CN112094363B - 一种制备琼脂糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制备琼脂糖的方法，该方法包括：将江蓠菜洗净后进行碱处理、酸化处理、漂白处理、煮胶、过滤、冷却凝固，以便获得胶体；将所述胶体搅碎；向搅碎后的胶体加水，加热，调pH，再加入H2O2溶液进行反应，反应结束后过滤、洗涤，反复洗涤直到胶粒样品无H2O2残留且洗液pH至中性，样品再进行冷冻、脱水、干燥、粉碎，得琼脂糖；该方法可使琼脂的硫酸基团含量显著降低，凝胶强度升高，电内渗显著降低，达到市售的琼脂糖指标要求，反应时间短，环保。

Description

一种制备琼脂糖的方法
技术领域
本发明涉及海藻深加工技术领域，具体涉及一种制备琼脂糖的方法。
背景技术
琼脂糖是一种多糖聚合物，是琼脂的主要成分，其基本结构为重复交替的1,3-连接的β-D-半乳糖和1,4-连接的3,6-脱水-α-L-半乳糖。琼脂糖为白色或者微黄色粉末，无臭，无味，在热水中的溶解性较好，亦能溶于二甲基亚砜(DMSO)。与琼脂相比，琼脂糖含负电基团较少，性质更为优良，具有高凝胶强度，低硫酸根含量，低电内渗等特点，这些性质也使得琼脂糖在生物、医学等领域具有广泛的应用。
20世纪60年代，瑞典的一位科学家第一次分离出琼脂糖，从此各国研究学者开始了对琼脂糖制备技术的探究。目前，琼脂糖的制备方法总体上可以分为硫琼脂沉淀法、琼脂糖沉淀法和离子色谱法。硫琼脂和琼脂糖是琼脂的两个主要组成成分，沉淀法主要是利用硫琼脂和琼脂糖在盐类和醇类溶液中的溶解性质差异，达到分离琼脂糖的目的，具有代表性的是EDTA-Na2法、聚乙二醇法。离子色谱法主要是利用阴离子交换树脂通过吸附酸性多糖，不吸附中性多糖琼脂糖，从而达到分离琼脂糖的目的。但上述方法在生产琼脂糖过程中存在一定弊端，其原料琼脂往往都需要海藻经传统碱处理工艺提取制作成琼脂粉后再进一步进行改性，存在生产周期长、生产工艺繁琐、成本较高等问题。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
为此，根据本发明的实施例，本发明提出了一种制备琼脂糖的方法，其包括以下步骤：
(1)将江蓠菜洗净后进行碱处理、酸化处理、漂白处理、煮胶、过滤、冷却凝固，以便获得胶体；
(2)将所述胶体搅碎；
(3)向搅碎后的胶体加水，加热，调pH，再加入H2O2溶液进行反应，反应结束后过滤、洗涤，反复洗涤直到胶粒样品无H2O2残留且洗液pH至中性，样品再进行冷冻、脱水、干燥、粉碎，得琼脂糖。
根据本发明实施例的制备琼脂糖的方法，采用一步法以江蓠海藻为原料提取制备琼脂糖，与传统工艺固体琼脂粉末提取琼脂糖相比，本发明在传统碱工艺提取琼脂过程中对胶体进行H2O2改性，直接从原料海藻提取制备琼脂糖，减少了中间生产环节，缩短生产周期，节约生产成本；并且对胶体进行H2O2改性，凝胶状态下的琼脂分子双螺旋结构排列较为紧密整齐，硫酸基团暴露在双螺旋外，此分子结构在H2O2处理过程中不仅能有效防止琼脂分子降解，也能够提高脱硫效率。
由此，与传统碱工艺提取琼脂样品相比，通过在提胶过程中使用环保清洁型试剂H2O2对胶体进行处理，使得提取出来的样品的硫酸根含量进一步降低，下降了80.5％，达到0.21％，凝胶强度升高了26.0％，达1136g/cm2，电内渗降低了48.8％，样品品质得到进一步提高；并且经过H2O2处理后的样品无论DNA maker分子量为多大时，DNA琼脂糖凝胶电泳分离效果较好，与市售琼脂糖无差异。
