CN115515560B - 冠状病毒感染的治疗 - Google Patents

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Abstract

本公开整体涉及病毒学、感染性疾病和医学领域，并且描述了用于治疗CoV介导的疾病例如由SARS‑CoV‑2、SAR8或MERS引起的疾病的化合物、组合物、方法和试剂盒。更具体地，本公开涉及冠状病毒的有效抑制剂，其可治疗冠状病毒，包括2019新型冠状病毒。在一个实施方案中，本公开提供了WX‑671作为冠状病毒的有效抑制剂的新用途及其在制备用于治疗人冠状病毒感染的药物中的应用。在一个实施方案中，本公开提供了ABC294640作为冠状病毒的有效抑制剂的新用途及其在制备用于治疗人冠状病毒感染的药物中的应用。

Description

冠状病毒感染的治疗
背景技术
冠状病毒是在细胞质中复制的脂质包膜正链RNA病毒(+ss RNA)。在2002年之前，冠状病毒被认为不是重要的人病原体。其他的人冠状病毒诸如HCoV-229E和HCoV-OC43在健康成人中仅导致轻度呼吸道感染。然而，目前已出现了严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)。
2012年，在沙特阿拉伯的一名严重呼吸系统疾病患者中检测到中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)。人MERS-CoV感染的临床特征范围从无症状到非常严重的肺炎，并可能发展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒性休克和导致死亡的多器官衰竭。自从报告了首例MERS-CoV感染并分离了该病毒以来，在了解该病毒的流行病学、生态学和生物学方面取得了显著进展。已经开发了几种通过实时逆转录(RT)-PCR检测MERS-CoV急性感染的测定法，并且正在广泛使用。
2019年，世界上出现了一种新型冠状病毒(nCoV)，并且目前已知其引起冠状病毒疾病2019(COVID-19)。COVID-19是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS冠状病毒-2或SARS-CoV-2)引起的感染性疾病，该病毒在系统发育上与SARS病毒密切相关。世界卫生组织(WHO)宣布2019-2020年冠状病毒爆发是国际关注的突发公共卫生事件(PHEIC)。对于大多数患者来说，COVID-19始于肺部并终于肺部，因为冠状病毒主要引起呼吸系统疾病。
发明内容
本发明整体涉及病毒学、感染性疾病和医学领域。在一个实施方案中，本发明提供了ABC294640作为游离碱或作为其盐在制备用于治疗人冠状病毒感染的药物中的新用途。
根据本文所示的方面，公开了一种用于治疗由SARS-CoV-2病毒引起的2019冠状病毒疾病(COVID-19)的方法，该方法包括向有需要的人施用有效量的ABC294640，
作为游离碱或作为其盐。在一个实施方案中，ABC294640作为盐酸盐存在。在一个实施方案中，ABC294640与药学上可接受的载体材料组合。在一个实施方案中，药学上可接受的载体材料是生理缓冲盐水。在一个实施方案中，形成包含悬浮在生理缓冲盐水中的ABC294640盐酸盐的悬浮液，并且施用包括使用管将悬浮液直接递送至胃。在一个实施方案中，ABC294640和任选的药学上可接受的载体材料处于适于口服施用的单位剂型中。在一个实施方案中，剂型是固体剂型。在一个实施方案中，固体剂型是胶囊。在一个实施方案中，SARS-CoV-2病毒是野生型的。在一个实施方案中，SARS-CoV-2病毒是天然存在的冠状病毒变体。在一个实施方案中，适于口服施用的单位剂型是具有250mg ABC294640盐酸盐的胶囊，并且其中施用包括每天两次施用两粒胶囊，持续至少10天，总日剂量为1000mg ABC294640盐酸盐。在一个实施方案中，施用有效量的ABC294640导致病毒载量降低至少10％。
根据本文所示的方面，公开了一种治疗方法，该方法包括将有效量的ABC294640，
作为游离碱或作为其盐，施用于患有由SARS-CoV-2病毒引起的2019冠状病毒疾病(COVID-19)的人。在一个实施方案中，ABC294640作为盐酸盐存在。在一个实施方案中，ABC294640与药学上可接受的载体材料组合。在一个实施方案中，药学上可接受的载体材料是生理缓冲盐水。在一个实施方案中，形成包含悬浮在生理缓冲盐水中的ABC294640盐酸盐的悬浮液，并且施用包括使用管将悬浮液直接递送至胃。在一个实施方案中，ABC294640和任选的药学上可接受的载体材料处于适于口服施用的单位剂型中。在一个实施方案中，剂型是固体剂型。在一个实施方案中，固体剂型是胶囊。在一个实施方案中，SARS-CoV-2病毒是野生型的。在一个实施方案中，SARS-CoV-2病毒是天然存在的冠状病毒变体。在一个实施方案中，适于口服施用的单位剂型是具有250mg ABC294640盐酸盐的胶囊，并且其中施用包括每天两次施用两粒胶囊，持续至少10天，总日剂量为1000mgABC294640盐酸盐。
根据本文所示的方面，公开了ABC294640，
作为游离碱或作为其盐，其用于治疗冠状病毒感染。
根据本文所示的方面，公开了ABC294640，
作为游离碱或作为其盐，其用于治疗由SARS-CoV-2病毒引起的2019冠状病毒疾病(COVID-19)。
根据本文所示的方面，公开了作为游离碱或作为其盐的(3-(4-氯-苯基)-金刚烷-1-甲酸(吡啶-4-基甲基)-酰胺)，其用于治疗冠状病毒感染。
根据本文所示的方面，公开了作为游离碱或作为其盐的(3-(4-氯-苯基)-金刚烷-1-甲酸(吡啶-4-基甲基)-酰胺)，其用于治疗由SARS-CoV-2病毒引起的2019冠状病毒疾病(COVID-19)。
根据本文所示的方面，公开了ABC294640，
作为游离碱或作为其盐，用于制造用于治疗冠状病毒感染的药物的用途。
根据本文所示的方面，公开了ABC294640，
作为游离碱或作为其盐，用于制造用于治疗由SARS-CoV-2病毒引起的2019冠状病毒疾病(COVID-19)的药物的用途。
根据本文所示的方面，公开了作为游离碱或作为其盐的(3-(4-氯-苯基)-金刚烷-1-甲酸(吡啶-4-基甲基)-酰胺)用于制造用于治疗冠状病毒感染的药物的用途。
根据本文所示的方面，公开了作为游离碱或作为其盐的化合物(3-(4-氯-苯基)-金刚烷-1-甲酸(吡啶-4-基甲基)-酰胺)用于制造用于治疗由SARS-CoV-2病毒引起的2019冠状病毒疾病(COVID-19)的药物的用途。
根据本文所示的方面，公开了一种用于治疗冠状病毒感染的药物组合物，该药物组合物包含ABC294640，
作为游离碱或作为其盐。
根据本文所示的方面，公开了一种用于治疗由SARS-CoV-2病毒引起的2019冠状病毒疾病(COVID-19)的药物组合物，该药物组合物包含ABC294640，
作为游离碱或作为其盐。
根据本文所示的方面，公开了一种用于治疗冠状病毒感染的药物组合物，该药物组合物包含作为游离碱或作为其盐的(3-(4-氯-苯基)-金刚烷-1-甲酸(吡啶-4-基甲基)-酰胺)。
根据本文所示的方面，公开了一种用于治疗由SARS-CoV-2病毒引起的2019冠状病毒疾病(COVID-19)的药物组合物，该药物组合物包含作为游离碱或作为其盐的(3-(4-氯-苯基)-金刚烷-1-甲酸(吡啶-4-基甲基)-酰胺)。
根据本文所示的方面，公开了一种抗冠状病毒感染剂，该抗冠状病毒感染剂包含ABC294640，
作为游离碱或作为其盐。
根据本文所示的方面，公开了一种包含作为游离碱或作为其盐的(3-(4-氯-苯基)-金刚烷-1-甲酸(吡啶-4-基甲基)-酰胺)的抗冠状病毒感染剂。
根据本文所示的方面，公开了一种用于治疗人冠状病毒感染的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的ABC294640(3-(4-氯-苯基)-金刚烷-1-甲酸(吡啶-4-基甲基)-酰胺)或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，该方法还包括在施用ABC294640之前诊断性地确认受试者感染了人冠状病毒。在一个实施方案中，ABC294640作为盐酸盐存在。在一个实施方案中，冠状病毒感染是严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)。
根据本文所示的方面，公开了一种治疗COVID-19(SARS-CoV-2)冠状病毒感染的方法，该方法包括向有需要的受试者施用一个或多个治疗有效剂量的ABC294640(3-(4-氯-苯基)-金刚烷-1-甲酸(吡啶-4-基甲基)-酰胺)或其药学上可接受的盐至少10天。在一个实施方案中，该方法还包括在施用化合物之前诊断性地确认受试者感染了SARS-CoV-2。在一个实施方案中，ABC294640作为盐酸盐存在。在一个实施方案中，ABC294640每天的总剂量在每次出现时独立地选自约250mg至约1500mg。
根据本文所示的方面，公开了一种用于治疗COVID-19(SARS-CoV-2)冠状病毒感染的方法，该方法包括向有需要的人受试者施用药学有效量的ABC294640(3-(4-氯-苯基)-金刚烷-1-甲酸(吡啶-4-基甲基)-酰胺)或其药学可接受的盐，ABC294640具有作用于宿主细胞因子鞘氨醇激酶-2(SK2)的能力，该宿主细胞因子参与细胞内的病毒复制和下游炎性/免疫应答。
根据本文所示的方面，公开了一种调节冠状病毒在感染冠状病毒的宿主细胞中的复制的方法，该方法包括向宿主细胞施用有效调节病毒复制的量的作为游离碱或作为其盐的ABC294640。
根据本文所示的方面，公开了作为游离碱或作为其盐的ABC294640在制备用于治疗冠状病毒感染的药物中的用途。在一个实施方案中，冠状病毒是2019新型冠状病毒COVID-19。在一个实施方案中，冠状病毒感染是冠状病毒肺炎。在一个实施方案中，ABC294640作为盐酸盐存在。在一个实施方案中，ABC294640具有针对宿主细胞因子鞘氨醇酶-2的活性，该宿主细胞因子参与细胞内的病毒复制和下游炎性/免疫应答。
根据本文所示的方面，本发明的特征在于包装的药物产品。包装的药物产品包括容器、容器中适于口服施用的多个ABC294640单位剂型、以及与容器相关联并指示施用ABC294640用于治疗由SARS-CoV-2病毒引起的2019冠状病毒疾病(COVID-19)的图例(例如，标签或插页)。
在一个实施方案中，本发明提供了WX-671作为(L)-或(D)-对映体和作为E-或(Z)-异构体或(E/Z)-混合物以及作为游离碱或作为其盐在制备用于治疗人冠状病毒感染的药物中的新用途。
根据本文所示的方面，公开了一种在有需要的人中治疗由SARS-CoV-2病毒引起的2019冠状病毒疾病(COVID-19)的方法，该方法包括施用有效量的WX-671，
作为(L)-或(D)-对映体和作为E-或(Z)-异构体或(E/Z)-混合物以及作为游离碱或作为其盐。在一个实施方案中，WX-671作为硫酸氢盐存在。在一个实施方案中，WX-671与药学上可接受的载体材料组合。在一个实施方案中，WX-671和任选的药学上可接受的载体材料呈适于口服施用的单位剂型。在一个实施方案中，剂型是固体剂型。在一个实施方案中，固体剂型是胶囊。在一个实施方案中，SARS-CoV-2病毒是野生型的。在一个实施方案中，SARS-CoV-2病毒是天然存在的冠状病毒变体。在一个实施方案中，将200mg WX-671以单粒胶囊施用于有需要的人，每天一次，持续至少10天，总日剂量为200mg。在一个实施方案中，将400mg WX-671以两粒胶囊施用于有需要的人，每天一次，持续至少10天，总日剂量为400mg。在一个实施方案中，将约231mg WX-671.1(乌莫司他(upamostat))以单粒胶囊施用于有需要的人，每天一次，持续至少10天，总日剂量相当于200mg游离形式。在一个实施方案中，将约463mg WX-671.1(乌莫司他)作为两粒胶囊施用于有需要的人，每天一次，持续至少10天，总日剂量相当于400mg游离形式。在一个实施方案中，施用有效量的WX-671导致病毒载量降低至少10％。
根据本文所示的方面，公开了一种治疗方法，该方法包括将有效量的WX-671，
作为(L)-或(D)-对映体和作为E-或(Z)-异构体或(E/Z)-混合物以及作为游离碱或作为其盐，施用于患有由SARS-CoV-2病毒引起的2019冠状病毒疾病(COVID-19)的人。在一个实施方案中，WX-671作为硫酸氢盐存在。在一个实施方案中，WX-671与药学上可接受的载体材料组合。在一个实施方案中，WX-671和任选的药学上可接受的载体材料呈适于口服施用的单位剂型。在一个实施方案中，剂型是固体剂型。在一个实施方案中，固体剂型是胶囊。在一个实施方案中，SARS-CoV-2病毒是野生型的。在一个实施方案中，SARS-CoV-2病毒是天然存在的冠状病毒变体。在一个实施方案中，WX-671.1(乌莫司他)作为包含200mg游离碱的单粒胶囊施用，并且其中将单粒胶囊每天一次施用于有需要的人，持续至少10天，总日剂量为200mg。在一个实施方案中，WX-671.1(乌莫司他)作为两粒胶囊施用，每粒胶囊包含200mg，并且其中将两粒胶囊每天一次施用于有需要的人持续至少10天，总日剂量为400mg。
根据本文所示的方面，公开了WX-671，
作为(L)-或(D)-对映体和作为E-或(Z)-异构体或(E/Z)-混合物以及作为游离碱或作为其盐，其用于治疗冠状病毒感染。
根据本文所示的方面，公开了WX-671，
作为(L)-或(D)-对映体和作为E-或(Z)-异构体或(E/Z)-混合物以及作为游离碱或作为其盐，其用于治疗由SARS-CoV-2病毒引起的2019冠状病毒疾病(COVID-19)。
根据本文所示的方面，公开了(N-α-(2,4,6-三异丙基苯磺酰基)-3-羟基脒基-苯丙氨酸-4-乙氧基羰基哌嗪)作为(L)-或(D)-对映体和作为E-或(Z)-异构体或(E/Z)-混合物以及作为游离碱或作为其盐，其用于治疗冠状病毒感染。
根据本文所示的方面，公开了(N-α-(2,4,6-三异丙基苯磺酰基)-3-羟基脒基-苯丙氨酸-4-乙氧基羰基哌嗪)作为(L)-或(D)-对映体和作为E-或(Z)-异构体或(E/Z)-混合物以及作为游离碱或作为其盐，其用于治疗由SARS-CoV-2病毒引起的2019冠状病毒疾病(COVID-19)。
根据本文所示的方面，公开了WX-671，
作为(L)-或(D)-对映体和作为E-或(Z)-异构体或(E/Z)-混合物以及作为游离碱或作为其盐，用于制造用于治疗冠状病毒感染的药物的用途。
根据本文所示的方面，公开了WX-671，
作为(L)-或(D)-对映体和作为E-或(Z)-异构体或(E/Z)-混合物以及作为游离碱或作为其盐，用于制造用于治疗由SARS-CoV-2病毒引起的2019冠状病毒疾病(COVID-19)的药物的用途。
根据本文所示的方面，公开了(N-α-(2,4,6-三异丙基苯磺酰基)-3-羟基脒基-苯丙氨酸-4-乙氧基羰基哌嗪)作为(L)-或(D)-对映体和作为E-或(Z)-异构体或(E/Z)-混合物以及作为游离碱或作为其盐用于制造用于治疗冠状病毒感染的药物的用途。
根据本文所示的方面，公开了(N-α-(2,4,6-三异丙基苯磺酰基)-3-羟基脒基-苯丙氨酸-4-乙氧基羰基哌嗪)作为(L)-或(D)-对映体和作为E-或(Z)-异构体或(E/Z)-混合物以及作为游离碱或作为其盐用于制造用于治疗由SARS-CoV-2病毒引起的2019冠状病毒疾病(COVID-19)的药物的用途。
根据本文所示的方面，公开了一种用于治疗冠状病毒感染的药物组合物，该药物组合物包含WX-671，
作为(L)-或(D)-对映体和作为E-或(Z)-异构体或(E/Z)-混合物以及作为游离碱或作为其盐。
根据本文所示的方面，公开了一种用于治疗由SARS-CoV-2病毒引起的2019冠状病毒疾病(COVID-19)的药物组合物，该药物组合物包含WX-671，
作为(L)-或(D)-对映体和作为E-或(Z)-异构体或(E/Z)-混合物以及作为游离碱或作为其盐。
根据本文所示的方面，公开了一种用于治疗冠状病毒感染的药物组合物，该药物组合物包含(N-α-(2,4,6-三异丙基苯磺酰基)-3-羟基脒基-苯丙氨酸-4-乙氧基羰基哌嗪)作为(L)-或(D)-对映体和作为E-或(Z)-异构体或(E/Z)-混合物以及作为游离碱或作为其盐。
