CN115135748A - 乳酸菌的发酵促进剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及乳酸菌的发酵促进剂，其包含选自苹果酸和富马酸中的至少1种有机酸。

Description

乳酸菌的发酵促进剂

相关申请的相互参照

本专利申请主张基于2019年12月27日申请的日本专利申请2019-239455号的优先权，上述在先专利申请中的全部公开内容通过引用作为本说明的一部分。

技术领域

本发明涉及新型的乳酸菌的发酵促进剂。

背景技术

在工业上基于微生物生产发酵物、代谢物时，发酵时间的缩短在消减制造成本、卫生管理方面是重要的。作为促进乳酸菌的发酵来缩短发酵时间的技术，报道了成为核酸的原料的物质促进乳酸菌的发酵(专利文献1)。另外，专利文献2中记载了：将十字花科植物种子的有机酸提取物等作为有效成分的微生物生产率改善剂。然而，从工业规模有效地生产发酵乳的观点出发，仍然需要简便地促进乳酸菌的代谢、发酵作用的新型技术手段。

另一方面，伴随着近些年健康意识的增强，寻求减少食品添加物的用量来制造美味的发酵乳。特别是，琥珀酸是鲜味物质，并且具有体重增加抑制作用、耐糖能改善作用、癌增殖抑制作用之类的有用的生理功能，因此经常被用作食品添加物。从拉动消费者的需求的观点出发，对于琥珀酸也是优选在不使用食品添加物的情况下在发酵乳内产生琥珀酸。

近些年，关于琥珀酸的产生机理，报道了：有时在厌氧条件下通过碳酸固定由丙酮酸或磷酸烯醇式丙酮酸生成草酰乙酸，通过TCA循环的反向途径产生琥珀酸(非专利文献1)。然而，尚没有任何报道乳酸菌可以利用TCA循环的反向途径。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：星野达雄、Microbiol.Cult.Coll.,2011,27(2),p.83-88

专利文献

专利文献1：日本特开2017-221157号公报

专利文献2：日本特开平04-141083号公报

发明内容

本发明提供用于促进乳酸菌的发酵的新型技术手段。另外，本发明提供用于促进发酵乳中的乳酸菌的琥珀酸的产生的新型技术手段。

本发明人等这次发现：选自苹果酸和富马酸中的至少1种有机酸可以促进乳酸菌的发酵。进而，本发明人等发现：上述有机酸可以促进发酵乳中的乳酸菌的琥珀酸的产生。本发明基于上述见解。

根据本发明，包括以下的发明。

[1]一种乳酸菌的发酵促进剂，其包含选自苹果酸和富马酸中的至少1种有机酸。

[2]根据[1]所述的发酵促进剂，其用于与核酸原料组合使用。

[3]根据[2]所述的发酵促进剂，其中，上述核酸原料为选自甲酸和具有在2位的碳原子上键合有氢原子的嘌呤骨架的化合物中的至少一种。

[4]根据[1]～[3]中任一项所述的发酵促进剂，其中，上述乳酸菌包含乳杆菌属菌。

[5]根据[4]所述的发酵促进剂，其中，乳杆菌属菌为选自由德氏乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜酸乳杆菌、格氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌和戊糖乳杆菌组成的组中的至少一种。

