WO2020173475A1

WO2020173475A1 - 一种双药物共递送系统及其制备方法与应用

Info

Publication number: WO2020173475A1
Application number: PCT/CN2020/076891
Authority: WO
Inventors: 许海燕; 闫豆豆; 孟洁; 刘健; 温涛; 葛洋洋
Original assignee: 中国医学科学院基础医学研究所
Priority date: 2019-02-27
Filing date: 2020-02-27
Publication date: 2020-09-03
Also published as: CN109745288A; US20220047613A1; US12274709B2; CN109745288B

Abstract

一种双药物共递送系统及其制备方法与应用，由包括嵌段共聚物、高三尖杉酯碱和阿霉素盐酸盐的原料制得，该共递送系统对多种血液肿瘤和实体肿瘤细胞都具有更强的杀伤作用，可为抑制肿瘤生长和白血病治疗提供可行的药物递送系统，前景广阔。

Description

一种双药物共递送系统及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，特别涉及一种双药物共递送系统、其制备方法及在制备抗肿瘤药物方面的应用。背景技术

化疗是利用化学药物阻止癌细胞的增殖、浸润、转移，直至最终杀灭癌细胞的治疗方式，是大部分实体肿瘤和血液系统肿瘤的主要治疗方式。化疗过程中使用的化学药物称为化疗药物。由于化疗药物耐药性的出现和剂量依赖性的毒副作用，单一用药已无法满足临床需求，于是使用多种化疗药物联用来解决此问题。多种化疗药物的联合使用虽然能够降低单一用药导致的毒副作用和产生耐药的可能性，但存在给药次数多、剂量分配方案不容易确定等问题。

化疗药物共递送系统是解决上述问题的有效方法，该共递送系统是将两种或以上化疗药物包裹在一个载体中，利用药物间协同作用增强其对肿瘤细胞的杀伤效果。与单一用药和联合用药相比，药物共递送系统的优势在于： 1）两种或多种化疗药物发挥协同作用，在较小的剂量下产生更强的抗肿瘤效应，降低毒副作用，避免耐药性的产生； 2）可控制药物释放的时间和空间，以协调不同药物的药物代谢动力学和药效学； 3）减少给药次数，改善病人依从性； 4）单一给药剂量，避免多种药物给药时剂量分配的不确定性。

药物共递送系统主要使用脂质体、聚合物胶束、固体脂质纳米粒、以及无机纳米材料如介孔桂纳米粒、金纳米粒、磁性纳米粒、碳纳米管等作为药物共递送载体。递送的药物可有多种类型，如递送两种作用于不同靶标的小分子化疗药物，以达到最大的肿瘤细胞杀伤效应，降低产生药物耐受的可能性；又如共递送化疗药物和 siRNA，利用 RNA干扰技术沉默耐药基因，干扰细胞信号通路，从而克服耐药；再如共递送化疗药物和成像剂，实现靶向药物递送和非侵袭性的肿瘤成像。

现有的药物共递送系统的研宄多集中于实体肿瘤的化疗治疗，包括乳腺癌、肝癌、宫颈癌、前列腺癌、肺癌、脑瘤、头颈部鳞状细胞癌、胰腺癌、胃癌、黑色素瘤、卵巢癌等。由于血液肿瘤种类很多，且每一个种类中的亚型十分复杂，对治疗其的药物种类也有很多限制，使得治疗血液肿瘤的药物不如治疗实体肿瘤的药物多，因此迄今适用于血液肿瘤，如白血病、淋巴瘤、骨髓异常增生综合症等的药物共递送系统很少，在化疗中面临更大的挑战。除少量基础研宄外，目前可用于制备治疗血液肿瘤的药物共递送系统的药物仅有阿糖胞苷和柔红霉素，由其形成药物共递送系统为脂质体共递送系统（CPX-351），已于 2014年 11月进入三期临床试验。试验显示 CPX-351对初治或复发的急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）老年患者有效，可以作为缓解诱导疗法用于标准诱导疗法无效的患者，或者作为巩固疗法用于已接受了干细胞移植或未进行过干细胞移植的患者。然而，上述脂质体共递送系统的制备工艺复杂，不仅需要使用多种脂质材料，而且需要在葡萄糖酸铜 /三乙胺缓冲体系中制备，以使药物阿糖胞苷和柔红霉素与缓冲体系（含有有机溶剂）中的铜离子按照一定的摩尔比形成复合物，从而保证药物在脂质体中的滞留时间。该脂质体共递送系统涉及有机溶剂的使用，因而存在毒副作用风险高的问题。