根据本文所示的方面，公开了一种用于治疗由SARS-CoV-2病毒引起的2019冠状病毒疾病(COVID-19)的药物组合物，该药物组合物包含(N-α-(2,4,6-三异丙基苯磺酰基)-3-羟基脒基-苯丙氨酸-4-乙氧基羰基哌嗪)作为(L)-或(D)-对映体和作为E-或(Z)-异构体或(E/Z)-混合物以及作为游离碱或作为其盐。
根据本文所示的方面，公开了一种抗冠状病毒感染剂，该抗冠状病毒感染剂包含WX-671，
作为(L)-或(D)-对映体和作为E-或(Z)-异构体或(E/Z)-混合物以及作为游离碱或作为其盐。
根据本文所示的方面，公开了一种抗冠状病毒感染剂，该抗冠状病毒感染剂包含作为(L)-或(D)-对映体和作为E-或(Z)-异构体或(E/Z)-混合物以及作为游离碱或作为其盐的(N-α-(2,4,6-三异丙基苯磺酰基)-3-羟基脒基-苯丙氨酸-4-乙氧基羰基哌嗪)。
根据本文所示的方面，公开了一种用于治疗人冠状病毒感染的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的选自N-α(2,4,6-三异丙基苯磺酰基)-3-脒基-苯丙氨酸-4-乙氧基-羰基哌嗪-盐酸盐或其前药N-α-(2,4,6-三异丙基苯磺酰基)-3-羟基脒基-苯丙氨酸-4-乙氧基羰基哌嗪中的一者的化合物，其中所选择的化合物可作为(L)-或(D)-对映体和作为E-或(Z)-异构体或(E/Z)-混合物以及作为游离碱或作为其盐存在。在一个实施方案中，该方法还包括在施用化合物之前诊断性地确认受试者感染了人冠状病毒。在一个实施方案中，冠状病毒感染是严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)。在一个实施方案中，化合物是N-α-(2,4,6-三异丙基苯磺酰基)-3-羟基脒基-苯丙氨酸-4-乙氧基羰基哌嗪并且是可口服施用的形式。在一个实施方案中，化合物是N-α(2,4,6-三异丙基苯磺酰基)-3-脒基-苯丙氨酸-4-乙氧基-羰基哌嗪-盐酸盐并且是待静脉内或肌内递送的可注射形式。在一个实施方案中，化合物是作为硫酸盐或硫酸氢盐存在的N-α-(2,4,6-三异丙基苯磺酰基)-3-羟基脒基-苯丙氨酸-4-乙氧基羰基哌嗪。
在一个实施方案中，化合物是以L-立体异构体构象存在的N-α-(2,4,6-三异丙基苯磺酰基)-3-羟基脒基-苯丙氨酸-4-乙氧基羰基哌嗪。在一个实施方案中，化合物是N-α-(2,4,6-三异丙基苯磺酰基)-3-羟基脒基-(L)-苯丙氨酸-4-乙氧基羰基哌嗪鎓硫酸氢盐。在一个实施方案中，化合物是N-α-(2,4,6-三异丙基苯磺酰基)-3-羟基脒基-苯丙氨酸-4-乙氧基羰基哌嗪并且待以每天200mg的剂量施用。在一个实施方案中，化合物是N-α-(2,4,6-三异丙基苯磺酰基)-3-羟基脒基-苯丙氨酸-4-乙氧基羰基哌嗪并且待以每天400mg的剂量施用。
根据本文所示的方面，公开了一种治疗COVID-19(SARS-CoV-2)冠状病毒感染的方法，该方法包括向有需要的受试者施用一个或多个治疗有效剂量的选自N-α(2,4,6-三异丙基苯磺酰基)-3-脒基-苯丙氨酸-4-乙氧基-羰基哌嗪-盐酸盐或其前药N-α-(2,4,6-三异丙基苯磺酰基)-3-羟基脒基-苯丙氨酸-4-乙氧基羰基哌嗪中的一者的化合物至少14天，其中所选择的化合物可作为(L)-或(D)-对映体和作为E-或(Z)-异构体或(E/Z)-混合物以及作为游离碱或作为其盐存在。在一个实施方案中，该方法还包括在施用化合物之前诊断性地确认受试者感染了SARS-CoV-2。在一个实施方案中，化合物N-α-(2,4,6-三异丙基苯磺酰基)-3-羟基脒基-苯丙氨酸-4-乙氧基羰基哌嗪每天的总剂量在每次出现时独立地选自约200mg至约400mg。在一个实施方案中，化合物是N-α-(2,4,6-三异丙基苯磺酰基)-3-羟基脒基-(L)-苯丙氨酸-4-乙氧基羰基哌嗪鎓硫酸氢盐。
根据本文所示的方面，公开了一种用于治疗COVID-19(SARS-CoV-2)冠状病毒感染的方法，该方法包括向有需要的人受试者施用治疗可接受量的选自N-α(2,4,6-三异丙基苯磺酰基)-3-脒基-苯丙氨酸-4-乙氧基-羰基哌嗪-盐酸盐或其前药N-α-(2,4,6-三异丙基苯磺酰基)-3-羟基脒基-苯丙氨酸-4-乙氧基羰基哌嗪中的一者的化合物，其中所选择的化合物可作为(L)-或(D)-对映体和作为E-或(Z)-异构体或(E/Z)-混合物以及作为游离碱或作为其盐存在，该化合物具有结合血凝素(HA)-激活的II型跨膜丝氨酸蛋白酶(TTSP)的能力，从而减少人受试者暴露于冠状病毒后的冠状病毒复制。在一个实施方案中，TTSP是跨膜蛋白酶丝氨酸SI成员2(TMPRSS2)。在一个实施方案中，TTSP是跨膜蛋白酶丝氨酸11A(TMPRSS11(A))。在一个实施方案中，该方法还包括在施用化合物之前诊断性地确认受试者感染了SARS-CoV-2。在一个实施方案中，化合物是N-α-(2,4,6-三异丙基苯磺酰基)-3-羟基脒基-(L)-苯丙氨酸-4-乙氧基羰基哌嗪鎓硫酸氢盐。
根据本文所示的方面，公开了一种调节冠状病毒在感染冠状病毒的宿主细胞中的复制的方法，该方法包括向宿主细胞施用有效调节病毒复制的量的选自N-α(2,4,6-三异丙基苯磺酰基)-3-脒基-苯丙氨酸-4-乙氧基-羰基哌嗪-盐酸盐或其前药N-α-(2,4,6-三异丙基苯磺酰基)-3-羟基脒基-苯丙氨酸-4-乙氧基羰基哌嗪中的一者的化合物，其中所选化合物可作为(L)-或(D)-对映体和作为E-或(Z)-异构体或(E/Z)-混合物以及作为游离碱或作为其盐存在。在一个实施方案中，化合物是N-α-(2,4,6-三异丙基苯磺酰基)-3-羟基脒基-(L)-苯丙氨酸-4-乙氧基羰基哌嗪鎓硫酸氢盐。
根据本文所示的方面，公开了WX-671在制备用于治疗冠状病毒感染的药物中的用途。在一个实施方案中，冠状病毒是2019新型冠状病毒COVID-19。在一个实施方案中，冠状病毒感染是冠状病毒肺炎。在一个实施方案中，WX-671具有针对宿主丝氨酸蛋白酶抑制剂的活性并且阻断刺突蛋白驱动的宿主细胞进入。
根据本文所示的方面，本发明的特征在于包装的药物产品。包装的药物产品包括容器、容器中适于口服施用的多个WX-671单位剂型、以及与容器相关联并指示施用WX-671用于治疗由SARS-CoV-2病毒引起的2019冠状病毒疾病(COVID-19)的图例(例如，标签或插页)。
附图说明
将参考附图进一步解释当前公开的实施方案。所示的附图未必按比例绘制，而是通常将重点放在说明当前公开的实施方案的原理上。
图1描绘了人EpiAirwayTM细胞培养模型，本文称为人支气管上皮细胞(HBEC)。
图2是显示在奥帕尼布(opaganib)处理的SARS-CoV-2感染的HBEC培养物中，温育3天后，在药理学相关浓度下观察到感染性病毒产量的剂量依赖性降低的图。
图3是显示在奥帕尼布处理的SARS-CoV-2感染的HBEC培养物中，温育3天后，在观察到强效抗病毒作用的剂量范围内有限的细胞毒性的图。
图4A是显示在WX-UK1处理和乌莫司他处理的SARS-CoV-2感染的HBEC培养物中，温育3天后，在药理学相关浓度下观察到感染性病毒产量的剂量依赖性降低的图。经由TCID50测定在顶端洗液中对病毒进行滴定。每个符号代表滴度，从所测试的3个重复中取平均值。
图4B是显示在乌莫司他处理的SARS-CoV-2感染的HBEC培养物中，温育3天后，在药理学相关浓度下观察到感染性病毒产量的剂量依赖性降低的图。经由噬斑减少测定在顶端洗液中对病毒进行滴定。每个符号代表滴度，从所测试的3个重复中取平均值。
图5是显示在WX-UK1处理的和乌莫司他处理的SARS-CoV-2-感染的HBEC培养物中，温育3天后，在观察到强效抗病毒作用的剂量范围内有限的细胞毒性的图。
图6是曲线拟合方程1，y轴上是分数速度，x轴上是WX-UK1浓度。该图示出了WX-UK1如何抑制TMPRSS2的活性
图7是曲线拟合方程1，y轴上是分数速度，x轴上是WX-UK1浓度。该图示出了WX-UK1如何抑制TMPRSS11A的活性。
图8A和图8B是展示乌莫司他和WX-UK1对Calu-3细胞和Vero-E6细胞中SARS-2-S-驱动的进入的抑制的图。将图8A Calu-3细胞或图8B Vero-E6细胞用指定浓度的乌莫司他、WX-UK1、甲磺酸卡莫司他或氯喹预温育，随后用携带VSV-SARS-2S蛋白的假颗粒接种。通过测定细胞裂解物中的荧光素酶活性来分析假型进入。示出了用一式四份样本进行的单个实验的结果。误差条表示标准偏差(SD)。
图9是展示乌莫司他和WX-UK1对Calu-3细胞中VSV-g驱动的进入的抑制的图。将Calu-3细胞用指定浓度的乌莫司他、WX-UK1、甲磺酸卡莫司他或氯喹预温育，随后用携带VSV-g蛋白的假颗粒接种。通过测定细胞裂解物中的荧光素酶活性来分析假型进入。示出了用一式四份样本进行的单个实验的结果。误差条表示标准偏差(SD)。
图10示出了在来自实施例7中描述的奥帕尼布在COVID-19肺炎中的随机、双盲、安慰剂对照2a期研究的统计分析后至少24小时不再接受辅助供氧的时间的卡普兰-迈耶曲线(mITT敏感性)。
图11示出了在来自实施例7中描述的奥帕尼布在COVID-19肺炎中的随机、双盲、安慰剂对照的2a期研究的统计分析后基于以L/min为单位的氧气流量的辅助供氧从基线降低50％的时间的时间累积发生率的卡普兰-迈耶曲线(mITT敏感性)。
图12示出了在来自实施例7中描述的奥帕尼布在COVID-19肺炎中的随机、双盲、安慰剂对照的2a期研究的统计分析后使用14天(第1天至第14天)的每日氧气流量(L/min)测量结果的总辅助供氧需求(曲线下面积)相对于基线的百分比变化的点图。
定义
如本文所用，术语“药剂”是指具有药理活性(即药剂对个体的作用)的药物物质。术语“药剂”、“活性成分”、“药物物质”和“化合物”在本文中可互换使用。
如本文所用，术语ABC294640是指呈游离碱或盐形式或呈立体异构或非立体异构形式的[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-甲酸(吡啶-4-基甲基)酰胺]。在化合物、盐、前药或溶剂化物为固体的情况下，本领域技术人员应理解，本发明的化合物、盐和溶剂化物可以不同的晶体形式存在，所有这些均旨在在本发明的范围内。奥帕尼布，也称为ABC294640盐酸盐，是ABC294640的一种特定盐形式。
如本文所用，术语WX-671是指作为(L)-或(D)-对映体和E-或(Z)-异构体或(E/Z)-混合物以及作为游离碱或作为其盐的(N-α-(2,4,6-三异丙基苯磺酰基)-3-羟基脒基-苯丙氨酸-4-乙氧基羰基哌嗪)。在化合物、盐、前药或溶剂化物为固体的情况下，本领域技术人员应理解，本发明的化合物、盐和溶剂化物可以不同的晶体形式存在，所有这些均旨在在本发明的范围内。WX-671.1(乌莫司他)是WX-671的一种特定结晶盐形式。
如本文所用，术语“冠状病毒”包括天然存在的(例如野生型)冠状病毒；天然存在的冠状病毒变体；以及实验室中生成的冠状病毒变体，包括通过选择而生成的变体、通过化学修饰而生成的变体以及经遗传修饰的变体(例如，通过重组DNA方法在实验室中修饰的冠状病毒)。在一个实施方案中，可在症状开始后的几天内或在根据本公开的治疗后，通过收集鼻分泌物(鼻或鼻咽(NP)拭子)、咽喉(口咽)拭子、血液或其他体液样本并使用例如抗原捕获酶联免疫吸附测定(ELISA)、使用IgM ELISA(以确定受试者是否具有IgM抗体)、使用IgG ELISA(以确定受试者是否具有IgG抗体)、使用聚合酶链反应(PCR)或通过病毒分离测试样本以检测血液和其他体液中的病毒抗原或RNA，来测试受试者的病毒感染。在一个实施方案中，冠状病毒选自由以下项组成的组：中东呼吸综合征(MERS)、严重急性呼吸综合征(SARS)和SARS-CoV-2。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”、“可/可以”、“含有”及其变体旨在是开放式的过渡性短语、术语或词语，其不排除附加动作或结构的可能性。单数形式“一个/种”和“该/所述”包括复数指代，除非上下文另有明确说明。本公开还设想“包括本文呈现的实施方案或要素”、“由本文呈现的实施方案或要素组成”和“基本上由本文呈现的实施方案或要素组成”的其他实施方案，无论是否明确阐述。
术语“共施用”、“共同施用”或“组合”用于描述本发明的化合物与至少一种其他抗病毒活性剂组合的施用。共同施用的时间最好由治疗患者的医学专家确定。有时期望同时施用这些药剂。另选地，选择用于组合疗法的药物可在不同时间施用于患者。当然，当存在多于一种病毒或其他感染或其他病症时，本发明化合物可根据需要与其他药剂组合以治疗该其他感染或病症。
如与本发明相关的，术语“治疗”等被定义为在本文所述的方法中预防性施用化合物之前、在病毒感染之前或感染发生后抑制病毒活性。在一个实施方案中，术语“治疗”意指施用一种或多种本发明的化合物以在体外或体内可测量地抑制病毒的复制、在体外或体内可测量地降低细胞中的病毒载量、或减少患者中与患有CoV介导的疾病相关联的至少一种症状。理想地，复制的抑制或病毒载量的降低为至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％，如使用合适的测定所确定的。监测病毒复制的测定包括但不限于细胞病变病毒测定、报告病毒和报告细胞测定、病毒复制子测定和基因靶向病毒测定。可使用基于核酸扩增的测试(NAT或NAAT)和基于非核酸的测试对血浆样本进行病毒载量测试，以确定给定体积中的病毒量，包括血浆和组织中的病毒RNA水平和总病毒DNA。另选地，在某些实施方案中，受过训练的医师观察到治疗对患有CoV介导的疾病的患者的症状有明显或显著的缓解。通常，病毒复制的减少是通过降低RNA聚合、RNA翻译、蛋白质加工或修饰的速率、或通过降低参与病毒复制任何步骤的分子(例如，对病毒复制重要的蛋白质或由病毒或宿主的基因组编码的分子)的活性来实现的。在一个实施方案中，术语“治疗”是指本发明的一种或多种化合物抑制或阻制病毒诸如RNA病毒的复制的能力。在一个实施方案中，术语“治疗”是指本发明的一种或多种化合物在RNA病毒感染期间抑制细胞病变效应的能力。
在一些实施方案中，本发明的化合物的“有效量”或“免疫刺激量”是当施用于受试者时足以产生可检测的免疫应答的量。在其他实施方案中，免疫原性组合物的“保护性有效量”是当施用于受试者时足以赋予受试者保护性免疫的量。在其他实施方案中，化合物的“治疗有效量”是当施用于受试者时足以治疗病毒感染诸如增加病毒清除率的量。
本发明的药剂和方法可用于治疗有需要的受试者。在某些实施方案中，受试者是哺乳动物，诸如人或非人哺乳动物。当施用于动物诸如人时，该药剂优选地作为药物组合物施用，该药物组合物包含例如至少一种本发明的药剂以及能够与该至少一种药剂组合的物质或物质的集合。如本文所用，术语“药学上可接受的载体材料”是指能够与药剂组合的物质或物质的集合，该药剂适用于在预期的暴露条件下与哺乳动物的组织接触以用于哺乳动物的治疗性处理目的。药学上可接受的载体材料是本领域熟知的，并且包括例如惰性固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料。当然，药学上可接受的载体材料必须具有足够高的纯度和足够低的毒性，以使它们适合施用于被治疗的人或低等动物。药物组合物可以是单位剂型，诸如片剂、胶囊(包括喷洒胶囊和明胶胶囊)、颗粒剂、粉剂、糖浆剂、栓剂、注射剂等。
术语“免疫应答”是指免疫系统的细胞诸如B细胞、T细胞、巨噬细胞或多形核细胞对刺激物诸如抗原的应答。免疫应答可包括参与宿主防御应答的任何身体细胞，包括例如分泌干扰素或细胞因子的上皮细胞。免疫应答包括但不限于先天免疫应答或炎症。如本文所用，保护性免疫应答是指保护受试者免于感染(防止感染或防止与感染相关的疾病的发展)的免疫应答。
“更有效”意指相比于被比较的另一种治疗，治疗表现出更大的功效，或者毒性更小、更安全、更方便、或更廉价。功效可由本领域技术人员使用适于给定指征的任何标准方法进行测定。
