CN115260341B

CN115260341B - 一种高质量琼脂糖及其制备方法

Info

Publication number: CN115260341B
Application number: CN202210908770.0A
Authority: CN
Inventors: 吴孝兰; 刘琴; 张元兴; 顾小焱; 贾自自
Original assignee: East China University of Science and Technology; Sinopharm Chemical Reagent Co Ltd
Current assignee: East China University of Science and Technology; Sinopharm Chemical Reagent Co Ltd
Priority date: 2022-07-29
Filing date: 2022-07-29
Publication date: 2023-05-02
Anticipated expiration: 2042-07-29
Also published as: CN115260341A

Abstract

本发明一种高质量琼脂糖及其制备方法，硫酸基含量小于0.18wt％、电内渗值小于0.15、凝胶强度达到至少1100g/cm²；其制备方法：配置琼脂悬浮液，加入过氧化钠，调节体系pH值至少为10并于至少30℃下进行第一反应；第一反应结束后，加入磷酸二氢钠，调节体系pH值小于10进行第二反应；第二反应结束，加入乙醇，调节体系pH值不超过5进行第三反应；第三反应结束后过滤、洗涤，收集第一沉淀，将其溶解在水中形成样品溶液，再加入聚乙二醇溶液，搅拌下进行第四反应，第四反应结束后过滤、洗涤，收集第二沉淀将其干燥、粉碎后即得到高质量琼脂糖；将其作为电泳介质对不同分子量的DNA片段具有较好的分离效果。

Description

一种高质量琼脂糖及其制备方法

技术领域

本发明涉及琼脂提纯技术领域，具体涉及一种高质量琼脂糖及其制备方法。

背景技术

琼脂主要是由石花菜、江蓠、鸡毛菜等红藻加热水提取出来的一种多糖。琼脂主要由琼脂糖和硫琼胶两部分组成。其中，琼脂糖是琼脂凝胶的主要组成成分，结构是由1,3-β-D-半乳糖和1,4-α-3,6-内醚-L-半乳糖交替链接起来的长链构成的亲水性聚合物。由于其结构单元上的含氧基团少使得其具有如硫酸根含量低、凝胶强度高、电内渗低等优良特性，使得琼脂糖作为一种电中性多糖越来越受到人们关注，是一种理想的惰性载体，已被广泛用于凝胶电泳、亲合层析、分子筛、免疫学、生物医学研究等方面。相比于硫酸基团含量较高的琼脂而言，琼脂糖在微生物实验中的应用更为广泛，而且其出售价格也高于琼脂，而目前我国需求的琼脂糖主要依赖进口，这对于我国琼脂产业的发展也造成了些许影响。

目前，琼脂糖的制备方法总体上可以分为硫琼脂沉淀法、琼脂糖沉淀法和离子色谱法等。硫琼脂和琼脂糖是琼脂的两个主要组成成分，沉淀法主要是利用硫琼脂和琼脂糖在盐类和醇类溶液中的溶解性质差异，达到分离琼脂糖的目的。离子色谱法主要是利用阴离子交换树脂通过吸附酸性多糖，不吸附中性多糖琼脂糖，从而达到分离琼脂糖的目的。但上述方法在生产琼脂糖过程中存在一定弊端，存在生产周期长、生产工艺繁琐、成本较高等问题。

发明内容

为了解决上述技术问题，而提供一种高质量琼脂糖及其制备方法。本发明放法获得的琼脂糖具有与市售琼脂糖相当的性能。

为了达到以上目的，本发明通过以下技术方案实现：

一种高质量琼脂糖，硫酸基含量小于0.18wt％、电内渗值小于0.15、凝胶强度达到至少1100g/cm²。

上述高质量琼脂糖的制备方法，包括如下步骤：

(1)配置琼脂悬浮液，加入过氧化钠，调节体系pH值至少为10并于至少30℃下进行第一反应；

(2)待所述第一反应结束后，加入磷酸二氢钠，调节体系pH值小于10进行第二反应；

(3)待所述第二反应结束，加入乙醇，调节体系pH值不超过5进行第三反应；

(4)待所述第三反应结束后过滤、洗涤，收集第一沉淀；将所述第一沉淀溶解在水中形成样品溶液，再加入聚乙二醇溶液，搅拌下进行第四反应，待所述第四反应结束后过滤、洗涤，收集第二沉淀，将所述第二沉淀干燥、粉碎后即得到高质量琼脂糖。