因此，本领域急需开发出适用于血液肿瘤，尤其是复发性、难治性白血病的新型药物共递送系统。发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，第一方面，提供一种具有强抗肿瘤作用、低毒副作用、且可用于复发性、难治性白血病的双药物共递送系统，该双药物共递送系统由包括嵌段共聚物、高三尖杉酯碱和阿霉素盐酸盐的原料制得；所述嵌段共聚物选自聚乙烯己内酰胺 -聚醋酸乙烯酯-聚乙二醇（Soluplus）、甲氧基聚乙二醇-聚己内酯（mPEG-PCL）、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇 2000 （ DSPE_PEG₂。。。）、聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物、聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）中的一种或几种，优选 Soluplus。

其中，高三尖杉酯碱、阿霉素盐酸盐、嵌段共聚物按重量份数比为（1-10）:（1-40）: （4-200）；优选（1-5） : （3-15） : （45-200）。

所述系统的平均水合直径为 20-200 nm，优选 60-180 nm。

所述嵌段共聚物 Soluplus中聚乙烯己内酰胺、聚醋酸乙烯酯和聚乙二醇的分子量比为 57 : 30 : 13。

第二方面，本发明提供一种制备上述双药物共递送系统的方法，包括制备载有高三尖杉酯碱的胶束和加载阿霉素。

优选的，所述载有高三尖杉酯碱的胶束是由高三尖杉酯碱、嵌段共聚物和磷酸盐缓冲液混合搅拌得到的。具体制备过程包括以下步骤：

1）将嵌段共聚物和高三尖杉酯碱加入磷酸盐缓冲液中，加热搅拌得到液体 B;

2）过滤步骤 1）得到的液体 B，滤液即为载有高三尖杉酯碱的胶束，称胶束 C。所述加载阿霉素是将所述载有高三尖杉酯碱的胶束与含有嵌段共聚物的磷酸盐缓冲液混合，再加入阿霉素盐酸盐水溶液搅拌。具体包括以下步骤：

（1）将嵌段共聚物溶于磷酸盐缓冲液中，得到澄清溶液 D; （2）将步骤（1）得到的澄清溶液 D与载有高三尖杉酯碱的胶束（胶束 C）混合，加热搅拌下滴加阿霉素盐酸盐水溶液（优选的，阿霉素盐酸盐水溶液中阿霉素盐酸盐的浓度为 3-8 mg/mL），得到液体 E;

（3）将步骤（2）得到的液体 E过滤，滤液即为所述双药物共递送系统。

所述加热均为加热至 25-70^°C。

所述搅拌的速度均为 100-1000 r/min。

第三方面，本发明提供上述双药物共递送系统在制备抑制肿瘤生长相关疾病药物或治疗白血病药物中的应用。

所述肿瘤生长相关疾病为高三尖杉酯碱和蒽环类抗生素联合应用有效的肿瘤，包括但不限于急性髓系白血病、慢性髓系白血病、宫颈癌等。

所述急性髓系白血病为复发性、难治性的 AML1-ET0急性髓系白血病。

本发明提供的双药物共递送系统中作为载体的嵌段共聚物为两亲性的高分子聚合物，在溶液中可形成亲水性壳-疏水性核结构：两亲性的嵌段共聚物在磷酸盐缓冲液中形成胶束，通过两步组装方法，先后将两种药物高三尖杉酯碱（疏水性）和阿霉素盐酸盐（亲水性）组装进胶束疏水核中，形成双药物共递送系统可实现联合给药。本发明的双药物共递送系统还可通过调整胶束中两种药物的比例从而对肿瘤发挥有差别的治疗作用。本发明的双药物共递送系统对多种血液肿瘤和实体肿瘤细胞都具有更强的杀伤作用，肿瘤细胞包括急性髓系白血病细胞、慢性髓系白血病细胞、宫颈癌细胞、乳腺癌细胞。该系统还可用作治疗复发性、难治性的 AML1-ET0急性髓系白血病的药物，效果优异；特别是：在白血病细胞实验中，与联合使用阿霉素和高三尖杉酯碱相比，本发明的双药物共递送系统能更有效地抑制髓系白血病细胞的增殖；在动物实验中，对急性髓系白血病 AML1-ET0小鼠具有更好的治疗效果，在延长小鼠生存期的同时还能降低毒副作用。本发明的双药物共递送系统可用于抑制肿瘤生长和白血病的治疗中。

