CN115494168B - 桑杏汤的多成分含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种桑杏汤的多成分含量测定方法，属于药物检测技术领域，所述含量测定方法是取山栀子苷B、苦杏仁苷、栀子苷、大豆苷元和西红花苷I制备对照品标准溶液；取桑杏汤制备供试品溶液；分别取对照品标准溶液和供试品溶液进行超高效液相色谱检测，再利用外标法，分别计算得桑杏汤中山栀子苷B、苦杏仁苷、栀子苷、大豆苷元和西红花苷I的含量。本发明的测定方法能够快速、简便、准确、可靠的获知桑杏汤的质量情况，解决了现有技术的检测方法仅能够测定单一成分，无法全面控制桑杏汤质量的问题，实现了通过测定5种化学成分的含量来控制桑杏汤质量的目的，为古代经典名方桑杏汤的开发和质量标准制定提供参考。
Description
技术领域
本发明涉及药物检测技术，尤其涉及一种桑杏汤的多成分含量测定方法。
背景技术
桑杏汤出自清代医学家吴瑭编撰的《温病条辩》，在国家药品监督管理局2018年制订并发布的《古代经典名方目录(第一批)》中，桑杏汤被列为一百首方剂之一。《温病条辩》记载：“桑叶一钱，杏仁一钱五分，沙参二钱，象贝一钱，香豉一钱，栀皮一钱，梨皮一钱，水二杯，煮取一杯。水二杯，煮取一杯，顿服之，重者再作服。秋感燥气，右脉数大，伤手太阴气分者，桑杏汤主之”。主治燥邪犯肺，外感温燥症，在临床上治疗干咳、支气管炎、小儿支原体肺炎、呼吸道感染、百日咳等疾病。
桑杏汤对干咳、咽痛、肺啰音等肺部炎症疾病应用广泛，大量研究证明了其在临床中的显著疗效。同时有研究表明，炎症引起的氧化应激反应能通过多种途径作用于机体，在临床上应用抗氧化剂治疗小儿肺炎或利用抗氧化剂辅助治疗小儿肺炎都可以有效缓解其症状，达到治疗的效果。目前，针对桑杏汤质量控制的研究较少，发现只建立了苦杏仁苷的含量测定，方法指标成分较少，且难以全面的评价桑杏汤的质量。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种桑杏汤的多成分含量测定方法。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：
一种桑杏汤的多成分含量测定方法，所述含量测定方法包括以下步骤：
取山栀子苷B、苦杏仁苷、栀子苷、大豆苷元和西红花苷I共五种化学成分制备对照品标准溶液；
取桑杏汤制备供试品溶液；
分别取对照品标准溶液和供试品溶液进行超高效液相色谱检测，再利用外标法，分别计算得桑杏汤中山栀子苷B、苦杏仁苷、栀子苷、大豆苷元和西红花苷I的含量；
所述超高效液相色谱检测的洗脱方式为梯度洗脱；
分别对照品标准溶液和供试品溶液的超高效液相色谱以0.05wt％磷酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，洗脱条件为：
0～7min，6％流动相A，94％流动相B；
7～7.5min，6％→7.5％流动相A，94％→92.5％流动相B；
7.5～16min，7.5％→8％流动相A，92.5％→92％流动相B；
16～22min，8％→12％流动相A，92％→88％流动相B；
25～41min，18％→21％流动相A，82％→79％流动相B；
41～45min，21％流动相A，79％流动相B；
45～47min，21％→90％流动相A，79％→10％流动相B。
进一步的，所述供试品溶液是取0.09～0.11重量份桑杏汤加至甲醇水溶液中超声20～30min，定容至5体积份，过滤，制得；
其中，重量份与体积份之间的比例关系为g：mL。
进一步的，所述超高效液相色谱检测的检测波长为252～256nm和 438～442nm。
进一步的，所述超高效液相色谱检测的流速为0.23～0.27mL/min、进样体积为1.0μL、柱温为28℃。
一种桑杏汤的多成分含量测定方法，所述含量测定方法包括以下步骤：
取山栀子苷B、苦杏仁苷、栀子苷、大豆苷元和西红花苷I共五种化学成分制备不同浓度的对照品标准系列溶液；
分别取不同浓度的对照品标准系列溶液进行超高效液相色谱检测，并根据不同化学成分的浓度和相应化学成分对应浓度测定的峰面积，绘制不同化学成分对应的标准曲线；
取桑杏汤制备供试品溶液；
对供试品溶液进行超高效液相色谱检测，所得相应化学成分的峰面积代入相应的标准曲线，分别计算得桑杏汤中山栀子苷B、苦杏仁苷、栀子苷、大豆苷元和西红花苷I的含量；