进一步地，步骤1中所述琼脂悬浮液的质量浓度为6-16％(w/v)，其中琼脂的硫酸基含量大于1％、电内渗大于0.8、凝胶强度大于1000g/cm²；所述过氧化钠的加入质量是该步骤中总反应液体积的4-10％；所述第一反应的条件为：调节体系pH值＝10-14、反应温度30-70℃、反应时间0.5-1h。

进一步地，步骤2中所述磷酸二氢钠的加入质量是该步骤中总反应液体积的4-10％；所述第二反应的条件为：调节体系pH值＝8-9.9、反应温度30-70℃、反应时间0.5-1h。

进一步地，步骤3中所述乙醇为无水乙醇，使所述乙醇在所述琼脂悬浮液中的质量浓度为40-80％；所述第三反应的条件为：调节体系pH值＝3-5、反应温度30-70℃、反应时间1-3h。

进一步地，保持所述第一反应、所述第二反应与所述第三反应的反应温度相同。

进一步地，步骤4中溶解所述第一沉淀的过程是：将所述第一沉淀与水配置成质量浓度为6-16％(w/v)的悬浮液，采用高压灭菌器于110-121℃下加热溶解20-40min。

进一步地，步骤4中所述聚乙二醇为PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000中的一种或多种；所述聚乙二醇溶液的质量浓度为10-50％；所述聚乙二醇溶液与所述样品溶液的体积之比为(0.5-3):1；所述第四反应的温度40-100℃、反应时间为5-60min。

有益技术效果：

本发明第一步在原材料琼脂悬浮液中加入过氧化钠，调节体系pH为强碱性，一方面过氧化钠与水反应生成氢氧化钠和少量双氧水，氢氧化钠对琼脂进行初步脱硫，虽然双氧水对脱硫也具有较好的效果，但由于在强碱性下脱硫效果较差，且强碱性下过氧化钠在体系中溶解度下降，因此第二步加入磷酸二氢钠，于弱碱性条件下将过氧化钠转化成双氧水，由于进一步对琼脂脱硫；由于以上两步反应后琼脂吸水发生溶胀，因此第三步加入乙醇增加反应体系的分散性，在弱酸性条件下，便于第二步产生的过氧化氢更进一步脱硫；最后将脱硫的琼脂收集后进行PEG纯化，得到高质量的琼脂糖，与市售琼脂糖无差异。本发明通过采用过氧化钠/强碱+磷酸二氢钠/弱碱+乙醇/弱酸+聚乙二醇后处理能够得硫酸基含量小于0.18wt％、电内渗值小于0.15、凝胶强度达到至少1100g/cm²的琼脂糖，品质较好。将本发明方法得到的高质量琼脂糖作为电泳介质对不同分子量的DNA片段具有较好的分离效果。

附图说明

图1为实施例1-3、对比例1制得的琼脂糖作为电泳介质对不同分子量的DNA片段的分离效果图，其中a代表实施例1、b代表实施例2、c代表实施例3、d代表对比例1；a-d中的1、2、3、4泳道分别代表分子量1000、2000、5000、10000的DNA标记。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值不限制本发明的范围。对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法应当被视为说明书的一部分。在这里示出和讨论的所有示例中，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。因此，示例性实施例的其它示例可以具有不同的值。

此外，需要说明的是，使用“第一”、“第二”等词语来限定各步反应，仅仅是为了便于对各反应步骤进行区别，如没有另行声明，上述词语并没有特殊含义，因此不能理解为对本发明保护范围的限制。

以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定；若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、或相关企业提出的标准要求进行。除非另有说明，否则所有的份数为重量份，所有的百分比为重量百分比。