本发明双药物共递送系统在制备过程中不使用任何有机溶剂，安全性高，满足临床用药要求；制备工艺简单，适于工业化生产。附图说明

图 1所示为本发明的双药物共递送系统在磷酸盐缓冲液中的粒径分布曲线图；图 2所示为本发明的双药物共递送系统的磷酸盐缓冲液的照片；

图 3所示为本发明的双药物共递送系统（D0X和 HHT的重量比为 8 : 1）对 HL60/A 细胞活力影响的柱状图；

图 4所示为本发明的双药物共递送系统（D0X和 HHT的重量比为 8 : 1）对 U937R 细胞活力影响的曲线图；图 5所示为本发明的双药物共递送系统（D0X和 HHT的重量比为 15 : 1）对 K562 细胞活力影响的曲线图；

图 6所示为本发明的双药物共递送系统（D0X和 HHT的重量比为 6 : 1）对 HeLa细胞活力影响的曲线图；

图 7所示为本发明的双药物共递送系统（D0X和 HHT的重量比为 4 : 1）对 MCF7细胞活力影响的曲线图；

图 8所示为本发明的双药物共递送系统（D0X和 HHT的重量比为 9 : 1）延长白血病小鼠生存期的曲线图；

图 9所示为本发明的双药物共递送系统（D0X和 HHT的重量比为 9 : 1）降低小鼠体内白血病细胞数量的柱状图；

图 10-图 11所示为本发明的双药物共递送系统（D0X和 HHT的重量比为 9 : 1）降低毒副作用的柱状图。具体实肺式

高三尖杉酯碱（HHT）是从三尖杉属植物中提取出的一种生物活性成分，能抑制白血病细胞的增殖，诱导细胞凋亡。阿霉素盐酸盐是一种广谱抗肿瘤药，通过破坏 DNA 结构表现出抗肿瘤效应。高三尖杉酯碱和阿霉素（DOX）盐酸盐分别为疏水和亲水性药物，在临床上可用于急性髓系白血病的联合治疗。但是，两种药物在急性髓系白血病治疗中分别给药，会导致患者依从性差；此外，由于药代动力学不同，两种药物在体内的浓度无法保持设定的比例。

在这两种药物的共递送系统方面，目前仅有一种脂质体共递送系统的文献报道（Shim G , Lee S , Choi J , et al. Liposomal Co-Delivery of Omacetaxine Mepesuccinate and Doxorubicin for Synergistic Potentiation of Antitumor Activity. Pharmaceutical Research, 2014, 31（8）:2178-2185.），该递送系统使用脂质体作为载体，粒径为 126 nm，在小鼠皮下移植宫颈癌细胞（HeLa细胞）的模型中具有抑制肿瘤生长的作用。该脂质体共递送系统制备过程复杂，需要使用多种脂质材料，并加入有机溶剂甲醇使高三尖杉酯碱首先被包裹到脂质体中，然后通过静电作用进一步包裹阿霉素盐酸盐。该脂质体共递送系统中存在有机溶剂甲醇会带来毒副作用，除此之外，该脂质体共递送系统是针对抑制实体肿瘤 HeLa细胞生长进行设计的，脂质体比较稳定，通常利用实体瘤的高通透性和滞留效应在肿瘤组织中蓄积和释放药物，而不能有效杀伤循环血液中的白血病细胞。而且，该脂质体共递送系统如果在骨髓中累积，难以减轻药物本身对骨髓细胞生长的抑制作用，而急性髓系白血病的治疗需要骨髓细胞的参与，因而该脂质体共递送系统病不适于在急性髓系白血病治疗中应用。聚合物胶束是一类受到广泛关注的共递送药物载体，因其一般尺寸在几十纳米，所以也将其称为纳米胶束，是由两亲性聚合物在合适的浓度和温度下于溶剂体系中自发形成，通过亲 -疏水作用，将药物包裹在胶束的疏水核中，因此通常作为两种疏水药物的共递送药物载体；其优势是不影响药物本身的活性，显著地对疏水药物进行增溶，制备方法简单，不需要使用有机溶剂。但是，常规设计的聚合物胶束对于亲水性药物则难以应用，特别是难以将疏水和亲水性药物同时负载到胶束的疏水核中。

