CN115141217B

CN115141217B - 二硫代氨基甲酯混价铜配合物及其热敏水凝胶的制备方法

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Publication number: CN115141217B
Application number: CN202210799848.XA
Authority: CN
Inventors: 苟峄; 黄国锦; 姚冬; 莫碧文; 候丽霞; 吴幼茹
Original assignee: Guilin Medical University
Current assignee: Guilin Medical University
Priority date: 2022-07-08
Filing date: 2022-07-08
Publication date: 2024-02-02
Anticipated expiration: 2042-07-08
Also published as: CN115141217A

Abstract

本发明公开了一种二硫代氨基甲酯混价铜配合物及其与聚氧乙烯聚氧丙烯醚三嵌段共聚物Pluronic F127组成的热敏水凝胶，所述二硫代氨基甲酯混价铜配合物化学式为[Cu^II ₂(L)₂(Br)₂Cu^I(Br)]，其中L为(E)‑2‑(喹啉‑8‑基亚甲基)肼碳二硫代甲酯。本发明所述二硫代氨基甲酯铜(I/II)配合物‑Pluronic F127热敏水凝胶通过瘤内注射表现出良好的抑制肿瘤生长能力，且具很低的系统毒性。而且该热敏水凝胶可以起到缓释作用，延长药物作用时间，减少给药次数，具有广泛的应用前景。

Description

二硫代氨基甲酯混价铜配合物及其热敏水凝胶的制备方法

技术领域

本发明属于制药领域，具体涉及是一种二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物和二代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物-Pluronic F127热敏水凝胶的制备方法及其应用。

背景技术

具有R₁R₂C=N-NH-(C=S)-SR₃骨架的二硫代氨基甲酯类衍生物由于其广泛的生物活性，例如抗病毒，抗氧化剂，和抗增殖活性，而受到了药物化学家的关注。这些二硫代氨基甲酯类衍生物配体不仅具有软硫（S）还具有硬氮（N）供体原子，导致这些配体能够与多种金属离子，如Cu(II)、Fe(III)和Co(II)，配位形成具有有趣的理化和生物性性质的金属配合物。铜元素作为生物体的基本必需元素参与如氧转运，酶活性和能量代谢等许多关键的生理过程。有趣地，铜元素还参与癌症的发展和进程，在多种实体瘤中对Cu的需求比正常组织需要更高。因此，设计和合成二硫代氨基甲酯铜配合物作为抗癌剂具有巨大的价值。

另一方面，金属基药物最常见的策略是系统给药，如静脉注射。不幸的是，这种化疗药物的给药途径可能会导致严重的副作用，如靶向性性低，系统毒性大。此外，从血液中快速清除化疗药物会降低其抗癌作用。将化疗药物局部递送至肿瘤，尤其是无法手术的恶性肿瘤，是一种替代策略，因为它直接将化疗药物递送至肿瘤，并最大限度地减少药物对正常器官和组织的非选择性分布。然而，肿瘤内注射亲水性抗癌药物并不是一个完美的解决方案，因为游离药物往往会通过系统循环迅速扩散到身体的其他部位，而不是留在注射部位。温敏凝胶制剂作为递送载体则可以有效解决上述问题。温敏凝胶制剂作为递送载体，可以起到缓释的作用，延长药物作用时间，进而具有减少给药次数和提高患者顺应性等优势。具有无溶血性、对皮肤无刺激性和毒性小的嵌段共聚物Pluronic F127用作温敏凝胶基质在药物制剂领域广泛应用。

发明内容

本发明针对现有多数金属基抗癌药物毒性大和靶向性低的问题，合成了一种二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物-Pluronic F127热敏水凝胶。肿瘤内注射该热敏水凝胶可以在肿瘤处有效形成凝胶、起到缓释作用并改善抗癌作用。

本发明用冷溶法将二硫代氨基甲酯混价铜配合物与Pluronic F127制备呈混合凝胶制剂，制备方法简单，所得二硫代氨基甲酯混价铜(I/II)配合物-Pluronic F127热敏水凝胶能持续释放药物，并改善抗癌作用。