所述超高效液相色谱检测的洗脱方式为梯度洗脱；
分别对照品标准溶液和供试品溶液的超高效液相色谱以0.05wt％磷酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，洗脱条件为：
0～7min，6％流动相A，94％流动相B；
7～7.5min，6％→7.5％流动相A，94％→92.5％流动相B；
7.5～16min，7.5％→8％流动相A，92.5％→92％流动相B；
16～22min，8％→12％流动相A，92％→88％流动相B；
25～41min，18％→21％流动相A，82％→79％流动相B；
41～45min，21％流动相A，79％流动相B；
45～47min，21％→90％流动相A，79％→10％流动相B。
进一步的，所述供试品溶液是取0.9～1.1重量份桑杏汤加至甲醇水溶液中超声20～30min，定容至5体积份，过滤，制得；
其中，重量份与体积份之间的比例关系为g：mL。
进一步的，所述不同浓度的对照品标准系列溶液中山栀子苷B的浓度在 12.58～201.2μg/mL之间、苦杏仁苷的浓度在26.19～419.0μg/mL之间、栀子苷的浓度在25.44～407.0μg/mL之间、大豆苷元的浓度在0.6275～10.04μg/mL 之间和西红花苷I的浓度在1.290～20.64μg/mL之间。
进一步的，所述不同化学成分对应的标准曲线如下：
山栀子苷B对应的标准曲线为y＝2.161x+0.1106，R2＝0.9998；
苦杏仁苷对应的标准曲线为y＝0.1084x+0.3212，R2＝0.9997；
栀子苷对应的标准曲线为y＝3.276x+5.964，R2＝0.9999；
大豆苷元对应的标准曲线为y＝22.83x+0.2150，R2＝0.9999；
西红花苷I对应的标准曲线为y＝24.43x-1.780，R2＝0.9991。
进一步的，所述超高效液相色谱检测的检测波长为252～256nm和 438～442nm。
进一步的，所述超高效液相色谱检测的流速为0.23～0.27mL/min、进样体积为1.0μL、柱温为28℃。
本发明的桑杏汤的多成分含量测定方法的有益效果为：
本发明建立了超高效液相色谱检测桑杏汤中山栀子苷B、苦杏仁苷、栀子苷、大豆苷元和西红花苷I共5种化学成分的含量测定方法，实现对经典名方桑杏汤中多个指标成分的控制；
本发明考虑到桑杏汤提取液中的成分复杂，且极性较大，优先选择超高效液相色谱系统进行分析方法开发；本发明的含量测定方法通过调整工艺参数和前处理条件，针对含不同化学成分的供试品溶液经一次进样，两种检测波长扫描，即可完成5种化学成分的测定；
本发明的测定方法能够快速、简便、准确、可靠的获知桑杏汤的质量情况，解决了现有技术的检测方法仅能够测定单一成分，无法全面控制桑杏汤质量的问题，实现了通过测定5种化学成分的含量来控制桑杏汤质量的目的，为古代经典名方桑杏汤的开发和质量标准制定提供参考；
本发明的含量测定方法专属性强、准确度高、精密度高、且线性关系良好；
本发明通过控制高效液相色谱条件，筛选合适的工艺参数，实现了山栀子苷B、苦杏仁苷、栀子苷、大豆苷元和西红花苷I共5种化学成分的完全分离，且与其它杂质峰有效分离，相互之间无干扰，简化了桑杏汤的预处理步骤；
不同溶剂及用量或不同提取时间，对于中药物质中有效成分的提取效率也有所不同，本发明通过选用合适的提取溶剂、用量及提取时间，从而提高了桑杏汤的提取效率，进而精准测定桑杏汤中5种化学成分的含量；
通过对不同种类的酸、色谱柱、温度、流速、进样量等进行考察，有效改善了色谱峰的拖尾现象，获得了分离度和峰形良好的色谱峰，为后续含量检测提供基础。
附图说明
图1是本发明实施例1中对照品标准溶液的色谱图；
图2是本发明实施例1中供试品溶液的色谱图；
图3是本发明实施例6中254nm波长下的山栀子苷B标准曲线图；
图4是本发明实施例6中254nm波长下的栀子苷标准曲线图；
图5是本发明实施例6中254nm波长下的苦杏仁苷标准曲线图；
图6是本发明实施例6中254nm波长下的大豆苷元标准曲线图；
图7是本发明实施例6中440nm波长下的西红花苷I标准曲线图；
图8是本发明实验例1中254nm波长下阴性对照专属性结果图；