另外，根据本发明上述实施例提出的制备琼脂糖的方法，还可以具有如下附加的技术特征：
可选地，步骤(3)中，加热的温度范围为30℃～70℃。
可选地，步骤(3)中，pH的调节范围为3.0～9.0。
可选地，步骤(3)中，胶体与H2O2反应的时间范围为1h～3h。
可选地，步骤(3)中，H2O2溶液的加入量为占总反应液体积0.2％-3％。
可选地，步骤(3)中，胶体与水的料液比为1g:2.5mL。
可选地，步骤(1)中，碱处理为：将江蓠菜自来水冲洗干净，自然晾干，取晾干后的江蓠菜以1g:20mL藻水比，加入总体系7％浓度NaOH溶液，于90℃下恒温处理3h，碱处理结束使用自来水进行浸泡漂洗，每次间隔40min，直至洗液pH呈中性；酸化处理为：经碱处理步骤后的江蓠菜按照总体系0.064％、0.052％和0.012％的比例加硫酸、草酸和乙二胺四乙酸二钠，处理40min，倾去液体，浸泡漂洗直至洗液pH呈中性；漂白处理为：经酸化处理步骤后江蓠菜加水，按照总体系0.1％(v/v)的比例加次氯酸钠溶液，漂白处理40min，再浸泡漂洗至洗液pH呈中性；煮胶为：经漂白处理后的江蓠菜以1g:20mL藻水比在100℃条件下煮胶1.5h。
可选地，步骤(2)中使用搅拌机将胶体搅碎。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为根据本发明实施例中反应pH对琼脂糖的影响；
图2为根据本发明实施例中H2O2添加量对琼脂糖的影响；
图3为根据本发明实施例中反应时间对琼脂糖的影响；
图4为根据本发明实施例中反应温度对琼脂糖的影响；
图5为根据本发明实施例中DNA琼脂糖凝胶电泳对比；
图6为乌氏粘度计示意图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
需要说明的是，本发明实施例中：
硫酸根含量的测定方法为：明胶-氯化钡法
(1)明胶-氯化钡溶液的配制：将2.5g明胶加入500mL蒸馏水至完全溶解，-4℃静置过夜，再向明胶溶液中加入5g氯化钡，超声溶解5min，静置2小时方可使用。
(2)K2SO4标准溶液的配制：K2SO4经105℃烘干至常温下恒重，称取0.1088g(精确至0.0001g)，用1mol/L盐酸定容至500mL，储存待用。
(3)标准曲线的绘制：分别取K2SO4标准溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1mL于试管中，其余用1mol/L盐酸补足至1mL，添加3mL明胶-氯化钡溶液，震荡混匀，静置10min，于360nm波长下测定其吸光值，得到不同浓度硫酸根吸光度的标准曲线。标准曲线方程为Y＝3.5984X+0.0021，R2＝0.9999。
(4)样品消化：称取0.3g样品于25mL比色管中，加入25mL浓度为1mol/L的盐酸，于100℃水浴消化5h后冷却至室温，活性炭脱色，过滤得澄清样品溶液待用。
(5)硫酸根含量的测定：取1mL澄清样品溶液和3mL明胶-氯化钡溶液，震荡混匀，静置10min，于360nm波长下测定其吸光值，利用标准曲线计算样品中硫酸根含量。
