CN115261337A - 一种适用于弧菌噬菌体培养及筛选的培养基及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种适用于弧菌噬菌体培养及筛选的培养基及方法。一种适用于弧菌噬菌体培养的液体培养基，每升该液体培养基含有：酵母浸粉8‑12g、蛋白胨8‑12g、硫酸钾8‑12g、柠檬酸铁0.05‑0.5g、氯化钠8‑12g、蔗糖15‑25g。本发明用蔗糖替代盐离子提供渗透压，蔗糖自身无毒害，且可以作为碳源为微生物提供能量加速生长；制备简单，不需要额外调节pH，品相澄清，弧菌及其噬菌体可以旺盛生长且不产生沉淀，易于观察菌和毒的生长状态；培养基灭菌后澄清无沉淀，方便噬菌体的筛选；盐离子较少，没有盐结晶，用于车间发酵，可保证发酵罐干净使用，减轻了对发酵设备的腐蚀性，延长设备的使用寿命。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种适用于弧菌噬菌体的培养基及方法。
背景技术
弧菌是一类常见嗜盐性的革兰氏阴性菌，其主要的栖息地是海水中，广泛存在于海水和海产品中，分布极广，是我国沿海地区海水鱼及贝类常见的致病菌，通常引起胃肠感染，也可以引起肠道外感染，会导致海水鱼类患有出血症。副溶血弧菌和溶藻弧菌是海水中存在最广泛最普遍的致病菌，很大程度上阻挠目前的海水养殖行业的发展。
针对于弧菌病的治疗，目前主要有抗生素、益生菌和噬菌体三个方向，抗生素因为滥用的问题导致很多抗药菌的出现，目前虽仍在大量使用，但是隐患很多。益生菌在治疗弧菌病方面起效慢，使用方法困难（很难在养殖池里人为构建合理的微生态平衡）。近几年，弧菌噬菌体的研究和使用迅速发展。
菌的培养和筛选对比噬菌体的培养和筛选有很大不同，菌的培养需要培养基营养丰富、条件适宜，菌就能正常生长；菌的筛选常常采用选择培养或者显色培养等方法。而噬菌体的培养首先需要宿主菌能正常生长，其次噬菌体需要的微量元素相对丰富，才能保证噬菌体大量繁殖，效价高；而噬菌体的筛选需要在噬菌体的培养的前提下，培养基澄澈透明，方便观察噬菌斑和细胞碎片残渣。因此，合适的培养基对于噬菌体的培养和筛选起到至关重要的作用。
现有技术中，通常采用2216E液体培养基作为弧菌噬菌体的培养基，但是灭菌后2216E培养基会出现大量盐颗粒的结晶，使培养基浑浊，透明度降低，严重影响对细菌碎片残渣和噬菌斑的观察，不适宜作为噬菌体的筛选用培养基，同时2216E液体培养基含有大量盐分，对于以金属为主要铸造成分的大型发酵罐有很强的腐蚀性，会缩短发酵罐的使用寿命。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有的2216E液体培养存在的问题和缺陷，提供一种适用于弧菌噬菌体培养及筛选的培养基及方法，该培养基不仅能够培养出高效价的噬菌体，而且灭菌后澄澈透明，在噬菌体的筛选中方便观察噬菌斑和细胞碎片残渣。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种适用于弧菌噬菌体培养的液体培养基，每升该液体培养基含有：酵母浸粉8-12g、蛋白胨8-12g、硫酸钾8-12g、柠檬酸铁0.05-0.5g、氯化钠8-12g、蔗糖15-25g。
本发明进一步提供了一种弧菌噬菌体的培养方法，将噬菌体与其对应的宿主接种于100mL所述的液体培养基，于37℃，180r/min条件下培养8ｈ。
本发明还进一步提供一种适用于弧菌噬菌体筛选的培养基，包括所述的液体培养基；将所述液体培养基加入琼脂中，制备成固体培养基。
本发明进一步提供一种弧菌噬菌体的筛选方法，将噬菌体与其对应的宿主接种于所述的固体培养基中，观察噬菌斑。
本发明用蔗糖替代盐离子提供渗透压，蔗糖自身无毒害，且可以作为碳源为微生物提供能量加速生长。本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
（1）制备简单，不需要额外调节pH，品相澄清，弧菌及其噬菌体可以旺盛生长且不产生沉淀，易于观察菌和毒的生长状态；培养基灭菌后澄清无沉淀，方便噬菌体的筛选；
（2）本发明培养基制备的噬菌体效价对比2216E培养基，效价更高，而且可以有效缩短培养时间，降低生产成本；
（3）本发明的培养基因为盐离子较少，没有盐结晶，用于车间发酵，可保证发酵罐干净使用，减轻了对发酵设备的腐蚀性，延长设备的使用寿命；
（4）本发明的培养基不惧温度变化，在低温下储存稳定，不会因低温产生沉淀。
附图说明
图1为本发明提供的液体培养基灭菌后的品相；
图2为本发明提供的固体培养基的示意图；
