CN115317551A - 一种紫花地丁总香豆素的提取方法及含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种紫花地丁总香豆素的提取方法及含量测定方法，涉及医药技术领域。所述提取方法为采用乙醇进行加热回流提取，所述乙醇的浓度为50～75%，提取的时间为1～2h。含量测定方法包括制备供试品、绘制标准曲线和计算含量。本发明通过实验验证了紫花地丁总香豆素采用乙醇回流提取方法提取效果较好，得率较高。通过对紫花地丁总香豆素的含量测定方法学考察结果表明，秦皮乙素作为对照品线性关系良好，紫外分光光度仪精密度良好，样品在24小时内稳定，实验方法重复性良好，可以用此方法测紫花地丁总香豆素含量。本发明公开的方法弥补了现有技术关于紫花地丁总香豆素提取的空白，为紫花地丁香豆素的进一步开发与利用提供参考依据。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及到一种紫花地丁总香豆素的提取方法及含量测定方法。
背景技术
紫花地丁为堇菜科植物紫花地丁Viola yedoensis Makino的干燥全草，在国内有广泛的分布，药材资源丰富。紫花地丁味苦、辛，性寒，归心、肝经，具有清热解毒、凉血消肿之功效。
紫花地丁是一种中医临床常用的中药，常以其干燥的全草入药，可以起到清热解毒，凉血消肿的治疗作用。张芳娟等以肝癌细胞(HepG2)和乳腺癌细胞(MCF-7)为研究对象，发现水提物有抗癌作用。研究发现紫花地丁除了广泛用于皮肤病等疾病的治疗，还具有提高皮肤水分，降低皮肤水分流失等作用。故紫花地丁在食品、药品以及化妆品方面具有很大的开发和利用价值。紫花地丁还具有抗氧化等药理作用。紫花地丁主要含有黄酮类、香豆素类、萜类、有机酸等化学成分。紫花地丁中含有丰富的香豆素类成分，如秦皮乙素等，还有研究报道紫花地丁还具有结构特殊的双香豆素等。目前对紫花地丁主要研究提取工艺的方面总酚酸、总黄酮方面的研究，然而，紫花地丁总香豆素提取工艺未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种紫花地丁总香豆素的提取方法及含量测定方法。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种紫花地丁总香豆素的提取方法，所述提取方法为采用乙醇进行加热回流提取，所述乙醇的浓度为50～75％，提取的时间为1～2h。
进一步地，它包括以下步骤：
S1.干燥粉碎：取紫花地丁，干燥后进行粉碎，粉碎后的颗粒粒径≤4.75mm；
S2.加热回流：将粉碎后的紫花地丁粉末加入烧杯中，再加入乙醇，加热回流提取2～3次，每次20～60min。
进一步地，步骤S1中所述干燥的温度为50～65℃。
进一步地，步骤S2中所述乙醇的浓度为68％。
进一步地，步骤S2中所述紫花地丁与乙醇的料液比为1g:20ml～30ml。
进一步地，步骤S2中所述加热回流提取的次数为2次，提取的时间为1.9h。
一种检测紫花地丁总香豆素的含量测定方法，包括以下步骤：
A.制备供试品：采用上述的方法进行紫花地丁总香豆素的提取，提取后合并过滤液，并将合并的过滤液定容至250mL，得供试品；
B.绘制标准曲线：精密称取秦皮乙素对照品适量，用甲醇溶解得35μg/mL的储备液，并贮存于2～8℃冰箱内备用；将储备液稀释10倍后得到35.4μg/mL的母液；分别取0.50mL、0.75mL、1.00mL、1.25mL、1.50mL母液用无水甲醇定容于5mL容量瓶内；采用全波长扫描法测定350nm处的吸光度，制作标准曲线；
C.计算含量：测定供试品350nm处的吸光度，将测得的吸光度值带入标准曲线中，计算紫花地丁总香豆素的含量。