由于阿霉素盐酸盐是水溶性的，而高三尖杉酯碱是疏水性的，因此，按通常理解难以采用聚合物胶束作为上述双药的共递送药物载体，把两种亲疏水性质不同的药物包裹到胶束的疏水核中。本发明通过使用筛选出的独特高分子作为载体，在不使用有机溶剂的前提下将亲疏水性质不同的两种药物包裹到聚合物胶束中，利用聚合物胶束形成共递送系统。

本发明的双药物共递送系统选用两亲性的嵌段共聚物作为载体，其在水溶液中可形成亲水性壳-疏水性核结构的胶束;通过疏水作用先将高三尖杉酯碱包裹在胶束的疏水核中，再将阿霉素盐酸盐组装进胶束的疏水核中，形成本发明的双药物共递送系统，即用两亲性嵌段共聚物将阿霉素盐酸盐和高三尖杉酯碱共递送。

本发明的双药物共递送系统中选用的嵌段共聚物选自聚乙烯己内酰胺-聚醋酸乙烯酯-聚乙二醇（例如商品名为 Soluplus 的商品）、甲氧基聚乙二醇-聚己内酯（mPEG-PCL）、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇 2000 （DSPE_PEG₂。。。）、聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物、聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）中的一种或几种，优选 Soluplus。可用的嵌段共聚物均可商购，平均分子量在 1000-150000。

本发明还提供了阿霉素盐酸盐和高三尖杉酯碱形成的双药物共递送系统在制备治疗肿瘤药物方面的应用。

本发明的双药物共递送系统尤其可用作治疗复发性、难治性的急性髓系白血病的药物，包括 AML1-ET0急性髓系白血病，其表征为 t（8; 21）（q22； q22）染色体易位，常见于 FAB分型中的 M2，存在于大约 12 %〜 15 % AML患者中；染色体 21 q22上的 AML 1 基因和染色体 8 q22上的 ET0基因重排形成 AML1-ET0融合基因。以下结合具体实施例，更具体地说明本发明的内容，并对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明进行限制。

除非特别指明，以下实施例中所用的细胞系均购自国家实验细胞资源共享平台。除非特别指明，以下实施例中所用的磷酸盐缓冲液均为 1 X PBS溶液（pH7. 4）; 所用水溶液的溶剂均为超纯水。实施例一：制备载有髙三尖杉酯碱的胶束

（1）将 15. 0-100. 0 mg 嵌段共聚物和 5. 0 mg高三尖杉酯碱溶于 4 mL磷酸盐缓冲液中，搅拌得到高分子混悬液 A; 嵌段共聚物选自聚乙烯己内酰胺-聚醋酸乙烯酯 - 聚乙二醇（Soluplus）、甲氧基聚乙二醇（mPEG） -聚己内酯（PCL）（mPEG-PCL，分子量： 4000 D）、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺（DSPE） -聚乙二醇 2000（PEG₂。。。）（DSPE_PEG₂。。。，分子量： 2807 D）、聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物（购自德国巴斯夫公司，分子量 9840 D-14600 D，聚氧乙烯和聚氧丙烯的含量比为 80 : 20）、聚乳酸-羟基乙酸共聚物

（PLGA， 10 KD-40 KD，聚乳酸和羟基乙酸的含量比为 50 : 50）中的一种或几种，优选 Soluplus （可商购，购自德国巴斯夫公司，分子量 120 KD，聚乙烯己内酰胺、聚醋酸乙烯酯和聚乙二醇的分子量比为 57 : 30 : 13）；

（2）将高分子混悬液 A在 25-7CTC加热、 100-1000 r/min搅拌 20-120 min，获得溶液 B;

（3）将溶液 B室温静置约 1小时，至其呈澄清透明状，然后用 0. 22 p m聚醚砜水系滤膜过滤以除去未包裹进胶束的游离药物，即得载有高三尖杉酯碱的胶束 C; 所得到的载有高三尖杉酯碱的胶束 C平均水合直径在 70 nm，载药量为 14%，包封率为 64% _o