图3为本发明提供的液体培养基对两株弧菌标准株培养的生长曲线测定：（a）溶藻弧菌；（b）副溶血弧菌。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
实施例1 本实施例提供一种适用于弧菌噬菌体培养的液体培养基，每升该液体培养基含有：酵母浸粉10g、蛋白胨10g、硫酸钾10g、柠檬酸铁0.1g、氯化钠10g、蔗糖20g。
本实施例的液体培养基采用上述配方通过常规方法制备而成。本实施的液体培养基，灭菌后效果如图1所示，品相澄澈，没有沉淀产生。
实施例2 本实施例提供一种适用于弧菌噬菌体筛选的培养基，将实施例1制备的液体培养基添加琼脂后，制备成固体培养基筛选弧菌噬菌体，更易于观察噬菌斑，如图2所示，可以明显的看到噬菌斑。
实施例3本发明的液体培养基对弧菌生长的影响
分别将3株副溶血弧菌BV21001、BV21002、ZHBV-18001用接种环挑取单菌落接种于100mL本发明的液体培养基，每组同时等量接种于100mL市面常见普通2216E液体培养基，于37℃，180r/min条件下培养8ｈ后，对不同发酵液培养的病原菌进行计数。上述三株副溶血弧菌均作为宿主保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，BV21001是RDP-VP-21007保藏编号为CGMCC NO.22492的宿主,BV21002是RDP-VP-21010保藏编号为CGMCCNO.22481的宿主,ZHBV-18001是RDP-VP-19010保藏编号为CGMCC NO.19384的宿主。
表1 本发明的液体培养基与2216E培养基对弧菌生长的影响对比结果
由表1中的结果可以看出，本发明的液体培养基与2216E液体培养基培养的弧菌菌落数差异不大，说明本发明的液体培养基在培养副溶血弧菌和溶藻弧菌方面对比2216E液体培养基性能基本一致。
实施例4本发明的液体培养基对弧菌噬菌体生长的影响
分别将3株副溶血弧菌噬菌体RDP-VP-21007、RDP-VP-21010、RDP-VP-19010其对应的宿主3%接种于100mL本发明的液体培养基中，培养1h后，将噬菌体按3%接种量接种，于37℃，180r/min条件下培养8ｈ，每组同时等量接种于100mL市面常见普通2216E液体培养基，对不同发酵液培养的噬菌体测效价。上述三株副溶血弧菌噬菌体均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，RDP-VP-21007保藏编号为CGMCC NO.22492,RDP-VP-21010保藏编号为CGMCC NO.22481,RDP-VP-19010保藏编号为CGMCC NO.19384。
表2本发明的液体培养基与2216E培养基对弧菌噬菌体生长的影响对比结果
由表2的结果可知，用本发明的液体培养基制备的噬菌体效价大多显著高于2216E液体培养基，说明本发明的液体培养基对比2216E液体培养基做为发酵液可以显著提升噬菌体效价。
实施例5 采用本发明的液体培养基培养弧菌生长曲线的测定
分别用2216E培养基和本发明的液体培养基对两株弧菌标准株（一株溶藻弧菌标准株，购自于广东省微生物菌种保藏中心GDM 编号：GIM 1.451，其他编号：ATCC 33787；一株副溶血弧菌标准株，购自于广东省微生物菌种保藏中心GDM 编号：1.306，其他编号：ATCC17802）进行培养，接种量为3%，标定未接种时OD600值为0，每10min测一次OD600值，检测10小时，汇总数据，绘制生长曲线。
分析图3（a）、图3（b）所示的曲线不难看出，在培养弧菌方面，本发明的液体培养基相较2216E培养基，可以使细菌生长的稳定期提前约一个小时到达，可有效缩短培养时间，降低生产成本。
Claims (4)
1.一种适用于弧菌噬菌体培养的液体培养基，其特征在于：每升该液体培养基含有：酵母浸粉8-12g、蛋白胨8-12g、硫酸钾8-12g、柠檬酸铁0.05-0.5g、氯化钠8-12g、蔗糖15-25g。
2.一种弧菌噬菌体的培养方法，其特征在于：将弧菌噬菌体与其对应的宿主接种于100mL如权利要求1所述的液体培养基，于37℃，180r/min条件下培养8ｈ。
3.一种适用于弧菌噬菌体筛选的培养基，其特征在于，包括如权利要求1所述的液体培养基；将所述液体培养基加入琼脂中，制备成固体培养基。
4.一种弧菌噬菌体的筛选方法，其特征在于：将弧菌噬菌体与其对应的宿主接种于如权利要求3所述的固体培养基中，观察噬菌斑。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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