CN115575627B - 超支化聚缩水甘油醚的应用、蛋白质标记物保存液和比浊法检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了超支化聚缩水甘油醚的应用、蛋白质标记物保存液和比浊法检测试剂盒，属于生物检测试剂技术领域。本发明采用超支化聚缩水甘油醚作为保存蛋白质标记物的稳定剂，所述超支化聚缩水甘油醚分子整体为球状结构，外层有大量的亲水性羟基，能够在水溶液中均匀的分散，可以作为载体支撑蛋白质标记物，使所述蛋白质标记物能够稳定分散于水溶液中，减少因自然沉降带来的分层效应，提高蛋白质标记物的分散性、水溶性和稳定性，尤其是热稳定性有显著提高。而且所述超支化聚缩水甘油醚内层具有分子空穴，能有效的形成局部浓缩与包裹蛋白质标记物的特性，将其用于比浊法检测试剂盒中，能够提高单位时间内抗原抗体亲和反应速率，从而提高灵敏度。

Description

超支化聚缩水甘油醚的应用、蛋白质标记物保存液和比浊法 检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测试剂技术领域，尤其涉及超支化聚缩水甘油醚的应用、蛋白质标记物保存液和比浊法检测试剂盒。

背景技术

蛋白质是一种具有复杂空间立体结构的大分子物质，其具有生物活性，但易受外界条件的影响发生变性。利用示踪载体对蛋白质进行标记得到蛋白质标记物，常用于免疫学实验测试过程中。为了保证所述蛋白质标记物的稳定性，现有技术中通常采用BSA、明胶、水解明胶或酪蛋白作为保护剂，但蛋白质标记物的稳定性仍有待提高。

发明内容

本发明的目的在于提供超支化聚缩水甘油醚的应用、蛋白质标记物保存液和比浊法检测试剂盒，本发明采用超支化聚缩水甘油醚作为蛋白质标记物的稳定剂，能够有效提高蛋白质标记物的稳定性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种超支化聚缩水甘油醚作为稳定剂在蛋白质标记物保存中的应用。

优选地，所述蛋白质标记物为蛋白质与示踪载体经物理方式结合或化学方式结合得到。

优选地，所述示踪载体包括高分子聚合物微球、胶体金颗粒、磁微粒、量子点、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和吖啶酯中的一种或几种。

优选地，所述超支化聚缩水甘油醚的数均分子量为（2.0~4.0）×10³，支化度为0.3~0.7。

优选地，所述蛋白质标记物包括聚苯乙烯胶乳微球抗体标记物、胶体金颗粒抗体标记物或量子点微球抗体标记物。

本发明提供了一种蛋白质标记物保存液，包括溶剂和以下浓度的组分：

超支化聚缩水甘油醚1~10g/L，蔗糖1~20g/L，聚蔗糖1~20g/L，蛋白保护剂1~10g/L，表面活性剂1~10g/L，防腐剂1~10g/L。

优选地，所述溶剂为缓冲液，所述缓冲液的pH值为7.4~8.0。

优选地，所述蛋白保护剂包括可溶性多肽或可溶性蛋白质。

优选地，所述表面活性剂包括司盘类表面活性剂、烷基葡糖苷表面活性剂或聚山梨酯类表面活性剂。

本发明提供了一种比浊法检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2和标准品S；所述试剂R1为PBST溶液，所述试剂R2包括蛋白质标记物和上述技术方案所述蛋白质标记物保存液。

本发明提供了一种超支化聚缩水甘油醚作为蛋白质标记物的稳定剂的应用。本发明采用超支化聚缩水甘油醚作为保存蛋白质标记物的稳定剂，所述超支化聚缩水甘油醚分子整体为球状结构，外层有大量的亲水性羟基，使得其具备良好的亲水性，能够在水溶液中均匀的分散，可以作为载体支撑蛋白质标记物，使所述蛋白质标记物能够稳定分散于水溶液中，减少因自然沉降带来的分层效应，提高蛋白质标记物的分散性、水溶性和稳定性，尤其是热稳定性有显著提高。而且所述超支化聚缩水甘油醚内层具有分子空穴，能有效的形成局部浓缩与包裹蛋白质标记物的特性，将其用于比浊法检测试剂盒中，能够提高单位时间内抗原抗体亲和反应速率，从而提高灵敏度。