凝胶强度的测定方法为：配制1.5％样品溶液，微波溶解3min，结束时补水恒重，冷却后盖保鲜膜，室温下静置过夜。将培养皿放在托盘天平的左方，将截面积为1cm2的柱塞恰好接触凝胶表面后固定，天平右方放置烧杯，匀速倒入蒸馏水，当凝胶表面破裂后立即停止倒水，记录蒸馏水的总重量。
凝胶强度(g·cm-2)＝M/S
式中：M—蒸馏水的总重量，g；
S—柱塞截面积，cm2。
电内渗的测定方法为：
(1)上样液配制：0.05g溴百里酚蓝溶于8mL pH 8.6巴比妥缓冲液中，过滤，滤液加0.1g Dextran T70，0.1g牛血清白蛋白，溶解后在10mL容量瓶中用pH 8.6巴比妥缓冲液定容。
(2)脱色剂配制：5％乙酸与95％乙醇等体积混合。
(3)染色剂配制：0.1g氨基黑加10mL乙酸，再加95％乙醇至1000mL。
(4)称取0.3g样品加20mL pH 8.6巴比妥缓冲液加热溶解配成1.5％溶液，趁热倒入制胶板中，立刻放上梳子，20min后，取下梳子将琼脂糖凝胶和制胶板一起放入电泳槽中，加入pH 8.6巴比妥缓冲液，取上样液3μL，室温下，恒电压85V，电泳2h。取出胶板，脱色剂浸泡30min，染色剂30min，脱色剂再振荡浸泡3h，中间更换脱色剂1次，最后测量正极侧蓝色斑点到上样原始位置距离(OA)负极侧白色斑点到上样原始位置距离(OD)，电内渗大小可表示为：-m＝OD/(OD+OA)。
分子量的测定方法为：采用乌氏粘度法进行测定，乌氏粘度计示意图如图6所示。
(1)0.75M NaSCN溶剂的配置：称取30.4g，将其溶解在500mL蒸馏水。
(2)1％样品溶液的配置：称取0.2g样品于烧杯中，微波溶解在20mL 0.75M NaSCN溶液，将烧杯置于35℃恒温水浴锅中备用。
(3)溶剂流出时间(t0)：将乌氏粘度计完全垂直浸没在35℃恒温槽中，取10mL0.75M NaSCN溶剂从A管加入至D球中，待溶剂温度达到指定温度(35℃)时，紧闭C管，使用洗耳球将液体从D球吸入至B管第一个小球之上，待液面稳定后，同时松开C管气阀与洗耳球，记录液面从a刻度线到b刻度线所使用的时间，记为t0。
(4)样品溶液流出时间(t)：将10mL 0.75M NaSCN溶剂换成等体积的1％琼脂溶液，按照步骤(3)进行测定，记录样品液面从a刻度线到b刻度线所使用的时间，记为t。
将所得数据按照以下公式进行计算，得出样品分子量：
ηr＝t/t0
ηsp＝(η-η0)/η0＝ηr-1＝(t-t0)/t0
Figure BDA0002690300950000051
[η]＝0.07M0.72
式中：M-分子量；[η]-特性粘度；ηsp-增比粘度；ηr-相对粘度；c-溶液浓度；
t-样品溶液流出时间；t0-溶剂流出时间；
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
实施例1不同pH
碱处理：江蓠菜自来水冲洗干净，自然晾干，取晾干后的江蓠菜100g，以1g:20mL(m:v)藻水比，加入浓度7％(w/v)NaOH溶液，于90℃下恒温处理3h。碱处理结束，使用自来水进行浸泡漂洗，每次间隔40min，直至洗液pH呈中性。
酸化处理：漂洗后的江蓠菜按照总体系0.064％(v/v)、0.052％(m/v)和0.012％(m/v)的比例加入硫酸、草酸和乙二胺四乙酸二钠，酸化处理40min，倾去液体，浸泡漂洗直至洗液pH呈中性。
