以外的脂蛋白中的胆固醇消除的试剂组合物并使其反应后，添加测定待测脂蛋白的试剂组合物并使其反应，并测定吸光度来进行即可。
被检体样品的量、各试剂组合物的量不受限定，能够根据各试剂组合物中的试剂的浓度等适当确定，但在适用于自动分析装置的范围内进行。例如，使用被检体样品1～10μL、第一试剂50～300μL、第二试剂25～200μL即可。
实施例
下面，基于实施例对本发明进行具体说明，但本发明并不限定于下述实施例。
下述实施例及比较例中使用的成分如下所述。
在下述实施例及比较例中，测定吸收光谱时使用HITACHI公司制的U-3900。
除氢供体、偶联剂、过氧化氢酶、亚铁氰化钾、过氧化物酶以外，各种测定对象中的第一试剂组合物或第二试剂组合物中所含的其它物质的种类及浓度如下所述。
测定对象：HDL-C
第一试剂组合物
Figure BDA0003976024890000211
第二试剂组合物
BES缓冲液，pH7.0 100mM
聚氧乙烯多环苯醚 1.0％(w/v)
测定对象：LDL-C
第一试剂组合物
Figure BDA0003976024890000212
Figure BDA0003976024890000221
第二试剂组合物
PIPES缓冲液，pH7.0 50mM
聚氧乙烯烷基醚 1.0％(w/v)
测定对象：HDL3-C
第一试剂组合物
Figure BDA0003976024890000222
第二试剂组合物
BES缓冲液，pH7.0 100mM
聚氧乙烯多环苯醚 2.0％(w/v)
测定对象：RLP-C
第一试剂组合物
Figure BDA0003976024890000223
Figure BDA0003976024890000231
第二试剂组合物
PIPES缓冲液，pH6.8 50mM
胆固醇酯酶(低分子；CEN(29.5kDa)) 4000U/L
聚氧乙烯烷基醚 0.1％(w/v)
测定对象：含apoE HDL-C
第一试剂组合物
Figure BDA0003976024890000232
第二试剂组合物
BES缓冲液，pH7.0 100mM
聚氧乙烯多环苯醚 1.0％(w/v)
[比较例1]
对于进行第二工序的第二试剂组合物，向上述各试剂成分加入下面的成分而制备。
第二试剂组合物
Figure BDA0003976024890000233
将第二试剂组合物在37℃下加速保存两周，针对保存期间的自然显色，测定波长320nm～480nm的吸收光谱。
图1示出刚刚制成后及在37℃下加速保存两周后的吸收光谱。如图1所示，刚刚制成后(0周)，所有测定对象均可见吸光度升高。在37℃下加速保存两周后的试剂在360nm附近产生显示极大吸收的峰(试剂为淡黄色)。在37℃下加速保存一周与冷藏保存1.5年相同。
[比较例2]
对于进行第一工序的第一试剂组合物，向上述各试剂成分添加下面的成分而制备。
第一试剂组合物
偶联剂(4氨基安替比林) 1.3mM
过氧化物酶 1.7U/mL
亚铁氰化钾 0.04mM
将第一试剂组合物在37℃下加速保存两周，针对保存期间的自然显色，测定波长320nm～480nm的吸收光谱。
图2中示出刚刚制成后及在37℃下加速保存两周后的吸收光谱。如图2所述，刚刚制成后(0周)，所有测定对象均可见吸光度升高。在37℃下保存后的试剂在360nm附近产生显示极大吸收的峰(试剂为淡黄色)。
[实施例1]
对于进行第一工序的第一试剂组合物及进行第二工序的第二试剂组合物，向上述各试剂成分加入下面的成分而制备。
第一试剂组合物
过氧化氢酶 1200U/mL
4-氨基安替比林 1.3mM
第二试剂组合物
氢供体
Figure BDA0003976024890000241
Figure BDA0003976024890000251