实现本发明目的的技术方案如下：

一种二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物，它的化学式为[Cu^II ₂(L)₂(Br)₂Cu^I(Br)]，其中L为(E)-2-(喹啉-8-基亚甲基)肼碳二硫代甲酯；Cu^II金属与HL配体配位时，脱去氢变成阴离子，所以化学式中用L表示；同时，由于Br离子和HL配体的还原作用，部分过量的Cu^II在溶液中还原为Cu^I，并参与配位。该二硫代氨基甲酯铜 (I/II) 配合物的结构式如下：

。

上述式所示二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物的制备方法如下：

按摩尔比2:1，将CuBr₂加入到含有(E)-2-(喹啉-8-基亚甲基)肼碳二硫代甲酯的甲醇溶液中，常温搅拌1-2小时；然后，常温静置、析晶，收集晶体，即得到所述的二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物；所述(E)-2-(喹啉-8-基亚甲基)肼碳二硫代甲酯与甲醇溶液的配比为1 mmol:20 mmol。

本发明的另一目的在于，提供上述二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物与Pluronic F127的热敏水凝胶，具体制备方法如下：

用作热敏水凝胶的 Pluronic F127 的浓度使用文献中报道的优化浓度 (21% w/v) （Journal of Drug Delivery Science and Technology, 48 (2018) 118-124）。采用冷法制备二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物与Pluronic F127的热敏水凝胶。简而言之，将计算量的 Pluronic F127 添加到二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物的水溶液中，并保持在 0-4℃ 搅拌形成均匀混合溶液，当温度提高到37℃得到水凝胶，其中二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物在混合溶液中的浓度为0.3 mg/mL。

本发明的另一目的在于，提供所述的二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物与Pluronic F127的热敏水凝胶在药物缓释方面的应用。

本发明的另一目的在于，提供所述的二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物以及该配合物与Pluronic F127的热敏水凝胶在制备抗癌药物中的应用。

本发明的优点：

（1）实验条件要求低，且可以高效合成所述的二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物；

（2）二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物与Pluronic F127的热敏水凝胶制备简单，原位注射后表现出优异的抗癌能力，且毒性低。

附图说明

图1为本发明二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物的晶体结构分子图，为了简洁，分子结构中的H删除。

图2为本发明二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物中由 Cu(II)···Br 相互作用（虚线）形成的一维锯齿形链的视图，对称代码：i = − x, −0.5 + y, − z; ii = − x,0.5 + y, − z。

图3为本发明二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物中 π⋯π 相互作用（虚线）的视图。

图4为实施例3制备的二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物-Pluronic F127 的热敏水凝胶在 37 ℃下形成水凝胶的示意图。

图5为实施例3制备的热敏水凝胶中硫代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物的释放曲线。

图6为二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物-Pluronic F127 热敏水凝胶的体内抗肿瘤能力评估分析图；

其中（A）A549 荷瘤裸鼠瘤内注射生理盐水、二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物和二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物-Pluronic F127 热敏水凝胶后的相对肿瘤体积变化图(n = 7, ** p < 0.005, *** p < 0.001)；

（B）第 14 天不同处理下小鼠的体重变化图；

（C）不同处理下肿瘤组织的 H&E分析图（比例尺：100 μm）；

（D）不同处理下肿瘤组织的TUNEL 分析图（比例尺：100 μm）。

图7为实施例不同处理下小鼠重要器官肺、心、肝和肾的H&E分析图（比例尺：100 μm）。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明内容作进一步详细说明，但不是对本发明的限定。

实施例中，肼碳二硫酸甲酯、Pluronic F127、3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）和喹啉-8-甲醛和 CuBr₂ 购自 Sigma-Aldrich。其余所有试剂和溶剂均来源于商业渠道。