如本文所用，术语“合适的时间段”是指从患者开始使用本公开的方法进行冠状病毒感染的诊断治疗时开始、贯穿治疗直到患者由于与冠状病毒感染相关联的症状减轻或由于指示病毒感染处于控制下的实验室诊断而停止治疗时的时间段。在一个实施方案中，合适的时间段是一(1)周。在一个实施方案中，合适的时间段介于一(1)周和两(2)周之间。在一个实施方案中，合适的时间段是两(2)周。在一个实施方案中，合适的时间段介于两(2)周和三(3)周之间。在一个实施方案中，合适的时间段是三(3)周。在一个实施方案中，合适的时间段介于三(3)周和四(4)周之间。在一个实施方案中，合适的时间段是四(4)周。在一个实施方案中，合适的时间段介于四(4)周和五(5)周之间。在一个实施方案中，合适的时间段是五(5)周。在一个实施方案中，合适的时间段介于五(5)周和六(6)周之间。在一个实施方案中，合适的时间段是六(6)周。在一个实施方案中，合适的时间段介于六(6)周和七(7)周之间。在一个实施方案中，合适的时间段是七(7)周。在一个实施方案中，合适的时间段介于七(7)周和八(8)周之间。在一个实施方案中，合适的时间段是八(8)周。
如本文所用，术语“细胞病变效应”是指由于病毒感染引起的细胞形态变化。
如本文所用，术语“细胞病变发生”或“发病机理”包括宿主细胞基因表达的抑制，并且除了在微观水平上可见的那些变化之外，还包括有助于病毒发病机理的其他细胞变化。
如本文所用，术语“抑制剂”是指影响酶的活性的分子。本发明的抑制剂是可逆的，这意味着它们与它们的靶酶形成弱相互作用并且易于除去。可逆抑制剂与酶形成瞬时相互作用。酶与可逆抑制剂之间的结合强度由解离常数(Kd)定义。Kd值越小，酶与抑制剂之间的相互作用越强，并且抑制作用越大。当谈论酶抑制时，Kd被称为Ki。
如本文所用，术语“体外”是指在人工环境中执行的规程，诸如但不限于在试管或细胞培养系统中。技术人员将理解，例如，分离的SK酶可以在体外环境中与调节剂接触。替代性地，分离的细胞可以在体外环境中与调节剂接触。
如本文所用，术语“体内”是指在活的生物体内执行的规程，所述活的生物体诸如但不限于人、猴、小鼠、大鼠、兔、牛、马、猪、犬科动物、猫科动物或灵长类动物。
具体实施方式
本发明整体涉及病毒学、感染性疾病和医学领域。本发明的特征在于用于治疗CoV介导的疾病(例如由SARS-CoV-2、SARS或MERS引起的疾病)的化合物、组合物、方法和试剂盒。更具体地，本发明涉及冠状病毒的有效抑制剂，其可治疗冠状病毒，包括2019新型冠状病毒。本发明提供了化合物作为包括2019新型冠状病毒的冠状病毒的有效抑制剂的新用途，以及它们在制备用于治疗人冠状病毒感染的药物中的应用。
ABC294640，[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-甲酸(吡啶-4-基甲基)酰胺]，是一种口服施用的鞘氨醇激酶2(“SphK2”或“SK2”)抑制剂。ABC294640由以下结构式表示：
并且可被制备成游离碱、其盐和结晶变型的形式。美国专利7,338,961、8,063,248、8,324,237和8,557,800教导了这些化合物、其用途及其制备方法，这些专利以引用方式并入本文。
作为盐酸盐的ABC294640已被给予奥帕尼布的国际非专有名称(INN)并且由以下结构式表示：
奥帕尼布的分子式为C23H25ClN2O·HCl，分子量为417.4g/mol。奥帕尼布是一种非吸湿性的白色至灰白色固体，其实际上不溶于水和乙酸乙酯。在一个实施方案中，通过将奥帕尼布填充在硬明胶1号胶囊中来制备药物，该胶囊还包含以下赋形剂中的至少一种：微晶纤维素；胶态二氧化硅；植物硬脂酸镁；二氧化钛。在一个实施方案中，奥帕尼布胶囊含有250mg ABC294640盐酸盐或228.16mg ABC294640游离碱。在一个实施方案中，奥帕尼布胶囊含有375mg ABC294640盐酸盐或342.24mg ABC294640游离碱。
在一个实施方案中，奥帕尼布250mg胶囊含有作为盐酸盐的药剂ABC294640以及被封装在1号白色不透明主体和瓶盖的coni-snap明胶胶囊中的赋形剂。在一个实施方案中，奥帕尼布375mg胶囊含有作为盐酸盐的药剂ABC294640以及被封装在1号白色不透明主体和瓶盖的coni-snap明胶胶囊中的赋形剂。
用于治疗冠状病毒感染的奥帕尼布通常以每天约250mg至约1500mg范围内的量施用。在一个实施方案中，奥帕尼布250mg作为两粒胶囊施用，每天两次，总日剂量为1000mg。在一个实施方案中，奥帕尼布250mg作为两粒胶囊、500mg、Q12小时施用。在一个实施方案中，向具有已确认的冠状病毒感染的患者提供每12小时服用单次500mg剂量(作为两粒250mg胶囊)的奥帕尼布(因此每天1000mg奥帕尼布)共至多连续2周或至多连续14天的说明。
本发明人在大量研究之后发现了奥帕尼布的新用途。奥帕尼布已展示出抗病毒、抗炎和抗血栓形成活性-作用于COVID-19的病因和效应两者。奥帕尼布靶向鞘氨醇激酶-2，这是一种参与病毒复制的人细胞组分，而不是病毒本身。全球出现的新的SARS-CoV-2突变的大量证据强调了这种独特机制的重要性，其潜在地使病毒对治疗产生抗性的风险最小化。
本文提供了包装的药物产品，也称为药物试剂盒，其包括容器、在容器中适于口服施用的多个奥帕尼布剂型和与容器相关联并指示施用奥帕尼布用于治疗冠状病毒感染的图例(例如标签或插页)。在一个实施方案中，图例包括实施上述方法和/或如何使用试剂盒的说明。包括在试剂盒中的说明可作为标签贴到包装材料上或可作为包装插页包括在内。虽然说明通常是书面或印刷材料，但它们不限于此。本公开设想了能够存储说明并将其传达给最终用户的任何介质。此类介质包括但不限于电子存储介质(例如，磁盘、磁带、盒式磁带)、光学介质(例如，CD ROM)等。如本文所用，术语“说明”可包括提供说明的互联网站点的地址。
WX-671(N-α-(2,4,6-三异丙基苯磺酰基)-3-羟基脒基-苯丙氨酸-4-乙氧基羰基哌嗪)是强效的丝氨酸蛋白酶抑制剂WX-UK1(N-α-(2,4,6-三异丙基苯磺酰基)-3-脒基-苯丙氨酸-4-乙氧基羰基哌嗪)的口服活性前药。WX-671由以下结构式表示：
并且可作为(L)-或(D)-对映体和作为E-或(Z)-异构体或(E/Z)-混合物以及作为游离碱或作为其盐制备。
WX-671是前药。如本文所用，前药是指包括在体内代谢以生成药物的活性形式的生物非活性化合物的药物组合物。WX-671是一种在体内可转化以提供WX-UK1的化合物。WX-UK1只能通过静脉内输注施用。WX-UK1用于本文所述的许多体外实验示例中。尽管本公开描述了作为药物的口服WX-671化合物，但应当理解，可使用静脉内输注化合物WX-UK1制备药物，这在本发明的范围和精神内。美国专利6,861,435、7,247,724、7,659,396和9,089,532公开了WX-UK1及其制备方法，这些专利以引用方式并入本文。
WX-671.1，N-α-(2,4,6-三异丙基苯磺酰基)-3-羟基脒基-(L)苯丙氨酸-4-乙氧基羰基哌嗪硫酸氢盐，也称为4-{3-[(E)-氨基(羟基亚氨基)甲基]-N-[(2,4,6-三异丙基苯基)磺酰基]-L-苯丙氨酰基}哌嗪-1-甲酸乙酯硫酸氢盐，其分子式为C32H47N5O6S×H2SO4并且分子量为727.91g/mol(游离碱：629.83g/mol)。美国专利6,624,169、7,211,670、7,247,724、7,342,018、7,608,623、7,659,396、7,713,980、7,745,441、7,807,681、7,884,206、7,951,943、8,492,385、8,692,761和RE46424公开了这些化合物、其用途和制备方法，这些专利以引用方式并入本文。物质WX-671.1已被给予乌莫司他的国际非专有名称(INN)。
WX-671.1(乌莫司他)的结构式如下：
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乌莫司他是一种非吸湿性的白色至淡黄色粉末，其可自由溶于二甲亚砜并可溶于乙醇。该药物物质极微溶于水或0.1M HCl。用于口服施用的固体制剂可被制备为片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊等。这些固体制剂通过向本发明的一种或多种化合物中添加至少一种赋形剂诸如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖或明胶来制造。此外，除了典型的赋形剂之外，还可使用润滑剂诸如硬脂酸镁和滑石。
在一个实施方案中，通过将乌莫司他填充在硬明胶胶囊中来制备药物，该胶囊还包含以下赋形剂中的至少一种：微晶纤维素；羟丙甲纤维素；无水乙醇；纯化水和植物硬脂酸镁。在一个实施方案中，乌莫司他胶囊含有乌莫司他硫酸氢盐231.26mg(相当于200mg游离碱)。口服施用后，乌莫司他转化为活性WX-UK1，其抑制若干丝氨酸蛋白酶。因为乌莫司他可作为口服配制物提供，所以它可避免与静脉内施用其他可能用于治疗冠状病毒感染的药物相关联的缺点。
用于治疗冠状病毒感染的乌莫司他通常以每天约200mg至约1000mg范围内的量施用。在一个实施方案中，乌莫司他作为一粒胶囊施用，每天一次，总日剂量为约231.26mg(相当于200mg游离碱)。在一个实施方案中，乌莫司他作为两粒胶囊施用，每天一次，总日剂量为约462.52mg(相当于400mg游离碱)。在一个实施方案中，向具有已确认的冠状病毒感染的患者提供每天服用一粒乌莫司他胶囊(相当于200mg乌莫司他游离碱)共连续2周或连续14天的说明。在一个实施方案中，向具有已确认的冠状病毒感染的患者提供每天服用两粒乌莫司他胶囊(相当于400mg乌莫司他游离碱)共连续2周或连续14天的说明。
本发明人在大量研究之后发现了乌莫司他的新用途。不受理论的约束，据信丝氨酸蛋白酶抑制剂WX-UK1(乌莫司他一旦在体内分解后的乌莫司他活性药物)具有针对似乎负责病毒刺突(S)蛋白引发的丝氨酸蛋白酶中的至少一种丝氨酸蛋白酶的活性。因此，使用蛋白酶抑制剂诸如WX-UK1(或其前药WX-671)可有效降低CoV激活和传播，从而产生有效的预防性和治疗性治疗。因此，WX-UK1能够阻断SARS-2-S驱动的细胞进入，并且因此，结果将抑制冠状病毒复制。在一个实施方案中，由于感染需要促进病毒与宿主细胞受体相互作用的蛋白水解活化，因此增强感染性和传播，本发明的乌莫司他当以治疗有效量施用并持续合适的时间段时将保护免受冠状病毒的感染。
本文提供了包装的药物产品，也称为药物试剂盒，其包括容器、在容器中适于口服施用的多个乌莫司他剂型和与容器相关联并指示施用乌莫司他用于治疗冠状病毒感染的图例(例如标签或插页)。在一个实施方案中，图例包括实施上述方法和/或如何使用试剂盒的说明。包括在试剂盒中的说明可作为标签贴到包装材料上或可作为包装插页包括在内。虽然说明通常是书面或印刷材料，但它们不限于此。本公开设想了能够存储说明并将其传达给最终用户的任何介质。此类介质包括但不限于电子存储介质(例如，磁盘、磁带、盒式磁带)、光学介质(例如，CD ROM)等。如本文所用，术语“说明”可包括提供说明的互联网站点的地址。
组合交替疗法
本文所述的化合物可在目前COVID患者标准护理的基础上施用，或者与保健提供者认为对患者有益的任何其他化合物或疗法组合或交替施用。组合和/或交替疗法可以是治疗性的、辅助性的或姑息性的。当方法包括向患者施用多于一种活性剂时，可将该药剂在7天、6天、5天、4天、3天、2天或1天内；在24小时、12小时、6小时、5小时、4小时、3小时、2小时或1小时内，在60分钟、50分钟、40分钟、30分钟、20分钟、10分钟或5分钟1分钟内；或基本上同时施用。本发明的方法可包括通过口服、全身、肠胃外、局部、静脉、吸入或肌内给药将一种或多种试剂施用给患者。
已观察到，COVID患者可经历不同的疾病阶段，并且标准护理可基于患者呈现或进展到什么疾病阶段而不同。COVID对于免疫系统和凝血系统之间的“串扰”的发展是值得注意的。随着疾病的发展，患者的免疫系统可能产生过度反应，这可能导致许多严重的影响，包括细胞因子风暴。经由免疫系统和凝血系统之间的串扰，患者可在身体的各个区域(包括呼吸系统、脑、心脏和其他器官)开始凝血。在COVID患者中观察到全身多处凝块，从而需要抗凝疗法。据认为，如果不进行治疗和缓解疾病，这些凝块可能导致长期甚至永久性的损伤。
更具体地，COVID-19已被描述为经历疾病的三个一般阶段：第1阶段(早期感染)、第2阶段(肺部阶段)和第3阶段(过度炎症阶段/细胞因子风暴)。
第1阶段的特征是非特异性的，通常是轻度的症状。病毒复制正在发生，并且适合立即用本文所述的化合物开始治疗，并且可能与另一种抗病毒疗法组合或交替。还可施用干扰素-β以增强对病毒的先天免疫应答。因此，在一个实施方案中，本发明的化合物以有效量与干扰素-β和/或附加的抗病毒药物组合或交替使用。锌补充剂和/或维生素C有时也在该阶段或随着疾病的进展而施用。
COVID-19的第2阶段是肺部阶段，在此阶段患者可能经历急性低氧性呼吸衰竭。事实上，COVID-19的主要器官衰竭是低氧性呼吸衰竭。已显示，经由类固醇例如地塞米松进行的适度免疫抑制可有益于患有急性低氧性呼吸衰竭的患者和/或机械通气的患者。在一个实施方案中，本发明的化合物以有效量与可以是糖皮质激素的皮质类固醇组合使用。非限制性示例是布地奈德(Entocort EC)、倍他米松(Celestone)、泼尼松(PrednisoneIntensol)、泼尼松龙(Orapred、Prelone)、曲安西龙(Aristospan Intra-Articular、Aristospan Intralesional、Kenalog)、甲泼尼龙(Medrol、Depo-Medrol、Solu-Medrol)、氢化可的松或地塞米松(Dexamethasone Intensol、DexPak 10Day、DexPak 13Day、DexPak6Day)。
当给予COVID19患者时，NS5B抑制剂瑞德西韦(Remdesivir)的结果喜忧参半。它只能在医院环境中施用，并且只能通过静脉内注射施用，通常一天三次，这使得它不适合轻度至中度COVID19患者。在一个实施方案中，本发明的化合物与瑞德西韦组合或交替施用以增强整体抗病毒效果。
第3阶段，疾病的最后阶段，其特征在于进行性弥散性血管内凝血(DIC)，这是一种在整个血流中形成小血块的情况。该阶段还可包括多器官衰竭(例如血管扩张性休克、心肌炎)。还观察到许多患者对COVID-19感染的这一严重阶段产生“细胞因子风暴”。DIC和细胞因子风暴之间似乎存在双向、协同关系。为了对抗DIC，通常向患者施用抗凝剂，其可以是例如间接凝血酶抑制剂或直接口服抗凝剂(“DOAC”)。非限制性示例是低分子量肝素、华法林、比伐卢定(Angiomax)、利伐沙班(rivaroxaban)(Xarelto)、达比加群(dabigatran)(Pradaxa)、阿哌沙班(apixaban)(Eliquis)或依度沙班(edoxaban)(Lixiana)。在一个实施方案中，本发明的化合物与抗凝疗法组合或交替施用。在COVID患者的一些严重凝血情况下，可施用TPA(组织纤溶酶原激活剂)。
已观察到，高水平的细胞因子白介素-6(IL-6)是COVID-19患者中呼吸衰竭和死亡的先兆。为了治疗这种可能构成细胞因子风暴的免疫应答的激增，可向患者施用靶向IL-6的单克隆抗体、药物抑制剂或蛋白质降解剂，诸如结合IL-6并且还结合介导降解的蛋白质的双特异性化合物。抗体的示例包括托珠单抗(tocilizumab)、沙利鲁单抗(sarilumab)、西妥昔单抗(siltuximab)、奥克珠单抗(olokizumab)和克拉扎珠单抗(clazakizumab)。在一个实施方案中，本发明的化合物与托珠单抗或沙利鲁单抗组合或交替施用。用于治疗过度反应的免疫系统的免疫抑制药物的附加的非限制性示例包括Janus激酶抑制剂(托法替尼(Xeljanz))；钙调磷酸酶抑制剂(环孢素(Neoral、Sandimmune、SangCya))、他克莫司(Astagraf XL、Envarsus XR、Prograf))；mTOR抑制剂(西罗莫司(Rapamune)、依维莫司(Afinitor、Zortress))；以及IMDH抑制剂(硫唑嘌呤(Azasan、Imuran)、来氟米特(Arava)、霉酚酸酯(CellCept、Myfortic))。附加的抗体和生物制剂包括阿巴西普(abatacept)(Orencia)、阿达木单抗(adalimumab)(Humira)、阿那白滞素(anakinra)(Kineret)、赛妥珠单抗(certolizumab)(Cimzia)、依那西普(etanercept)(Enbrel)、戈利木单抗(golimumab)(Simponi)、英夫利昔单抗(infliximab)(Remicade)、伊克塞珠单抗(ixekizumab)(Taltz)、那他珠单抗(natalizumab)(Tysabri)、利妥昔单抗(rituximab)(Rituxan)、苏金单抗(secukinumab)(Cosentyx)、托珠单抗(Actemra)、优特克单抗(ustekinumab)(Stelara)、维多珠单抗(vedolizumab)(Entyvio)、巴利昔单抗(basiliximab)(Simulect)和达利珠单抗(daclizumab)(Zinbryta)。