将第一试剂组合物及第二试剂组合物在37℃下加速保存两周，针对保存期间的自然显色，测定320nm～480nm的吸收光谱，与比较例1、2进行比较。
图3a示出刚刚制成后及在37℃下加速保存两周后的第一试剂组合物的吸收光谱，图3b示出第二试剂组合物的吸收光谱。如图3a、图3b所示，刚刚制成后(0周)及在37℃下加速保存两周后也没有太大差异，与比较例1、2相比，360nm附近的显示极大吸收的峰减少、消失。
[实施例2]
对于进行第一工序的第一试剂组合物及进行第二工序的第二试剂组合物，向上述各试剂成分中加入下面的成分而制备。
第一试剂组合物
过氧化物酶 1.7U/mL
4-氨基安替比林 1.3mM
第二试剂组合物
氢供体
(HDAOS：HDL-C、含apoE HDL-C) 2.1mM
(TOOS：LDL-C、HDL3-C、残粒-C) 6.0mM
亚铁氰化钾 0.11mM
将第一试剂组合物及第二试剂组合物在37℃下加速保存两周，针对保存期间的自然显色，测定320nm～480nm的吸收光谱，与比较例1、2进行比较。
图4a示出刚刚制成后及在37℃下加速保存两周后的第一试剂组合物的吸收光谱，图4b示出第二试剂组合物的吸收光谱。如图4a、图4b所示，刚刚制成后(0周)及在37℃下加速保存两周后也没有太大差异，与比较例1、2相比，360nm附近的显示极大吸收的峰减少、消失。
[实施例3]
针对进行第一工序的第一试剂组合物及进行第二工序的第二试剂组合物，向上述各试剂成分中加入下面的成分而制备。
第一试剂组合物
4-氨基安替比林 1.3mM
亚铁氰化钾 0.04mM
过氧化氢酶 1200U/mL
第二试剂组合物
氢供体
Figure BDA0003976024890000261
将第一试剂组合物及第二试剂组合物在37℃下加速保存两周，针对保存期间的自然显色，测定320nm～480nm的吸收光谱，与比较例1、2进行比较。
图5a示出刚刚制成后及在37℃下加速保存两周后的第一试剂组合物的吸收光谱，图5b示出第二试剂组合物的吸收光谱。如图5a、图5b所示，刚刚制成后(0周)及在37℃下加速保存两周后也没有太大差异，与比较例1、2相比，360nm附近的显示极大吸收的峰减少、消失。
[实施例4]
针对进行第一工序的第一试剂组合物及进行第二工序的第二试剂组合物，向上述各试剂成分中加入下面的成分而制备。
第一试剂组合物
过氧化物酶 1.7U/mL
氢供体
(HDAOS：HDL-C、含apoE HDL-C) 0.7mM
(TOOS：LDL-C、HDL3-C、残粒-C) 2.0mM
第二试剂组合物
4-氨基安替比林 4.0mM
亚铁氰化钾 0.11mM
将第一试剂组合物及第二试剂组合物在37℃下加速保存两周，针对保存期间的自然显色，测定320nm～480nm的吸收光谱，与比较例1、2进行比较。
图6a示出刚刚制成后及在37℃下加速保存两周后的第一试剂组合物的吸收光谱，图6b示出第二试剂组合物的吸收光谱。第一试剂组合物(图6a)中，刚刚制成后(0周)及在37℃下加速保存两周后也没有太大差异，第二试剂组合物(图6b)中，两周后360nm附近的显示极大吸收的峰略微升高，但与比较例1、2相比，360nm附近的显示极大吸收的峰减少、消失。
[实施例5]
针对进行第一工序的第一试剂组合物及进行第二工序的第二试剂组合物，向上述各试剂成分中加入下面的成分而制备。
第一试剂组合物
氢供体
Figure BDA0003976024890000271
Figure BDA0003976024890000281
第二试剂组合物
4-氨基安替比林 4.0mM
过氧化物酶 5.0U/mL
叠氮化钠 0.05％(w/v)
将第一试剂组合物及第二试剂组合物在37℃下加速保存两周，针对保存期间的自然显色，测定320nm～480nm的吸收光谱，与比较例1、2进行比较。