实施例1

(E)-2-(喹啉-8-基亚甲基)肼碳二硫代甲酯（HL）的合成与表征：

将肼碳二硫酸甲酯（0.24 g， 2 mmol）和喹啉-8-甲醛（0.32 g，2 mmol）在60℃甲醇中回流1 h，得到含(E)-2-(喹啉-8-基亚甲基)肼碳二硫代甲酯配体的黄色溶液；在室温下缓慢挥发可生成HL的黄色结晶产物，产量0.39 g（71％），计算值 C₁₂H₁₁N₃S₂ (261.37):C, 55.14; H, 4.24; N, 16.08。实测值: C, 55.22; H, 4.61; N, 15.96。m/z: 260.03[M – H]⁺。

实施例2

二硫代氨基甲酯铜 (I/II) 混价配合物的合成和结构表征：

将2 mmol 的CuBr₂加入到1 mmol 的HL配体的甲醇（20 mmol）溶液中，在55-65℃回流1小时；然后将上述混合溶液放置在室温环境，并缓慢挥发一周，获得黑色的块状混价Cu配合物，产率: 59%，计算值C₂₄H₂₀Br₃Cu₃N₆S₄ (1276.28): C, 30.31; H, 2. 1, N, 8.84。实测值: C, 30.44; H, 2.31, N, 8.56。

二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II)配合物的单晶结构表征：在Cu-Kα (λ = 1.54184)的SMART APEX2 CCD衍射仪上收集混价Cu配合物的数据信息。通过Olex-2软件中的直接法（Direct methods）求解，并通过全矩阵最小二乘法进行结构优化。非H原子进行各向异性热参数细化，H原子则通过理论添加。二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II)配合物的部分晶体参数和键合参数分别列于表1和表2中。

表1. 二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II)配合物的晶体参数表

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表2. 二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II)配合物的键长（Å）和键角（º）

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如图1所示，X-射线单晶衍射显示，该配合物的分子结构中有两个单负三齿HL配体，三个铜原子和三个Br原子，表明Cu^I和Cu^II共存于该配合物中。Cu1 中心被 L^- 配体的两个 N 原子 [Cu1−N2 = 1.980(5) Å 和 Cu1−N3 = 2.008(5) Å] 和一个硫原子 [Cu1−S2 =2.2544(16) Å] 和一个 Br (Cu1−Br1 = 2.4124(10) Å) 并表现出轻微扭曲的方形平面配位几何。Cu2 原子位于扭曲的方形平面配位中，被两个 Br 阴离子 [Cu2−Br2 = 2.5289(10) Å 和 Cu2−Br3 = 2.3650(11) Å] 和来自两个 L^- 配体的两个 S 原子 [Cu2−S2 =2.3039(17) ) Å 和 Cu1−S4 = 2.3923(17) Å]包围。Cu3 中心也采用方形平面几何形状，并被一个 Br (Cu3−Br2 = 2.4732(10) Å)和来自L^- 配体两个 N 原子 [Cu3−N5 = 1.981(5) Å 和 Cu3−N6 = 2.010(5) Å] 和一个硫原子 [Cu3−S4 = 2.2798(15) Å]配位。如图 2和 3 所示，在探索配合物 4 单体单元之间的弱力时，我们发现存在三个弱相互作用：来自L^-配体的芳环两个 π···π相互作用（中心到-中心距：3.501 Å 和 3.571 Å；位移距离：0.861 Å 和 0.768 Å），以及强的 Cu3···Br1（Cu3···Br1 = 3.073 Å）相互作用。

二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物的体外抗癌活性研究：

人肺癌细胞A549和Calu-1，耐顺铂肺癌细胞A549cisR以及人正常肾细胞HK-2，用含1%双抗和10%的胎牛血清的完全培养液置于培养箱中培养。体外抗癌活性通过MTT法测试。由表3中可见，铜 (I/II)配合物的IC₅₀值显著低于顺铂的IC₅₀值，这表明铜 (I/II)配合物显示出比顺铂更优异的体外抗癌能力。进一步地，混价Cu配合物显示出比顺铂更优异的体外抗癌能力。特别地，铜 (I/II)配合物对A549和A549cisR表现出相当的抗癌活力，表明铜 (I/II)配合物可以克服耐药性。在本发明中，铜 (I/II)配合物对正常肾细胞 (HK-2)和癌细胞显示出相当的细胞毒性，这表明铜复合物需要水凝胶、两亲性嵌段共聚物或碳纳米管等策略降低毒性。