[6]一种乳酸菌发酵剂，其包含乳酸菌、及选自苹果酸和富马酸中的至少1种有机酸。

[7]根据[6]所述的乳酸菌发酵剂，其还包含核酸原料。

[8]一种制造发酵乳的方法，其包括在选自苹果酸和富马酸中的至少1种有机酸的存在下进行乳酸菌发酵。

[9]根据[8]所述的方法，其包括在上述有机酸与核酸原料的共存下进行乳酸菌发酵。

[10]根据[9]所述的方法，其中，上述核酸原料为选自甲酸和具有在2位的碳原子上键合有氢原子的嘌呤骨架的化合物中的至少一种。

[11]根据[8]～[10]中任一项所述的方法，其中，上述发酵乳包含琥珀酸。

[12]根据[11]所述的方法，其中，上述琥珀酸是由上述乳酸菌产生的内源性的有机酸。

[13]一种发酵乳，其是利用[8]～[12]中任一项所述的方法而得到的发酵乳，

上述发酵乳包含乳酸菌和琥珀酸。

[14]根据[13]所述的发酵乳，其中，上述琥珀酸是由前述乳酸菌产生的内源性的有机酸。

[15]根据[14]所述的发酵乳，其中，上述琥珀酸的含量相对于发酵乳总量为0.15mM以上。

[16]根据[13]～[15]中任一项所述的发酵乳，其还包含选自苹果酸和富马酸中的至少1种有机酸。

[17]一种乳酸菌的发酵促进方法，其包括在选自苹果酸和富马酸中的至少1种有机酸的存在下进行乳酸菌发酵。

[18]根据[17]所述的乳酸菌的发酵促进方法，其还包含核酸原料。

[19]根据[18]所述的乳酸菌的发酵促进方法，其中，上述核酸原料为选自甲酸和具有在2位的碳原子上键合有氢原子的嘌呤骨架的化合物中的至少一种。

[20]一种制造乳酸菌发酵剂的方法，其包括在选自苹果酸和富马酸中的至少1种有机酸的存在下培养乳酸菌。

[21]根据[20]所述的方法，其包括在上述有机酸和核酸原料的共存下培养乳酸菌。

[22]根据[20]或[21]所述的方法，其中，上述乳酸菌发酵剂包含乳酸菌、及选自苹果酸和富马酸中的至少1种有机酸。

[23]根据[22]所述的方法，其中，上述乳酸菌发酵剂还包含琥珀酸。

[24]根据[23]所述的方法，其中，上述琥珀酸是由前述乳酸菌产生的内源性的有机酸。

[25]一种发酵乳，其中，琥珀酸的含量相对于发酵乳总量为0.15mM以上。

[26]根据[25]所述的发酵乳，其还包含选自苹果酸和富马酸中的至少1种有机酸。

[27]根据[25]或[26]所述的发酵乳，其中，上述琥珀酸是由前述乳酸菌产生的内源性的有机酸。

[28]一种乳酸菌发酵代谢物的产生方法，其包括在选自苹果酸和富马酸中的至少1种有机酸的存在下进行乳酸菌发酵。

[29]根据[28]所述的产生方法，其中，乳酸菌发酵代谢物为细胞外多糖(EPS)。

[30]一种促进乳酸菌发酵代谢物的产生的方法(以下也记为“产生促进方法”)，其包括在选自苹果酸和富马酸中的至少1种有机酸的存在下进行乳酸菌发酵。

[31]根据[30]所述的方法，其中，乳酸菌发酵代谢物为细胞外多糖(EPS)。

根据本发明，能够促进乳酸菌的发酵。另外，根据本发明，能够增加发酵乳中的琥珀酸的产生量。本发明能够有利地用于促进乳酸菌的发酵、代谢、在短时间内产生细胞外多糖(EPS)、肽等发酵代谢物。另外，本发明能够有利地用于增加乳酸菌的琥珀酸的产生量、减少作为琥珀酸的食品添加物的添加量。

附图说明

图1是示出试验例9的相对于培养时间的EPS浓度变化的图。

具体实施方式

发酵促进剂

本发明的乳酸菌的发酵促进剂的特征之一在于：包含选自苹果酸和富马酸中的至少1种有机酸。

发酵促进剂中，选自苹果酸和富马酸中的至少1种有机酸的含量没有特别限定，例如为0.1～100质量％，优选为50～100质量％，更优选为80～100质量％。

发酵促进剂中的有机酸的原料可以使用作为食品添加物的市售品，也可以使用合成品、包含有机酸的制剂等。

发酵促进剂可以包含苹果酸、富马酸中的任一者的有机酸，也可以包含两者。苹果酸与富马酸的质量比(苹果酸/富马酸)没有特别限定，例如为0.1～10，优选为0.2～5，更优选为0.5～2，更进一步优选为0.6～1.5。

苹果酸

发酵促进剂中的苹果酸的形态只要不妨碍本发明的效果就没有特别限定，可以以游离酸或盐的任意的形态含有在试剂中。作为上述盐，可以列举出钾、钠等碱金属盐或钙、镁等碱土金属盐。培养中使用的苹果酸不限定于光学异构体，但优选为L-苹果酸。