IL-1阻断IL-6和其他促炎细胞因子的产生。COVID患者有时也用抗IL-1疗法治疗以减少过度炎症反应，例如静脉内施用阿那白滞素。抗IL-1疗法通常可以是例如靶向单克隆抗体、药物抑制剂或蛋白质降解剂，诸如结合IL-1并且还结合介导降解的蛋白质的双特异性化合物。
COVID患者通常出现病毒性肺炎，这可能导致细菌性肺炎。患有严重COVID-19的患者也可能受到脓毒症或“脓毒性休克”的影响。对继发于COVID的细菌性肺炎或脓毒症的治疗包括施用抗生素，例如大环内酯类抗生素，包括阿奇霉素、克拉霉素、红霉素或罗红霉素。附加的抗生素包括阿莫西林、强力霉素、头孢氨苄、环丙沙星、克林霉素、甲硝唑、磺胺甲噁唑、甲氧苄啶、阿莫西林、克拉维酸盐或左氧氟沙星。因此，在一个实施方案中，本发明的化合物与抗生素例如阿奇霉素组合或交替施用。这些抗生素中的一些抗生素诸如阿奇霉素具有独立的抗炎特性。此类药物既可用作COVID患者的抗炎剂并且还对继发性细菌感染具有治疗效果。
治疗感染COVID-19的患者的一个独特挑战是如果患者需要可能持续至多或大于5天、10天或甚至14天的机械通气，则需要相对长期的镇静。对于在该治疗期间持续的疼痛，可依次加入镇痛剂，并且对于持续的焦虑，可依次加入镇静剂。镇痛药的非限制性示例包括对乙酰氨基酚、氯胺酮和PRN阿片类药物(氢吗啡酮、芬太尼和吗啡)。镇静剂的非限制性示例包括褪黑激素、具有镇静剂主导特性的非典型抗精神病药(奥氮平、喹硫平)、丙泊酚或右美托咪啶、氟哌啶醇和苯巴比妥。在一个实施方案中，本发明的化合物与疼痛缓解剂诸如对乙酰氨基酚、氯胺酮、氢吗啡酮、芬太尼或吗啡组合或交替施用。在一个实施方案中，本发明的化合物与镇静剂诸如褪黑激素、奥氮平、喹硫平、丙泊酚、右美托咪啶、氟哌啶醇或苯巴比妥组合或交替施用。
COVID-19的研究药物包括氯喹和羟氯喹。在一个实施方案中，本发明的化合物与氯喹或羟氯喹组合或交替施用。
还可施用先前批准用于HIV的蛋白酶抑制剂，诸如洛匹那韦(lopinavir)或利托那韦(ritonavir)。
在一个实施方案中，将奥帕尼布与乌莫司他组合施用以用于治疗由SARS-CoV-2病毒引起的2019冠状病毒疾病(COVID-19)。在一个实施方案中，将奥帕尼布与乌莫司他组合施用以制造用于治疗冠状病毒感染的药物。在一个实施方案中，将奥帕尼布与乌莫司他组合施用以制造用于治疗由SARS-CoV-2病毒引起的2019冠状病毒疾病(COVID-19)的药物。
可用于治疗COVID患者的附加药物包括但不限于法匹拉韦(favipiravir)、芬戈莫德(fingolimod)(Gilenya)、甲泼尼龙、贝伐单抗(bevacizumab)(Avastin)、Actemra(托珠单抗)、乌米诺韦(umifenovir)、氯沙坦、以及REGN3048和REGN3051的单克隆抗体组合、或利巴韦林(ribavirin)。这些药物或疫苗中的任何一种都可与本文提供的活性化合物组合或交替使用，以治疗对此敏感的病毒感染。
在一个实施方案中，本发明的化合物以有效量与抗冠状病毒疫苗疗法组合使用，该抗冠状病毒疫苗疗法包括但不限于mRNA-1273(Moderna,Inc.)、AZD-1222(AstraZeneca和University of Oxford)、BNT162(Pfizer和BioNTech)、CoronaVac(Sinovac)、NVX-CoV2372(NovoVax)、SCB-2019(Sanofi和GSK)、ZyCoV-D(Zydus Cadila)和CoVaxin(BharatBiotech)。在另一个实施方案中，本发明的化合物以有效量与被动抗体疗法或恢复期血浆疗法组合使用。
在一个实施方案中，本发明的化合物以有效量与5-HT受体拮抗剂组合使用，该受体拮抗剂可减轻可能存在于感染冠状病毒的患者中的某些症状，诸如腹泻。
SARS-CoV-2不断突变，这增加了其毒力和传播率。抗病毒剂长期治疗后可能出现病毒的耐药变体。耐药性可能是由编码用于病毒复制的酶的基因突变引起的。在某些情况下，药物针对RNA病毒感染的功效可通过将该化合物与另一种并且可能甚至两种或三种其他诱导不同的突变或通过不同于主要药物的途径起作用的抗病毒化合物组合或交替施用来延长、增强或恢复。
本发明具有由以下非限制性实施例说明的多个方面。给出以下实施例的目的是说明本发明的各种实施方案，并不意味着以任何方式限制本发明。
实施例
实施例1：人气道上皮细胞中ABC294640针对SARS-CoV-2的抗病毒活性的评估
我们设计了在人原代支气管上皮细胞(HBEC；EpiAirwayTM，MatTek)的器官型气液界面(ALI)培养物中的体外评估以评价SARS-CoV-2的感染和传播是否可被奥帕尼布直接抑制。选择这种人细胞培养物模型系统是因为它含有假复层上皮层，该假复层上皮层在形态和功能上类似于人气道的假复层上皮层，由从顶端层暴露于空气的纤毛和杯状(产生粘液)细胞组成。这些细胞充当抵御入侵病毒的第一道防线，并用作复制位点。可用的证据还表明，人支气管上皮细胞表达由奥帕尼布靶向的宿主因子(鞘氨醇激酶-2)。
测试化合物：
奥帕尼布-测试化合物
描述：奥帕尼布[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-甲酸(吡啶-4-基甲基)酰胺盐酸盐]是酶鞘氨醇激酶-2(SK2)的可口服抑制剂。溶剂：DMSO
瑞德西韦(GS-5734)-阳性抗病毒对照
描述：瑞德西韦是核苷酸类似物抗病毒前药。它表现出针对EBOV的多种变体的抗病毒活性，在基于细胞的测定中EC50值在0.06-0.14μM的范围内，并且在体外表现出针对其他致病性RNA病毒(包括SARS-CoV)的广谱抗病毒活性。溶剂：DMSO 100mg/mL(166.0mM)
(硫酸)博来霉素-阳性细胞毒性对照
描述：博来霉素是常用于治疗霍奇金淋巴瘤和胚胎癌的化疗剂。博莱霉素引起的广谱肺毒性已被充分地描述为此类疗法的并发症，其中最常见的变体是博莱霉素引起的肺炎(BIP)(Sleijfer等人，2001)。博来霉素(BLM)被选为具有不同遗传毒性机制的在人淋巴细胞中研究最充分的微核(MN)诱导剂。溶剂：DMSO 16.67mg/mL(11.2mM)
方法：
细胞培养-分化的人支气管上皮细胞(HBEC)
正常人支气管上皮(HBEC)细胞由MatTek Corporation(Ashland,MA)分化，并以各自具有12孔或24孔插入物的试剂盒形式提供。HBEC细胞在transwell插入物中的6mm^2网盘上生长。装运前三天，将组织转移到不含氢化可的松的培养基中。在运输期间，将组织稳定在琼脂糖片上，收到后将其取出。一个插入物估计由约1.2×106个细胞组成。细胞插入物试剂盒(EpiAirwayTMAIR-100)源自单个供体，#9831，一名23岁、健康、不吸烟的白种男性。这些细胞在形成层方面具有独特的特性，其顶端侧仅暴露于空气并产生粘蛋白层。到达后，根据制造商的说明，将细胞transwell插入物立即转移到6孔板的各个孔中，并将1mL MatTek的专有培养基(AIR-100-MM)添加到基底外侧，而顶端侧暴露于潮湿的5％CO2环境中。在实验开始前将细胞在37℃处培养一天。在16-18小时平衡期后，通过用400μL预热的TEER缓冲液洗涤而去除从细胞顶端侧分泌的粘蛋白层。洗涤步骤后补充培养基。图1提供了培养插入物和EpiAirway组织的描述。
用测试化合物处理：
将测试化合物从储备溶液(含有DMSO)系列稀释于测定培养基(AIR-ASY-100，MatTek)中并置于室温下。测试化合物稀释度概述如下(最终DMSO<0.5％)。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤HBEC培养物，并在感染前在37℃下与在测定培养基(AIR-100-ASY，MatTek)中稀释的瑞德西韦(2μM)、硫酸博来霉素(75.6μg/ml和151μg/ml)和奥帕尼布(6种浓度范围为0.05μg/ml至11.25μg/ml)一起温育1小时。对于对照孔，在感染前1小时添加含有DMSO的测定培养基(最终DMSO<0.5％；对照)和仅病毒对照(仅测定培养基)。将化合物一式三份添加到每个插入物的顶端层(0.15mL)和基底层(0.85mL)上。
病毒感染和样本处理：
在与化合物温育1小时后，洗涤培养物的顶端侧，然后在化合物或测定对照培养基的存在下，以MOI＝0.1PFU/细胞用SARS-CoV-2临床分离物(2019-nCoV/USA-WA1/2020)在37℃下感染1小时。病毒温育1小时后，从顶端侧去除病毒，用PBS洗涤培养物一次以去除任何未结合的病毒。然后将培养物与新鲜化合物在37℃下温育72小时。在感染后24小时和48小时，用1mL含有相应化合物的新鲜培养基替换基底外侧培养基。
在感染后72小时，收集组织和培养基用于处理。将顶端层用0.4mL TEER缓冲液(含Mg2+和Ca2+的PBS)洗涤，并收集用于经由TCID50(50％组织培养感染剂量)测定的病毒滴度评估。将八倍系列稀释度的顶端层上清液样本浓度添加到含有Vero E6细胞的96孔测定板(20,000/孔)。将板在37℃、5％CO2和95％相对湿度下温育。温育3天(72±4小时)后，用结晶紫对板进行染色以测量细胞病变效应(CPE)。使用Reed和Muench的方法(Reed等人，1938)计算病毒滴度。TCID50值由一式三份样本确定。
为了评价HBEC细胞在暴露于奥帕尼布、对照化合物和病毒感染后的健康状况，进行乳酸脱氢酶(LDH)释放测定。感染后72小时从组织培养插入物的基底外侧层去除培养基，并按照制造商的说明(Promega)在LDH储存缓冲液中稀释。将样本用LDH缓冲液进一步稀释，并与等体积的LDH检测试剂温育。在室温下温育60分钟后记录发光。包括无细胞对照作为阴性对照以确定培养基背景，并且包括博来霉素作为阳性细胞毒性对照。报告发光，其中发现背景水平在可接受的发光范围内(范围1,000-10,000)内。
另外，HBEC组织的顶端层通过如下方式收集：向每个培养插入物中添加Trizol LS(Invitrogen)并上下吹打数次以裂解和收集细胞并储存在-80℃下用于将来的RNA和蛋白质表达分析。
结果：
奥帕尼布在HBEC培养物中具有针对SARS-CoV-2的高度活性
在本研究中，用6种不同浓度的奥帕尼布(11.25μg/ml-0.05μg/ml)在每种培养物的顶端侧和基底外侧上预处理正常人支气管上皮细胞(HBEC)，一式三份。一旦预处理，就将HBEC暴露于SARS-CoV-2(2019-nCoV/USA-WA1/2020)1小时，洗涤顶端层以去除未结合的病毒，然后将培养物与化合物一起温育3天。在感染后3天，洗涤顶端层并通过TCID50测定评估病毒载量。收集基底外侧培养基并评估从受损细胞释放用作细胞死亡/活力的指示剂的乳酸脱氢酶(LDH)的存在。
奥帕尼布展示出强效的抗病毒活性，其中病毒复制以剂量依赖性方式被抑制而不显著损害细胞活力。在奥帕尼布处理的SARS-CoV-2感染的HBEC培养物中，温育3天后，观察到感染性病毒产量的剂量依赖性降低，从奥帕尼布1μg/ml(药理学相关浓度)开始具有完全抑制。这些结果与研究中的阳性对照瑞德西韦相比是有利的。细胞活力如在LDH释放测定中所评估。为了展示奥帕尼布在人原代上皮培养系统中针对SARS-CoV-2的抗病毒活性，我们在HBEC培养物中进行了抗病毒测定，这些培养物在气-液界面上生长，并且重演了人传导气道的细胞复杂性和生理学。在奥帕尼布处理的SARS-CoV-2感染的HBEC培养物中，温育3天后，观察到感染性病毒产量的剂量依赖性降低，从奥帕尼布1μg/ml(药理学相关浓度)开始具有完全抑制(图2)。这些结果与研究中的阳性对照瑞德西韦相比是有利的。
奥帕尼布在HBEC培养物中在观察到强效抗病毒作用的浓度范围内不引起细胞毒性(图3)。总之，这些数据展示，奥帕尼布在原代人肺培养物中具有针对SARS-CoV-2的强效抗病毒活性，而不损害细胞膜完整性，细胞膜完整性是细胞活力和药物安全性的量度，从而进一步展示奥帕尼布对于治疗COVID-19患者具有有前景的潜力。
在测试的浓度范围，既没有达到50％抑制，也没有达到50％细胞毒性。在最低测试浓度0.05μg/ml下，达到了对感染性病毒产量的大于90％的抑制。在最高测试浓度11.25μg/ml下，细胞在整个实验中保持存活。当利用来自该实验的高和低浓度范围计算选择性指数(SI)时，SI值为225，该选择性指数是通过将抗病毒活性值(AVA)除以毒性(TOX)值(AVA/TOX)来测量细胞毒性与抗病毒活性之间的窗口的比率。如果测试更宽范围的浓度，则预期SI值更大。
实施例2：人气道上皮细胞中乌莫司他和WX-UK1针对SARS-CoV-2的抗病毒活性的评估
我们设计了在人原代支气管上皮细胞(HBEC；EpiAirwayTM，MatTek)的器官型气液界面(ALI)培养物中的体外评估以评价SARS-CoV-2的感染和传播是否可被乌莫司他和WX-UK1直接抑制。选择这种人细胞培养物模型系统是因为它含有假复层上皮层，该假复层上皮层在形态和功能上类似于人气道的假复层上皮层，由从顶端层暴露于空气的纤毛和杯状(产生粘液)细胞组成。这些细胞充当抵御入侵病毒的第一道防线，并用作复制位点。可用的证据还表明，人支气管上皮细胞表达由乌莫司他靶向的宿主因子(例如，TMPRSS2)。
测试化合物：
乌莫司他-测试化合物
描述：乌莫司他-4-{3-[(E)-氨基(羟基亚氨基)甲基]-N-[(2,4,6-三异丙基苯基)磺酰基]-L-苯丙氨酰基}-哌嗪-1-甲酸乙酯硫酸氢盐。
溶剂：DMSO
WX-UK1-测试化合物
描述：WX-UK1-4-[(25)-3-(3-甲脒基苯基)-2-[(2,4,6-三异丙基苯基)磺酰基氨基]丙酰基]哌嗪-1-甲酸乙酯。
溶剂：DMSO
甲磺酸卡莫司他-测试化合物
描述：甲磺酸卡莫司他(CM)4-[[4-[(氨基亚氨基甲基)氨基]苯甲酰基]氧基]苯乙酸2-(二甲基氨基)-2-氧代乙基酯甲磺酸盐；FOY 305；FOY-S980；Foipan甲磺酸盐。卡莫司他是一种合成的口服生物可利用的丝氨酸蛋白酶。
溶剂：DMSO
(硫酸)博来霉素-阳性细胞毒性对照
描述：博来霉素是常用于治疗霍奇金淋巴瘤和胚胎癌的化疗剂。博莱霉素引起的广谱肺毒性已被充分地描述为此类疗法的并发症，其中最常见的变体是博莱霉素引起的肺炎(BIP)(Sleijfer等人，2001)。博来霉素(BLM)被选为具有不同遗传毒性机制的在人淋巴细胞中研究最充分的微核(MN)诱导剂。
溶剂：DMSO 16.67mg/mL(11.2mM)
方法：
细胞培养-分化的人支气管上皮细胞(HBEC)
正常人支气管上皮(HBEC)细胞由MatTek Corporation(Ashland,MA)分化，并以各自具有12孔或24孔插入物的试剂盒形式提供。HBEC细胞在transwell插入物中的6mm^2网盘上生长。装运前三天，将组织转移到不含氢化可的松的培养基中。在运输期间，将组织稳定在琼脂糖片上，收到后将其取出。一个插入物估计由约1.2×106个细胞组成。细胞插入物试剂盒(EpiAirwayTMAIR-100)源自单个供体，#9831，一名23岁、健康、不吸烟的白种男性。这些细胞在形成层方面具有独特的特性，其顶端侧仅暴露于空气并产生粘蛋白层。到达后，根据制造商的说明，将细胞transwell插入物立即转移到6孔板的各个孔中，并将1mL MatTek的专有培养基(AIR-100-MM)添加到基底外侧，而顶端侧暴露于潮湿的5％CO2环境中。在实验开始前将细胞在37℃处培养一天。在16-18小时平衡期后，通过用400μL预热的TEER缓冲液洗涤而去除从细胞顶端侧分泌的粘蛋白层。洗涤步骤后补充培养基。图1提供了培养插入物和EpiAirway组织的描述。