按照以上方法，制备得到一系列载有高三尖杉酯碱的胶束 C，仅是调整了使用的原料组成和制备参数，具体见表 1。

表 1 载有高三尖杉酯碱的胶束 C的制备参数

实施例二：加载阿霉素

( 1 ) 将 50. 0-200. 0 mg嵌段聚合物溶于 3 mL磷酸盐缓冲液中，搅拌至完全溶解，得到澄清溶液 D;

( 2 )将阿霉素盐酸盐用水溶解，配制成浓度为 3-8 mg/mL的阿霉素盐酸盐水溶液;

( 3 )将澄清溶液 D与实施例 1得到的载有高三尖杉酯碱的胶束 C混合， 25-70 ^°C 加热、 100-1000 r/min搅拌下滴加 1 mL步骤 ( 2 ) 得到的阿霉素盐酸盐水溶液，搅拌 20-120 min，得到溶液 E; 载有高三尖杉酯碱的胶束 C的聚合物与步骤 ( 1 ) 中所用的聚合物相同；

( 4) 将溶液 E室温静置，用 0. 22 |J m聚醚砜水系滤膜过滤以除去未包裹进胶束的游离药物，得到同时包载高三尖杉酯碱和阿霉素的胶束 F，即为本发明的双药物共递送系统，见图 2 , 为红色澄清溶液。

按照以上方法，制备得到一系列双药物共递送系统，仅是调整了加载阿霉素的参数，具体见表 2。通过改变向澄清溶液 D中加入载有高三尖杉酯碱的胶束 C的体积，可得到不同 D0X和 HHT比例的双药物共递送系统，其平均水合直径如表 3所示。

表 2 加载阿霉素的参数

实施例 1的胶束 F平均水合直径在 80 nm (如图 1所示)，阿霉素的载药量为 5%，包封率为 75%; 其它实施例的性能参数见表 2和表 3。表 3 DOX和 HHT比例不同的双药物共递送系统

实验一：单一游离药物、两种游离药物联合以及双药物共递送系统体外对多种血液肿瘤和实体肿瘤细胞增殖的抑制作用

以 HL60/A细胞（对阿霉素耐药的 HL60细胞）为例，具体实施方法如下：在 Corning 96孔 U型板中，每孔使用 100 |J L RPMI-1640培养基（含 10%胎牛血清和 1%青链霉素）培养 5 X 10⁴个细胞。实验组包括： 1）单一 HHT组（H）： HHT用二甲基亚砜（DMS0）溶解得到 10 mg/mL母液； 2）单一 D0X组（D）：阿霉素盐酸盐用水溶解得到 5 mg/mL母液； 3）游离药物联合组（DH）: 母液 1）和 2）分别用培养基稀释后混合得到， D0X与 HHT的重量比为 8 : 1 ; 4）本发明的双药物共递送系统组（DHM）：将实施例 1-6的双药物共递送系统分别用培养基稀释后得到。对照组每孔加入 100 H L 培养基；实验组每孔加入 100 kl L稀释后的药物溶液，使 HHT终浓度为 5 ng/mL、 10 ng/mL、 25 ng/mL、 50 ng/mL、 100 ng/mL；对应的 DOX终浓度为 40 ng/mL、 80 ng/mL、 200 ng/mL、 400 ng/mL、 800 ng/mL。将 Corning 96孔 U型板中的细胞孵育 24 h后用 PBS清洗细胞，向每孔加入 110 M L CCK8稀释液，孵育 2 h，用酶标仪测定 450和 630 nm波长下的吸光度值（0D值），按照公式 1计算细胞存活率，以实施例 1的结果为例，见图 3。

公式 1 : 细胞存活率 =0D_4M-63。（实验组） / OD_45O-63O （对照组） X 100%

图 3结果表明，当双药物共递送系统中 HHT浓度为 25 ng/mL, D0X浓度为 200 ng/mL 时，单一 D0X对 HL60阿霉素耐药株无细胞毒性，单一 HHT作用下细胞存活率为 56%，游离药物联合作用下细胞存活率为 54%，双药物共递送系统作用下细胞存活率为 40%，因此相同药物浓度下，本发明双药物共递送系统比单一药物、游离药物联合能够更加有效地抑制肿瘤细胞的增殖。