以下所用原材料琼脂的属性：琼脂中硫酸基含量1.2％、电内渗值0.95、凝胶强度1100g/cm²。

实施例1

高质量琼脂糖的制备方法，包括如下步骤：

(1)、配置质量浓度为6％(w/v)的琼脂悬浮液，添加过氧化钠至琼脂悬浮液中，过氧化钠的加入质量是该步骤中总反应液体积的4％，调节体系pH＝10、于30℃下进行第一反应0.5h；

(2)、第一反应结束后，在上述反应液体系中加入磷酸二氢钠，磷酸二氢钠的加入质量是该步骤中总反应液体积的4％，调节体系pH＝8、于30℃下进行第二反应0.5h；

(3)、第二反应结束后，在上述反应液体系中加入无水乙醇，使反应液体系中乙醇质量浓度为40％，调节体系pH＝5、于30℃下进行第三反应1h；

(4)、第三反应结束后，过滤、清洗至无过氧化氢残留，收集第一沉淀样品；

将第一沉淀样品加入玻璃瓶中，加水配制成质量浓度为6％(w/v)的样品悬浮液，采用高压灭菌器于110℃加热溶解40min，形成样品溶液，冷却至50℃，将质量浓度为10％的聚乙二醇溶液加入至样品溶液中(聚乙二醇溶液与样品溶液的体积之比为0.5:1，采用PEG-4000)在搅拌条件下进行第四反应30min；第四反应结束后即刻过滤、洗涤，收集第二沉淀，将第二沉淀经干燥、粉碎后得到高质量琼脂糖。

本实施例制得的高质量琼脂糖的基本性能参数见表1。

以本实施例的高质量琼脂糖作为电泳介质对不同分子量的DNA片段进行分离，分离效果图如图1的b所示，由图1的b可见，本实施例的琼脂糖对不同分子量的DNA标记均可实现较好分离，各分子量的DNA电泳条带清晰。

实施例2

高质量琼脂糖的制备方法，包括如下步骤：

(1)、配置质量浓度为10％(w/v)的琼脂悬浮液，添加过氧化钠至琼脂悬浮液中，过氧化钠的加入质量是该步骤中总反应液体积的8％，调节体系pH＝12、于50℃下进行第一反应1h；

(2)、第一反应结束后，在上述反应液体系中加入磷酸二氢钠，磷酸二氢钠的加入质量是该步骤中总反应液体积的8％，调节体系pH＝9、于50℃下进行第二反应1h；

(3)、第二反应结束后，在上述反应液体系中加入无水乙醇，使反应液体系中乙醇质量浓度为60％，调节体系pH＝4、于50℃下进行第三反应2h；

将第一沉淀样品加入玻璃瓶中，加水配制成质量浓度为8％(w/v)的样品悬浮液，采用高压灭菌器于115℃加热溶解35min，形成样品溶液，冷却至70℃，将质量浓度为30％的聚乙二醇溶液加入至样品溶液中(聚乙二醇溶液与样品溶液的体积之比为1:1，PEG-6000)在搅拌条件下进行第四反应45min；第四反应结束后即刻过滤、洗涤，收集第二沉淀，将第二沉淀经干燥、粉碎后得到高质量琼脂糖。

本实施例制得的高质量琼脂糖的基本性能参数见表1。

以本实施例的高质量琼脂糖作为电泳介质对不同分子量的DNA片段进行分离，分离效果图如图1的a所示，由图1的a可见，本实施例的琼脂糖对不同分子量的DNA标记均可实现较好分离，各分子量的DNA电泳条带清晰。

实施例3

高质量琼脂糖的制备方法，包括如下步骤：

(1)、配置质量浓度为16％(w/v)的琼脂悬浮液，添加过氧化钠至琼脂悬浮液中，过氧化钠的加入质量是该步骤中总反应液体积的10％，调节体系pH＝14、于70℃下进行第一反应1h；

