CN105017557B - 一种可用于肝素提取的阳离子骨架聚合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明是关于一种阳离子骨架聚合物和其制备方法及在肝素提取中的应用。利用现有的密胺海绵特有的三维骨架结构，将壳聚糖涂层包覆在骨架上，再通过二甘醇二缩水甘油醚与壳聚糖涂层反应，使其交联并在表面携带大量的环氧基团，然后利用环氧基团与二乙胺反应生成叔胺基团，再用硫酸二乙酯进行季铵化反应，使骨架表面因带有悬挂的阳离子而强亲水化，并通过与肝素大分子上硫酸负离子的静电相互作用，实现高效吸附，在从猪小肠黏膜中提取肝素的过程中发挥关键作用。使用这种材料的优点是：吸附能力强，操作简化，材料能多次循环使用，降低成本，提高生产效率。

Description

一种可用于肝素提取的阳离子骨架聚合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物活性物质提取技术领域，尤其是一种利用阳离子骨架聚合物快速高效提取肝素的方法及该聚合物材料的制备方法。

背景技术

肝素是一种天然的抗凝血药，10mg肝素4h内能抑制500mL血浆凝固，同时还具有澄清血浆脂质、降低血胆固醇和增强抗癌药疗效等作用，临床广泛用作各种外科手术前后防治血栓形成和血塞，输血时预防血液凝出和保存鲜血时的抗凝剂，小剂量时用于防治高血脂症和动脉粥样硬化。肝素是由动物结缔组织的肥大细胞产生的，它广泛存在于哺乳动物的各种器官和组织中，多与蛋白质结合成无活性的复合体，解离后产生抗凝活性。国外大多数药用肝素是从牛肺中提取的，羊脏器中也有肝素，但含量低，我国猪小肠原料丰富，肠黏膜又是生产肠衣的废弃物，而且肝素含量很高，所以我国以从猪小肠黏膜提取肝素为主。

目前肝素的制备分为粗制和精制两个阶段，黏膜内的肝素与其它黏多糖共存，并与蛋白质结合，所以肝素的粗制包括肝素蛋白质复合物提取、解离和分级分离三步；精制是把粗品经过纯化得到精品。在粗品提取中，常用碱式盐解来完成前两步，而关键的最后一步只能采用离子交换法来完成，它是基于肝素分子含有带负电荷的硫酸基团的基本特性，通过与阳离子相互作用形成复合物，然后经过洗脱、沉淀、干燥等步骤得到肝素钠粗品。众所周知，离子交换法必须要使用一种带正电荷的多孔固体材料，传统上使用高分子阴离子交换树脂，如D-2514树脂，这种树脂一般都用来交换低分子量的阴离子，所以其孔径较小(通常为小于20nm的微孔)，肝素作为一种大分子阴离子，其在液相中的扩散速率远低于普通的阴离子，而且很难进入微孔中，只能作用于交换树脂的表面，所以在粘性液体中的交换速率和效率都成问题。本发明提供一种三维骨架结构的高分子材料，如图1所示，其孔径达到100μm，材料表面带有正电荷，所以非常适合用于交换大分子量的肝素分子，采用过整体性柱子的方法明显提高离子交换的效率和速率，有利于提高肝素的生产效率。

发明内容

本发明所要解决的首要技术问题是针对现有从猪小肠黏膜提取肝素过程中存在离子交换树脂孔径较小的问题提供一种阳离子骨架聚合物，它具有三维网络结构和100微米的贯通孔道，其表面带有丰富的正电荷，最大限度的吸附带负电荷的肝素分子，避免因扩散速率问题影响吸附效率和速率，并能很容易将吸附物质洗脱，实现材料的多次循环使用，提高肝素的生产效率。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供上述阳离子骨架聚合物的制备路线与方法，它切实可行，操作简便，易于大量制备。

本发明所要解决的再一个技术问题是提供一种上述阴离子骨架聚合物在肝素提取中的具体应用。

1、本发明解决首要技术问题所采用的技术方案为：一种阳离子化的三维骨架聚合物，其结构具有如图1所示的特征，骨架之间包含约100μm的互相连通的孔道，这种孔道对液体流通的阻力非常低，骨架的尺寸最小处为5μm左右，骨架之间通过共同点连接，结构成三维连续的网络结构。

非常有益的是，上述的三维骨架聚合物表面带有大量的并且具有一定游离程度的季铵阳离子基团，既有很强的亲水性，又容易和带大量硫酸负离子基团的肝素发生静电相互作用，增强吸附能力，提高肝素提取的效率。