化疗药物的瘤内给药是一种有吸引力的策略，它可以提供瘤内药物定位以改善毒性和提高疗效。特别是，可注射的原位形成水凝胶代表了局部区域给药化疗药物的良好技术，可以延长作用期，提供特定部位的药物递送，易于制备并提高患者的依从性。其中，在体温下从溶胶状态转变为半固体凝胶状态的热敏水凝胶已被广泛用于控制药物递送。最近，已被 FDA 批准用于人体的两亲性 Pluronic F127 共聚物经常被用作温度敏感的水凝胶材料。一旦受到接近生理温度的温度刺激，Pluronic F127可以通过在水中的物理交联而自发形成网络。值得一提的是，Pluronic F127可以依靠简单的物理方法自组装成水凝胶，无需外源性化学交联剂或有毒化学品，从而降低生产成本，提高安全性。此外，PluronicF127与药物的预混合溶液易于储存。因此，为了降低该铜 (I/II)配合的毒性，提高抗癌潜力，本发明将制备 Pluronic F127-铜 (I/II)配合物的热敏水凝胶用于瘤内给药。

表3. 二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物抑制人癌细胞系生长的IC₅₀值（48h，μM）

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实施例3

二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物-Pluronic F127热敏水凝胶的制备和表征：

采用冷法制备二硫代氨基甲酯铜 (I/II) 配合物与Pluronic F127的热敏水凝胶，将计算量的浓度为21%（w/w）的Pluronic F127 添加到二硫代氨基甲酯铜 (I/II) 配合物的水溶液中，在 4℃条件下搅拌12小时形成均匀混合溶液，当温度提高到37℃得到水凝胶，其中二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物在混合溶液中的浓度为0.3 mg/mL。

二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物从热敏水凝胶的释放采用如“透析膜法”。简而言之，将 2 mL 的二硫代氨基甲酯铜 (I/II) 配合物与Pluronic F127的冷悬浮液添加到分子量截止值为 10 kDa 的单独透析袋中，然后置于37℃ 的 40 mL PBS 缓冲液中。在预定时间，取出 2 mL 释放介质并补充 2 mL 新鲜 PBS 缓冲液。从二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物-Pluronic F127的热敏水凝胶释放的铜配合物的量通过电感耦合等离子体质谱 (ICP-MS) 测量。

如图4所示，二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物-Pluronic F127的热敏水凝胶系统在较低温度下具有良好的流动性，便于储存和管理，并且在体温下（37℃）迅速凝胶化。特别是该水凝胶的制备方法简单，绿色环保，没有引入额外的化学物质。由于这些水凝胶用于皮下给药，因此使用更接近体内条件的透析膜法评估了该水凝胶中二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物的体外释放。如图 5 所示，3 天内该水凝胶系统才完全释放了二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物，表明二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物-Pluronic F127的热敏水凝胶系统具有持续的药物释放能力。

二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物-Pluronic F127热敏水凝胶的体内抗肿瘤（Intratumoral injection）能力评估，参见图6：

使用 BALB/c 小鼠（5 周大，约 21 g）建立肺 A549 癌异种移植瘤模型。用 200μL A549 细胞悬液 (3 × 10⁶) 皮下接种小鼠的右侧。当肿瘤生长到大约 100 mm³ 时，A549 荷瘤小鼠被随机分为三组（n = 7/组）。每周给药一次，连续两次向小鼠肿瘤内注射生理盐水、二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物（0.75 mg/kg）或二硫代氨基甲酯混价铜(I/II) 配合物-Pluronic F127热敏水凝胶（相当于 0.75 mg/kg 游离二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物）两次。每隔一天测量体重和肿瘤的长度和宽度。使用以下公式计算肿瘤体积（V）：V = (宽度²×长度)/2。在尸检时，收集这些小鼠的肿瘤、心脏、肝脏、肺和肾脏，切片并用苏木精和伊红 (H&E) 和 TUNEL 染色。