(2)、第一反应结束后，在上述反应液体系中加入磷酸二氢钠，磷酸二氢钠的加入质量是该步骤中总反应液体积的10％，调节体系pH＝9.5、于70℃下进行第二反应1h；

(3)、第二反应结束后，在上述反应液体系中加入无水乙醇，使反应液体系中乙醇质量浓度为80％，调节体系pH＝3、于70℃下进行第三反应2h；

将第一沉淀样品加入玻璃瓶中，加水配制成质量浓度为16％(w/v)的样品悬浮液，采用高压灭菌器于118℃加热溶解35min，形成样品溶液，冷却至100℃，将质量浓度为50％的聚乙二醇溶液加入至样品溶液中(聚乙二醇溶液与样品溶液的体积之比为3:1，采用PEG-6000)在搅拌条件下进行第四反应60min；第四反应结束后即刻过滤、洗涤，收集第二沉淀，将第二沉淀经干燥、粉碎后得到高质量琼脂糖。

本实施例制得的高质量琼脂糖的基本性能参数见表1。

以本实施例的高质量琼脂糖作为电泳介质对不同分子量的DNA片段进行分离，分离效果图如图1的c所示，由图1的c可见，本实施例的琼脂糖对不同分子量的DNA标记均可实现较好分离，各分子量的DNA电泳条带清晰。

对比例1

琼脂糖的制备：只采用PEG-6000对原材料琼脂进行提纯，配置375mL质量浓度为60％的聚乙二醇溶液，加热至80℃，在其中倒入375mL质量浓度为4％的琼脂溶液(琼脂悬浮液加热溶解得到)搅拌混合均匀，产生沉淀后，过滤收集沉淀，40℃温水洗2～3次，洗去硫琼胶；再用常温蒸馏水洗涤，浸洗8h以除去聚乙二醇，然后用无水乙醚洗涤10min，过滤收集沉淀；放55℃烘箱干燥。

重复以上步骤2次即得本对比例琼脂糖。

本对比例琼脂糖的基本性能参数见表1。

以本对比例琼脂糖作为电泳介质对不同分子量的DNA片段进行分离，分离效果图如图1的d所示，由图1的d可见，本对比例琼脂糖对不同分子量的DNA标记可实现分离，但当DNA标记分子量大于1000，电泳条带开始模糊。

对比例2

琼脂糖的制备：

(1)、配置质量浓度为16％(w/v)的琼脂悬浮液，添加过氧化氢至琼脂悬浮液中，过氧化氢添加量为该步骤中总反应液体积的10％(w/v)，调节反应温度70℃、反应pH为3.0、反应时间1h，反应完后过滤、清洗至无过氧化氢残留，收集沉淀样品；

(2)、将收集的沉淀样品加入玻璃瓶中，加水配制成质量浓度为

16％(w/v)的样品悬浮液，采用高压灭菌器加热溶解，溶解温度118℃，时间35min，形成样品溶液；

冷却至100℃，将质量浓度50％(w/v)的聚乙二醇溶液(聚乙二醇溶液与样品溶液的体积之比为1:1，采用PEG-6000)加入至样品溶液中，在搅拌条件下反应60min时间；反应结束后即刻过滤、洗涤，收集沉淀，将沉淀经干燥、粉碎后得到琼脂糖。

本对比例制得的琼脂糖的基本性能参数见表1。

对比例3

本对比例琼脂糖的制备方法与实施例3相同，不同之处在于，不添加过氧化钠，直接在质量浓度为16％(w/v)的琼脂悬浮液添加磷酸二氢钠，后续反应条件及参数与实施例3的步骤2-4相同。本对比例制得的琼脂糖的基本性能参数见表1。

对比例4

本对比例琼脂糖的制备方法与实施例3相同，不同之处在于，不添加磷酸二氢钠进行第二反应。本对比例制得的琼脂糖的基本性能参数见表1。

对比例5

本对比例琼脂糖的制备方法与实施例3相同，不同之处在于，不存在步骤4中聚乙二醇的第四反应过程。本对比例制得的琼脂糖的基本性能参数见表1。

以上实施例及对比例制得的琼脂糖的基本性能参数见表1。

表1实施例及对比例制得的琼脂糖的基本性能参数

由表1可知，对比例1只采用聚乙二醇对琼脂粉原料进行纯化，对琼脂粉原料的纯化效果非常有限，其中的硫酸基含量和电内渗值下降幅度非常小。

对比例3采用磷酸二氢钠+聚乙二醇对琼脂粉原料进行纯化，对琼脂粉原料的纯化效果：可将硫酸基含量由1.2％降至0.86％，由较高的电内渗值0.95下降至0.816，但凝胶强度略有下降。