本发明的双药物共递送系统对 U937R （阿糖胞苷耐药株，发明人所在实验室筛选的急性髓系白血病耐药细胞株）、 K562、 HeLa和 MCF7细胞也有类似效果，各细胞的培养条件见表 4, 结果见图 4 -图 7。

对于 U937R细胞，当双药物共递送系统中 HHT浓度为 15 ng/mL、 D0X浓度为 120 ng/mL时，单一 D0X、单一 HHT、游离药物联合、本发明实施例 1双药物共递送系统作用下细胞存活率分别为 55%、 59%、 34%、 21%。

对于 K562细胞，当双药物共递送系统中 HHT浓度为 25 ng/mL、D0X浓度为 375 ng/mL 时，单一 D0X、单一 HHT、游离药物联合、本发明实施例 7双药物共递送系统作用下细胞存活率分别为 80%、 59%、 35%、 27%。

对于 HeLa细胞，当双药物共递送系统中 HHT浓度为 20 ng/mL、D0X浓度为 120 ng/mL 时，单一 D0X、单一 HHT、游离药物联合、本发明实施例 5双药物共递送系统作用下细胞存活率分别为 90%、 41%、 35%、 30%。

对于 MCF7细胞，当双药物共递送系统中 HHT浓度为 25 ng/mL、D0X浓度为 100 ng/mL 时，单一 D0X、单一 HHT、游离药物联合、本发明实施例 4双药物共递送系统作用下细胞存活率分别为 92%、 50%、 43%、 27%。

表 4 肿瘤细胞的培养条件

实验二：游离药物联合、双药物共递送系统对 AML1-ET0小鼠生存期的影响本实验所采用的小鼠为 6-8周大的雌性 C57鼠（来自中国医学科学院基础医学研宄所的动物实验中心），在 SPF级环境中饲养。用 200 M L乙二胺四乙酸钠盐（EDTA） / PBS悬浮 1 X 10⁶个 AML1-ET0小鼠原代脾脏细胞（GFP标记），通过尾静脉注射到经亚致死辐照（450 cGy）的 C57小鼠体内。移植第七天从小鼠尾静脉取血，用流式细胞仪检测外周血白血病细胞阳性率，确认小鼠发病。从移植后的第 8天开始，腹腔注射以下各组药物：（1）游离药物高三尖杉醋碱 0. 4 mg/kg、阿霉素盐酸盐 3. 6 mg/kg，作为 DH组；（2）本发明实施例 8的双药物共递送系统（D0X与 HHT的重量比为 9 : 1），作为 DHM组；（3）无菌 PBS作为溶剂对照组（con组）；（4）无菌 PBS溶解的 Soluplus 72 mg/kg作为 Solupus组。连续给药四天，停药七天，为一个疗程；结果见图 8。

图 8结果表明，游离药物联合组小鼠终末生存期为 52天，本发明双药物共递送系统组小鼠在 52天时存活率高达 9/10，本发明的双药物共递送系统组比游离药物联合组小鼠的生存期更长，且差异显著。

67天时检测 DHM组存活小鼠外周血（PB）、脾（spleen）、骨髓（bone）的 GFP阳性细胞比例，各小鼠不同脏器的白血病细胞浸润结果见图 9。图 9结果表明，本发明双药物共递送系统可延长小鼠生存期，同时能减少各器官白血病细胞的浸润。实验三：游离药物联合、双药物共递送系统对 AML1-ET0小鼠的药效

实验过程同实验二。

治疗一个疗程后处死小鼠，用流式细胞仪检测外周血（PB）和骨髓（Bone） GFP 阳性细胞比例，同时使用血细胞分析仪（迈瑞公司 BC-5120型号）检测外周血中白细胞（WBC）、红细胞（RBC）和血小板（PLT）数量，结果见图 10和图 11。

图 10结果表明，治疗后 DHM组外周血中白血病细胞比例从 DH组的 40%降低到 10%; 骨髓中白血病细胞比例从 DH组的 50%降低到 5%，表明 DHM能显著降低外周血和骨髓中白血病细胞比例。图 11结果表明，治疗后 DHM组 WBC从 DH组的 10 X 10⁹/L降低至 5 X 10⁹/L, RBC从 DH组的 5. 9 X 10¹²/L升高至 6. 4 X 10¹²/L, PLT从 DH组的 9. 3 X 10ⁿ/L 升高至 1. 2 X 107L; 说明 DHM治疗在减少白血病细胞的同时，没有降低红细胞和血小板的数量，表明其对骨髓细胞没有抑制作用，在发挥治疗效果的同时还能降低毒副作用。