2、本发明解决另一个技术问题所采用的技术方案为：一种上述高分子骨架材料的离子化方法，操作与反应路线如下所示：

其特征步骤为：将商品的壳聚糖溶于稀醋酸水溶液中(粘度大于400mPa的配成1～2wt.％的浓度；粘度在200～400mPa范围的配成2～3wt.％的浓度)加入少量阳离子表面活性剂(如十二烷基三甲基氯化铵，溶液中的浓度为0.1～0.2wt.％)，将市售的密胺海绵(三聚氰胺与甲醛交联反应制成的泡沫材料，现已商品化)浸泡在溶液中，取出后用真空吸掉多余的溶液，保证其在静置下没有溶液流出，然后再烘箱中于60℃下干燥2～3小时，再在pH＝9～10的碳酸钠溶液中浸泡20～30分钟，壳聚糖去质子化后形成不溶性的薄膜覆盖在骨架表面，材料用清水洗涤后再浸泡于10～12wt.％的二甘醇二缩水甘油醚的乙醇溶液中常温下反应1～2小时，然后用95％乙醇洗涤1～2次，再浸泡于12～15wt.％的二乙胺的乙醇溶液中，在常温下反应2～3小时，，悬挂的环氧基团转化成叔胺基团，再用95％乙醇洗涤1～2次，再将样品浸泡于10～12wt.％的硫酸二乙酯乙醇溶液中3～4小时，在常温下发生季铵化反应，最后用8～10wt.％的氯化钠水溶液洗涤2～3次，用离心方法去掉材料内部多余的液体。

非常有益的是，上述的二甘醇二缩水甘油醚可起到两个作用：一是与壳聚糖表面的氨基反应，引出悬挂的环氧基团，使下一步反应后阴离子的游离性增强；二是与壳聚糖内部的氨基反应，使壳聚糖发生交联反应，有利于该包覆层的稳定化；另外，壳聚糖既有很强的亲水性，又有较好的机械强度，这样能保证涂层牢固附着，不会轻易脱落。

3、本发明解决再一个技术问题所采用的技术方案为：上述阴离子骨架聚合物在溶菌酶提取中的应用方法，其特征在于将若干块材料叠加在一起，置于一个玻璃柱子中， 构成整体性吸附柱子，将原料溶液浸润并流过该材料，提取物被吸附于聚合物的骨架上，在经过清水和缓冲溶液洗涤，除去其它杂质，然后通过洗脱将提取物收集，以达到分离与提纯的目的。

非常有益的是，上述处理方法比一般的树脂填充柱子要高效快捷，材料中的每一个阳离子都有可能与肝素上的硫酸阴离子基团发生作用，不存在扩散受阻的问题，经过试验发现，每一克材料能够吸附122～147毫克的肝素，其吸附能力要高于现有的阴离子交换树脂。

本发明的优点在于：1)新的吸附材料孔径大，有利于大分子扩散；2)其三维网络结构有利于液体的流通，减小流动阻力；3)悬挂的阳离子要比相对固定的阳离子基团具有更大的游离性，更容易与肝素发生静电吸引作用。

附图说明

图1为三维骨架材料的SEM图像。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

材料制备：将商品的壳聚糖溶于稀醋酸水溶液中(粘度大于400mPa的配成1～2wt.％的浓度；粘度在200～400mPa范围的配成2～3wt.％的浓度)加入少量阳离子表面活性剂(十二烷基三甲基氯化铵，溶液中的浓度为0.1～0.2wt.％)，将圆柱状密胺海绵(直径10cm，厚度为20cm)浸泡在溶液中，取出后用真空吸掉多余的溶液，保证其在静置下没有溶液流出，然后再烘箱中于60℃下干燥2～3小时，再在pH＝9～10的碳酸钠溶液中浸泡20～30分钟，壳聚糖去质子化后形成不溶性的薄膜覆盖在骨架表面，材料用清水洗涤后再浸泡于10～12wt.％的乙二醇二缩水甘油醚的乙醇溶液中常温下反应1～2小时，然后用95％乙醇洗涤1～2次，再浸泡于12～15wt.％的二乙胺的乙醇溶液中，在常温下反应2～3小时，悬挂的环氧基团转化成叔胺基团，再用95％乙醇洗涤1～2次，然后将样品浸泡于10～12wt.％的硫酸二乙酯乙醇溶液中3～4小时，在常温下发生季铵化反应，最后用8～10wt.％的氯化钠水溶液洗涤2～3次，用离心方法甩掉材料内部多余的液体。