苹果酸或其盐相对于培养基或原料乳总量，例如可以以0.001～75mM的范围、优选以0.01～50mM、更优选以0.1～10mM、更进一步优选以0.5～10mM的量添加。因此，苹果酸优选以成为上述量的方式包含在发酵促进剂中。此处，培养基或原料乳总量是指除培养中使用的菌以外的全部成分的总计量，例如，是指培养基或原料乳、苹果酸和/或富马酸、以及核酸原料的总计量。本发明的培养系统中的苹果酸的含量可利用高效液相色谱(HPLC)法测定。这样的测定可以通过使用市售的HPLC装置(例如岛津制作所株式会社制)和柱(例如，ICSep ICE-ORH-801(TRANSGENOMIC公司))来实施。更具体而言，上述测定可以利用以下的条件来进行。分析装置：岛津制作所株式会社制LC20 system、柱：ICSep ICE-ORH-801、6.5mm I.D.×300mm、连接2根而使用，流动相：7.5mM对甲苯磺酸、反应液：7.5mM对甲苯磺酸·150μM EDTA(2NA)·30mM Bis Tris、流速：0.5ml/分钟、注入量：10μl、炉温：55℃、检测：电导率检测器。

富马酸

发酵促进剂中的富马酸的形态只要不妨碍本发明的效果就没有特别限定，可以以游离酸或盐的任意的形态含有在试剂中。作为上述盐，可以列举出钾、钠等碱金属盐、钙等碱土金属盐、铵盐等。

另外，富马酸相对于培养基或原料乳总量，富马酸或其盐的含量例如可以以成为0.001～10mM的范围的量、优选以0.01～7.5mM、更优选以0.1～5mM、更进一步优选以0.1～2.5mM的量添加。因此，富马酸优选以成为上述量的方式包含在本发明的发酵促进剂中。本发明的培养系统中的富马酸的含量可以利用与苹果酸同样的方法测定。

核酸原料

对于本发明的发酵促进剂，从更有效地促进乳酸菌的发酵的观点出发，优选与核酸原料组合使用。核酸原料可以作为发酵促进剂的构成成分而包含，也可以单独使用。作为上述核酸原料，只要不妨碍本发明的效果就没有特别限定，作为适合的例子，可列举出甲酸、具有在2位的碳原子上键合有氢原子的嘌呤骨架的化合物。

甲酸已知为构成核酸的嘌呤骨架的原料。甲酸的形态只要不妨碍本发明的效果就没有特别限定，可以以游离酸或盐的任意的形态含有在试剂中。作为上述盐，可以列举出钾、钠等碱金属盐、钙等碱土金属盐、铵盐等。本发明的培养系统中的甲酸的含量可以利用与苹果酸同样的方法测定。

具有嘌呤骨架的化合物表示具有以下的结构(嘌呤骨架)：

[式(I)中的数字表示碳原子或氮原子的位置编号]

作为基本骨架的物质。具有嘌呤骨架的化合物通常也被统称为嘌呤体。作为具有嘌呤骨架的化合物，典型地可列举出嘌呤碱基、嘌呤核苷、嘌呤核苷酸、或它们的盐。

用作本发明的核酸原料的具有嘌呤骨架的化合物具有嘌呤骨架的在2位的碳原子(上述式(I)中，2所表示的碳原子)上键合有氢原子的嘌呤骨架。作为这样的化合物，可列举出包含腺嘌呤和次黄嘌呤(嘌呤碱基)、腺嘌呤和次黄嘌呤作为构成要素的嘌呤核苷、包含腺嘌呤或次黄嘌呤作为构成要素的嘌呤核苷酸、以及它们的盐。

嘌呤核苷是嘌呤碱基与糖(核糖、或脱氧核糖等)结合而成的物质，可以是核糖核苷，也可以是脱氧核糖核苷。作为包含腺嘌呤或次黄嘌呤作为构成要素的嘌呤核苷，例如可列举出腺苷和肌苷(核糖核苷)、以及脱氧腺苷和脱氧肌苷(脱氧核糖核苷)。