图9是本发明实验例1中440nm波长下阴性对照专属性结果图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
实施例1一种桑杏汤的多成分含量测定方法
本实施例采用桑杏汤冻干粉进行桑杏汤的多成分含量测定，具体桑杏汤冻干粉的制备方法如下：
根据《古代经典名方目录(第一批)》的物质基准制备原则，照《温病条辩》中桑杏汤处方记载的“桑叶一钱，杏仁一钱五分，沙参二钱，象贝一钱，香豉一钱，栀皮一钱，梨皮一钱，水二杯，煮取一杯。水二杯，煮取一杯，顿服之，重者再作服。秋感燥气，右脉数大，伤手太阴气分者，桑杏汤主之”进行制备，所得桑杏汤提取液进行旋蒸浓缩，浓缩液经旋转预制冷处理，-80℃预冻24～48h，真空冷冻干燥后取出研磨，过筛，得到桑杏汤冻干粉，即为桑杏汤物质基准。干燥、阴凉处保存。
本实施例为一种桑杏汤的多成分含量测定方法，包括以下具体步骤：
1)供试品溶液和对照品溶液的配制
11)供试品溶液配制
精密称取桑杏汤冻干粉0.10g(即m桑＝0.10g)，置5mL量瓶中，加入 3mL甲醇，超声20min，放冷，加甲醇定容至5mL，摇匀，离心，取上清液，过0.22μm微孔滤膜，所得续滤液即为供试品溶液(即V试＝5mL)。
需要注意的是超声前，加入的甲醇水溶液的量只要足够提取桑杏汤冻干粉中有效成分即可，不必非要加入3mL，其它量也可以，如4mL，但一般需要≥3mL。本实施例为描述清楚，仅采用了其中一种用量，应理解本发明所要求保护的含量测定方法中并不受本实施例中甲醇水溶液用量所限制。
12)对照品储备液配制
分别取山栀子苷B、苦杏仁苷、栀子苷、大豆苷元和西红花苷I对照品适量，精密称定，用甲醇溶解并稀释制成浓度分别251.5μg/mL(山栀子苷B 的浓度)、523.8μg/mL(苦杏仁苷的浓度)、508.8μg/mL(栀子苷的浓度)、 12.55μg/mL(大豆苷元的浓度)、25.80μg/mL(西红花苷I的浓度)的混合对照品储备液。
13)对照品标准溶液配制
分别精密量取2mL混合对照品储备液置于10mL量瓶中，用甲醇定容，作为对照品标准溶液，浓度为C对-相应化学成分，其中，C对-山栀子苷B＝50.30μg/mL、 C对-苦杏仁苷＝104.8μg/mL、C对-栀子苷＝101.8μg/mL、C对-大豆苷元＝2.510μg/mL、C对-西红花苷I＝5.160μg/mL。
2)超高效液相色谱检测
21)取对照品标准溶液进行超高效液相色谱检测，所得对照品标准溶液的色谱图见图1，根据色谱图得不同化学成分对应浓度下的峰面积A对-相应化学成分。
以山栀子苷B为例，即测定的对照品标准溶液中的山栀子苷B对应的峰面积为A对-山栀子苷B，以此类推其它化学成分。
其中，检测对照品标准溶液的超高效液相色谱条件为：
色谱柱：Waters CORTECS T3(2.1×150mm，1.6μm)；
流动相：0.05wt％磷酸水溶液(A)-乙腈(B)；
洗脱方式为梯度洗脱；洗脱程序：0～7min，6％流动相A，94％流动相B；
7～7.5min，6％→7.5％流动相A，94％→92.5％流动相B；
7.5～16min，7.5％→8％流动相A，92.5％→92％流动相B；
16～22min，8％→12％流动相A，92％→88％流动相B；
25～41min，18％→21％流动相A，82％→79％流动相B；
41～45min，21％流动相A，79％流动相B；
45～47min，21％→90％流动相A，79％→10％流动相B；
流速：0.25mL/min；
柱温：28℃；
在一次进样的情况下，利用不同检测波长进行检测，具体为：254nm(检测山栀子苷B、苦杏仁苷、栀子苷和大豆苷元)，440nm(检测西红花苷I)；
进样量：1.0μL；
检测器：二极管阵列检测器(DAD)。
22)取供试品溶液在上述色谱条件下进行超高效液相色谱检测，所得供试品溶液的色谱图见图2，根据色谱图得供试品溶液中所含相应化学成分的峰面积A试-相应化学成分；即分别得供试品溶液中所含山栀子苷B、苦杏仁苷、栀子苷、大豆苷元和西红花苷I对应的峰面积，也就是A试-山栀子苷B、A试-苦杏仁苷、 A试-栀子苷、A试-大豆苷元、A试-西红花苷I。
根据C试-相应化学成分＝(A试-相应化学成分×C对-相应化学成分)/A对-相应化学成分，计算供试品溶液中的各化学成分的浓度C试-相应化学成分；