用测试化合物处理：
将测试化合物从储备溶液(含有DMSO)系列稀释于测定培养基(AIR-ASY-100，MatTek)中并置于室温下。测试化合物稀释度概述如下(最终DMSO<0.5％)。将HBEC培养物用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，并在感染前在37℃下与在测定培养基(AIR-100-ASY，MatTek)中稀释的硫酸博来霉素(75.6μg/ml和151μg/ml)、乌莫司他(6种浓度范围为0.12μg/ml至30.00μg/ml)、WX-UK1(3.33μg/ml、10μg/ml和30.00μg/ml)或卡莫司他(0.5μg/ml、5μg/ml和25μg/ml)温育1小时。对于对照孔，在感染前1小时添加含有DMSO的测定培养基(最终DMSO<0.5％；对照)和仅病毒对照(仅测定培养基)。将化合物一式三份添加到每个插入物的顶端层(0.15mL)和基底层(0.85mL)上。
病毒感染和样本处理：
在与化合物温育1小时后，洗涤培养物的顶端侧，然后在化合物或测定对照培养基的存在下，以MOI＝0.1PFU/细胞用SARS-CoV-2临床分离物(2019-nCoV/USA-WA1/2020)在37℃下感染1小时。病毒温育1小时后，从顶端侧去除病毒，用PBS洗涤培养物一次以去除任何未结合的病毒。然后将培养物与新鲜化合物在37℃下温育72小时。在感染后24小时和48小时，用1mL含有相应化合物的新鲜培养基替换基底外侧培养基。
在感染后72小时，收集组织和培养基用于处理。将顶端层用0.4mL TEER缓冲液(含Mg2+和Ca2+的PBS)洗涤，并收集用于经由TCID50(50％组织培养感染剂量)测定的病毒滴度评估。将八倍系列稀释度的顶端层上清液样本浓度添加到含有Vero E6细胞的96孔测定板(20,000/孔)。将板在37℃、5％CO2和95％相对湿度下温育。温育3天(72±4小时)后，用结晶紫对板进行染色以测量细胞病变效应(CPE)。使用Reed和Muench的方法(Reed等人，1938)计算病毒滴度。TCID50值由一式三份样本确定。为了确认TCID50测定的结果，进行噬斑减少测定。简言之，将10倍系列稀释度的顶端层上清液样本浓度添加到含有VeroE6细胞的24孔测定板(100,000个细胞/孔)中用于噬斑减少测定。将板在37℃、5％CO2和95％相对湿度下温育。温育3天(72±4小时)后，将板用5％中性缓冲福尔马林固定，并用结晶紫染色以显现噬斑。使用下式以PFU/mL为单位计算滴度：滴度(PFU/mL)＝噬斑计数×10^稀释度计数×10(以达到mL，因为我们添加了100μL稀释样本)。该测定进行两次，其中第二次测定在病毒+DMSO和0.2ug/ml乌莫司他上进行以评价附加的样本稀释度。
为了评价HBEC细胞在暴露于奥帕尼布、对照化合物和病毒感染后的健康状况，进行乳酸脱氢酶(LDH)释放测定。感染后72小时从组织培养插入物的基底外侧层去除培养基，并按照制造商的说明(Promega)在LDH储存缓冲液中稀释。将样本用LDH缓冲液进一步稀释，并与等体积的LDH检测试剂温育。在室温下温育60分钟后记录发光。包括无细胞对照作为阴性对照以确定培养基背景，并且包括博来霉素作为阳性细胞毒性对照。报告发光，其中发现背景水平在可接受的发光范围内(范围1,000-10,000)内。
另外，HBEC组织的顶端层通过如下方式收集：向每个培养插入物中添加Trizol LS(Invitrogen)并上下吹打数次以裂解和收集细胞并储存在-80℃下用于将来的RNA和蛋白质表达分析。
结果：
乌莫司他和WX-UK1在人支气管上皮组织培养物中是SARS-CoV-2的强效抗病毒抑 制剂。
在本研究中，用6种不同浓度的乌莫司他(0.12μg/ml至30.0μg/ml)和3种不同浓度的WX-UK1(3.33μg/ml至30.0μg/ml)在每种培养物的顶端侧和基底外侧上预处理正常人支气管上皮细胞(HBEC)，一式三份。一旦预处理，就将HBEC暴露于SARS-CoV-2(2019-nCoV/USA-WA1/2020)并与化合物温育3天。在感染后3天，洗涤顶端层并通过TCID50测定评估病毒载量。收集基底外侧培养基并评估从受损细胞释放用作细胞死亡/活力的指示剂的乳酸脱氢酶(LDH)的存在。为了比较，包括3种浓度的卡莫司他(范围为0.5μg/ml至25.0μg/ml)，这是一种已确立的TMPRSS2抑制剂。
乌莫司他和WX-UK1都展示出强效的抗病毒活性，其中复制以剂量依赖性方式被抑制，而不显著损害细胞活力(除了在每种化合物的最高剂量下)。通过TCID50分别在最低浓度的乌莫司他(0.12μg/ml)和WX-UK1(3.33μg/ml)下观察到病毒载量的3-log和4-log减少。在感染后3天，乌莫司他和WX-UK1都发现病毒滴度的类似降低。如在LDH释放测定中所评估的，除了针对乌莫司他和WX-UK1所评估的最大浓度之外，细胞活力被报告为完全没有受到损害。
为了展示乌莫司他和WX-UK1在人原代上皮培养系统中针对SARS-CoV-2的抗病毒活性，我们在HBEC培养物中进行了抗病毒测定，该培养物在气-液界面上生长，并且重演了人传导气道的细胞复杂性和生理学。在upamostat和WX-UK1处理的感染SARS-CoV-2的HBEC培养物中，在3天的孵育后，通过TCID50和噬菌斑减少测定证实，在药理学相关浓度下，观察到感染性病毒产生的剂量依赖性减少(图4A和图4B)。这些结果与已知的TMPRSS2抑制剂卡莫司他相比是有利的。
我们用噬斑减少测定结果计算EC50估计值。在最高测试浓度下，病毒产生的抑制超过50％。使用graphpad，用可用数据估计EC50。估计的EC50为0.02ug/ml。如下所述，在将TCID值转换为估计PFU值之后，我们利用下式计算抑制％：
抑制％＝((值-平均病毒对照)/(平均细胞对照-平均病毒对照)*100)
然后按照以下这些说明经由GraphPad分析抑制％值：
-X值是乌莫司他浓度。
-Y值是响应。
-选择“剂量与响应曲线”\
-选择分析、非线性回归和剂量-响应(刺激)方程组并选择[剂量]与响应--可变斜率。接受所有其他默认值。计算所得EC50为0.02ug/ml。
通过LDH释放所测量，乌莫司他、WX-UK1和卡莫司他抑制了病毒复制而不显著损害细胞活力(除了在最高测试浓度下)。为了测量从非活细胞释放的LDH，在感染后72小时从组织培养插入物的基底外侧层去除培养基，并按照制造商的说明(Promega)在LDH储存缓冲液中稀释。将样本用LDH缓冲液进一步稀释，并与等体积的LDH检测试剂温育。在室温下温育60分钟后记录发光。包括无细胞对照作为阴性对照以确定培养基背景以及阳性细胞毒性对照博来霉素(151ug/ml)。使用发光值减去无细胞对照(6936的平均发光读数)绘制数据。使用生理学相关的人呼吸组织模型，该数据展示了乌莫司他强烈抑制SARS-CoV-2病毒复制的潜力，其在HBEC培养物中在观察到强效抗病毒作用的剂量范围内具有有限的细胞毒性(图5)，从而进一步展示乌莫司他对于治疗COVID-19患者具有有前景的潜力。用可用数据生成50％细胞培养物的细胞毒性浓度(CC50)，以确定与对照细胞相比将处理细胞的吸光度降低50％所需的化合物浓度。使用经由MTT测定生成的发光数据计算的乌莫司他的CC50值为46.37uM(或29.2ug/ml)。在该CC50浓度下，低于4.6uM(或2.9ug/ml)的EC50浓度将导致SI值(CC50/EC50)>10。
实施例3：ABC294640针对ARDS诱导的血栓形成的体内功效的评估
本研究使用大鼠静脉淤滞模型评估ABC294640在急性呼吸窘迫综合征(ARDS)病症中降低原位不良血栓栓塞事件发生率的功效。本测定被设计成测量LPS诱导的肺损伤后的血栓形成风险。LPS诱导的肺损伤是ARDS最常用的啮齿动物模型之一，并且被描述为模拟在ARDS患者中观察到的中性粒细胞性炎症反应。LPS诱导的ARDS的机制是基于对内皮细胞的损伤和全身性炎症反应。
动物中的静脉淤滞(Wessler)测试已广泛地用作体内高凝状态的实验室测量超过40年。已经证明它对于评估各种血液制品的致血栓性是非常有价值的。
在滴注后3小时和滴注后24、48和72小时通过经口管饲法以250mg/kg的剂量施用测试化合物。将适量的来自大肠杆菌(E.coli)(O55:B5)的LPS在盐水中稀释，得到400μg/mL的最终浓度。通过气管内滴注(0.5mL/kg)给予该溶液。媒介物由pH 7.4±0.1的PBS组成。将ABC294640称重并转移到媒介物(PBS，0.375％，pH 7.4)中，得到25mg/mL的最终溶液。在给药前将ABC294640溶液在室温下搅拌10分钟。通过经口管饲法(250mg/kg，10mL/kg)给予该溶液。
本研究使用体重在275g与400g之间的Sprague-dawley大鼠(雄性)。由研究指导者将动物随机分配到治疗组。随意给予食物和水。观察行为和一般健康状况直至处死。在滴注前和滴注后24、48和72小时记录体重。
在滴注前和滴注后24、48和72小时，用安装在清醒小鼠上的小鼠脉搏血氧仪项圈探头(MouseOx Plus系统，Starr Life Sciences)记录动脉氧饱和度(SpO2)和心率。还将大鼠引入体积描记室环境中，与SpO2的计划相同。通过全身体积描记器(VivoFlow，SCIREQ)评估功能呼吸参数。所分析的功能呼吸参数包括；呼吸率、PenH(肺充血指数)和吸气/呼气时间测量值。在终末规程之前还采集血液样本用于全血计数和细胞因子水平评价。
在该研究中，ARDS是通过气管内滴注LPS诱导的。在整个ARDS诱导和发展过程中，通过经口管饲法向动物给药媒介物或ABC294640(滴注后3小时、24小时、48小时和72小时)。72小时清醒测量后，将大鼠麻醉并对下腔静脉进行静脉淤滞(72小时时间点管饲后4小时)。淤滞维持30分钟。然后切除该节段并对其内容物进行评分。随后，通过放血对动物实施安乐死。
放血后，进行气管切开术并打开胸腔以暴露肺。然后将气管连接到灌注系统的插管上。夹住左肺，同时通过气管注射冷PBS 1X、蛋白酶抑制剂1X溶液，以在肺的右叶上进行支气管肺泡灌洗液(BALF)并收集用于进一步分析。在BALF样本中评估总细胞计数与细胞分类计数以及总蛋白质含量。保留BALF的等分试样用于对BALF中的趋化因子/细胞因子的水平进行定量。
切除肺的左叶。将新鲜收获的左叶湿称重以确定左肺重量和左肺指数(左肺重量/体重×100)。左叶的下部用于确定左肺的湿/干比，这是肺水肿的指标。将左肺的剩余部分匀浆并等分用于对蛋白质含量进行定量。
LPS肺损伤的诱导：
1.在LPS或盐水滴注之前，通过全身体积描记术评估所有大鼠的功能呼吸参数，并且用颈圈探头脉搏血氧仪评估清醒大鼠的SpO2。在生理评估之前首先使大鼠适应体积描记室。分析呼吸率、Penh和吸气/呼气时间测量值。
2.在氧气中用2.5％异氟烷USP(Abbot Laboratories，Montreal Canada)麻醉大鼠。然后将大鼠插管并通过气管内滴注递送LPS或盐水。
3.大鼠从麻醉中恢复并返回其各自的笼中。
4.滴注后三小时，通过经口管饲法施用第一剂量的ABC294640(参见下表1)。
表1：大鼠的实验进展/步骤
5.定期评价大鼠以确保动物健康(一般行为和日体重)。
6.还在滴注后24、48和72小时通过经口管饲法对动物给药。
7.还在滴注后24、48和72小时评价SpO2和全身体积描记术。
8.在静脉淤滞规程之前从颈静脉抽取血液样本用于全血计数和细胞因子水平测量。
9.最后一次给药后四小时，在氧气中用2.5％异氟烷USP(Abbot Laboratories，Montreal Canada)麻醉大鼠。在恒温毯上进行该规程以控制体温。
10.暴露大鼠的下腔静脉，并且间隔1cm放置两(2)根松散的缝合线。结扎分离节段的任何侧支血管。
11.原位维持淤滞30分钟的时段。
12.取出静脉淤滞节段，纵向打开，在滤纸上倒空并拍照。将任何存在的血栓取出并在滤纸上吸干。测量血栓，称重并以0至4的等级评分(参见表2)。
表2：致血栓性的定量评价
致血栓性的定量评价 评分
无凝块 0
几乎看不到肉眼可见的纤维蛋白束 0.5
少量肉眼可见的纤维蛋白束 1.0
<1.5mm的一个或几个血栓 1.5
>1.5mm的一个血栓 2.0
>1.5mm的两个或更多个血栓 2.5
>3mm的一个大血栓 3.0
>3mm的两个或更多个大血栓 3.5
形成整个节段的单个血栓 4.0
13.静脉淤滞后，通过放血对动物实施安乐死，并从右肺收集支气管肺泡灌洗液。为此，在进行气管切开术之前，切开气管上的肌肉。打开胸腔以暴露肺，并将气管连接到灌注系统的插管。夹住左肺，同时通过气管注射15mL(3×5mL)冷PBS 1X、蛋白酶抑制剂1X溶液，以在肺的右叶上进行支气管肺泡灌洗液(BALF)。收集BALF用于进一步分析。在BALF样本中评估总细胞计数与细胞分类计数。保留BALF的等分试样用于对BALF中的趋化因子/细胞因子水平进行定量。
14.然后收获左肺并称重用于左肺重量和左肺指数计算。使用湿/干比计算来评估肺组织水肿。左肺下部单独称重(湿重)并用于确定肺湿/干比。在60℃下干燥至少24小时后，将其重新称重(干重)。
对每组的每个参数(如下所列)进行汇编并用适当的统计分析以柱状图呈现。
1-体重变化
2-饱和度(SpO2)和心率(bpm)
3-呼吸参数：吸气/呼气时间
潮气量和呼气量
呼吸率
PenH
4-BALF总细胞计数与细胞分类
5-BALF细胞因子/趋化因子水平
6-左肺重量和指数
7-肺湿/干比
8-肺匀浆中的肺总蛋白质含量
LPS诱导与炎症和嗜睡状态相关的肺重量的显著增加。这种增加与严重的水肿有关，如W/D比的显著增加所指示。相比于LPS-媒介物组，在72小时时间点的管饲后4小时，LPS-媒介物组的肺重量增益更大。以250mg/kg施用的ABC294640展示出血栓形成的减少-由血凝块长度、重量和总血栓评分的减少证明。
实施例4：对TMPRSS2和TMPRSS11(A)作为WX-UK1抑制的靶标的评价
属于不同蛋白酶家族的若干酶可被CoV S蛋白劫持用于引发。pH依赖性半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶L、TMPRSS2、TMPRSS11A以及丝氨酸蛋白酶弗林蛋白酶可在病毒进入靶细胞期间引发S蛋白。我们进行了分析，包括结构建模/预测、结构分析和相关文献的综述，以确定是否有任何TTSP是乌莫司他抑制的相关靶标。
TMPRSS2和TMPRS11A哺乳动物表达系统购自MyBioSource(分别为MBS1193731和MBS1345824)。根据制造商将蛋白质重构为1mg/ml，并且我们用重构的蛋白质运行凝胶。制备WX-UK1的新鲜储备溶液(100％DMSO中的100mM WX-UK1)。将浓缩的储备液在HBS缓冲液中稀释至1mM，然后在测定中进一步稀释。
酶抑制剂可以几种不同的方式与酶和/或酶-底物复合物相互作用以降低酶催化反应的速率。对于每种抑制模式，可计算抑制剂的解离常数Ki，其反映酶与抑制剂之间相互作用的强度。抑制剂的Ki类似于底物的Km；小的Ki值反映抑制剂与酶的紧密结合，而较大的Ki值反映较弱的结合。用于计算Ki的精确公式取决于抑制模式，其可通过将在抑制剂存在下的酶的Vmax和Km的“表观”值与在不存在任何抑制剂的情况下的Vmax和Km值进行比较而从实验上确定(下面的方程2)。
为这些研究选择的生色底物是S-2288底物。通过测量WX-UK1对生色底物的人丝氨酸蛋白酶切割的影响来确定Ki值。为了确定Ki值，在添加生色底物以引发反应之前，将浓度系列的WX-UK1与目标人丝氨酸蛋白酶预温育。使用线性回归根据斜率确定反应速度，并将其归一化为非抑制性反应的速度。在使用方程1通过非线性回归获得Ki值之前，将归一化活性针对WX-UK1浓度作图。
方程1：
vi/v0是具有和不具有抑制剂的初始速度的比率，其被描述为抑制剂浓度[I]和底物浓度[S]的函数。
KM参数通过标准米氏(Michaelis-Menten)动力学获得。将丝氨酸蛋白酶添加到合适浓度的底物系列中，其浓度足够高以产生实验性Vmax值。针对底物浓度绘制后续反应速度，然后使用米氏方程(2)得出KM值。
方程2：