如图6A所示，与对照组相比，二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物和二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物-Pluronic F127热敏水凝胶治疗14天后肿瘤体积分别为40.7%和27.6%；因此，二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物-Pluronic F127热敏水凝胶的治疗效果最高。在治疗期间，治疗组未观察到严重的毒性症状，例如体重减轻（如图 6B所示）、虚弱或嗜睡。还进行了H&E和TUNEL染色以评估不同制剂治疗后的抗癌功效。如图 6C所示，肿瘤组织切片的 H&E 分析显示，治疗组和对照组之间的组织形态存在明显差异。在对照组中没有观察到明显的损伤或坏死。相比之下，在二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物和二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物-Pluronic F127热敏水凝胶治疗组，特别是热敏水凝胶治疗的肿瘤中观察到肿瘤组织中有大的坏死区域。TUNEL 结果显示，与对照组相比，用各种药物制剂治疗的小鼠中 TUNEL 阳性癌细胞的百分比增加（如图 6D所示）。这些结果证实了二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物-Pluronic F127热敏水凝胶优越的体内抗癌功效。

此外，在治疗 14 天后获得的主要器官（即肺、心脏、肝脏和肾脏）的 H&E 分析显示没有明显的损伤（如图 7所示）。虽然二硫代氨基甲酯混价铜 (I/II) 配合物单独在体外显示出毒性，但在主要器官中没有观察到明显的毒性，这归因于较低的剂量和瘤内注射。总体而言，水凝胶载体在协同铜络合物化疗期间足够有效和安全。

Claims

1.一种二硫代氨基甲酯混价铜配合物，其特征在于：所述铜配合物的化学式为[Cu^II ₂(L)₂(Br)₂Cu^I(Br)]，其中L为 (E)-2-(喹啉-8-基亚甲基)肼碳二硫代甲酯；

铜配合物的结构式如下：

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2.如权利要求1所述的二硫代氨基甲酯混价铜配合物的制备方法，其特征在于：按摩尔比2:1，将CuBr₂加入到含有(E)-2-(喹啉-8-基亚甲基)肼碳二硫代甲酯的甲醇溶液中，常温搅拌1-2小时；然后，常温静置、析晶，收集晶体，即得到二硫代氨基甲酯混价铜配合物。

3.如权利要求2所述的二硫代氨基甲酯混价铜配合物的制备方法，其特征在于：所述(E)-2-(喹啉-8-基亚甲基)肼碳二硫代甲酯与甲醇溶液的配比为1 mmol:20 mmol。

4.如权利要求1所述的二硫代氨基甲酯混价铜配合物的用途，其特征在于：所述的二硫代氨基甲酯混价铜配合物在制备抗癌药物中的应用。

5.一种二硫代氨基甲酯混价铜配合物热敏水凝胶的制备方法，其特征在于：将权利要求1所述的二硫代氨基甲酯混价铜配合物的水溶液加入到聚氧乙烯聚氧丙烯醚三嵌段共聚物Pluronic F127中，0-4℃条件下搅拌形成均匀混合溶液，当温度提高到37℃得到水凝胶。

6.如权利要求5所述的二硫代氨基甲酯混价铜配合物热敏水凝胶的制备方法，其特征在于：Pluronic F127的浓度为21%（w/w），二硫代氨基甲酯混价铜配合物的浓度为0.3 mg/mL。

7.如权利要求5-6任一项所述的制备方法制得的二硫代氨基甲酯混价铜配合物热敏水凝胶的用途，其特征在于：所述的二硫代氨基甲酯混价铜配合物热敏水凝胶在制备抗癌药物中的应用。