再根据桑杏汤冻干粉与供试品溶液的重量体积比，利用桑杏汤中各化学成分含量＝(C对-相应化学成分×V试)/m桑，计算得桑杏汤中各化学成分含量；
或者，利用桑杏汤中各化学成分的含量＝A试-相应化学成分×C对-相应化学成分×V试/ (m桑×A对-相应化学成分)，计算得桑杏汤中各化学成分含量；
以山栀子苷B为例：
计算方法一，首先，计算供试品溶液中山栀子苷B的浓度C试-山栀子苷B＝ (A试-山栀子苷B×C对-山栀子苷B)/A对-山栀子苷B；
然后，计算桑杏汤中山栀子苷B的含量＝(C对-山栀子苷B×V试)/m桑。
其它化学成分以此类推。
计算方法二，桑杏汤中山栀子苷B的含量＝A试-山栀子苷B×C对-山栀子苷B×V试/ (m桑×A对-山栀子苷B)。
其它化学成分以此类推。
本实施例中，桑杏汤中含有山栀子苷B 7.175mg/g、苦杏仁苷 18.78mg/g、栀子苷15.92mg/g、大豆苷元0.07919mg/g和西红花苷I 0.3156mg/g。
实施例2～5桑杏汤的多成分含量测定方法
实施例2～5分别为一种桑杏汤的多成分含量测定方法，它们的步骤与实施例1基本相同，不同之处仅在于工艺参数的不同，具体详见表1：
表1实施例2～5中各项工艺参数一览表
实施例2～5其它部分的工艺参数及步骤，与实施例1相同。
实施例6一种桑杏汤的多成分含量测定方法
b1)供试品溶液和对照品溶液的配制
b11)供试品溶液配制
按照实施例1中步骤11)的方法配制供试品溶液，其中步骤和用量与实施例1相同。
b12)对照品储备液配制
按照实施例1中步骤12)的方法配制混合对照品储备液，其中步骤和用量与实施例1相同。
b13)不同浓度的对照品标准系列溶液配制
分别精密量取0.5、1、2、4、8mL混合对照品储备液置于10mL量瓶中，用甲醇定容，作为不同浓度的对照品标准系列溶液，其中，山栀子苷B的浓度分别为12.58μg/mL、25.15μg/mL、50.30μg/mL、100.6μg/mL、201.2 μg/mL，苦杏仁苷的浓度分别为26.19μg/mL、52.38μg/mL、104.8μg/mL、 209.5μg/mL、419.0μg/mL，栀子苷的浓度分别为25.44μg/mL、50.88μg/mL、101.8μg/mL、203.5μg/mL、407.0μg/mL，大豆苷元的浓度分别为0.6275 μg/mL、1.255μg/mL、2.510μg/mL、5.020μg/mL、10.04μg/mL，西红花苷I的浓度分别为1.290μg/mL、2.580μg/mL、5.160μg/mL、10.32μg/mL、 20.64μg/mL。
b2)超高效液相色谱检测
b21)取不同浓度的对照品标准系列溶液在实施例1中的色谱条件下进行超高效液相色谱检测，得相应化学成分对应浓度测定的峰面积，并根据不同化学成分的浓度和相应化学成分对应浓度测定的峰面积，绘制不同化学成分对应的标准曲线，并以不同化学成分的浓度作为横坐标(即x，单位为μ g/mL)，以相应化学成分对应浓度测定的峰面积作为纵坐标(即y)。
以山栀子苷B为例，即山栀子苷B的浓度为12.58μg/mL时，x＝12.58 μg/mL，此时该浓度对应的峰面积即为纵坐标y，以此类推其它化学成分。
具体不同浓度的对照品标准系列溶液中各化学成分的浓度及峰面积见下表：
表2不同浓度的对照品标准系列溶液实验结果一览表
利用不同浓度的对照品标准系列溶液绘制的标准曲线如图3～7所示，具体如下：
山栀子苷B对应的标准曲线为y＝2.2065x-2.1906，R2＝0.9995，标准曲线见图3；
栀子苷对应的标准曲线为y＝3.2766x+5.964，R2＝0.9999，标准曲线见图4；
苦杏仁苷对应的标准曲线为y＝0.1094x+0.3212，R2＝0.9997，标准曲线见图5；
大豆苷元对应的标准曲线为y＝22.83x+0.2150，R2＝0.9999，标准曲线见图6；
西红花苷I对应的标准曲线为y＝24.432x-1.7804，R2＝1.0000，标准曲线见图7。
b22)取供试品溶液在实施例1中的色谱条件下进行超高效液相色谱检测，分别得供试品溶液中所含山栀子苷B、苦杏仁苷、栀子苷、大豆苷元和西红花苷I对应的峰面积，将相应化学成分的峰面积代入相应的标准曲线，即得供试品溶液中山栀子苷B、苦杏仁苷、栀子苷、大豆苷元和西红花苷I 的浓度(C试-相应化学成分)。