所有实验均于37℃下在HBS(30mM Hepes，pH＝7.4；150mM NaCl；0.5％BSA)中进行至少三次。在405nm下以2读数/分钟的速度监测反应至少45分钟。由于WX-UK1保持在100％DMSO中，因此所有实验均包括不受抑制的DMSO对照，以排除不期望的DMSO对蛋白酶活性的影响。
WX-UK1抑制人TMPRSS2
图6是曲线拟合方程1，y轴上是分数速度，x轴上是WX-UK1浓度。该图示出了WX-UK1如何抑制TMPRSS2的活性。Ki被确定为2.9±0.04(3)μM。
WX-UK1抑制人TMPRSS11a
图7是曲线拟合方程1，y轴上是分数速度，x轴上是WX-UK1浓度。该图示出了WX-UK1如何抑制TMPRSS11A的活性。Ki被确定为0.39±0.01(3)μM。
表3列出了WX-UK1针对一组蛋白酶的抑制常数Ki值：
表3：Ki值
实施例5：乌莫司他和WX-UK1对SARS-CoV-2刺突蛋白介导的进入的影响的评估
进行研究以评价乌莫司他和WX-UK1两者针对用SARS-CoV-2刺突蛋白(VSVpp+SARS-2-SΔ18)或作为对照的水泡性口炎病毒(VSV)的糖蛋白假型化的复制缺陷型、单周期水泡性口炎病毒(VSV)颗粒的细胞进入的抑制作用。Δ18是指S蛋白的18个C-末端氨基酸的缺失，其增加假型化效率而不影响ACE2或TMPRSS2的使用。在Calu-3和Vero-E6细胞中评价假型进入及其抑制。Calu-3细胞是肺衍生的人癌细胞系，其允许以TMPRSS2依赖性方式的SARS-CoV-2S驱动的进入。抑制TMPRSS2的药剂(包括卡莫司他，一种已知的显示抑制培养的肺细胞的SARS-CoV-2感染的TMPRSS2抑制剂(Hoffmann等人，2020))预期在该模型中会抑制S-驱动的进入。Vero细胞是绿猴肾细胞系，其允许以TMPRSS2非依赖性、组织蛋白酶L依赖性方式的SARS-CoV-2刺突驱动的进入。提高酸性细胞内内体的pH的药剂(包括氯喹)预期在该模型中会抑制进入。由水泡性口炎病毒(VSV)的G蛋白驱动的进入用作特异性对照(VSV-G驱动的进入取决于低pH并且因此是氯喹而非卡莫司他敏感的)。
方法：
对于假型化，根据公布的方案(Berger Rentsch和Zimmer，2011)生成水泡性口炎病毒假型(VSVpp)。简言之，用含有eGFP(增强的绿色荧光蛋白)和萤火虫荧光素酶的表达盒而不是VSV-G开放阅读框VSV*DG-fLuc(由Gert Zimmer,Institute of Virology andImmunology,惠赠)的复制缺陷型VSV载体接种转染以表达研究中的病毒表面糖蛋白的293T。在37℃下温育1小时的时段后，去除接种物并将细胞用PBS洗涤，然后添加补充有抗VSV-G抗体(I1，来自CRL-2700的小鼠杂交瘤上清液；ATCC)的培养基以便中和残余的输入病毒(没有向表达VSV-G的细胞中添加抗体)。在接种后16小时收获假型化颗粒，通过离心从细胞碎片中澄清并用于实验。
对于转导，使靶细胞在96孔板中生长直至它们达到50％-75％汇合，然后用各自的假型接种。对于涉及蛋白酶抑制剂的实验，在转导前2小时用相应的化学品处理靶细胞。转导后16小时，通过使用商业底物(Beetle-Juice，PJK)和Hidex Sense平板光度计(Hidex)测量细胞裂解物中萤火虫荧光素酶的活性来对转导效率进行定量。转导测定测量携带SARS-CoV-2刺突的单周期水泡性口炎病毒(VSV)的进入。
结果：
在Calu-3(人肺癌细胞)和Vero-E6细胞中评价乌莫司他和WX-UK1抑制携带SARS-2-S和VSV-G的假型进入的能力。Calu-3细胞是肺衍生的人癌细胞系，其允许以TMPRSS2依赖性方式并且因此是卡莫司他敏感的方式的SARS-CoV-2刺突驱动的进入。Vero细胞是非洲绿猴衍生的肾细胞系，其允许以组织蛋白酶L依赖性方式和氯喹敏感性方式的SARS-CoV-2刺突驱动的进入。由水泡性口炎病毒(VSV)的G蛋白驱动的进入用作特异性对照(VSV-G驱动的进入取决于低pH并且因此是氯喹而非卡莫司他敏感的)。
乌莫司他和WX-UK1在人肺癌细胞(Calu-3)和绿猴肾细胞(Vero E6)中以中等效率 抑制SARS-CoV-2S蛋白介导的进入。
在Calu-3细胞中针对VSVpp+SARS-2-SΔ18进行测试时，WX-UK1和upamostat均显示出中等抑制活性，但低于另一种丝氨酸蛋白酶抑制剂camostat(图8A)。当在不具有表面TMPRSS2的Vero-E6细胞中测试时，对于乌莫司他和WX-UK1仍注意到中等抑制活性；卡莫司他在这种情况下是无活性的，而最高浓度的氯喹强效地抑制S蛋白驱动的进入(图8B)。WX-UK1和乌莫司他适度抑制calu-3细胞中的VSV-G进入，表明乌莫司他的活性谱更宽(图9)。当在Vero76细胞中针对VSV-G进行测试时，除氯喹外，所有三种化合物均无活性。总之，这些结果展示WX-UK1和乌莫司他以中等效率抑制SARS-CoV-2刺突驱动的Calu-3和Vero细胞进入。由于模型的性质，不可能具体外推至实际的体外或体内抑制浓度。
实施例6：用奥帕尼布治疗COVID-19合并肺炎
从该住院研究中评估诊断患有COVID-19感染的患者，该患者已发展为肺炎并且不需要机械通气或者其已机械通气不超过24小时。
主要目标：
1)评价以500mg Q12小时给药的奥帕尼布在因COVID-19感染而住院的患者中的安全性和耐受性
评价奥帕尼布治疗中的病毒排出
次要/探索性可包括以下中的一项或多项：
1)评价奥帕尼布治疗中因COVID-19感染而住院的患者的生命体征
2)评价奥帕尼布治疗中因COVID-19感染而住院的患者的临床改善
3)对于在基线处未机械通气的患者，评价奥帕尼布治疗对机械通气的需要
4)经由SpO2/FiO2或PaO2/FiO2比率以及室内空气中的SpO2评价对缺氧的改善。返回到室内空气或室内空气的特定SpO2氧饱和度。
评估治疗中病毒载量变化，以及D-二聚体、心肌肌钙蛋白、LDH和铁蛋白水平的变化。
研究设计：
本研究包括一个主动治疗组；对于不需要机械通气或已接受机械通气<24小时的所有入院患有COVID-19肺炎的合格患者，接受开放标记的奥帕尼布500mg Q12小时，每日两次。患者进入至多1周的筛选期。合格患者进入至多2周的治疗期。所有参与者在其最后一次给药研究药物后、在2周治疗期结束时、或一旦他们连续2次COVID-19病毒的每日病毒拭子阴性后或在第14天之前药物过早中止后随访2周。研究参与的最长持续时间为35天(7周)。研究参与者接受奥帕尼布，2×250mg胶囊(500mg)Q12小时，每日施用共至多14天(2周)或直至连续2次每日鼻咽病毒拭子呈COVID-19阴性，以先发生者为准。将奥帕尼布与食物一起施用(在清淡至适量的饭菜后)，然后喝240mL(8液体盎司)的水。如果患者只能通过鼻胃管服用奥帕尼布，则将胶囊内容物悬浮于20cc生理盐水溶液中，并通过鼻胃管推入，并用无菌水充分冲洗。如果患者正在管饲，则在管饲之后不久(约15-30分钟)施用奥帕尼布。
关键纳入标准：
1.≥18岁至≤75岁的成年男性或女性，包括端值
2.不需要机械通气或在知情同意时机械通气不超过24小时的已确认的COVID-19感染和肺炎
3.患者、监护人或法律上可接受的代表已签署书面IRB批准的知情同意书。
关键排除标准：
1.纽约心脏协会III或IV类心脏病、过去6个月内的心肌梗塞、不稳定心律失常、或ECG上的局部缺血证据
2.研究者判断可能增加治疗风险的任何共病。
3.妊娠(血清试验阳性)或哺乳女性
4.不愿意或无法遵守本方案要求的规程。
5.AST(SGOT)或ALT(SGPT)>2.5×正常上限(ULN)
6.胆红素>1.5×ULN(由于吉尔伯特综合征导致胆红素增加的情况除外)
7.血清肌酐>2.0×ULN
8.中性粒细胞绝对计数<1000个细胞/mm3
9.血小板计数<75,000/mm3
10.血红蛋白<8.0g/dL
11.目前正在服用华法林、阿哌沙班、阿加曲班(argatroban)或利伐沙班
12.目前药物或酒精滥用
研究评估：
每日监测以下情况(参见表4)：
·伴随用药审查
·不良事件
·体格检查
·生命体征(通过脉搏血氧仪测量体温、血压、脉搏率、呼吸率和氧饱和度)
·临床症状(咳嗽、呼吸困难、恶心、呕吐、腹泻)
·鼻咽病毒拭子
·血清化学
·CBC与分类
·胸部X线
·验尿
表4：
评估计划表；下文未提及的其他可能的评估包括收集血液和粪便样本，并使用定量RT-PCR测定确定SARS-CoV-2RNA水平。只要受试者继续排出病毒RNA，就每日评估病毒载量。
1每日评估至第14天或更早，如果每日连续2次SARS-CoV-2病毒拭子阴性
2通过脉搏血氧仪评估体温、血压、脉搏率、呼吸率和氧饱和度
3评估咳嗽、呼吸困难、恶心、呕吐、腹泻
4有生育能力的女性；血清妊娠试验在随机化前3天内必须为阴性
剂型和施用模式：
奥帕尼布作为250mg胶囊提供，在白色不透明硬明胶胶囊中含有250mg奥帕尼布以及赋形剂。
奥帕尼布作为两粒胶囊(500mg)每12小时口服施用(或在适当时经由鼻胃管)，持续至多2周。适当时，每个剂量与食物一起施用或在管饲后15-30分钟施用。
研究终点：
主要安全性终点：
1)不良事件、实验室测试、体格检查和生命体征
2)到奥帕尼布治疗的第14天，连续2次每日鼻咽病毒拭子阴性患者的百分比
次要/探索性终点：
1)展示出生命体征改善的患者百分比(基于以下中的一项或多项的改善：体温、心率、呼吸率、氧饱和度)
2)展示出临床改善的患者百分比(基于以下症状中的一项或多项的改善：咳嗽、呼吸困难、恶心、呕吐、腹泻)
基线时未机械通气、到为期2周的停药随访结束时不需要机械通气的患者百分比
结果：
·结果已获自被批准同情用药的七名患者。这些患者患有中度至重度COVID-19相关肺炎，伴有需要辅助供氧的缺氧。给予七名患者中的六名奥帕尼布加标准护理，包括羟氯喹(HCQ)作为背景疗法。
·如从表5可以看出，除了由于可能与或可能不与奥帕尼布(该患者也被给予HCQ和阿奇霉素)相关的腹泻而仅接受1天治疗的患者#7之外，所有6名中度至重度患者均有显著改善，其中5名患者返回呼吸室内空气并且3名患者出院。
·所有六名患者均显示出C-反应蛋白(CRP)降低，所有六名患者也展示出可测量的临床改善，包括降低的补充氧合和更高的淋巴细胞计数。
·所有患者以250mg奥帕尼布Q12小时开始持续前3天，然后增加至500mg奥帕尼布Q12小时。
·尽管仅有六名患者，但这些初步发现显示在用奥帕尼布治疗的第一名COVID-19患者中有临床改善，并为COVID-19患者使用奥帕尼布的耐受性提供了初步支持。
表5：研究结果
*治疗开始后一天改善，在室内空气中出院，无需重复血液检查。
RA-室内空气，D/C-出院，SOB-呼吸急促
分析中包括五名患者，并且为了比较的目的，我们使用具有相同性别、相同严重程度患者的对照组(基线特征)。适当时，组之间的单变量比较用分类变量的卡方检验和连续变量的t检验或曼-惠特尼U检验进行。将时间变量与Cox比例风险回归进行比较，针对年龄和背景疾病进行调整。利用重复测量一般线性模型和用于多重比较的Bonferroni校正比较CRP和淋巴细胞变化。
用奥帕尼布治疗的患者的淋巴细胞计数增加显著更快。所有其他临床结局均具有有利于治疗组的非统计学显著趋势：与对照相比，病例从高流量鼻插管(HFNC)断离的中位时间为10天和15天(HR＝0.3，95％CI：0.07-1.7，p＝0.2)，到环境空气的时间为13天对14.5天(HR＝0.4，95％CI：0.15-1.5)，没有病例需要机械通气，而对照则为33％。在该严重的COVID-19患者的小队列中，奥帕尼布是安全的和耐受良好的，在所有治疗患者中临床和实验室参数均有所改善。应在随机安慰剂对照试验中进一步测试奥帕尼布对COVID-19感染的功效。
实施例7：奥帕尼布在COVID-19肺炎中的随机、双盲、安慰剂对照2a期研究
主要目标：
评价在14天(第1天至第14天)内使用每日辅助供氧流量(L/min)的总氧气需求(曲线下面积)
次要目标：
1)基于以L/min为单位的氧气流量评价辅助供氧从基线降低50％的时间
2)评价到第14天至少24小时不再需要辅助供氧的患者比例
3)评价第14天无发热患者的比例
4)通过PCR评价SARS-CoV-2拭子阴性的时间
5)在第14天通过PCR评价SARS-CoV-2拭子阴性患者的比例
6)评价到第14天对插管和机械通气的需要
7)评价到机械通气的时间
8)评价在基线时具有至少一次发热测量(定义为体温>38.0℃[100.4F])、在第14天无发热(定义为体温<37.2℃[99F])的患者比例
9)评价基线后30天的死亡率
探索性目标：
评估全身性炎症标志物(D-二聚体、心肌肌钙蛋白、C-反应蛋白[CRP]、乳酸脱氢酶[LDH]和铁蛋白)的变化
安全性目标：
评估在患有COVID-19肺炎的患者中以500mg Q12小时口服施用奥帕尼布至多14天的安全性和耐受性
研究人群：
研究人群由诊断患有COVID-19感染的患者组成，这些患者发展有被定义为胸部X线影像学阴影并需要辅助供氧的肺炎。患者必须至少在筛选期间和基线时(第1天)住院。
研究设计和描述：
这是一项2a期、概念验证、多中心随机双盲、平行组、安慰剂对照研究。在获得知情同意后，患者进入不超过3天的筛选期，以确定合格性。将42名合格患者随机化，以1:1的随机化比率接受添加到标准护理中的奥帕尼布或添加到标准护理中的匹配的安慰剂。治疗分配对患者、研究者和医院工作人员以及申办者保持盲态。由于没有特别靶向引起COVID-19的SARS-CoV-2病毒的明确治疗的共识(Wilson，2020)，在COVID-19大流行期间实施的标准护理是指区域、机构或医生指导的治疗。
研究参与者除了标准护理(药理学和/或支持性)之外，每12小时接受奥帕尼布2×250mg胶囊(500mg)或匹配的安慰剂。研究药物每天施用，持续14天(第1天至第14天)，除非患者已出院而无需辅助供氧，在这种情况下，研究药物将仅施用至第10天。
根据患者或医生的决定，所有参与者在最后一次研究药物给药后随访4周，这可能在2周双盲治疗期结束时或研究药物过早中止后发生。研究参与的最长持续时间为至多45天(包括至多3天的筛选期；2周DB治疗期和4周停药随访)
分层：
基于考虑以下三个参数的最小化算法对患者进行分层：筛选时年龄≥70岁(是或否)；筛选时HbA1c≥6.5(是或否)；基线时的氧气需求，需要非侵入性正压通气(例如，经由BIPAP、CPAP)(是或否)。
合格性标准：
纳入：
1.成年男性或女性年龄≥18岁至≤80岁
2.经咽部样本(鼻咽或口咽)RT-PCR测定确认的COVID-19感染，以及定义为胸部X线影像学阴影的肺炎
3.患者在基线时需要辅助供氧
4.患者、监护人或法定代表人已签署书面IRB批准的知情同意书
排除：
1.研究者判断可能增加治疗风险的任何共病。
2.需要插管和机械通气
3.室内空气氧饱和度>95％
4.住院前需要间歇性或持续性动态氧气的任何既存呼吸疾病
5.根据研究者的临床判断患者不太可能存活>72小时
6.妊娠(随机化前3天内血清试验阳性)或哺乳女性
7.不愿意或无法遵守本方案要求的规程。
8.使用Friedericia公式(QTcF)计算的心电图(ECG)上的校正QT(QTc)间期对于女性>470ms或对于男性>450ms
9.AST(SGOT)或ALT(SGPT)>2.5×正常上限(ULN)
10.胆红素>1.5×ULN(由于吉尔伯特综合征导致胆红素增加的情况除外)
11.血清肌酐>2.0×ULN
12.中性粒细胞绝对计数<1000个细胞/mm3
13.血小板计数<75,000/mm3
14.血红蛋白<8.0g/dL
15.目前正在服用对CYP3A4、CYP2C9或CYP2C19底物敏感且治疗指数窄的药物
16.目前正在服用为CYP2D6和CYP3A4的强诱导剂或抑制剂的药物。
17.目前正在服用华法林、阿哌沙班、阿加曲班或利伐沙班
18.目前药物或酒精滥用
19.目前参与评估药理学治疗的临床研究，包括抗病毒研究
受试者数量：
本研究共筛选了49名患者，其中42名患者被随机化(23名接受奥帕尼布，19名接受安慰剂)，而7名筛选失败。在每组中随机化两名患者，但不进行治疗。19名奥帕尼布患者和16名安慰剂患者完成治疗(第14天)。3名奥帕尼布患者和2名安慰剂患者过早中止治疗。在奥帕尼布组中的两名患者经历了不良事件，使得研究药物被终止，而一名安慰剂患者由于不良事件而被终止。
筛选/基线评估：
·签署知情同意书
·合格性确定
·完整病史(包括COVID-19症状发作)