肝素的提取按以下操作步骤进行：

a.提取，将新鲜的猪小肠黏膜移入不锈钢提取锅中，按肠粘膜量加入4～5％的粗盐，加热搅拌，用30～40％氢氧化钠溶液调pH至9.0，待锅内温度升到50℃时停止加热，搅拌下保温(55℃)2h，然后升温到85℃左右，这时停止搅拌，在90℃下保温15min，趁热除去大的杂物，最后用100目尼龙布过滤提取液，滤液供吸附使用；

b.吸附与清洗，待液体温度冷却至40℃以下时，将滤液通过由阳离子化骨架聚合物制成的整体柱(10cm×100cm，由5块圆柱状样品叠加而成)，滤液的体积与柱子的体积与之比应为1∶2～1∶2.5，流速控制在50～80mL/min，然后用柱子体积2倍量的去离子水洗涤柱子，再用柱子体积1倍量的7％精盐水洗涤；

c.洗脱，先用柱子体积1倍量的25wt.％的精盐水洗脱柱子，再用柱子体积1倍量的18wt.％精盐水洗脱柱子，收集肝素洗脱液；

d.乙醇沉淀，将洗脱液倾入搪瓷缸中，然后加入95％乙醇，使洗脱液中乙醇的质量分数达到35～40％，搅匀过夜，然后虹吸出上层乙醇清液，回收后再用；

e.脱水与干燥，把下层沉淀滤干或用白布吊干，将吊干的粗品放在真空烘箱中常温干燥24小时；

f.脱色精制，用2wt.％氯化钠水溶液将粗品配成10wt.％肝素钠溶液，用盐酸将pH调至1～2，然后迅速过滤，再用氢氧化钠溶液调pH为10～12，按3％的量加入30％的过氧化氢，25下放置2天，并随时矫正pH为10～12，过滤后收集滤液，再用盐酸条绿叶pH为6～7，加入等量的95％乙醇沉淀，次日滤去清液，沉淀用丙酮脱水，干燥后得白色的肝素钠精品，效价大于145U/mg。

肝素钠效价测定：肝素钠效价测定采用羊血浆法，即将肝素钠标准品和供试品加入柠檬酸羊血浆中，钙化一定时间后观察两者的凝固程度，如标准品和供试品配成相同的浓度又得到相同的凝固程度，则说明两者效价相同，以此来对比测定未知样品的效价，具体操作如下：取管径均匀、洁净干燥的小试管9支，分别加入血浆0.5m L，置(37±5)℃恒温水浴中预热5～10分钟后，依次每管加入一种浓度(质量百分浓度)的标准品或供试品稀释液(1％、0.5％、0.2％)及氯化钙溶液(每种浓度3管，各浓度的试管支数相等)，加入氯化钙溶液后，立即混匀，并开始计算时间，注意观察并计算各管凝结时间.将各管凝结时间换成对数参照生物检定统计法(中国药典附录XIV)中的量反应平行线测定法计算效价及实验误差。

材料吸附能力评估：阴离子骨架材料的干态密度一般为0.04～0.05g/mL，整体柱的体积为7.85L，其质量为314～393g，平均值为353g，整体柱经过充分吸附后，经过洗脱、提纯后每次获得的肝素钠精品量为43～52g，因此每克材料能吸附肝素的量在122～147mg范围，而一般的离子交换树脂的吸附能力只有16～25mg/g，所以，本发明提供的材料在吸附能力上有明显优势，这主要归功于其大孔径和高孔隙率(低密度)的特点。

Claims (4)

1.一种阳离子骨架聚合物，其特征在于骨架的尺寸最小处为5μm，骨架之间通过共同点联接，构成连续的三维网络结构，骨架之间包含100μm的互相连通的孔道；

所述的阳离子骨架聚合物是以密胺海绵为基础骨架，其表面含有悬挂的季铵阳离子，其所带的正电荷有利于对阴离子物质的吸附。

2.根据权利要求1所述的阳离子骨架聚合物，其特征在于所述的阳离子骨架聚合物能以整体性柱子的方式通过离子交换原理吸附带负电荷的肝素大分子，使其吸附能力与速率明显提高。

3.一种权利要求1所述的阳离子骨架聚合物的制备方法，其特征在于步骤依次为：

(1)将密胺海绵浸泡在壳聚糖溶液中，取出后用真空吸掉多余的溶液，保证其在静置下没有溶液流出，然后再烘箱中于60℃下干燥2～3小时，再在pH＝9～10的碳酸钠溶液中浸泡20～30分钟，壳聚糖去质子化后形成不溶性的薄膜覆盖在骨架表面；

(2)上述材料用清水洗涤后再浸泡于10～12wt.％的二甘醇二缩水甘油醚的乙醇溶液中常温下反应1～2小时，然后用95％乙醇洗涤1～2次；

(3)再浸泡于12～15wt.％的二乙胺的乙醇溶液中，在常温下反应2～3小时，悬挂的环氧基团转化成叔胺基团，再用95％乙醇洗涤1～2次；

(4)再将样品浸泡于10～12wt.％的硫酸二乙酯乙醇溶液中3～4小时，在常温下发生季铵化反应，最后用8～10wt.％的氯化钠水溶液洗涤2～3次，用离心方法甩掉材料内部多余的液体。

4.根据权利要求3所述的阳离子骨架聚合物的制备方法，其特征在于壳聚糖溶液的浓度与其本身的粘度有关：粘度大于400mPa·s的配成1～2wt.％的浓度，粘度在200～400mPa·s范围的配成2～3wt.％的浓度。