再将供试品溶液中相应化学成分的浓度(C试-相应化学成分)乘以制备的供试品溶液总体积(V试)除以制备供试品溶液所用桑杏汤冻干粉的用量(m桑)，即得桑杏汤中相应化学成分的含量，也就是说桑杏汤中相应化学成分的含量＝(C对-相应化学成分×V试)/mI桑。
以山栀子苷B为例，即将山栀子苷B在实施例1中的色谱条件下测定的峰面积(A对-山栀子苷B)代入山栀子苷B对应的标准曲线，计算得供试品溶液中山栀子苷B的浓度(C试-山栀子苷B)；
桑杏汤中山栀子苷B的含量＝(C对-山栀子苷B×V试)/mI桑，以此类推其它化学成分的计算方法。
本实施例中，桑杏汤中含有含有山栀子苷B 7.175mg/g、苦杏仁苷 18.78mg/g、栀子苷15.92mg/g、大豆苷元0.07919mg/g和西红花苷I 0.3156mg/g。
另外，在实际应用过程中，在已知标准曲线的情况下，可以直接配制供试品溶液进行超高效液相色谱检测后，直接代入标准曲线进行计算。无需重复配制不同浓度的对照品标准系列溶液进行测定，绘制标准曲线这个过程。
实施例7～10桑杏汤的多成分含量测定方法
实施例7～10分别为一种桑杏汤的多成分含量测定方法，它们的步骤与实施例6基本相同，不同之处仅在于工艺参数的不同，具体详见表3：
表3实施例7～10中各项工艺参数一览表
实施例7～10其它部分的工艺参数及步骤，与实施例6相同。
实验例1方法学考察
本实验例桑杏汤的多成分含量测定方法进行考察，主要考察该含量测定方法的系统适用性、专属性、准确度、精密度、检测限和定量限、耐用性。
一、系统适用性
按照实施例1中步骤12)中的方法配制混合对照品储备液(其中，山栀子苷B的浓度为251.5μg/mL，苦杏仁苷的浓度为523.8μg/mL，栀子苷的浓度为508.8μg/mL，大豆苷元的浓度为12.55μg/mL，西红花苷I的浓度为 25.80μg/mL)，按照实施例1中的色谱条件进行超高效液相检测，连续检测 6次，记录待测成分色谱峰的分离度(R)、理论塔板数和拖尾因子，计算各化学成分峰面积的RSD值，并设置灵敏度实验溶液评价色谱系统的检测能力。
表4系统适用性实验结果一览表
| 项目 | 山栀子苷B | 苦杏仁苷 | 栀子苷 | 大豆苷元 | 西红花苷I |
| 1 | 219.120 | 23.222 | 675.708 | 114.875 | 246.515 |
| 2 | 219.506 | 23.446 | 677.199 | 114.099 | 247.998 |
| 3 | 220.141 | 23.532 | 674.395 | 115.801 | 248.665 |
| 4 | 219.221 | 23.097 | 675.410 | 115.127 | 250.162 |
| 5 | 218.410 | 23.822 | 675.294 | 115.573 | 251.148 |
| 6 | 220.310 | 23.776 | 678.444 | 115.881 | 251.954 |
| STDEV | 0.6407219 | 0.2650961 | 1.346898412 | 0.61687249 | 1.87028625 |
| AVERAGE | 219.451 | 23.482 | 676.075 | 115.226 | 249.407 |
| RSD | 0.29％ | 1.13％ | 0.20％ | 0.54％ | 0.75％ |
经试验，本发明的含量测定方法，以栀子苷计理论塔板数不低于10000，各化学成分色谱峰与相邻色谱峰之间的分离度(R)均大于1.5；拖尾因子在0.80～1.20之间；连续进样6次，各成分峰面积RSD值均小于1.2％，系统适用性良好。
二、专属性
阴性对照品的制备：分别称取除栀皮外的其它药材，按照桑杏汤冻干粉制备方法制备，制成缺栀皮的桑杏汤冻干粉；
分别称取除苦杏仁外的其它药材，按照桑杏汤冻干粉制备方法制备，制成缺苦杏仁的桑杏汤冻干粉。
分别称取除淡豆豉外的其他药材，按照桑杏汤冻干粉制备方法制备，制成缺淡豆豉的桑杏汤冻干粉。
按照实施例1中步骤11)中的供试品溶液的配制方法，分别利用缺栀皮的桑杏汤冻干粉、缺苦杏仁的桑杏汤冻干粉、缺淡豆豉的桑杏汤冻干粉配制栀皮阴性对照溶液、苦杏仁阴性对照溶液和淡豆豉阴性对照溶液；