·伴随用药评估
·系统基线审查
·体格检查
·生命体征(通过脉搏血氧仪测量体温、血压、脉搏率、呼吸率和氧饱和度)
·患者走动时的体重
·需氧量(L/min)
·12导联心电图
·胸部X线
·SARS-CoV-2PCR测试鼻咽或口咽拭子
·血清化学
·CRP、D-二聚体、LDH、铁蛋白、心肌肌钙蛋白
·HbA1c
·CBC与分类
·验尿
·治疗前3天内的血清妊娠试验(对于有生育能力的女性)
研究评估：
作为标准护理的一部分，每日监测并记录以下内容：
·伴随用药
·不良事件
·临时体格检查
·生命体征(通过脉搏血氧仪测量体温、血压、脉搏率、呼吸率和氧饱和度)
·需氧量(L/min)
作为标准护理的一部分并且在可能的情况下，将不那么频繁地监测以下内容：
·对于伴随服用羟氯喹的患者，在第1天第一次施用研究药物后约3小时，在第2天和第4天的任何时间，以及再次在治疗结束时(第10天、第14天或在研究药物过早中止时)进行12导联心电图(如果COVID-19的医院治疗指南允许)。如果患者使用监护仪(包括遥测或Holter监护仪)，鼓励研究者收集QT间期数据
·每1-3天SARS-CoV-2PCR测试鼻咽或口咽病毒拭子
·每周一次血清化学
·每周一次血清CRP、D-二聚体、LDH、铁蛋白、心肌肌钙蛋白
·每周一次CBC与分类
·根据医生的决定进行胸部X线检查
研究终点：
主要
在14天(第1天至第14天)内使用每日辅助供氧流量(L/min)的总氧气需求(曲线下面积)
次要
1)基于以L/min为单位的氧气流量辅助供氧从基线降低50％的时间
2)到第14天至少24小时不再接受辅助供氧的患者百分比
3)通过PCR间隔至少24小时连续两次SARS-CoV-2拭子阴性的时间
4)在第14天通过PCR至少连续两次SARS-CoV-2拭子阴性、随后拭子连续阴性的患者百分比
5)到为期2周的停药随访结束时需要插管和机械通气的患者百分比
6)到插管和机械通气的时间
7)在基线时具有至少一次发热测量(定义为体温>38.0℃[100.4F])、在第14天无发热(定义为体温<37.2℃[99F])的患者百分比8)在第30天因任何原因导致的死亡率
探索性
1)第14天全身性炎症标志物(D-二聚体、心肌肌钙蛋白、C-反应蛋白[CRP]、降钙素原[PCT]、乳酸脱氢酶[LDH]和铁蛋白)相对于基线的平均变化
安全性
1)所有治疗紧急AE(TEAE)和SAE的发生率
2)生命体征评价
3)实验室参数评价(化学和血液学)
4)心电图(ECG)评价
统计方法：
本研究的主要功效目标是使用14天(第1天至第14天)的每日氧气流量(L/min)测量结果来评价奥帕尼布对总辅助供氧需求(曲线下面积)的影响。在减去每天的基线氧气需求之后，使用梯形法则，计算每个患者在第14天的辅助供氧需求曲线下面积的主要功效终点。不需要辅助供氧的天数记录为0。如果在某一天记录到若干个氧气需求值(L/min)，则对于主要分析，取这些值中的最高值。在主要分析中，对于在第14天之前死亡或需要插管和机械通气的患者，将缺失的每日值指定为8L/min的最大辅助供氧流量需求。对于在第14天之前在辅助供氧中出院的患者，如果出院后该试验中心没有收集到值，则将对此后的每天至第14天分配出院当天的氧气需求(L/min)。
主要分析基于改良的意向性治疗人群(mITT)，该人群由随机化并用至少一个剂量的研究药物治疗的所有患者组成(该人群包括共40名受试者，奥帕尼布22名，安慰剂组18名)，经基线调整的AUC的描述性统计按组呈现，其中对于每组和对于组间平均值的差异具有95％置信区间。收集直至第14天的辅助供氧需求，即使患者在第14天之前中止治疗但在研究中持续至第14天。此外，假设失访使得直至第14天的生命状态丢失是不太可能的。因此，主要分析假设在治疗中止后所有辅助供氧值都缺失的情况下，将最后一个值向前行进直到第14天，或死亡(如果之前发生)。使用AUC汇总统计方法对上述缺失数据处理方法进行敏感性分析，其中组AUC由重复测量模型的估计参数计算。
在mITT队列中，两名受试者因1级胃肠AE而撤销他们的同意。此外，一名受试者在开始治疗前在基线时不需要任何辅助供氧，并根据统计分析计划(SAP)的要求从若干分析中移除。因此，事后活动分析人群(“mITT敏感性”)将这三名患者从分析中排除，并包括37名受试者，奥帕尼布19名，安慰剂18名。mITT人群(包括这3名受试者)和mITT敏感性人群的结果显示出类似的活性趋势。
结果：
来自研究的顶线结果发现奥帕尼布是安全的，在奥帕尼布和安慰剂治疗组之间没有实质性的安全性差异。总之，与安慰剂组相比，奥帕尼布治疗组中遭受严重不良事件(SAE)的患者更少。在该小样本量中，很少发生插管或死亡事件，并且这在两组之间是平衡的。
奥帕尼布治疗组在关键的主要和次要功效结局中，展示出在第14天治疗结束时在降低氧气需求方面更大改善的一致趋势，与世界卫生组织(WHO)顺序量表定义的临床改善相关：
与对照组相比，到第14天达到室内空气且不再需要氧气支持的患者比例有更大改善(52.6％对22.2％)。图10示出了在至少24小时内不再接受辅助供氧的时间的卡普兰-迈耶曲线(mITT敏感性)。
与对照组相比，到第14天辅助供氧降低50％的患者比例有更大改善(89.5％对66.7％)。图11示出了基于以L/min为单位的氧气流量的辅助供氧从基线降低50％的时间的时间累积发生率的卡普兰-迈耶曲线(mITT敏感性)。
与对照组相比，到第14天出院的患者比例更高(73.7％对55.6％)。
在14天内平均总氧气需求(AUC)比基线降低更大(68.0％对46.7％)。图12示出了使用14天(第1天至第14天)的每日氧气流量(L/min)测量结果的总辅助供氧需求(曲线下面积)相对于基线的百分比变化的点图。
实施例8：奥帕尼布在COVID-19肺炎中的随机、双盲、安慰剂对照的国际2/3期研究
主要目标：
评价到第14天需要插管和机械通气的患者比例。
次要目标：
1)评价WHO临床改善顺序量表(Ordinal Scale for Clinical Improvement)的变化
2)评价到插管和机械通气的时间
3)评价经由鼻插管到低氧气流量的时间，例如，如果高氧气流量不是可用选项，经由鼻插管或CPAP从高氧气流量到低氧气流量的时间
4)评价到第14天至少24小时不再需要辅助供氧的患者比例
5)评价在14天(第1天至第14天)内使用每日辅助供氧流量(L/min)的总氧气需求(曲线下面积)
6)通过PCR评价连续两次SARS-CoV-2拭子阴性的时间
7)在第14天通过PCR评价连续两次SARS-CoV-2拭子阴性患者的比例
8)评价在基线时具有至少一次发热测量(定义为体温>38.0℃[100.4F])、在第14天无发热(定义为体温<37.2℃[99F])的患者比例
9)评价基线后30天的死亡率
探索目标：
评估在14天的治疗期内全身性炎症标志物(D-二聚体、心肌肌钙蛋白、C-反应蛋白[CRP]、乳酸脱氢酶[LDH]和铁蛋白)的变化。
安全性目标：
评估在患有严重COVID-19肺炎的患者中以500mg Q12小时口服施用奥帕尼布至多14天的安全性和耐受性。
研究人群：
研究人群将由诊断患有COVID-19感染的患者组成，该感染基于符合当前区域特异性诊断指南的合格性标准而被定义为严重的。具体地，患者将至少具有继发于SARS-CoV-2的肺炎、胸部X线或CT扫描的肺炎的影像学证据，并且如果高氧气流量不是可用选项，则需要经由鼻插管或CPAP通过高流量氧气辅助供氧。患者必须至少在筛选期间和基线时(第1天)住院。
研究设计和描述：
这是一项2/3期多中心、随机、双盲、平行组、安慰剂对照研究，其具有将利用无效性评估的适应性设计。本研究计划在意大利、其他欧盟国家、俄罗斯、巴西、墨西哥和美国至多约40家临床试验中心进行。
获得知情同意后，患者将进入不超过3天的筛选期，以确定合格性。将约270名合格的患者随机化，并以1:1的随机化比率接受添加到标准护理中的奥帕尼布或添加到标准护理中的匹配的安慰剂。治疗分配将对患者、研究者和医院工作人员以及申办者保持盲态。由于治疗COVID-19的批准和/或指南在不断发展，对于本方案，将根据疾病的严重程度，基于当地诊断和指南文件，诸如临时方法建议：新冠状病毒感染(COVID-19)的预防、诊断和治疗；欧盟委员会、欧洲药品管理局(EMA)、药品局总部(HMA)和FDA以及如更新到推荐的最新版本，通过推荐的治疗方案来确定标准护理。
研究参与者除了标准护理(如上文所定义的药理学和/或支持性)之外将在任何给定机构每12小时接受奥帕尼布2×250mg胶囊(500mg)或匹配的安慰剂。每天施用研究药物，持续14天(第1天至第14天)。根据患者或医生的决定，所有参与者将在最后一次研究药物给药后随访28天，这可能在第14天或研究药物过早中止后发生。
随机化策略：
由于根据疾病严重程度推荐的治疗方案中的治疗可能不同，基于当地诊断和指南文件，诸如临时方法建议：新冠状病毒感染(COVID-19)的预防、诊断和治疗；欧盟委员会、欧洲药品管理局(EMA)、药品局总部(HMA)和FDA，给予患者的标准护理可能因机构而异。为了确保在两个治疗组中的标准治疗方案的平衡，将在单个试验中心水平上确定随机化。
无效性的适应性期中分析：
在对大约100名受试者(每组大约50名受试者)进行了主要终点评估后，将进行非盲无效性期中分析，以确定拒绝无效零假设的概率以及继续研究是否无效。将在期中分析之前瞻性地确定标准并记录在统计分析计划(SAP)的最终版本中。
数据安全监测委员会：
将召集数据安全监测委员会(DSMB)进行该研究的安全性监督，以确保试验参与者的安全性。计划在分别25％、50％和75％或当约70、135和200名随机化患者到达第7天，然后到达第14天时召开DSMB会议以审查安全性数据。DSMB还负责将向申办者传达由独立的非盲统计学家进行的无效性分析的结果(无效/非无效)。
分层：
将基于在基线时符合COVID-19结局的三个或更多个高风险临床参数(是或否)对患者进行分层。参数为：1)筛选时年龄≥60岁(是或否)；2)男性(是或否)；3)筛选时HbA1c≥6.5(是或否)；4)呼吸功未相应增加的低氧血症(定义为呼吸率增加、鼻扩和/或包括膈肌的呼吸肌使用增加)[是或否]；5)已知的潜在慢性肺病(是或否)；6)已知的心血管疾病或高血压(是或否)；7)BMI≥28.0kg/m2(是或否)；8)已知肾病(是或否)。
治疗和施用：
奥帕尼布500mg Q12小时或匹配的安慰剂。制成悬浮液形式的奥帕尼布或安慰剂可通过鼻胃管施用于患者的胃。
研究持续时间：
研究参与的最长持续时间将为至多45天(包括至多3天的筛选期；至多14天的双盲治疗和28天的停药随访)。
合格性标准：
纳入：
1.成年男性或女性年龄≥18岁至≤80岁
2.经咽部样本(鼻咽或口咽)RT-PCR测定确认的COVID-19感染，以及定义为胸部X线或CT扫描影像学阴影的肺炎。
3.如果高氧气流量不是可用选项，则患者在基线时需要高流量辅助供氧或CPAP。
4.患者同意在研究期间和最后一次研究药物给药后3个月使用适当的避孕方法
5.患者或法定代表人已签署IRB/伦理委员会批准的书面知情同意书排除：
1.研究者判断可能增加治疗风险的任何共病。
2.需要插管和机械通气
3.室内空气氧饱和度>95％
4.住院前需要间歇性或持续性动态氧气的任何既存呼吸疾病
5.根据研究者的临床判断患者不太可能存活>72小时
6.妊娠(随机化前3天内血清或尿液试验阳性)或哺乳女性。
7.不愿意或无法遵守本方案要求的规程。
8.使用Friedericia公式(QTcF)计算的心电图(ECG)上的校正QT(QTc)间期对于女性>470ms或对于男性>450ms
9.AST(SGOT)或ALT(SGPT)>2.5×正常上限(ULN)
10.总胆红素>1.5×ULN(由于吉尔伯特综合征导致胆红素增加的情况除外)
11.血清肌酐>2.0×ULN
12.中性粒细胞绝对计数<1000个细胞/mm3
13.血小板计数<75,000/mm3
14.血红蛋白<8.0g/dL
15.目前正在服用对CYP3A4、CYP2C9或CYP2C19底物敏感且治疗指数窄的药物
16.目前正在服用为CYP2D6和CYP3A4的强诱导剂或抑制剂的药物
17.由于基于CYP450代谢的药物-药物相互作用目前正在服用华法林、阿哌沙班、阿加曲班或利伐沙班
18.目前药物或酒精滥用
19.目前参与评估药理学治疗的临床研究，包括抗病毒研究
筛选/基线评估：
·由患者或法定代表人签署知情同意书
·合格性确定
·完整病史(包括COVID-19症状发作)
·伴随用药评估
·系统基线审查
·体格检查
·生命体征(通过脉搏血氧仪测量体温、血压、脉搏率、呼吸率和氧饱和度)
·患者走动时的体重
·需氧量(L/min)
·FiO2(估计值)
·12导联心电图
·胸部X线或CT扫描
·SARS-CoV-2PCR测试鼻咽或口咽拭子
·血清化学
·CRP、D-二聚体、LDH、铁蛋白、心肌肌钙蛋白
·HbA1c
·CBC与分类
·验尿
·治疗前3天内的血清或尿液妊娠试验(对于有生育能力的女性)
研究评估：
作为标准护理的一部分，将每日监测并记录以下内容：
·伴随用药
·不良事件
·临时体格检查
·生命体征(通过脉搏血氧仪测量体温、血压、脉搏率、呼吸率和氧饱和度)
·氧气流速设置(L/min)
·FiO2(估计或知道患者是否通气)
作为标准护理的一部分并且在可能的情况下，将不那么频繁地监测以下内容：
·对于伴随服用氯喹/羟氯喹/甲氟喹的患者，在第1天第一次施用研究药物后约3小时，在第2天和第4天的任何时间，以及再次在治疗结束时(第14天或在研究药物过早中止时)进行12导联心电图(如果COVID-19的医院治疗指南允许)。如果患者使用监护仪(包括遥测或Holter监护仪)，鼓励研究者收集QT间期数据
·每3天SARS-CoV-2PCR测试鼻咽或口咽病毒拭子
·每周一次血清化学
·每周一次血清CRP、D-二聚体、LDH、铁蛋白、心肌肌钙蛋白
·每周一次CBC与分类
·根据医生的决定进行胸部X线或CT扫描
研究终点：
主要
到第14天需要插管和机械通气的患者百分比
次要
1)WHO临床改善顺序量表上有≥2类改善的患者百分比
2)插管和机械通气的时间
3)经由鼻插管到低氧气流量的时间，例如，如果高氧气流量不是可用选项，经由鼻插管或CPAP从高氧气流量到低氧气流量的时间
4)到第14天至少24小时不再接受辅助供氧的患者百分比
5)在14天(第1天至第14天)内使用每日辅助供氧流量(L/min)的总氧气需求(曲线下面积)
6)通过PCR间隔至少24小时连续两次SARS-CoV-2拭子阴性的时间
7)在第14天通过PCR至少连续两次SARS-CoV-2拭子阴性的患者百分比
8)在基线时具有至少一次发热测量(定义为体温>38.0℃[100.4F])、在第14天无发热(定义为体温<37.2℃[99F])的患者百分比
9)基线后第30天因任何原因导致的死亡率
探索性
第14天全身性炎症标志物(D-二聚体、心肌肌钙蛋白、C-反应蛋白[CRP]、降钙素原[PCT]、乳酸脱氢酶[LDH]和铁蛋白)相对于基线的平均变化
安全性
1)所有治疗紧急AE(TEAE)和SAE的发生率
2)生命体征评价
3)实验室参数评价(化学和血液学)
4)心电图(ECG)评价
研究期间禁用的药物：
研究期间(包括28天的随访期)禁用以下药物：
·禁用对CYP3A4、CYP2C9或CYP2C19底物敏感且治疗指数窄的药物
·禁用CYP2D6和3A4的强诱导剂或抑制剂
由于基于CYP450代谢的药物-药物相互作用禁用华法林、阿哌沙班、阿加曲班和利伐沙班
停止规则：
在研究期间的任何时间，如果确定参与者经历了任何以下不良事件，则他们将停止研究药物(使用如修订后的NCI不良事件通用术语[CTCAE v.5.0]中定义的评级标准)
·3级严重程度的任何神经精神不良事件
·任何严重程度(任何等级)的幻觉
·3级严重程度的恶心
·3级严重程度的呕吐
·2级严重程度的肌酐升高
统计方法：
主要分析将基于复合失效(是/否)变量，指示受试者是否需要插管和机械通气或截至研究第14天死亡。
在患者结局未知(患者失访)的罕见病例中，对于主要分析，这将被计数为治疗失效。如果患者在14天内开始新的COVID-19的研究性治疗，则在主要分析中，这也被认为是治疗失效。
每个治疗组中失效事件的受试者的数量和百分比将被制表。将为每个比例构建95％置信区间。Cochran Mantel-Haenzel(CMH)检验将使用用于随机化的研究分层因素比较两组之间的失效比例，并且将以95％置信区间呈现对应的风险差异估计。将根据需要使用精确的置信区间。