图7a示出刚刚制成后及在37℃下加速保存两周后的第一试剂组合物的吸收光谱，图7b示出第二试剂组合物的吸收光谱。如图7a、图7b所示，刚刚制成后(0周)及在37℃下加速保存两周后也没有太大差异，与比较例1、2相比，360nm附近的显示极大吸收的峰减少、消失。
[实施例6]
针对进行第一工序的第一试剂组合物及进行第二工序的第二试剂组合物，向上述各试剂成分中加入下面的成分而制备。
第一试剂组合物
氢供体
Figure BDA0003976024890000282
第二试剂组合物
4-氨基安替比林 4.0mmol/L
将第一试剂组合物及第二试剂组合物在37℃下加速保存两周，针对保存期间的自然显色，测定320nm～480nm的吸收光谱，与比较例1、2进行比较。
图8a示出刚刚制成后及在37℃下加速保存两周后的第一试剂组合物的吸收光谱，图8b示出第二试剂组合物的吸收光谱。如图8a、图8b所示，刚刚制成后(0周)及在37℃下加速保存两周后也没有太大差异，与比较例1、2相比，360nm附近的显示极大吸收的峰减少、消失。
[实施例7]
针对进行第一工序的第一试剂组合物及进行第二工序的第二试剂组合物，向上述各试剂成分中加入下面的成分而制备。
第一试剂组合物
4-氨基安替比林 1.3mM
过氧化物酶 1.7U/mL
过氧化氢酶 1200U/mL
第二试剂组合物
氢供体
Figure BDA0003976024890000291
将第一试剂组合物及第二试剂组合物在37℃下加速保存两周，针对保存期间的自然显色，测定320nm～480nm的吸收光谱，与比较例1、2进行比较。
图9a示出刚刚制成后及在37℃下加速保存两周后的第一试剂组合物的吸收光谱，图9b示出第二试剂组合物的吸收光谱。如图9a、图9b所示，刚刚制成后(0周)及在37℃下加速保存两周后也没有太大差异，与比较例1、2相比，360nm附近的显示极大吸收的峰减少、消失。
[实施例8]
针对进行第一工序的第一试剂组合物及进行第二工序的第二试剂组合物，向上述各试剂成分中加入下面的成分而制备。
第一试剂组合物
氢供体
Figure BDA0003976024890000301
第二试剂组合物
4-氨基安替比林 4.0mM
亚铁氰化钾 0.11mM
叠氮化钠 0.05％(w/v)
将第一试剂组合物及第二试剂组合物在37℃下加速保存两周，针对保存期间的自然显色，测定320nm～480nm的吸收光谱，与比较例1、2进行比较。
图10a示出刚刚制成后及在37℃下加速保存两周后的第一试剂组合物的吸收光谱，图10b示出第二试剂组合物的吸收光谱。第一试剂组合物(图10a)中，刚刚制成后(0周)及在37℃下加速保存两周后也没有太大差异，第二试剂组合物(图10b)中，两周后360nm附近的显示极大吸收的峰略微升高，但与比较例1、2相比，360nm附近的显示极大吸收的峰减少、消失。
[实施例9]
针对进行第一工序的第一试剂组合物及进行第二工序的第二试剂组合物，向上述各试剂成分中加入下面的成分而制备。
第一试剂组合物
氢供体
Figure BDA0003976024890000311
第二试剂组合物
4-氨基安替比林 4.0mM
叠氮化钠 0.05％(w/v)
将第一试剂组合物及第二试剂组合物在37℃下加速保存一周、两周，针对保存期间的自然显色，测定320nm～480nm的吸收光谱，与比较例1、2进行比较。
图11a示出刚刚制成后及在37℃下加速保存两周后的第一试剂组合物的吸收光谱，图11b示出第二试剂组合物的吸收光谱。如图11a、图11b所示，刚刚制成后(0周)及在37℃下加速保存两周后也没有太大差异，与比较例1、2相比，360nm附近的显示极大吸收的峰减少、消失。
[验证1]