IDIk应用性

本发明提供的双药物共递送系统对多种血液肿瘤和实体肿瘤细胞都具有杀伤作用，同时能降低毒副作用，可抑制肿瘤生长和用于白血病治疗；制备过程中不使用任何有机溶剂，制备工艺简单，适于工业应用。

Claims

权利要求

1、一种双药物共递送系统，由包括嵌段共聚物、高三尖杉酯碱和阿霉素盐酸盐的原料制得;所述嵌段共聚物选自聚乙烯己内酰胺 -聚醋酸乙烯醋-聚乙二醇（Soluplus）、甲氧基聚乙二醇-聚己内酯（mPEG-PCL）、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇 2000

（DSPE-PEG₂。。。）、聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物、聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）中的一种或几种，优选 Soluplus。

2、根据权利要求 1所述双药物共递送系统，其中，高三尖杉酯碱、阿霉素盐酸盐、嵌段共聚物按重量份数比为（1-10）:（1-40）:（4-200）；优选（1-5） :（3-15） :（45-200）。

3、根据权利要求 1 或 2 所述双药物共递送系统，所述系统的平均水合直径为 20-200 nm, 优选 60-180 nm。

4、根据权利要求 1-3任一所述双药物共递送系统，所述嵌段共聚物 Soluplus中聚乙烯己内酰胺、聚醋酸乙烯酯和聚乙二醇的分子量比为 57 : 30 : 13。

5、根据权利要求 4所述双药物共递送系统，高三尖杉酯碱、阿霉素盐酸盐、嵌段共聚物 Soluplus按重量份数比为（1-10）: （1-40）：（4-200）；优选（1-5） : （3-15） :

（45-200）。

6、一种制备权利要求 1-5任一所述双药物共递送系统的方法，包括制备载有高三尖杉酯碱的胶束和加载阿霉素；

优选的，所述载有高三尖杉酯碱的胶束是由高三尖杉酯碱、嵌段共聚物和磷酸盐缓冲液混合搅拌得到。

7、根据权利要求 6所述方法，所述加载阿霉素是将所述载有高三尖杉酯碱的胶束与含有嵌段共聚物的磷酸盐缓冲液混合，再加入阿霉素盐酸盐水溶液搅拌得到。

8、根据权利要求 6或 7所述方法，所述载有高三尖杉酯碱的胶束的具体制备过程包括以下步骤：

2）过滤步骤 1）得到的液体 B，滤液即为载有高三尖杉酯碱的胶束，称胶束 C。

9、根据权利要求 6-8任一所述方法，所述加载阿霉素具体包括以下步骤：

（1）将嵌段共聚物溶于磷酸盐缓冲液中，得到澄清溶液 D;

（2）将步骤（1）得到的澄清溶液 D与载有高三尖杉酯碱的胶束（胶束 C）混合，加热搅拌下滴加阿霉素盐酸盐水溶液（优选的，阿霉素盐酸盐水溶液中阿霉素盐酸盐的浓度为 3-8 mg/mL），得到液体 E;

10、根据权利要求 8或 9所述方法，所述加热均为加热至 25-70^°C。

11、根据权利要求 8或 9或 10所述方法，所述搅拌的速度均为 100-100() r/min。

12、权利要求 1-5任一所述双药物共递送系统在制备抑制肿瘤生长相关疾病药物或治疗白血病药物中的应用。

13、根据权利要求 12所述应用，所述肿瘤生长相关疾病为高三尖杉酯碱和蒽环类抗生素联合应用有效的肿瘤，包括但不限于急性髓系白血病、慢性髓系白血病、宫颈癌等。

14、根据权利要求 13所述应用，所述急性髓系白血病为复发性、难治性的急性髓系白血病。

15、根据权利要求 14所述应用，所述急性髓系白血病为 AML1-ET0急性髓系白血病，其表征为 t (8; 21) (q22； q22)染色体易位，常见于 FAB分型中的 M2 ,染色体 21 q22 上的 AML 1基因和染色体 8 q22上的 ET0基因重排形成 AML1-ET0融合基因。