对比例2采用过氧化氢+聚乙二醇对琼脂粉原料进行纯化、对比例4采用过氧化钠+聚乙二醇对琼脂粉原料进行纯化、对比例5采用过氧化钠+磷酸二氢钠对琼脂粉原料进行纯化，均对琼脂粉原料具有不同程度较好的纯化效果，对比例2、对比例4、对比例5可分别将硫酸基含量由1.2％降至0.54％、0.45％、0.25％，由较高的电内渗值0.95下降至0.483、0.375、0.216。

而通过本发明方法对原材料琼脂粉进行纯化，可以将其中的硫酸基含量由1.2％降至小于0.18％，由较高的电内渗值0.95下降至小于0.15，在此基础得到的琼脂糖凝胶强度能够保持原有琼脂粉的凝胶强度甚至略有增加。与市售琼脂糖相比，在凝胶强度相差小于20％的情况下，本发明的琼脂糖具有更低的硫酸基含量和电内渗值。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种高质量琼脂糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）配置琼脂悬浮液，加入过氧化钠，调节体系pH值至少为10并于至少30℃下进行第一反应；

（2）待所述第一反应结束后，加入磷酸二氢钠，调节体系pH值小于10进行第二反应；

（3）待所述第二反应结束，加入乙醇，调节体系pH值不超过5进行第三反应；

（4）待所述第三反应结束后过滤、洗涤，收集第一沉淀；将所述第一沉淀溶解在水中形成样品溶液，再加入聚乙二醇溶液，搅拌下进行第四反应，待所述第四反应结束后过滤、洗涤，收集第二沉淀，将所述第二沉淀干燥、粉碎后即得到高质量琼脂糖，所得的高质量琼脂糖中硫酸基含量小于0.18wt%、电内渗值小于0.15、凝胶强度达到至少1100 g/cm²。

2.根据权利要求1所述的一种高质量琼脂糖的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述琼脂悬浮液的质量浓度为6-16%，其中琼脂的硫酸基含量大于1%、电内渗大于0.8、凝胶强度大于1000 g/cm²；所述过氧化钠的加入质量是该步骤中总反应液体积的4-10%；所述第一反应的条件为：调节体系pH值=10-14、反应温度30-70 ℃、反应时间0.5-1 h。

3.根据权利要求1所述的一种高质量琼脂糖的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述磷酸二氢钠的加入质量是该步骤中总反应液体积的4-10%；所述第二反应的条件为：调节体系pH值=8-9.9、反应温度30-70 ℃、反应时间0.5-1 h。

4.根据权利要求1所述的一种高质量琼脂糖的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述乙醇为无水乙醇，使所述乙醇在所述琼脂悬浮液中的质量浓度为40-80%；所述第三反应的条件为：调节体系pH值=3-5、反应温度30-70 ℃、反应时间1-3 h。

5.根据权利要求1所述的一种高质量琼脂糖的制备方法，其特征在于，其特征在于，保持所述第一反应、所述第二反应与所述第三反应的反应温度相同。

6.根据权利要求1所述的一种高质量琼脂糖的制备方法，其特征在于，步骤（4）中溶解所述第一沉淀的过程是：将所述第一沉淀与水配置成质量浓度为6-16%的悬浮液，采用高压灭菌器于110-121℃下加热溶解20-40 min。

7.根据权利要求1所述的一种高质量琼脂糖的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述聚乙二醇为PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000中的一种或多种；所述聚乙二醇溶液的质量浓度为10-50%；所述聚乙二醇溶液与所述样品溶液的体积之比为(0.5-3):1；所述第四反应的温度40-100℃、反应时间为5-60 min。