使用实施例1～实施例9的定量试剂盒测定脂蛋白胆固醇。作为比较对象法，HDL-C、LDL-C、HDL3-C分别使用DENTCA公司制的用于测定脂蛋白胆固醇的试剂HDL-EX“生研”、LDL-EX“生研”、HDL3-C“SEIKEN”来比较脂蛋白胆固醇浓度，含apoE HDL-C使用Ann ClinBiochem 56,123-132(2019)的方法来比较脂蛋白胆固醇浓度，残粒-C使用Ann ClinBiochem 56,123-132(2019)的方法来比较脂蛋白胆固醇浓度。针对相同样本的各实施例的各脂蛋白中的胆固醇的测定结果与各比较例的测定结果的相关系数示于表1。
如表1所示，本实施例的方法与比较对象法显示出良好的相关关系。
[表1]
Figure BDA0003976024890000321
由该验证结果可知，通过本发明的定量试剂盒能够良好地检测HDL-C、LDL-C、HDL3-C、残粒-C、含apoE HDL-C。
工业适用性
通过本发明的试剂盒及方法，能够定量脂蛋白中的胆固醇，同时不损害试剂的稳定性。
本说明书中引用的全部刊物、专利及专利申请均直接通过引用并入本说明书。

Claims (24)

1.一种脂蛋白胆固醇的定量试剂盒，其特征在于，是被检体样品中的脂蛋白胆固醇的定量试剂盒，用于通过两个工序定量脂蛋白中的胆固醇的方法，包含：
(1)第一试剂组合物，具有胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶，用于将测定对象以外的脂蛋白中的胆固醇导向反应体系外；和
(2)第二试剂组合物，用于定量待测脂蛋白中的胆固醇，
第一试剂组合物及第二试剂组合物的任意一者至少包含偶联剂、铁络合物、过氧化物酶、氢供体及表面活性剂，偶联剂和氢供体不包含在同一试剂组合物中，在第一试剂组合物及第二试剂组合物的任一试剂组合物中，同一试剂组合物中不共存偶联剂、铁络合物及过氧化物酶。
2.一种脂蛋白胆固醇的定量试剂盒，其特征在于，是被检体样品中的脂蛋白胆固醇的定量试剂盒，用于通过两个工序定量脂蛋白中的胆固醇的方法，包含：
(1)第一试剂组合物，具有胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶，用于将测定对象以外的脂蛋白中的胆固醇导向反应体系外；和
(2)第二试剂组合物，用于定量脂蛋白中的胆固醇，
第一试剂组合物及第二试剂组合物的任意一者至少包含偶联剂、铁络合物、过氧化物酶、氢供体及表面活性剂，偶联剂和氢供体不包含在同一试剂组合物中，在第一试剂组合物及第二试剂组合物的任一试剂组合物中，同一试剂组合物中不共存偶联剂及铁络合物。
3.根据权利要求1或2所述的脂蛋白胆固醇的定量试剂盒，其特征在于，
第一试剂组合物包含过氧化氢酶及偶联剂，第二试剂组合物包含氢供体、铁络合物及过氧化物酶。
4.根据权利要求1或2所述的脂蛋白胆固醇的定量试剂盒，其特征在于，
第一试剂组合物包含过氧化物酶及偶联剂，第二试剂组合物包含氢供体及铁络合物。
5.根据权利要求1所述的脂蛋白胆固醇的定量试剂盒，其特征在于，
第一试剂组合物包含过氧化氢酶、偶联剂及铁络合物，第二试剂组合物包含氢供体及过氧化物酶。
6.根据权利要求1所述的脂蛋白胆固醇的定量试剂盒，其特征在于，第一试剂组合物包含过氧化物酶及氢供体，第二试剂组合物包含偶联剂及铁络合物。
7.根据权利要求1或2所述的脂蛋白胆固醇的定量试剂盒，其特征在于，第一试剂组合物包含过氧化氢酶、氢供体及铁络合物，第二试剂组合物包含过氧化物酶及偶联剂。
8.根据权利要求1或2所述的脂蛋白胆固醇的定量试剂盒，其特征在于，第一试剂组合物包含过氧化物酶、氢供体及铁络合物，第二试剂组合物包含偶联剂。