按照实施例1中的色谱条件检测254nm波长下的实施例1中配制的对照品标准溶液和供试品溶液、栀皮阴性对照品溶液、苦杏仁阴性对照品溶液、淡豆豉阴性对照品溶液，结果见图8，其中，A为对照品标准溶液的色谱图， B为供试品溶液的色谱图，C为栀皮阴性对照品溶液的色谱图，D为苦杏仁阴性对照品溶剂的色谱图，E为淡豆豉阴性对照品溶剂的色谱图；图8中1 号峰为山栀子苷B，2号峰为苦杏仁苷，3号峰为栀子苷，4号峰为大豆苷元；
图8可以看出各阴性对照溶液在254nm波长下测定的化学成分出峰时间处均无干扰，表明方法专属性良好。
按照实施例1中的色谱条件检测440nm波长下的实施例1中配制的对照品标准溶液和供试品溶液、栀皮阴性对照品溶液，结果见图9，其中，F为对照品标准溶液的色谱图，G为供试品溶液的色谱图，H为栀皮阴性对照品溶液的色谱图；图9中的5号峰为西红花苷I；
图9中可以看出，栀皮阴性对照溶液在440nm波长下测定的化学成分出峰时间处均无干扰，表明方法专属性良好。
三、准确度
取已知含量的桑杏汤冻干粉0.5g，精密称定，分别按已知含量的50％、 100％、150％加入各化学成分对照品，按实施例1中的供试品溶液的配制方法，制备低、中、高三种浓度的准确度供试品溶液，每一种浓度平行制备3 份。分别按照实施例1中的色谱条件进行的超高效液相色谱检测，并计算各成分的平均回收率及其RSD值，具体结果如下：
表5准确度实验结果一览表
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由表5可以看出，各化学成分的回收率均在88.02％～115.46％之间，RSD 均小于5.0％，方法准确度良好。
四、精密度
取同一批桑杏汤冻干粉，分别精密称取0.05g、0.10g、0.15g，按照实施例1中供试品溶液的配制方法，制备低、中、高三种浓度的精密度供试品溶液(除桑叶汤冻干粉用量不同外，其它溶剂用量及方法均与实施例1相同)，每一种浓度平行制备3份；在同一日内分别按照实施例1的色谱条件进行的超高效液相色谱检测，测定各化学成分的含量，并计算各化学成分含量的 RSD值，作为重复性实验(即日内精密度实验)，见下表：
表6重复性实验结果一览表
由表6可以看出，山栀子苷B、苦杏仁苷、栀子苷、大豆苷元和西红花苷I同一日内的RSD值分别为0.61％、1.34％、0.72％、1.56％、0.96％，表明该方法重复性良好。
分别取同一批桑杏汤冻干粉，精密称取0.10g，按照实施例1中供试品溶液的配制方法，制备相同浓度的日间精密度供试品溶液3份，分别按照实施例1的色谱条件进行的超高效液相色谱检测，每天平行制备3份，连续三天进样检测，计算各待测成分含量的RSD值，为日间精密度实验，具体结果如下：
表7日间精密度实验结果一览表
由表7可以看出，山栀子苷B、苦杏仁苷、栀子苷、大豆苷元和西红花苷I日间精密度的RSD值分别为0.76％、4.26％、0.61％、1.02％、0.97％，结果表明该方法日间精密度良好。
五、检测限和定量限
分别对实施例1中配制的混合对照品储备液，用甲醇逐级稀释，至信噪比为3：1(即S/N＝3:1时浓度为检测限)和10：1(即S/N＝10:1时浓度为定量限)，记录浓度，确定各化学成分的检测限和定量限。
表8检测限和定量限结果一览表
| 项目 | 检测限(μg/mL) | 定量限(μg/mL) |
| 山栀子苷B | 0.3340 | 1.002 |
| 苦杏仁苷 | 5.990 | 16.67 |
| 栀子苷 | 0.2260 | 0.6780 |
| 大豆苷元 | 0.1004 | 0.2008 |
| 西红花苷I | 0.01613 | 0.04300 |
由表8可知，该色谱条件下，山栀子苷B、苦杏仁苷、栀子苷、大豆苷元、西红花苷I可被测得的最低浓度分别为0.3340、5.990、0.2260、0.1004、 0.01613μg/mL；可被定量的最低浓度分别为1.002、16.67、0.6780、0.2008、 0.04300μg/mL。
六、耐用性
S1)色谱条件耐用性
取实施例1中制备的供试品溶液和对照品标准溶液，按照实施例1中的色谱条件进行高效液相色谱检测，检测过程中分别对进样体积、检测波长、流速、流动相、柱温进行考察，每次检测仅改变一项工艺参数。