本发明具有以下优点：本发明公开了一种紫花地丁总香豆素的提取方法及含量测定方法，紫花地丁总香豆素采用乙醇回流提取方法提取效果较好，得率较高。通过对紫花地丁总香豆素的含量测定方法学考察结果表明，秦皮乙素作为对照品线性关系良好，紫外分光光度仪精密度良好，样品在24小时内稳定，实验方法重复性良好，可以用此方法测紫花地丁总香豆素含量。利用响应曲面法优化紫花地丁总香豆素的提取工艺，最终最优条件为乙醇浓度68％，料液比1:25g/mL，提取时间1.9h，在该条件下进行验证试验，得到紫花地丁总香豆素平均得率为21.10±0.17mg/g，与模型预测的结果(20.79±0.36)相近，本发明公开的方法弥补了现有技术关于紫花地丁总香豆素提取的空白，为紫花地丁香豆素的进一步开发与利用提供参考依据。
附图说明
图1为紫花地丁总香豆素溶液和秦皮乙素的紫外吸收光谱图，图中，1号峰形图为秦皮乙素；2号峰形图为紫花地丁总香豆素溶液。
图2为液料比对总香豆素得率的影响。
图3为提取时间对总香豆素得率的影响。
图4为乙醇浓度对总香豆素得率的影响。
图5A为料液比与时间两两相交作用的响应面和等高线图。
图5B为时间与乙醇浓度两两相交作用的响应面和等高线图。
图5C为乙醇浓度与料液比两两相交作用的响应面和等高线图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：实施例1：一种紫花地丁总香豆素的提取方法，它包括以下步骤：
S1.干燥粉碎：取紫花地丁，50℃温度干燥后进行粉碎，粉碎后的颗粒粒径≤4.75mm；
S2.加热回流：将粉碎后的紫花地丁粉末加入烧杯中，所述紫花地丁与乙醇的料液比为1g:20ml，再加入50％乙醇，加热回流提取2次，第一次20min、第二次40min，提取的时间为1h。
实施例2：一种紫花地丁总香豆素的提取方法，它包括以下步骤：
S1.干燥粉碎：取紫花地丁，65℃温度干燥后进行粉碎，粉碎后的颗粒粒径≤4.75mm；
S2.加热回流：将粉碎后的紫花地丁粉末加入烧杯中，所述紫花地丁与乙醇的料液比为1g:30ml，再加入75％乙醇，加热回流提取3次，第一次40min，第二次30min，第三次50min，提取的时间为2h。
实施例3：一种紫花地丁总香豆素的提取方法，它包括以下步骤：
S1.干燥粉碎：取紫花地丁，60℃温度干燥后进行粉碎，粉碎后的颗粒粒径≤4.75mm；
S2.加热回流：将粉碎后的紫花地丁粉末加入烧杯中，所述紫花地丁与乙醇的料液比为1g:20ml～30ml，再加入68％乙醇，加热回流提取2次，第一次60min，第二次54min，提取的时间为1.9h。
以下通过实验说明本发明的有益效果
1材料与试剂
1.1实验材料
紫花地丁药材购于安徽省亳州市远光中药饮片厂(批号：200100)，本实验中的紫花地丁药材经西南医科大学药学院中药资源与鉴定教研室专家鉴定为正品紫花地丁的药材。
1.2实验试剂
实验主要使用的试剂与材料如表1所示。
表1实验试剂
2实验方法
2.1紫花地丁总香豆素的含量测定方法的建立
2.1.1供试品溶液制备
紫花地丁药材通过60℃干燥并粉碎，过4号筛后密封保存备用，称取3.00g紫花地丁细粉装于无纺布内密封，使用乙醇回流提取法提取提取2次，过滤，将两次紫花地丁提取的滤液在250mL容量瓶内定容，得到样品溶液。
2.1.2检测波长的选择
取“2.1.1”项的样品溶液，通过乙醇溶液稀释至适宜浓度后作为供试液，使用紫外分光光度仪，以乙醇为空白液，在200-800nm波长之间进行全波长扫描。
2.1.3秦皮乙素的标准曲线的绘制
精密称取秦皮乙素对照品适量，用甲醇溶解得354μg/mL的储备液，并贮存于2-8℃冰箱内备用。将储备液稀释10倍后得到35.4μg/mL的母液。分别取0.50mL、0.75mL、1.00mL、1.25mL、1.50mL母液用无水甲醇定容于5mL容量瓶内。采用全波长扫描法测定350nm处的吸光度，制作标准曲线。