嘌呤核苷酸是1个以上的磷酸基与嘌呤核苷结合而成的物质，可以是核糖核苷酸，也可以是脱氧核糖核苷酸。嘌呤核苷酸可以为核苷一磷酸(核苷单磷酸)、核苷二磷酸、或核苷三磷酸。作为包含腺嘌呤或次黄嘌呤作为构成要素的嘌呤核苷酸，例如可列举出腺苷酸(腺苷一磷酸或腺苷单磷酸；AMP)、腺苷二磷酸(ADP)、腺苷三磷酸(ATP)、脱氧腺苷一磷酸(dAMP)、脱氧腺苷二磷酸(dADP)、脱氧腺苷三磷酸(dATP)、肌苷酸(肌苷一磷酸或肌苷单磷酸；IMP)、肌苷二磷酸(IDP)、肌苷三磷酸(ITP)、脱氧肌苷一磷酸(dIMP)、脱氧肌苷二磷酸(dIDP)、和脱氧肌苷三磷酸(dITP)。

具有在2位的碳原子上键合有氢原子的嘌呤骨架的化合物还包括嘌呤碱基、嘌呤核苷、或嘌呤核苷酸的衍生物。本发明中“衍生物”是指：对嘌呤碱基、嘌呤核苷或者嘌呤核苷酸的嘌呤碱基部分、糖残基部分、和/或磷酸基部分进行了化学修饰的、或者导入了取代基的化合物。

具有在2位的碳原子上键合有氢原子的嘌呤骨架的化合物可以是盐，例如腺嘌呤、次黄嘌呤、或包含腺嘌呤或者次黄嘌呤作为构成要素的嘌呤核苷或者嘌呤核苷酸的盐。本发明中，优选的盐可列举出碱金属盐(例如，钠盐、钾盐)，例如腺苷酸钠和肌苷酸钠，但不限定于这些。

具有在2位的碳原子上键合有氢原子的嘌呤骨架的化合物例如选自由腺嘌呤、次黄嘌呤、腺苷、肌苷、脱氧腺苷、脱氧肌苷、腺苷酸、肌苷酸、和它们的盐组成的组，优选为肌苷酸。需要说明的是，本发明的培养系统中的肌苷酸的含量可以使用基于荧光法的试剂盒、Inosine Assay Kit、CELL BIOLABS公司进行测定。

对于本发明的发酵促进剂，可以组合使用上述的具有在2位的碳原子上键合有氢原子的嘌呤骨架的化合物的至少1种、优选为1～4种、例如1～3种或1～2种。

将核酸原料与有机酸组合使用时，有机酸与核酸原料的质量比(有机酸/核酸原料)没有特别限定，例如为0.005～500，优选为0.05～200，更优选为0.1～100。

另外，核酸原料可以以相对于培养基或原料乳总量、核酸原料的含量例如成为0.001～75mM的范围的量、优选以成为0.01～50mM、更优选以0.1～10mM、更进一步优选以0.5～2mM的量添加。

另外，本发明的剂可以以与上述成分一起配混了根据期望的食品卫生上或药物可接受的添加剂的试剂的形式提供。作为食品卫生上或药物可接受的添加剂，可列举出水等水性介质、溶剂、溶解辅助剂、润滑剂、乳化剂、等渗剂、稳定化剂、保存剂、防腐剂、表面活性剂、调整剂、螯合剂、pH调节剂、缓冲剂、赋形剂、增稠剂、着色剂、芳香剂或香料等。

本发明的剂可以为液体、粉末、颗粒、凝胶、固体、胶囊包封体等任意的形态。

发酵促进剂可以通过将选自苹果酸和富马酸中的至少1种有机酸、及以核酸为代表的其它任意成分适宜混合而制造。对于得到的混合物，可以依据公知的制剂技术进一步进行在溶剂中的溶解、粉末化、颗粒化、凝胶化、固体化、胶囊包封等处理。