分别考察实施例1中色谱条件的不同进样体积(0.8μL、1.0μL、1.2μL)，检测波长(252nm、254nm、256nm)和(438nm、440nm、442nm)，不同流速(0.23mL/min、0.23～0.27mL/min、0.27mL/min)，不同流动相A(0.04wt％磷酸水溶液、0.05wt％磷酸水溶液、0.06wt％磷酸水溶液)和不同柱温(26℃、 28℃、30℃)条件下，测定各化学成分的含量，并计算不同条件下的RSD 值。
表9不同进样量实验结果一览表
表10不同检测波长实验结果一览表(252～256nm)
表11不同检测波长实验结果一览表(438～442nm)
表12不同流速实验结果一览表
表13不同流动相A实验结果一览表
表14不同柱温实验结果一览表
需要说明的是，由于同一化学成分测定的含量相同时，峰面积也有所偏差，导致部分化学成分测定的含量相同，但仍然存在一定的RSD值。
结果表明，进样量、流动相A和柱温对苦杏仁苷含量影响较大，其余各色谱条件下各化学成分的含量RSD值均小于4.0％，说明方法色谱条件耐用性良好。
S2)稳定性
取实施例1中制备的供试品溶液，室温放置，分别于0、2、4、6、8、 10、12、24h按照实施例1中的色谱条件进行相应的超高效液相色谱检测，记录各化学成分的峰面积，并计算各个化学成分成分的含量RSD值。
表15稳定性实验结果一览表(峰面积)
| 项目 | 山栀子苷B | 苦杏仁苷 | 栀子苷 | 大豆苷元 | 西红花苷I |
| 0 | 214.488 | 30.318 | 710.395 | 122.35 | 131.699 |
| 2 | 214.112 | 30.351 | 709.572 | 121.69 | 134.134 |
| 4 | 212.357 | 29.578 | 710.877 | 121.81 | 131.304 |
| 6 | 214.535 | 26.704 | 711.775 | 122.28 | 134.968 |
| 8 | 214.334 | 26.568 | 710.351 | 121.76 | 134.46 |
| 10 | 214.463 | 29.141 | 712.347 | 122.25 | 134.535 |
| 12 | 214.774 | 26.669 | 709.686 | 121.67 | 130.866 |
| 24 | 213.406 | 27.750 | 705.754 | 118.51 | 134.442 |
| AVE | 214.06 | 28.38 | 710.09 | 121.54 | 133.30 |
| SD | 0.74889117 | 1.54400295 | 1.869025611 | 1.176151344 | 1.586045948 |
| RSD | 0.35％ | 5.44％ | 0.26％ | 0.97％ | 1.19％ |
可以看出，山栀子苷B、苦杏仁苷、栀子苷、大豆苷元和西红花苷I的含量RSD值分别为0.35％、5.44％、0.26％、0.97％、1.19％，表明供试品溶液在24h内稳定。
显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
Claims (8)
1.一种桑杏汤的多成分含量测定方法，其特征在于，所述含量测定方法包括以下步骤：
取山栀子苷B、苦杏仁苷、栀子苷、大豆苷元和西红花苷I共五种化学成分制备对照品标准溶液；
取0.09~0.11重量份桑杏汤加至甲醇水溶液中超声，定容至5体积份，过滤，制得供试品溶液；其中，重量份与体积份之间的比例关系为g：mL；
分别取对照品标准溶液和供试品溶液进行超高效液相色谱检测，再利用外标法，分别计算得桑杏汤中山栀子苷B、苦杏仁苷、栀子苷、大豆苷元和西红花苷I的含量；
所述超高效液相色谱检测的洗脱方式为梯度洗脱；
分别对照品标准溶液和供试品溶液的超高效液相色谱以0.05wt%磷酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，洗脱条件为：
0~7min，6%流动相A，94%流动相B；
7~7.5min，6%→7.5%流动相A，94%→92.5%流动相B；
7.5~16min，7.5%→8%流动相A，92.5%→92%流动相B；
16~22min，8%→12%流动相A，92%→88%流动相B；
25~41min，18%→21%流动相A，82%→79%流动相B；