漂白处理：经酸化后的江蓠菜加水，再加入0.1％(w/v)次氯酸钠溶液，漂白处理40min，再浸泡漂洗至洗液pH呈中性。
煮胶：洗净后的江蓠菜，以1g:20mL(m:v)藻水比在100℃条件下煮胶1.5h。
过滤：热胶液趁热过三层棉布，常温下冷却凝固。
胶体粉碎：将凝固后的胶体使用搅拌机进行粉碎，作为原料备用。
分别称取上述胶体粉碎原料200g于烧杯中，加蒸馏水500mL，置于磁力搅拌器上，待温度达到40℃后，调节反应液pH分别至3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，再加入10mL H2O2溶液，反应2h结束后，使用无纺纱布进行过滤，加1000mL蒸馏水进行洗涤，反复洗涤直到胶粒样品无H2O2残留(采用过氧化氢试纸检测样品有无H2O2残留)且洗液pH至中性，然后放于-20℃冰箱进行冷冻、常温脱水、55℃温度下烘干粉碎，得样品，测定样品硫酸根和凝胶强度。
结果如图1所示，图中AA为对比例1种传统碱工艺所得样品，在酸性和碱性条件下反应结果不同，硫酸根含量在弱碱pH 9.0条件下达到最低，凝胶强度相对于传统碱工艺提取的样品有显著上升。酸性条件下的脱硫效果没有碱性条件下脱硫效果好，选择pH 9.0为最佳反应pH。
实施例2不同过氧化氢添加量
碱处理：江蓠菜自来水冲洗干净，自然晾干，取晾干后的江蓠菜100g，以1g:20mL(m:v)藻水比，加入浓度7％(w/v)NaOH溶液，于90℃下恒温处理3h。碱处理结束，使用自来水进行浸泡漂洗，每次间隔40min，直至洗液pH呈中性。
酸化处理：漂洗后的江蓠菜按照总体系0.064％(v/v)、0.052％(m/v)和0.012％(m/v)的比例加入硫酸、草酸和乙二胺四乙酸二钠，酸化处理40min，倾去液体，浸泡漂洗直至洗液pH呈中性。
漂白处理：经酸化后的江蓠菜加水，再加入0.1％(w/v)次氯酸钠溶液，漂白处理40min，再浸泡漂洗至洗液pH呈中性。
煮胶：洗净后的江蓠菜，以1g:20mL(m:v)藻水比在100℃条件下煮胶1.5h。
过滤：热胶液趁热过三层棉布，常温下冷却凝固。
胶体粉碎：将凝固后的胶体使用搅拌机进行粉碎，作为原料备用。
分别称取上述胶体粉碎原料200g于烧杯中，加蒸馏水500mL，置于磁力搅拌器上，待温度达到40℃后，调节反应液pH至9.0，再分别加入0mL、1mL、2mL、5mL、10mL、15mL、20mL、25mLH2O2溶液，反应2h结束后，使用无纺纱布进行过滤，加1000mL蒸馏水进行洗涤，反复洗涤直到胶粒样品无H2O2残留且洗液pH至中性，然后放于-20℃冰箱进行冷冻、常温脱水、55℃温度下烘干粉碎，得样品，测定样品硫酸根和凝胶强度。
结果如图2所示，图中AA为对比例1中传统碱工艺所得样品，当过氧化氢添加量为0时，硫酸根含量有所下降，但下降幅度不大。当添加过氧化氢时，硫酸根含量进一步降低，说明过氧化氢具有脱硫作用。随着过氧化氢添加量的增加，硫酸根含量先降低后不变。当添加量为5mL时，硫酸根含量达到最低为0.38％，此时凝胶强度也有所上升。因此，选择过氧化氢添加量5mL最佳。
实施例3不同反应时间