对于本发明的发酵促进作用，在添加了发酵促进剂的原料乳中培养乳酸菌使其发酵，调查显示出该发酵状态的进展的指标，其结果，能够确认与对照(未添加本发明的发酵促进剂的组)相比，发酵更快地进行。作为显示出发酵状态的进展的指标，没有特别限定，例如为可以使用伴随通过乳酸菌的发酵而生成的乳酸量的增加的发酵乳的pH值降低作为指标。作为上述pH，例如为pH4.6。此处，对于pH4.6，可以设定为在通常的发酵乳的制造中充分进行发酵、并使发酵结束的pH。与对照相比，达到pH4.6所需的时间缩短的情况下，可以判断发酵促进剂对乳酸菌具有发酵促进作用。pH可以使用市售的pH计进行测定。

乳酸菌

本发明中，发酵中使用的乳酸菌只要不妨碍本发明的效果就没有特别限定，可以是源自动物的乳酸菌，也可以是源自植物的乳酸菌。

作为本发明的优选的乳酸菌，可列举出乳杆菌(Lactobacillus)属菌、链球菌(Streptococcus)属菌、乳球菌(Lactococcus)属菌、肠球菌(Enterococcus)属菌、明串珠菌(Leuconostoc)属菌、和它们的组合，优选包含乳杆菌属菌的乳酸菌。作为包含乳杆菌属菌的乳酸菌，例如可列举出乳杆菌属菌、乳杆菌属菌与链球菌属菌的组合、乳杆菌属菌与乳球菌属菌的组合等。这些乳酸菌例如可以从ATCC等贮存机构等获得，也可以适宜使用市售品。

作为乳杆菌属菌，例如可列举出德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、马乳酒样乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、噬淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorous)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)等。优选的乳杆菌属菌为德氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、格氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌、戊糖乳杆菌等。此处，作为优选的嗜酸乳杆菌、格氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌和戊糖乳杆菌，分别列举出嗜酸乳杆菌JCM 1132T株、格氏乳杆菌JCM 1131T株、鼠李糖乳杆菌JCM 1136T株、罗伊氏乳杆菌JCM1112T株、唾液乳杆菌JCM 1231T株、和戊糖乳杆菌JCM 1558T株等。

另外，作为德氏乳杆菌，例如可列举出Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus(德氏乳杆菌保加利亚亚种；保加利亚乳杆菌)、Lactobacillusdelbrueckii subsp.lactis(德氏乳杆菌乳酸亚种)、Lactobacillus delbrueckiisubsp.delbrueckii(德氏乳杆菌德氏亚种)、Lactobacillus delbrueckii subsp.indicus(德氏乳杆菌印度亚种)等。优选的德氏乳杆菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种等，更优选为德氏乳杆菌保加利亚亚种(2038株、OLL1073R-1株、P1902901株、OLL1171株、OLL1255株、OLL1247株、OLL205013株)等。作为马乳酒样乳杆菌，例如可列举出马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种(Lactobacillus kefiranofaciens subsp.kefirgranum)等，优选为马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种JCM 8572T等。

另外，对于嗜酸乳杆菌JCM 1132T株、格氏乳杆菌JCM 1131T株、鼠李糖乳杆菌JCM1136T株、罗伊氏乳杆菌JCM 1112T株、唾液乳杆菌JCM 1231T株、戊糖乳杆菌JCM 1558T株、马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种JCM 8572T株，可以由独立行政法人理化学研究所生物资源中心(RIKEN BRC)微生物材料开发室(Japan Collection of Microorganisms)(RIKENBRC-JCM、日本)分别以保藏号JCM 1132T、JCM 1131T、JCM 1136T、JCM 1112T、JCM 1231T、JCM 1558T、JCM 8572T获得。

德氏乳杆菌保加利亚亚种2038株可以由“明治保加利亚酸奶(明治ブルガリアヨーグルト)”(注册商标)利用市售的乳杆菌属用的选择培养基来分离，株式会社明治(〒192-0919日本东京都八王子市七国1-29-1明治创新中心)贮存。