41~45min，21%流动相A，79%流动相B；
45~47min，21%→90%流动相A，79%→10%流动相B；
使用的色谱柱为Waters CORTECS T3，2.1×150mm，1.6µm。
2.根据权利要求1所述的桑杏汤的多成分含量测定方法，其特征在于，所述超高效液相色谱检测的检测波长为252~256nm和438~442nm。
3.根据权利要求1所述的桑杏汤的多成分含量测定方法，其特征在于，所述超高效液相色谱检测的流速为0.23~0.27mL/min、进样体积为1.0μL、柱温为28℃。
4.一种桑杏汤的多成分含量测定方法，其特征在于，所述含量测定方法包括以下步骤：
取山栀子苷B、苦杏仁苷、栀子苷、大豆苷元和西红花苷I共五种化学成分制备不同浓度的对照品标准系列溶液；
分别取不同浓度的对照品标准系列溶液进行超高效液相色谱检测，并根据不同化学成分的浓度和相应化学成分对应浓度测定的峰面积，绘制不同化学成分对应的标准曲线；
取0.09~0.11重量份桑杏汤加至甲醇水溶液中超声，定容至5体积份，过滤，制得供试品溶液；其中，重量份与体积份之间的比例关系为g：mL；
对供试品溶液进行超高效液相色谱检测，所得相应化学成分的峰面积代入相应的标准曲线，分别计算得桑杏汤中山栀子苷B、苦杏仁苷、栀子苷、大豆苷元和西红花苷I的含量；
所述超高效液相色谱检测的洗脱方式为梯度洗脱；
分别对照品标准溶液和供试品溶液的超高效液相色谱以0.05wt%磷酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，洗脱条件为：
0~7min，6%流动相A，94%流动相B；
7~7.5min，6%→7.5%流动相A，94%→92.5%流动相B；
7.5~16min，7.5%→8%流动相A，92.5%→92%流动相B；
16~22min，8%→12%流动相A，92%→88%流动相B；
25~41min，18%→21%流动相A，82%→79%流动相B；
41~45min，21%流动相A，79%流动相B；
45~47min，21%→90%流动相A，79%→10%流动相B；
使用的色谱柱为Waters CORTECS T3，2.1×150mm，1.6µm。
5.根据权利要求4所述的桑杏汤的多成分含量测定方法，其特征在于，所述不同浓度的对照品标准系列溶液中山栀子苷B的浓度在12.58~201.2μg/mL之间、苦杏仁苷的浓度在26.19~419.0μg/mL之间、栀子苷的浓度在25.44~407.0μg/mL之间、大豆苷元的浓度在0.6275~10.04μg/mL之间和西红花苷I的浓度在1.290~20.64μg/mL之间。
6.根据权利要求4所述的桑杏汤的多成分含量测定方法，其特征在于，所述不同化学成分对应的标准曲线如下：
山栀子苷B对应的标准曲线为y =2.161x +0.1106，R2=0.9998；
苦杏仁苷对应的标准曲线为y =0.1084x +0.3212，R2=0.9997；
栀子苷对应的标准曲线为y =3.276x +5.964，R2=0.9999；
大豆苷元对应的标准曲线为y =22.83x +0.2150，R2=0.9999；
西红花苷I对应的标准曲线为y=24.43x-1.780，R2=1.0000。
7.根据权利要求4所述的桑杏汤的多成分含量测定方法，其特征在于，所述超高效液相色谱检测的检测波长为252~256nm和438~442nm。
8.根据权利要求4所述的桑杏汤的多成分含量测定方法，其特征在于，所述超高效液相色谱检测的流速为0.23~0.27mL/min、进样体积为1.0μL、柱温为28℃。
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| CN107271589A (zh) * | 2017-01-19 | 2017-10-20 | 安徽九洲方圆制药有限公司 | 一种苦杏仁配方颗粒及其制备和质量控制方法 |
| CN109596745A (zh) * | 2018-12-28 | 2019-04-09 | 成都普思生物科技股份有限公司 | 一种高效液相色谱法在苦杏仁苷检测中的应用及特征图谱 |
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