附图说明

图1为实施例1制备的蛋白质标记物保存液与对照保存液在相同反应体系条件下（S:R1:R2）的校准曲线比较图；

图2为采用实施例1制备的蛋白质标记物保存液与对照保存液在胶乳比浊方法中试剂空白空白吸光度随时间变化图。

具体实施方式

本发明提供了一种超支化聚缩水甘油醚作为蛋白质标记物的稳定剂的应用。

在本发明中，所述超支化聚缩水甘油醚（HPG）的分子内部具有大量的空穴结构，在分子末端具有丰富的官能团，同时相较于线性聚合物具有较低的黏度，由于分子支链的高度超支化，使得分子具备紧凑的球形结构，分子链缠结少，具备高溶解度、低黏度和良好的生物相容性等重要特性，对于蛋白质标记物具有较好的稳定作用。

在本发明中，所述超支化聚缩水甘油醚具有式I所示结构：

式I。

在本发明中，所述超支化聚缩水甘油醚的数均分子量优选为（2.0~4.0）×10³，更优选为2.5×10³。本发明对所述超支化聚缩水甘油醚的来源没有特殊限限定，采用本领域技术人员熟知的方法制备得到即可；在本发明的实施例中，所述超支化聚缩水甘油醚优选参照文献《超支化聚缩水甘油的合成及性能》中“1.3 实验过程”部分记载的方案（王宗胜等，超支化聚缩水甘油的合成及性能[J]. 功能高分子学报, 2019, 8, 32(4): 507-512.）制备得到。

在本发明中，所述蛋白质标记物具体为蛋白质与示踪载体经物理方式结合或化学方式结合得到。在本发明中，所述物理方式结合优选为蛋白质与示踪载体经分子间相互作用力结合形成稳定构象，具体的，所述蛋白质与示踪载体可以通过电荷吸附作用结合。在本发明中，所述化学方式结合优选为蛋白质与示踪载体经化学键合形成稳定构象，具体的，蛋白质与示踪载体可以通过脱水缩合方式、形成酰胺键、醚键或二硫键中的一种或几种方式键合联接。在本发明中，所述示踪载体优选包括高分子聚合物微球、胶体金颗粒、磁微粒、量子点、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和吖啶酯中的一种或几种；所述高分子聚合物微球具体可以为羧基乳胶微球，所述羧基乳胶微球是指以聚苯乙烯为骨架，表面带有羧基的一种固相载体。

本发明对所述蛋白质标记物的来源没有特殊限定，本领域技术人员熟知的市售商品或采用本领域技术人员熟知的方法制备得到均可。在本发明中，所述蛋白质标记物优选包括聚苯乙烯胶乳微球蛋白标记物、量子点微球蛋白标记物、胶体金颗粒蛋白标记物、磁微粒蛋白标记物，碱性磷酸酶-蛋白标记物或吖啶酯-蛋白标记物；其中，所述聚苯乙烯胶乳微球蛋白标记物具体可以为聚苯乙烯胶乳微球抗体标记物，也可以为聚苯乙烯胶乳微球抗原标记物；所述量子点微球蛋白标记物具体可以为量子点微球抗体标记物，也可以为量子点微球抗原标记物；所述胶体金颗粒蛋白标记物具体可以为胶体金颗粒抗体标记物，也可以为胶体金颗粒抗原标记物。

本发明提供了一种蛋白质标记物保存液，包括溶剂和以下浓度的组分：

超支化聚缩水甘油醚1~10g/L，蔗糖1~20g/L，聚蔗糖1~20g/L，蛋白保护剂1~10g/L，表面活性剂1~10g/L，防腐剂1~10g/L。

在本发明中，所述溶剂优选为缓冲液，所述缓冲液的pH值优选为7.4~8.0。在本发明中，所述缓冲液优选包括磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液或TAPSO缓冲液；所述磷酸盐缓冲液具体由磷酸氢二钠与磷酸二氢钠配制得到，所述磷酸盐缓冲液的浓度优选为20~200mmol/L；所述Tris缓冲液、HEPES缓冲液和TAPSO缓冲液的浓度优选独立为5~100mmol/L，更优选独立为30~50mmol/L。