该检验的显著性水平将为双侧5％。在发生少量事件(任何研究组中少于5个事件)的情况下，将使用Fisher精确检验。
将按组描述每种失效类型(插管和机械通气)的数量和百分比。
主要分析将基于改良的意向性治疗人群(mITT)，该人群由随机化并用至少一个剂量的研究药物治疗的所有患者组成。
DSMB无效性审查
在2021年1月，独立数据安全监测委员会(DSMB)一致地推荐在对研究中接受治疗的前135名患者的非盲功效数据和前175名患者的安全性数据进行计划前无效性审查后继续研究。
实施例9：用于治疗COVID-19疾病的奥帕尼布(一种鞘氨醇激酶-2(SK2)抑制剂)或安慰剂的随机、双盲、安慰剂对照的2/3期研究
本研究将评估奥帕尼布相对于安慰剂治疗根据研究者的判断不需要住院的COVID-19患者的活性。
主要目标：
在从疾病中持续恢复的时间内比较奥帕尼布和安慰剂。一旦患者符合以下标准，将被视为已痊愈：
1)在不使用退热剂的情况下持续至少48小时的无发热(核心温度<38.0℃)；
2)除以下情况外，所有症状均已缓解或恢复至疾病前水平(例如，如果患者在COVID-19发作前具有基线呼吸受损)：
a.疲劳、嗅觉丧失、味觉丧失或味觉障碍，其可持续与急性疾病期间类似的水平，即，按症状问卷相同的水平；
b.胸痛、咳嗽或呼吸困难，如果持续，必须比治疗开始时低至少一个等级，并且不差于1级(轻度)。
根据以上定义，持续恢复是指维持至少28天或直至研究结束(以先发生者为准)的恢复。
次要目标：
活性治疗组与安慰剂组之间的比较：
1)在治疗开始后第8、15、29和57天为PCR阴性的患者比例(界标分析)；
2)基线时存在的个体疾病相关症状的消退时间；
3)研究中新的疾病相关症状的发展；
4)研究期间无基线肺炎患者的肺炎发生率(临床诊断)；
5)疾病严重程度的实验室标志物(即氧饱和度、CRP、淋巴细胞计数、心肌肌钙蛋白和D-二聚体水平)从基线到研究中测量这些的时间点的变化；
6)不良事件；
7)研究用药第一次给药后8周内住院，总体和COVID-19相关适应症；
8)研究用药第一次给药后30天的死亡率；
探索性
1)到第57天报告已发展出有症状的经PCR确认的COVID-19的家庭联系人的患者百分比；
2)在治疗开始后第57天针对SARS-CoV-2的血清IgM和IgG抗体的水平。
安全性：
在整个研究过程中，将随访患者的不良事件，包括临床和实验室事件。
特别地，导致剂量减少或治疗中止的毒性将被跟踪并制表。
人群：
纳入标准：
1.根据呼吸道样本的RT-PCR测定，患者有症状，经诊断确认为COVID-19。
2.患者必须在随机化的3天内有症状或通过RT-PCR发现阳性，以较大者为准。
3.男性和女性年龄≥18岁。
4.在基线时，下列实验室参数不差于NCI CTCAE v5.0 2级，例外情况如下：
-胆红素≤正常值上限的1.5倍(ULN；仅1级)
-AST(SGOT)、ALT(SGPT)≤5.0×ULN，
-血清肌酐≤1.5×ULN(1级)
-白蛋白≥2.0g/dL
5.可接受的血液学状态：
-中性粒细胞绝对计数≥1000个细胞/mm3
-血小板计数≥50,000plt/mm3
-血红蛋白≥8.0g/dL
6.研究者认为临床上可接受的血糖控制。
7.INR和部分凝血活酶时间(PTT)各自≤±1.5×ULN(即1级)，除非患者正在服用达比加群或肝素。
8.脉搏血氧仪测定的室内空气氧饱和度≥92％
9.阴性妊娠试验(如果女性有生育能力)。
10.有生育能力的女性和有生育能力的女性伴侣的男性必须同意在研究期间和在最后一次研究用药给药后至少两个月使用可接受的避孕方法。
11.能够独立完成每日日记。
12.患者必须作出知情同意。
排除标准：
1.根据临床医生评估，患者需要急性住院。
2.妊娠或哺乳女性。
3.不愿意或无法遵守本方案要求的规程。
4.患者需要辅助供氧
5.患者目前正在接受、在过去7天内已接受或预期在研究过程中接受瑞德西韦、氯喹、羟氯喹、阿奇霉素或其他用于COVID-19的特定抗病毒疗法或相当于每日≥20mg泼尼松/每日3mg地塞米松的全身皮质类固醇。
6.患者目前正在接受或在筛选任何其他研究性药剂的任何适应症之前30天内已接受，包括针对研究性适应症给予的批准药物(例如，抗细胞因子治疗)。
7.患者目前正在服用或预期开始服用华法林、阿哌沙班(Eliquis)或利伐沙班(Xarelto)。患者可能正在服用或开始服用研究用达比加群(Pradaxa)、标准或低分子量肝素。
设计：
这是一项在不需要住院的有症状COVID-19的患者中奥帕尼布与安慰剂相比的随机、双盲、安慰剂对照、平行组研究。该研究将包括对无效性早期终止或样本量增加的期中分析，如初步结果所示。
方法学：
部分B：研究参与者将每12小时接受奥帕尼布2×250mg胶囊(500mg)，或匹配的安慰剂。患者将按以下情况的数量进行分层(无、一种或多于一种)：年龄≥65，存在以下有关医学病症：高血压、慢性肺病、肥胖[BMI≥30]、糖尿病、心力衰竭、冠状动脉疾病、血栓形成事件(当前或病史)、肾病。患者也将按其被治疗的区域(美国与非美国)进行分层。然后将他们以1:1随机分配到活性药物或安慰剂。患者将完成关于症状(包括不良事件)、生命体征(包括体温和脉搏血氧定量)的每日问卷调查，以及所服用药物的记录，在研究的前4周每天一次，之后每周三次。用于安全性实验室和药效学标志物的病毒拭子和血液将由医务人员在家访时获得。治疗完成后，患者将从随机化开始随访57天。
研究期间禁用的药物：
研究期间(包括28天的随访期)禁用以下药物：
·禁用对CYP3A4、CYP2C9或CYP2C19底物敏感且治疗指数窄的药物
·禁用CYP2D6和3A4的强诱导剂或抑制剂
由于基于CYP450代谢的药物-药物相互作用禁用华法林、阿哌沙班、阿加曲班和利伐沙班
实施例10：用于治疗COVID-19疾病的乌莫司他(一种丝氨酸蛋白酶抑制剂)或安慰剂的随机、双盲、安慰剂对照的2/3期研究
本研究将评估乌莫司他相对于安慰剂治疗根据研究者的判断不需要住院的COVID-19患者的活性。
主要目标：
研究的A部分：确定两种剂量水平的安全性和耐受性，并决定B部分的乌莫司他剂量。将评估疾病标志物的严重程度的变化，但不是决定寻求哪种剂量的主要因素。还将计算恢复时间，尽管鉴于样本量较小和预期结局变异性，可能看不到具有临床意义的差异。
研究的B部分：在从疾病中持续恢复的时间内比较乌莫司他和安慰剂。一旦患者符合以下标准，将被视为已痊愈：
1)在不使用退热剂的情况下持续至少48小时的无发热(核心温度<38.0℃)；
2)除以下情况外，所有症状均已缓解或恢复至疾病前水平(例如，如果患者在COVID-19发作前具有基线呼吸受损)：
c.疲劳、嗅觉丧失、味觉丧失或味觉障碍，其可持续与急性疾病期间类似的水平，即，按症状问卷相同的水平；
d.胸痛、咳嗽或呼吸困难，如果持续，必须比治疗开始时低至少一个等级，并且不差于1级(轻度)。
根据以上定义，持续恢复是指维持至少28天或直至研究结束(以先发生者为准)的恢复。
次要目标：
活性治疗组与安慰剂组之间的比较：
1)在治疗开始后第8、15、29和57天为PCR阴性的患者比例(界标分析)；
2)基线时存在的个体疾病相关症状的消退时间；
3)研究中新的疾病相关症状的发展；
4)研究期间无基线肺炎患者的肺炎发生率(临床诊断)；
5)疾病严重程度的实验室标志物(即氧饱和度、CRP、淋巴细胞计数、心肌肌钙蛋白和D-二聚体水平)从基线到研究中测量这些的时间点的变化；
6)不良事件；
7)研究用药第一次给药后8周内住院，总体和COVID-19相关适应症；
8)研究用药第一次给药后30天的死亡率；
探索性
1)到第57天报告已发展出有症状的经PCR确认的COVID-19的家庭联系人的患者百分比；
2)在治疗开始后第57天针对SARS-CoV-2的血清IgM和IgG抗体的水平。
安全性
在整个研究过程中，将随访患者的不良事件，包括临床和实验室事件。
特别地，导致剂量减少或治疗中止的毒性将被跟踪并制表。
人群：
纳入标准：
1.根据呼吸道样本的RT-PCR测定，患者有症状，经诊断确认为COVID-19。
2.患者必须在随机化的3天内有症状或通过RT-PCR发现阳性，以较大者为准。
3.男性和女性年龄≥18岁。
4.在基线时，下列实验室参数不差于NCI CTCAE v5.0 2级，例外情况如下：
-胆红素≤正常值上限的1.5倍(ULN；仅1级)
-AST(SGOT)、ALT(SGPT)≤5.0×ULN，
-血清肌酐≤1.5×ULN(1级)
-白蛋白≥2.0g/dL
5.可接受的血液学状态：
-中性粒细胞绝对计数≥1000个细胞/mm3
-血小板计数≥50,000plt/mm3
-血红蛋白≥8.0g/dL
6.研究者认为临床上可接受的血糖控制。
7.INR和部分凝血活酶时间(PTT)各自≤±1.5×ULN(即1级)，除非患者正在服用达比加群或肝素。
8.脉搏血氧仪测定的室内空气氧饱和度≥92％
9.阴性妊娠试验(如果女性有生育能力)。
10.有生育能力的女性和有生育能力的女性伴侣的男性必须同意在研究期间和在最后一次研究用药给药后至少两个月使用可接受的避孕方法。
11.能够独立完成每日日记。
12.患者必须作出知情同意。
排除标准：
1.根据临床医生评估，患者需要急性住院。
2.妊娠或哺乳女性。
3.不愿意或无法遵守本方案要求的规程。
4.患者需要辅助供氧
5.患者目前正在接受、在过去7天内已接受或预期在研究过程中接受瑞德西韦、氯喹、羟氯喹、阿奇霉素或其他用于COVID-19的特定抗病毒疗法或相当于每日≥20mg泼尼松/每日3mg地塞米松的全身皮质类固醇。
6.患者目前正在接受或在筛选任何其他研究性药剂的任何适应症之前30天内已接受，包括针对研究性适应症给予的批准药物(例如，抗细胞因子治疗)。
7.患者目前正在服用或预期开始服用华法林、阿哌沙班(Eliquis)或利伐沙班(Xarelto)。患者可能正在服用或开始服用研究用达比加群(Pradaxa)、标准或低分子量肝素。
设计：
这是一项在不需要住院的有症状COVID-19的患者中乌莫司他与安慰剂相比的随机、双盲、安慰剂对照、平行组研究。本研究将使用2/3期操作无缝设计方法用于剂量选择(A部分)和推理独立的验证性3期研究(B部分)。该3期部分将包括对无效性早期终止或样本量增加的期中分析，如初步结果所示。
方法学：
A部分：在研究合格后，患者将按年龄<65或≥65进行分层。然后将他们1:1:1随机分入以下治疗组之一：
1.乌莫司他200mg两粒胶囊qd(n＝20)；
2.乌莫司他200mg一粒胶囊和匹配的安慰剂一粒胶囊qd(n＝20)
3.安慰剂两粒胶囊qd(n＝20)。
为了保持盲态，患者将被给予两瓶药物并被指示每天从每瓶服用一粒药丸。两种药丸同时服用。
药物应与水一起服用，可与或不与食物一起服用。
患者服药14天或直至出现以下情况之一：
·根据研究者的判断需要中止治疗的不良事件，无论与研究用药相关或不相关；
·患者或研究者决定停止治疗符合患者的最大利益。
在共60名患者完成A部分后，将由数据安全监测委员会(DSMB)进行期中分析。
·如果DSMB确定两种方案的安全性类似，则在B部分中应计将继续400mg qd剂量。
·如果200mg qd方案的安全性更有利，则在B部分中应计将继续200mg qd剂量。
B部分：基于A部分的安全性结果，将选择200mg或400mg(即一粒或两粒200mg胶囊)的治疗方案。B部分入组的患者将按以下情况的数量进行分层(无、一种或多种)：年龄≥65，存在以下有关医学病症：高血压、慢性肺病、肥胖[BMI≥30]、糖尿病、心力衰竭、冠状动脉疾病、血栓形成事件(当前或病史)、肾病。患者也将按其被治疗的区域(美国与非美国)进行分层。然后以基于A部分选择的计划表将他们以3:2随机分配到活性药物或安慰剂。在本研究的B部分中，共入组约250名另外的患者，其中150名接受活性药物，100名接受安慰剂。因此，将研究的两个部分组合，共170名患者将接受A部分中所选择的剂量的活性剂，120名将接受安慰剂。然而，将对A和B部分独立地进行分析。
患者将完成关于症状(包括不良事件)、生命体征(包括体温和脉搏血氧定量)的每日问卷调查，以及所服用药物的记录，在研究的前4周每天一次，之后每周三次。用于安全性实验室和药效学标志物的病毒拭子和血液将由医务人员在家访时获得。治疗完成后，患者将从随机化开始随访57天。
统计：
在本研究的部分A中，将测试两种剂量水平的活性药物和安慰剂。根据每个活性组中毒性的发生率和严重程度、DSMB对安全性的总体评估，选择本研究的B部分的方案。在两个活性组之间没有显著的毒性差异的情况下，继续进入B部分的默认选择是400mg每日方案。
将分别分析来自A和B部分的功效数据。
可根据中期研究结果扩大总体样本量。
样本量根据主要终点即从COVID-19疾病持续恢复的时间确定，如主要目标中所定义。经计算，为了检测危险比＝1.5，将活性组与安慰剂组以3:2分配比进行比较，需要总共201个恢复事件，以使用双侧显著性水平为0.05的对数秩检验提供80％功效。假设随访结束时的持续恢复率为80％(假设所有入组患者的随访率相等)，则B部分中入组的患者的最小数量将共为250名，其中150名在研究的B部分中所采用的方案的有效组中，100名在安慰剂组中。
工业适用性
本发明提供了抗冠状病毒剂，其包含由下式表示的化合物作为活性成分：作为游离碱或其盐，包含抗冠状病毒剂的抗SARS剂；以及使用抗冠状病毒剂治疗SARS的方法。本发明能够治疗由冠状病毒，特别是SARS相关冠状病毒引起的疾病。
本发明提供了抗冠状病毒剂，其包含由下式表示的化合物作为活性成分：
作为(L)-或(D)-对映体和作为E-或(Z)-异构体或(E/Z)-混合物以及作为游离碱或作为其盐；包含该抗冠状病毒剂的抗SARS剂；以及使用该抗冠状病毒剂治疗SARS的方法。本发明能够治疗由冠状病毒，特别是SARS相关冠状病毒引起的疾病。
本文引用的所有专利、专利申请和公布的参考文献均据此全文以引用方式并入。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所述组合物和方法的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。尽管已结合具体实施方案描述了本发明，但应当理解，本发明不应不当地限于此类具体实施方案。实际上，对于分子生物学、医学、免疫学、药理学、病毒学或相关领域的技术人员显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种修改旨在处于本发明的范围内。

Claims (10)

1.ABC294640作为游离碱或作为其盐在制备用于治疗由SARS-CoV-2病毒引起的2019冠状病毒疾病(COVID-19)的药物中的用途，所述ABC294640的结构为。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述ABC294640是其盐酸盐的形式。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述药物还包括药学上可接受的载体材料，并且呈适于口服施用的单位剂型。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述单位剂型是固体剂型。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述固体剂型是胶囊。
6.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述SARS-CoV-2病毒是野生型的。
7.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述SARS-CoV-2病毒是天然存在的冠状病毒变体。
8.根据权利要求2所述的用途，其中所述药物是具有250mgABC294640盐酸盐的胶囊，并且其中每天两次施用两粒胶囊，持续至少10天，总日剂量为1000mg ABC294640盐酸盐。
9.根据权利要求2所述的用途，其中所述药物还包括生理缓冲盐水。
10.根据权利要求9所述的用途，其中形成包含悬浮在所述生理缓冲盐水中的ABC294640盐酸盐的悬浮液，并且其中使用管将所述悬浮液直接递送至胃。
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