9.根据权利要求4、6及8中任一项所述的脂蛋白胆固醇的定量试剂盒，其特征在于，第一试剂组合物还包含过氧化氢酶。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的脂蛋白胆固醇的定量试剂盒，其特征在于，第一试剂组合物还包含作用于脂蛋白以外的脂蛋白的表面活性剂，第二试剂组合物还包含至少作用于脂蛋白的表面活性剂。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的脂蛋白胆固醇的定量试剂盒，其中，待测的所述脂蛋白胆固醇为LDL胆固醇、HDL胆固醇、HDL3胆固醇、残粒胆固醇或含apoE HDL-胆固醇。
12.根据权利要求10或11所述的脂蛋白胆固醇的定量试剂盒，其特征在于，第一试剂组合物中所含的表面活性剂包含聚氧乙烯多环苯醚衍生物或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物。
13.根据权利要求12所述的脂蛋白胆固醇的定量试剂盒，其特征在于，聚氧乙烯多环苯醚衍生物包含聚氧乙烯苄基苯醚衍生物及/或聚氧乙烯苯乙烯化苯醚衍生物。
14.一种脂蛋白胆固醇定量方法，其特征在于，是通过两个工序定量被检体样品中的脂蛋白胆固醇的方法，包括：
(1)第一工序，在胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶的存在下，将测定对象以外的脂蛋白中的胆固醇导向反应体系外；和
(2)第二工序，定量所述第一工序中残存的待测脂蛋白中的胆固醇，
在(1)的工序或(2)的工序的任意一者中至少使用偶联剂、铁络合物、过氧化物酶、氢供体及表面活性剂，偶联剂和氢供体不在同一工序中使用，
在(1)或(2)中的任一工序中不同时使用偶联剂、铁络合物及过氧化物酶。
15.一种脂蛋白胆固醇定量方法，其特征在于，是通过两个工序定量被检体样品中的脂蛋白胆固醇的方法，包括：
(1)第一工序，在胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶的存在下，将测定对象以外的脂蛋白中的胆固醇导向反应体系外；和
(2)第二工序，定量所述第一工序中残存的待测脂蛋白中的胆固醇，
在(1)或(2)中的任一工序中不同时使用偶联剂及铁络合物。
16.根据权利要求14或15所述的脂蛋白胆固醇定量方法，其特征在于，第一工序中使用过氧化氢酶及偶联剂，第二工序中使用氢供体、铁络合物及过氧化物酶。
17.根据权利要求14或15所述的脂蛋白胆固醇定量方法，其特征在于，第一工序中使用过氧化物酶及偶联剂，第二工序中使用氢供体及铁络合物。
18.根据权利要求14所述的脂蛋白胆固醇定量方法，其特征在于，第一工序中使用过氧化氢酶、偶联剂及铁络合物，第二工序中使用氢供体及过氧化物酶。
19.根据权利要求14所述的脂蛋白胆固醇定量方法，其特征在于，第一工序中使用过氧化物酶及氢供体，第二工序中使用偶联剂及铁络合物。
20.根据权利要求14或15所述的脂蛋白胆固醇定量方法，其特征在于，第一工序中使用过氧化氢酶、氢供体及铁络合物，第二工序中使用过氧化物酶及偶联剂。
21.根据权利要求14或15所述的脂蛋白胆固醇定量方法，其特征在于，第一工序中使用过氧化物酶、氢供体及铁络合物，第二工序中使用偶联剂。
22.根据权利要求17、19及21中任一项所述的脂蛋白胆固醇定量方法，其特征在于，第一工序中还使用过氧化氢酶。
23.根据权利要求14～22中任一项所述的脂蛋白胆固醇定量方法，其特征在于，第一工序中还包含作用于测定对象以外的脂蛋白的表面活性剂，第二工序中还使用至少作用于待测脂蛋白的表面活性剂。
24.根据权利要求14～23中任一项所述的脂蛋白胆固醇定量方法，其中，待测的所述脂蛋白胆固醇为LDL胆固醇、HDL胆固醇、HDL3胆固醇、残粒胆固醇或含apoE HDL-胆固醇。
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