在本发明中，所述蛋白质标记物保存液中超支化聚缩水甘油醚的浓度为1~10g/L，优选为1~5g/L，进一步优选为1~3g/L。在本发明中，将蛋白质标记物保存于本发明提供的蛋白质标记物保存液中时，所述蛋白质标记物中蛋白质的含量优选为5μg/mL~20mg/mL。在本发明中，所述超支化聚缩水甘油醚内层具有分子空穴，能有效的形成局部浓缩与包裹蛋白质标记物的特性，将其用于比浊法检测试剂盒中，能够提高单位时间内抗原抗体亲和反应速率，从而提高灵敏度；具体的，所述超支化聚缩水甘油醚的支化链上含有亲水基团，能够与蛋白的相应部位发生一定的亲和，但是又由于其支化链上没有能够与抗原或抗体反应的特异性位点，加上蛋白质标记物能够有效地附着于超支化聚缩水甘油醚的支化链中，增加局部浓缩效果，变相提高反应速率，相当于在较短时间即可形成较多的抗原抗体复合物，从而提高反分析灵敏度。

在本发明中，所述蛋白质标记物保存液中蔗糖的浓度为1~20g/L，优选为5~10g/L。在本发明中，所述蔗糖的作用是增加蛋白质标记物保存液的粘度，从而有利于提高蛋白质标记物在溶液中的均一性，使蛋白质标记物能够均匀且稳定的分散于溶液中，同时适当的高浓度蔗糖，能够减少微生物对于溶液的不良影响。

在本发明中，所述蛋白质标记物保存液中聚蔗糖的浓度为1~20g/L，优选为5~10g/L。在本发明中，所述聚蔗糖优选为聚蔗糖400（即聚合度为400），其作用是使蛋白质标记物保持较好的分散性。

在本发明中，所述蛋白质标记物保存液中蛋白保护剂的浓度为1~10g/L，优选为1~5g/L。在本发明中，所述蛋白保护剂优选包括可溶性多肽或可溶性蛋白质，所述可溶性多肽优选包括明胶或水解明胶，所述可溶性蛋白质优选包括牛血清白蛋白（BSA）、酪蛋白、水解酪蛋白或脱脂奶粉；所述蛋白保护剂的作用是提高非特异性蛋白含量，稳定环境对标记物的影响。

在本发明中，所述蛋白质标记物保存液中表面活性剂的浓度为1~10g/L，优选为1~5g/L。在本发明中，所述表面活性剂优选包括司盘类表面活性剂、烷基葡糖苷表面活性剂或聚山梨酯类表面活性剂，所述聚山梨酯类表面活性剂优选为吐温20；所述表面活性剂能够调节蛋白质标记物保存液的表面张力，防止蛋白质标记物或其他蛋白造成仪器管路残留污染。

在本发明中，所述蛋白质标记物保存液中防腐剂的浓度为1~10g/L，优选为1~5g/L。在本发明中，所述防腐剂优选包括山梨酸钾、柠檬酸钠、叠氮钠和Proclin 300中的一种或几种，更优选为叠氮钠。

在本发明中，所述蛋白质标记物保存液优选还包括pH值调节剂，所述pH值调节剂的用量以使所述蛋白质标记物保存液的pH值为7.4~8.0为基准，更优选为8.0。在本发明中，所述pH值调节剂优选为酸性调节剂，更优选包括甘氨酸或盐酸，所述甘氨酸具体以固体形式直接使用，所述盐酸的浓度优选为1~2mol/L。

本发明优选将蛋白质标记物保存液的各组分混合，即得到所述蛋白质标记物保存液；当所述蛋白质标记物保存液还包括pH值调节剂时，所述pH值调节剂优选最后加入。在本发明中，各组分混合后优选还包括过滤，具体是采用0.22μm微孔滤膜过滤。

本发明提供了一种比浊法检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2和标准品S；所述试剂R1为PBST溶液，所述试剂R2包括蛋白质标记物和上述技术方案所述蛋白质标记物保存液。在本发明中，所述PBST溶液的浓度优选为10~200mmol/L，更优选为100~200mmol/L，进一步优选为150~200mmol/L；pH值优选为7.2~7.6，更优选为7.4。在本发明中，所述试剂R2具体是首先制备蛋白质标记物，然后将所述蛋白质标记物与所述蛋白质标记物保存液混合得到。在本发明中，所述标准品S优选为BSA溶液，具体是由PBS缓冲液与BSA配制得到；所述PBS缓冲液的浓度优选为10~100mmol/L，更优选为20~50mmol/L，pH值优选为7.2~7.6，更优选为7.4；所述标准品S中BSA的浓度优选为0.1~1.0，更优选为0.5%（w/v）。