碱处理：江蓠菜自来水冲洗干净，自然晾干，取晾干后的江蓠菜100g，以1g:20mL(m:v)藻水比，加入浓度7％(w/v)NaOH溶液，于90℃下恒温处理3h。碱处理结束，使用自来水进行浸泡漂洗，每次间隔40min，直至洗液pH呈中性。
酸化处理：漂洗后的江蓠菜按照总体系0.064％(v/v)、0.052％(m/v)和0.012％(m/v)的比例加入硫酸、草酸和乙二胺四乙酸二钠，酸化处理40min，倾去液体，浸泡漂洗直至洗液pH呈中性。
漂白处理：经酸化后的江蓠菜加水，再加入0.1％(w/v)次氯酸钠溶液，漂白处理40min，再浸泡漂洗至洗液pH呈中性。
煮胶：洗净后的江蓠菜，以1g:20mL(m:v)藻水比在100℃条件下煮胶1.5h。
过滤：热胶液趁热过三层棉布，常温下冷却凝固。
胶体粉碎：将凝固后的胶体使用搅拌机进行粉碎，作为原料备用。
分别称取上述胶体粉碎原料200g于烧杯中，加蒸馏水500mL，置于磁力搅拌器上，待温度达到40℃后，调节反应液pH至9.0，再加入10mLH2O2溶液，分别反应1h、1.5h、2h、2.5h、3h，结束后，使用无纺纱布进行过滤，加1000mL蒸馏水进行洗涤，反复洗涤直到胶粒样品无H2O2残留且洗液pH至中性，然后放于-20℃冰箱进行冷冻、常温脱水、55℃温度下烘干粉碎，得样品，测定样品硫酸根和凝胶强度。
结果如图3所示，图中AA为对比例1种传统碱工艺所得样品，随着反应时间的延长，硫酸根含量呈现先下降后不变的趋势，当反应时间为2h时，硫酸根含量最低。反应时间继续延长时，硫酸根含量和凝胶强度均无显著性变化。选择2h为最佳反应时间。
实施例4不同温度
碱处理：江蓠菜自来水冲洗干净，自然晾干，取晾干后的江蓠菜100g，以1g:20mL(m:v)藻水比，加入浓度7％(w/v)NaOH溶液，于90℃下恒温处理3h。碱处理结束，使用自来水进行浸泡漂洗，每次间隔40min，直至洗液pH呈中性。
酸化处理：漂洗后的江蓠菜按照总体系0.064％(v/v)、0.052％(m/v)和0.012％(m/v)的比例加入硫酸、草酸和乙二胺四乙酸二钠，酸化处理40min，倾去液体，浸泡漂洗直至洗液pH呈中性。
漂白处理：经酸化后的江蓠菜加水，再加入0.1％(w/v)次氯酸钠溶液，漂白处理40min，再浸泡漂洗至洗液pH呈中性。
煮胶：洗净后的江蓠菜，以1g:20mL(m:v)藻水比在100℃条件下煮胶1.5h。
过滤：热胶液趁热过三层棉布，常温下冷却凝固。
胶体粉碎：将凝固后的胶体使用搅拌机进行粉碎，作为原料备用。
分别称取上述胶体粉碎原料200g于烧杯中，加蒸馏水500mL，置于磁力搅拌器上，待温度分别达到30℃、40℃、50℃、60℃、70℃后，调节反应液pH至9.0，再加入10mLH2O2溶液，反应2h结束后，使用无纺纱布进行过滤，加1000mL蒸馏水进行洗涤，反复洗涤直到胶粒样品无H2O2残留且洗液pH至中性，然后放于-20℃冰箱进行冷冻、常温脱水、55℃温度下烘干粉碎，得样品，测定样品硫酸根和凝胶强度。
结果如图4所示，图中AA为对比例1种传统碱工艺所得样品，反应温度对碱工艺提取过程中H2O2处理样品的硫酸根和凝胶强度结果有显著影响。随着反应温度的升高硫酸根含量呈现先下降后上升的趋势，当反应温度为40℃时，硫酸根含量达到最低。
实施例5琼脂糖的制备