2.1.4精密度的考察
取对照品溶液作为供试液稀释至一定浓度后作为供试液，放入紫外分光光度仪内检测6次吸光度，记录紫花地丁提取液的吸光度值，计算RSD值。
2.1.5稳定性考察
取同一紫花地丁提取液稀释一定比例后作为供试液，分别0、2、6、12、24h后，在紫外分光光度仪中检测样品的吸光度，记录相应的吸光度值，并计算RSD值。
2.1.6重复性考察
称取同一批次紫花地丁粉末按“2.1.1”项方法，得到6份供试液，在紫外分光光度仪内检测，记录相应的吸光度值，并计算总香豆素得率和RSD值。
2.1.7加样回收
取已知含量的紫花地丁提取液作为储备液，稀释至一定比例后得到已知含量为6.17μg/mL的总香豆素含量的供试液，配置秦皮乙素对照品溶液浓度为4.51μg/mL。取1mL的秦皮乙素供试液加入到2mL的供试液内，实验重复6次，记录吸光度，并计算紫花地丁总香豆素的加样回收率和RSD值。
2.2不同提取方法的筛选
2.2.1回流提取法
称取2.50g紫花地丁粉末3份于250mL的圆底烧瓶中，加入40mL的65％的乙醇，加热回流提取2次，每次0.5h，合并滤液用65％的乙醇定容到100mL的容量瓶内，重复3次，测定各组别的紫花地丁的总香豆素得率。
2.2.2渗漉提取法
称取2.50g紫花地丁粉末3份，分别加入65％的乙醇润湿紫花地丁粉末，然后装入渗漉筒内，加入65％的乙醇以每分钟滴下5mL的速度渗漉药材，收集100mL渗漉液于容量瓶内定容，重复3次，测定各组别的紫花地丁的总香豆素得率。
2.2.3超声提取法
称取2.50g紫花地丁粉末3份，放入锥形瓶内，分别加入40mL65％的乙醇，超声提取2次，每次0.5h，参照“2.2.1”项的方法得到样品供试液，测定各组别的紫花地丁的总香豆素得率。
2.2.4热浸渍法
称取2.50g紫花地丁粉末3份，放入锥形瓶内，分别加入40mL的65％的乙醇于水浴锅内，设置温度为75℃水浴提取2次，每次0.5h，参照“2.2.1”项的方法得到样品供试液，测定各组别的紫花地丁的总香豆素得率。
2.3总香豆素含量的测定
取摇匀后的样品溶液5mL于10mL离心管内，1000r/min离心4min后，取上清液3mL于100mL容量瓶内定容，采用全波长扫描法测定350nm的吸光度，将实验数据吸光度代入标准曲线内计算出样品溶液中的总香豆素含量。计算公式如下：
紫花地丁总香豆素得率
其中，Y为紫花地丁总香豆素得率(mg/g)；N为稀释倍数；V为样品溶液总体积(mL)；C为由标准曲线计算出的总香豆素浓度(g/mL)；M为称取的紫花地丁细粉的质量(g)。
2.4单因素试验
考察乙醇的浓度对紫花地丁总香豆素提取的影响：设置料液比为1:10g/mL，提取时间为1h，提取次数为2次，乙醇浓度分别为35％、45％、55％、65％、75％；考察料液比对紫花地丁的总香豆素的提取的影响：设置乙醇提取浓度为65％，提取时间为2h，料液比分别为1:10、1:15、1:20、1:25、1:30g/mL；考察提取时间对紫花地丁的总香豆素的提取的影响：设置乙醇提取浓度为65％，料液比为1:20g/mL，提取时间为1h、1.5h、2h、2.5h、3h。
2.5响应面优化试验
通过单因素考察结果，利用Box-Behnken设计原理，以紫花地丁总香豆素得率为响应值，利用Design-Expert 8.0.1软件进行响应曲面分析，如表2所示：
表2响应面实验设计
3实验结果
3.1紫花地丁总香豆素含量测定的方法学的建立
3.1.1检测波长的选择
将紫花地丁总香豆素的提取液和秦皮乙素对照品液稀释后进行全波长扫描结果如图1所示，结果表明紫花地丁总香豆素在350nm处有最大吸收峰，与秦皮乙素的最大吸收峰一致，故选用秦皮乙素作为对照品。
3.1.2秦皮乙素标准曲线的绘制