将本发明提供的蛋白质标记物保存液作为比浊试剂的基质液，即在制备得到蛋白质标记物后，利用所述蛋白质标记物保存液重新复悬所述蛋白质标记物，根据复悬标蛋白质记物的吸光度，可以调整所述蛋白质标记物保存液用量。采用本发明提供的蛋白质标记物保存液能够提高蛋白质标记物的稳定性以及分散性，且分析灵敏度有显著提升。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明以下实施例中所用超支化缩水甘油醚（HPG）参照文献（超支化聚缩水甘油的合成及性能，功能高分子学报，2019年8月，Vol.32，No.4，507-512）制备得到，包括以下步骤：

（1）采用CaH₂对缩水甘油（即2,3-环氧-1-丙醇）进行过夜干燥处理，之后在45℃±5℃条件下进行减压蒸馏纯化，收集40~50℃条件下的馏分并密封保存于0.4nm分子筛中，储存于4℃冰箱中备用。

（2）将1,1,1-三羟甲基丙烷（TMP）添加至干燥的反应容器中，在65℃、无氧环境下加入无水N-甲基吡咯烷酮以及含叔丁醇钾的四氢呋喃溶液，磁力搅拌1h，以排除叔丁醇和四氢呋喃。

（3）将步骤（2）所得体系的温度升高至120℃，使用微量注射泵以0.75mL/min的速率滴加缩水甘油，其中，所述缩水甘油与1,1,1-三羟甲基丙烷（TMP）以及N-甲基吡咯烷酮的摩尔比为80:1:3；所述缩水甘油滴加完毕后，继续搅拌3h；之后使用无水甲醇溶解所得产物体系，随后经阳离子交换树脂中和，并将所得料液转移至10倍体积的丙酮中沉析，所得沉淀物为粗产物；采用甲醇溶解所述粗产物，之后使用旋转蒸发仪于45℃条件下除去甲醇，得到黄色透明的黏稠液体。

（4）采用截留分子量为1×10³的透析袋于纯水中对步骤（3）所得体系进行透析处理，之后经冷冻干燥，得到超支化缩水甘油醚，数均分子量为2.5×10³，支化度为0.3~0.7。

实施例1

制备蛋白质标记物保存液，包括以下步骤：

配制浓度为50mmol/L的Tris缓冲液，将10g蔗糖、5g聚蔗糖（聚合度为400）、1g超支化缩水甘油醚（HPG）、5g牛血清白蛋白（BSA）、1g吐温-20和1g Proclin 300溶于1L所述Tris缓冲液中，然后采用甘氨酸固体调整pH值至8.00±0.05（25℃），经0.22μm微孔滤膜过滤，得到蛋白质标记物保存液。

实施例2

（1）用1mL去离子水溶解EDC 10mg和NHS 15mg，配制得到活化剂；

（2）称取1.0g羧基胶乳微球悬浊液（市售产品，JSR，货号P0116；所述羧基胶乳微球悬浊液中羧基胶乳微球干重为50mg，所述羧基胶乳微球直径为123nm），用去离子水稀释至4mL，得到羧基胶乳微球分散液；

（3）将所述羧基胶乳微球分散液与活化剂混合，于4℃条件下活化1h，得到活化羧基胶乳微球分散液；

（4）取200mg兔抗CysC多克隆抗体（市售产品，博奥森），用20mmol/L pH值为7.4的PBS缓冲液稀释至5mL，得到抗体溶液；

（6）将所述抗体溶液匀速滴加至所述活化羧基胶乳微球分散液中，于4℃条件下标记1h，然后向所得分散液中加入500μL浓度为1wt%的BSA溶液，在4℃条件下封闭30h，得到标记物分散液；

（7）将所述标记物分散液等分成2份，分别记为A标记物分散液和B标记物分散液；将所述A标记物分散液和B标记物分散液分别加入离心管中，于18000rpm离心60min，弃去上清，所得标记物分别记为A标记物和B标记物；