碱处理：江蓠菜自来水冲洗干净，自然晾干，取晾干后的江蓠菜100g，以1g:20mL(m:v)藻水比，加入浓度7％(w/v)NaOH溶液，于90℃下恒温处理3h。碱处理结束，使用自来水进行浸泡漂洗，每次间隔40min，直至洗液pH呈中性。
酸化处理：漂洗后的江蓠菜按照总体系0.064％(v/v)、0.052％(m/v)和0.012％(m/v)的比例加入硫酸、草酸和乙二胺四乙酸二钠，酸化处理40min，倾去液体，浸泡漂洗直至洗液pH呈中性。
漂白处理：经酸化后的江蓠菜加水，再加入0.1％(w/v)次氯酸钠溶液，漂白处理40min，再浸泡漂洗至洗液pH呈中性。
煮胶：洗净后的江蓠菜，以1g:20mL(m:v)藻水比在100℃条件下煮胶1.5h。
过滤：热胶液趁热过三层棉布，常温下冷却凝固。
胶体粉碎：将凝固后的胶体使用搅拌机进行粉碎，作为原料备用。
称取上述胶体粉碎原料200g于烧杯中，加蒸馏水500mL置于磁力搅拌器上，待温度达到40℃后，调节反应液pH至9.0，再加入5mLH2O2溶液，反应2h结束后，使用无纺纱布进行过滤，加1000mL蒸馏水进行洗涤，反复洗涤直到胶粒样品无H2O2残留且洗液pH至中性，然后放于-20℃冰箱进行冷冻、常温脱水、55℃温度下烘干粉碎，得琼脂糖，测定琼脂糖的硫酸根、凝胶强度和电内渗。
本实施例中，所得的琼脂糖的硫酸根含量：＜0.25％；凝胶强度：1136±13g/cm2；分子量：2.01×105；电内渗：0.230。
对比例1
碱处理：江蓠菜自来水冲洗干净，自然晾干，取晾干后的江蓠菜100g，以1g:20mL(m:v)藻水比，加入浓度7％(w/v)NaOH溶液，于90℃下恒温处理3h。碱处理结束，使用自来水进行浸泡漂洗，每次间隔40min，直至洗液pH呈中性。
酸化处理：漂洗后的江蓠菜按照总体系0.064％(v/v)、0.052％(m/v)和0.012％(m/v)的比例加入硫酸、草酸和乙二胺四乙酸二钠，酸化处理40min，倾去液体，浸泡漂洗直至洗液pH呈中性。
漂白处理：经酸化后的江蓠菜加水，再加入0.1％(w/v)次氯酸钠溶液，漂白处理40min，再浸泡漂洗至洗液pH呈中性。
煮胶：洗净后的江蓠菜，以1g:20mL(m:v)藻水比在100℃条件下煮胶1.5h。
过滤：热胶液趁热过三层棉布，常温下冷却凝固。
脱水、干燥、粉碎：冷凝后的琼脂切块装袋，-20℃冰箱过夜冷冻，常温脱水，55℃温度下烘干粉碎，得琼脂粉，测定琼脂粉的硫酸根、凝胶强度和电内渗。
本对比例中，所得的琼脂粉的硫酸根含量：1.08％±0.02％；凝胶强度：902±10g/cm2；电内渗：0.438。
对比例2
碱处理：江蓠菜自来水冲洗干净，自然晾干，取晾干后的江蓠菜100g，以1g:20mL(m:v)藻水比，加入浓度7％(w/v)NaOH溶液，于90℃下恒温处理3h。碱处理结束，使用自来水进行浸泡漂洗，每次间隔40min，直至洗液pH呈中性。
酸化处理：漂洗后的江蓠菜按照总体系0.064％(v/v)、0.052％(m/v)和0.012％(m/v)的比例加入硫酸、草酸和乙二胺四乙酸二钠，酸化处理40min，倾去液体，浸泡漂洗直至洗液pH呈中性。
漂白处理：经酸化后的江蓠菜加水，再加入0.1％(w/v)次氯酸钠溶液，漂白处理40min，再浸泡漂洗至洗液pH呈中性。
煮胶：洗净后的江蓠菜，以1g:20mL(m:v)藻水比在100℃条件下煮胶1.5h。