使用紫外分光光度计对秦皮乙素对照品溶液进行全波长扫描，以350nm处得到最大吸收峰的吸光度值Y为纵坐标，以秦皮乙素浓度X为横坐标，得标准曲线为Y＝0.0655X-0.0236，r2＝0.9993(n＝5)。结果表明紫花地丁总香豆素在3.54-10.63μg/mL的范围内线性关系良好。
3.1.3不同提取方法对紫花地丁总香豆素得率的影响
通过实验结果可知，在相同时间内(0.5h)，回流法提取获得总香豆素平均得率最高，其为16.55mg/g，渗漉提取法获得的总香豆素平均得率仅为8.81mg/g，效果最差。故选用回流提取的方法对紫花地丁总香豆素提取工艺进行进一步研究，如表3所示：
表3不同提取方法对紫花地丁总香豆素得率的影响
3.1.4精密性
通过对仪器精密度考察，结果可知RSD值仅为0.128％，仪器精密度良好，如表4所示。
表4精密性实验结果
3.1.5重复性
通过对实验方法的重复性考察，结果可知RSD为2.94％，重复性好，如表5所示。
表5重复性实验结果
3.1.6稳定性
通过对紫花地丁总香豆素溶液的稳定性考察，结果可知样品在24小时内稳定性良好，其RSD为0.318％，如表6所示。
表6稳定性实验结果
3.1.7加样回收
通过样品溶液和对照品溶液的加样回收考察，结果可知紫花地丁总香豆素的平均加样回收率为99.72％，其RSD为0.82％。加样回收效果良好，方法准确，如表7所示。
表7加样回收实验结果
3.3单因素考察
3.3.1料液比的影响
由图1可知，当乙醇提取浓度为65％，提取时间为2h时，当料液比从1:15g/mL增至1:25g/mL的过程中，总香豆素得率显著增加，料液比为1:25g/mL时，总香豆素得率最高为20.79mg/g。当继续提高料液比时，由于紫花地丁中香豆素含量是有限的，故继续增加料液比，提取率变化较小，因此选择料液比为1:25g/mL。
3.3.2提取时间的影响
由图2可知，随提取时间的延长，在1h-2h过程中，总香豆素的得率显著升高，并在2h达到大值20.91mg/g。超过2h后，总香豆素得率急剧下降。时间过长，可能导致某些热稳定性较差的香豆素遭到破坏降解，导致其提取率下降。因此选择最优提取时间是2h。
3.3.3乙醇浓度的影响
由图3可知，随着乙醇浓度的增加，总香豆素的提取率呈先急剧上升后缓慢下降，当乙醇浓度为65％时总香豆素得率最高为17.82mg/g，随着乙醇浓度的升高，提取率反而降低。可能是由于高浓度乙醇极性降低，导致其他低极性物质溶出，使得总香豆素提取率下降。因此选用65％的乙醇作为提取溶剂。
3.4响应面法优化设计结果分析
以乙醇浓度、液料比、提取时间三个因素为变量，以紫花地丁总香豆素得率为响应值，结果见表8。采用Design Expert 8.0.1软件对表1-10所示响应面实验结果进行回归分析，得到多项二次回归方程Y＝20.65-0.16A-0.17B+0.79C-0.31AB+0.54AC+0.17BC-0.46A2-0.34B2-1.17C2，进一步对回归方程进行方差分析和显著性考察，结果见表9。回归方程的F值为12.3，自由度为9，平方和为14.72，均方为1.64，P<0.01，说明该模型极其显著。另外还可以看到C(乙醇浓度)的P值为0.0005，对模型的影响也相当显著。在二次项中，A2对模型的影响显著(P<0.05)，C2对模型的影响极显著(P<0.01)，B2对模型的影响不显著，AC交互作用较强，但AB和BC总体交互性水平较弱。