（8）采用实施例1中制备的蛋白质标记物保存液复悬A标记物，得到A标记物复悬液；采用同样体积的对照保存液复悬B标记物，得到B标记物复悬液，其中，所述对照保存液以浓度为20mmol/L且pH值为7.4的Tris-HCl溶液为溶剂，且含有BSA 0.5%（w/v）、甘油5%（w/v）、聚蔗糖400 2%（w/v）和Proclin300 0.1%（v/v）；在570nm条件下用去离子水调零，用浓度为200mmol/L且pH值为7.4的PBST溶液分别将A标记物复悬液和B标记物复悬液稀释5倍，检测吸光度为0.90±0.01，确定A标记物复悬液和B标记物复悬液中蛋白质标记物浓度一致；

（9）用浓度为20mmol/L且pH值为7.4的PBS缓冲液配制终浓度为0.5%（w/v）的BSA溶液，经过0.22μm滤膜过滤，所得BSA溶液作为校准品S；用浓度为200mmol/L且pH值为7.4的PBST溶液作为试剂R1，分别用所述A标记物复悬液和B标记物复悬液作为试剂R2，在相同的试剂参数且波长为578nm条件下，以样本试剂比为S：R1：R2=3：240：60μL的比例，测定试剂分析灵敏度、线性范围以及空白吸光度。

图1为实施例1制备的蛋白质标记物保存液与对照保存液在相同反应体系条件下（S:R1:R2）的校准曲线比较图，结果显示，采用本发明提供的蛋白质标记物保存液时，校准品浓度（具体指抗原CysC在校准品稀释液中的浓度）为0.5mg/L时吸光度明显优于采用对照保存液时的吸光度，说明分析灵敏度明显提高。

表1为采用实施例1中制备的蛋白质标记物保存液与对照保存液在胶乳比浊试剂中热稳定性试验（于37℃热处理14天）后的校准曲线比较结果。由表1可知，采用本发明蛋白质标记物保存液的低值分析灵敏度明显优于采用对照保存液时的低值分析灵敏度，整体反应信号高于对照保存液，经过14天热稳定性处理，其低值分析灵敏度和线性均优于对照保存液。

表1 采用本发明蛋白质标记物保存液发明试剂与对照保存液在胶乳比浊试剂中热稳定性试验后校准曲线比较结果

图2为采用实施例1制备的蛋白质标记物保存液与对照保存液在胶乳比浊方法中试剂空白空白吸光度随时间变化图，由图2可知，与对照保存液相比，本发明提供的蛋白质标记物保存液在维持试剂均一性方面具有良好优势。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种蛋白质标记物保存液，包括溶剂和以下浓度的组分：

超支化聚缩水甘油醚1~10g/L，蔗糖1~20g/L，聚蔗糖1~20g/L，蛋白保护剂1~10g/L，表面活性剂1~10g/L，防腐剂1~10g/L。

2.根据权利要求1所述的蛋白质标记物保存液，其特征在于，所述蛋白质标记物为蛋白质与示踪载体经物理方式结合或化学方式结合得到。

3.根据权利要求2所述的蛋白质标记物保存液，其特征在于，所述示踪载体包括高分子聚合物微球、胶体金颗粒、磁微粒、量子点、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和吖啶酯中的一种或几种。

4.根据权利要求1~3任一项所述的蛋白质标记物保存液，其特征在于，所述超支化聚缩水甘油醚的数均分子量为（2.0~4.0）×10³，支化度为0.3~0.7。

5.根据权利要求4所述的蛋白质标记物保存液，其特征在于，所述蛋白质标记物包括聚苯乙烯胶乳微球抗体标记物、胶体金颗粒抗体标记物或量子点微球抗体标记物。

6.根据权利要求1所述的蛋白质标记物保存液，其特征在于，所述溶剂为缓冲液，所述缓冲液的pH值为7.4~8.0。

7.根据权利要求1所述的蛋白质标记物保存液，其特征在于，所述蛋白保护剂包括可溶性多肽或可溶性蛋白质。

8.根据权利要求1所述的蛋白质标记物保存液，其特征在于，所述表面活性剂包括司盘类表面活性剂、烷基葡糖苷表面活性剂或聚山梨酯类表面活性剂。

9.一种比浊法检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2和标准品S；所述试剂R1为PBST溶液，所述试剂R2包括蛋白质标记物和权利要求1~8任一项所述蛋白质标记物保存液。

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