过滤：热胶液趁热过三层棉布，置于100℃水浴锅进行保温。
倒热胶液250mL于1L置于磁力搅拌器上，调整磁力搅拌器温度达100℃后，调节胶液pH至9.0，添加5mL H2O2溶液，反应2h后，使溶液自然冷却凝固，-20℃冰箱过夜冷冻，常温脱水，55℃温度下烘干粉碎后，得样品，测定样品硫酸根和凝胶强度。
本对比例中，所得的样品的硫酸根含量：0.88％±0.01％；凝胶强度：231±13g/cm2。本对比例的硫酸根含量和凝胶强度与实施例5的结果差异较大的原因是琼脂分子在水溶液中是无规则线圈形式存在，琼脂分子中的官能团及糖苷键充分暴露，过氧化氢与其他基团充分接触，氧化糖苷键，导致琼脂分子降解，从而降低凝胶强度，脱硫效果不显著。
对比例3琼脂粉改性
碱处理：江蓠菜自来水冲洗干净，自然晾干，取晾干后的江蓠菜100g，以1g:20mL(m:v)藻水比，加入浓度7％(w/v)NaOH溶液，于90℃下恒温处理3h。碱处理结束，使用自来水进行浸泡漂洗，每次间隔40min，直至洗液pH呈中性。
酸化处理：漂洗后的江蓠菜按照总体系0.064％(v/v)、0.052％(m/v)和0.012％(m/v)的比例加入硫酸、草酸和乙二胺四乙酸二钠，酸化处理40min，倾去液体，浸泡漂洗直至洗液pH呈中性。
漂白处理：经酸化后的江蓠菜加水，再加入0.1％(w/v)次氯酸钠溶液，漂白处理40min，再浸泡漂洗至洗液pH呈中性。
煮胶：洗净后的江蓠菜，以1g:20mL(m:v)藻水比在100℃条件下煮胶1.5h。
过滤：热胶液趁热过三层棉布，常温下冷却凝固。
脱水、干燥、粉碎：冷凝后的琼脂切块装袋，-20℃冰箱过夜冷冻，常温脱水，55℃温度下烘干粉碎，得琼脂粉。
称取25g琼脂粉于烧杯中，加30％无水乙醇溶液250mL，置于磁力搅拌器上，待温度达到40℃时，调节反应至pH 9.0，再加入5mL H2O2溶液，反应2h后结束，使用无纺纱布进行过滤，加1000mL蒸馏水进行洗涤，反复洗涤直到样品无H2O2残留且洗液pH至中性，55℃烘干，粉碎，得样品。
本对比例中，所得的样品的硫酸根含量：＜0.25％；凝胶强度：1023±13g/cm2；分子量：1.92×105。由此可知，本对比例样品与实施例5的琼脂糖的硫酸根含量均达到了0.25％以下，与实施例5相比，实施例5中琼脂糖的凝胶强度较本实施例中的凝胶强度有显著提升，这是因为固体粉末H2O2改性后洗涤过程中H2O2分子进入琼脂分子内部，无法检测到残留，在溶胶过程中H2O2分子得到释放，硫酸根降低的同时也会降解部分琼脂分子，导致分子量降低，难以达到实施例5中凝胶强度的效果；实施例5中对传统碱工艺提取过程中的胶体进行改性，改性后除蒸馏水洗涤外，样品还会经过冷冻、解冻方式进行脱水，使得H2O2分子从琼脂分子内部释放出来，凝胶强度得到进一步提升。
另外，还对实施例5的琼脂糖、对比例1的琼脂粉和市售的琼脂糖(来源于北京全式金生物技术有限公司，GS201-01)进行凝胶电泳试验，在凝胶电泳中三种凝胶的浓度均为1％(用0.2g的粉末溶解于20ml的缓冲液中，配成浓度为1％的胶液跑电泳)。使用微波炉将这两种琼脂糖以及琼脂粉分别溶解在20mL 0.5×TBE缓冲液中，加入2μL溴化乙锭溶液，将胶液倒在胶板中待冷却后形成凝胶；将4个不同分子量的DNA marker(1、2、3、4泳道分别代表：DL 1000、DL 2000、DL 5000、DL 10000)加在上述三种凝胶上并进行电泳验证(110V下使用0.5×TBE缓冲液进行80min)。电泳结束后，在凝胶成像仪(GEAI 600