通过多元二次回归方程分析得到香豆素得率的响应面及等高线图，由图5A、图5B、图5C可知，乙醇浓度与料液比之间交互作用最显著，对紫花地丁总香豆素的得率影响最大。利用Design Expert 8.0.1软件得到紫花地丁总香豆素的最优提取工艺为：乙醇浓度68.43％、料液比1:25g/mL、回流时间为1.89h，在最佳提取工艺下紫花地丁总香豆素理论预测得率为20.79mg/g。因考虑实际操作的可行性，将最佳提取工艺参数调整为乙醇浓度为68％，料液比1:25g/mL，提取时间1.9h。在此条件下进行3次验证试验得到紫花地丁总香豆素平均得率为21.10±0.17mg/g，如表10所示，理论值与实际相差1.47％，RSD值为0.80％，进一步验证了该理论模型的可行性，表明该提取工艺可靠。
表8响应面法优化设计和结果
表9方差分析
注:*：差异显著(P<0.05)；**：差异极显著(P<0.01)
表10验证试验结果表
根据前人研究结果，目前未对紫花地丁总香豆素提取工艺进行研究。本发明，建立了紫花地丁总香豆素含量测定方法，对影响紫花地丁总香豆素的得率的提取方法进行了考察，结果表明采用乙醇回流提取的方法对于紫花地丁的总香豆素的提取较为合适。利用响应曲面法对紫花地丁总香豆素的提取工艺进行了优化，最终得到乙醇浓度为68％，料液比为1:25g/mL，提取时间为1.9h，该提取方法简单，稳定性好，为紫花地丁总香豆素提取物的后续开发研究提供基础。
4结论
紫花地丁总香豆素采用乙醇回流提取方法提取效果较好，得率较高。通过对紫花地丁总香豆素的含量测定方法学考察结果表明，秦皮乙素作为对照品线性关系良好，紫外分光光度仪精密度良好，样品在24小时内稳定，实验方法重复性良好，可以用此方法测紫花地丁总香豆素含量。利用响应曲面法优化紫花地丁总香豆素的提取工艺，最终最优条件为乙醇浓度68％，料液比1:25g/mL，提取时间1.9h，在该条件下进行验证试验，得到紫花地丁总香豆素平均得率为21.10±0.17mg/g，与模型预测的结果(20.79±0.36)相近。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种紫花地丁总香豆素的提取方法，其特征在于，所述提取方法为采用乙醇进行加热回流提取，所述乙醇的浓度为50～75%，提取的时间为1～2h。
2.根据权利要求1所述的一种紫花地丁总香豆素的提取方法，其特征在于，它包括以下步骤：
S1. 干燥粉碎：取紫花地丁，干燥后进行粉碎，粉碎后的颗粒粒径≤4.75mm；
S2. 加热回流：将粉碎后的紫花地丁粉末加入烧杯中，再加入乙醇，加热回流提取2～3次，每次20～60min。
3.根据权利要求2所述的一种紫花地丁总香豆素的提取方法，其特征在于，步骤S1中所述干燥的温度为50～65℃。
4.根据权利要求2所述的一种紫花地丁总香豆素的提取方法，其特征在于，步骤S2中所述乙醇的浓度为68%。
5.根据权利要求2所述的一种紫花地丁总香豆素的提取方法，其特征在于，步骤S2中所述紫花地丁与乙醇的料液比为1g:20ml～30ml。
6.根据权利要求2所述的一种紫花地丁总香豆素的提取方法，其特征在于，步骤S2中所述加热回流提取的次数为2次，提取的时间为1.9h。
7.一种检测紫花地丁总香豆素的含量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
A. 制备供试品：采用权利要求1-6中任一所述的方法进行紫花地丁总香豆素的提取，提取后合并过滤液，并将合并的过滤液定容至250mL，得供试品；
B. 绘制标准曲线：精密称取秦皮乙素对照品适量，用甲醇溶解得35μg/mL的储备液，并贮存于2～8℃冰箱内备用；将储备液稀释10倍后得到35.4μg/mL的母液；分别取0.50mL、0.75mL、1.00mL、1.25mL、1.50mL母液用无水甲醇定容于5mL容量瓶内；采用全波长扫描法测定350nm处的吸光度，制作标准曲线；
C. 计算含量：测定供试品350nm处的吸光度，将测得的吸光度值带入标准曲线中，计算紫花地丁总香豆素的含量。
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