美国GE公司)下显现三个样品的凝胶电泳图。
结果如图5所示，图中，左边的为对比例1的琼脂粉；中间的为实施例5的琼脂糖；右边的为市售琼脂糖样品；1、2、3、4泳道分别代表分子量1000、2000、5000、10000 DNA maker。
图5 DNA琼脂糖凝胶电泳结果显示，经传统碱工艺提取出来的琼脂样品当分离DNAmaker分子量大于1000时，出现条带模糊，拖尾现象，而经过H2O2处理后的样品无论DNAmaker分子量为多大时，分离效果较好，与市售琼脂糖无差异。
综上，本发明的实施例，通过在提胶过程中使用环保清洁型试剂H2O2对胶体进行处理，使得提取出来的样品的硫酸根含量进一步降低，下降了80.5％，达到0.21％，凝胶强度升高了26.0％，达1136g/cm2，电内渗降低了48.8％，样品品质得到进一步提高；并且经过H2O2处理后的样品无论DNA maker分子量为多大时，分离效果较好，与市售琼脂糖无差异。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (6)

1.一种制备琼脂糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将江蓠菜洗净后进行碱处理、酸化处理、漂白处理、煮胶、过滤、冷却凝固，以便获得胶体；
（2）将所述胶体搅碎；
（3）向搅碎后的胶体加水，加热至30℃~70℃，调pH值至3.0~9.0，再加入H2O2溶液进行反应，反应结束后过滤、洗涤，反复洗涤直到胶粒样品无H2O2残留且洗液pH至中性，样品再进行冷冻、脱水、干燥、粉碎，得琼脂糖。
2.如权利要求1所述的制备琼脂糖的方法，其特征在于，步骤（3）中，胶体与H2O2反应的时间范围为1h~3h。
3.如权利要求1所述的制备琼脂糖的方法，其特征在于，步骤（3）中，H2O2溶液的加入量为占总反应液体积0.2%~3%。
4.如权利要求1所述的制备琼脂糖的方法，其特征在于，步骤（3）中，胶体与水的料液比为1g:2.5mL。
5.如权利要求1-4中任一项所述的制备琼脂糖的方法，其特征在于，步骤（1）中，碱处理为：将江蓠菜自来水冲洗干净，自然晾干，取晾干后的江蓠菜以1g:20mL藻水比，加入浓度7%w/v NaOH溶液，于90℃下恒温处理3 h，碱处理结束使用自来水进行浸泡漂洗，每次间隔40min，直至洗液pH呈中性；酸化处理为：经碱处理步骤后的江蓠菜按照总体系0.064% v/v、0.052% m/v和0.012% m/v的比例加硫酸、草酸和乙二胺四乙酸二钠，处理40 min，倾去液体，浸泡漂洗直至洗液pH 呈中性；漂白处理为：经酸化处理步骤后江蓠菜加水，按照总体系0.1% w/v的比例加次氯酸钠溶液，漂白处理40 min，再浸泡漂洗至洗液pH呈中性；煮胶为：经漂白处理后的江蓠菜以1g:20mL藻水比在100℃条件下煮胶1.5 h。
6.如权利要求1-4中任一项所述的制备琼脂糖的方法，其特征在于，步骤（2）中使用搅拌机将胶体搅碎。
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