德氏乳杆菌保加利亚亚种OLL1073R-1株于1999年2月22日被保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(现在的国家高级工业科学技术学院，国际专利生物保藏中心(IPOD，NITE)(日本茨城县筑波市东1丁目1番1中央第6)，之后，被移至国际保藏保管并赋予保藏号FERM BP-10741。需要说明的是，记载于Budapest Notification No.282(http：//www.wipo.int/treaties/en/notifications/budapest/treaty_budapest_282.html)，由于由独立行政法人产品评价技术基础机构(IPOD,NITE)独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(IPOD,AIST)承接了专利微生物保藏业务，因此现在国家高级工业科学技术学院国际专利生物保藏中心(IPOD,NITE)以保藏号FERM BP-10741进行保藏。

德氏乳杆菌保加利亚亚种P1902901株由株式会社明治(〒192-0919日本东京都八王子市七国1-29-1明治创新中心)贮存。

德氏乳杆菌保加利亚亚种OLL1171株于2013年3月13日以NITE BP-01569在作为基于布达佩斯条约规定的国际保藏机构的国家技术评估学会专利微生物保藏中心进行了国际保藏。

德氏乳杆菌保加利亚亚种OLL1255株于2005年2月10日以NITE BP-76在作为基于布达佩斯条约规定的国际保藏机构的国家技术评估学会专利微生物保藏中心进行了国际保藏。

德氏乳杆菌保加利亚亚种OLL1247株于2014年3月6日以NITE BP-01814在作为基于布达佩斯条约规定的国际保藏机构的国家技术评估学会专利微生物保藏中心进行了国际保藏。

德氏乳杆菌保加利亚亚种OLL205013株于2017年2月3日以NITE BP-02411在作为基于布达佩斯条约规定的国际保藏机构的国家技术评估学会专利微生物保藏中心进行了国际保藏。

作为链球菌属菌，例如可列举出嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)等。

作为乳球菌属菌，例如可列举出乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、植物乳球菌(Lactococcus plantarum)、棉子糖乳球菌(Lactococcus raffinolactis)等。

作为乳杆菌属菌与链球菌属菌的组合，优选可列举出德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌。

乳酸菌与选自苹果酸和富马酸中的至少1种有机酸、核酸原料的混合比例可以根据乳酸菌、培养基、原料乳的种类、性质、温度条件其它发酵条件进行适宜设定。

乳酸菌与选自苹果酸和富马酸中的至少1种有机酸的质量比(乳酸菌/有机酸)例如为0.001～500000，优选为0.01～5000，更优选为0.1～500。

乳酸菌与上述核酸原料的质量比(乳酸菌/核酸原料)例如为0.1～11000，优选为1～11000，更优选为10～1100，进一步优选为50～550。

乳酸菌相对于培养基或原料乳总量，例如可以以成为0.001质量％～5质量％、优选为0.01质量％～2.5质量％、更优选为0.01质量％～2质量％、更进一步优选为0.1质量％～1质量％的量添加。

乳酸菌发酵剂

选自上述那样的苹果酸和富马酸中的有机酸可以与乳酸菌一起使用并用作乳酸菌发酵剂。因此，根据本发明的优选的实施方式，可提供乳酸菌发酵剂，其包含乳酸菌、及选自苹果酸和富马酸中的至少1种有机酸。

乳酸菌发酵剂包含：用培养基(例如，活化培养基)培养乳酸菌、经中间发酵而制备所得者。乳酸菌发酵剂优选包含乳酸菌及培养其的培养基作为构成要素。因此，乳酸菌发酵剂也可以进一步包含琥珀酸。此处，上述琥珀酸优选为由上述乳酸菌产生的内源性的有机酸。另外，乳酸菌发酵剂中，包含直接接种在成为发酵乳的来源的原料乳中者，还包含将该乳酸菌发酵剂接种在其他培养基中并使乳酸菌进一步增殖(扩大规模)的下一代及之后的乳酸菌发酵剂。

乳酸菌发酵剂基本上用于使原料乳发酵而得到发酵乳。需要说明的是，乳酸菌发酵剂的使用中，除了包括将通过本发明而得到的乳酸菌发酵剂直接接种在原料乳中之外，还包括将通过本发明而得到的乳酸菌发酵剂在培养基中进一步培养1次以上，并将该培养后的下一代及之后的乳酸菌发酵剂接种在原料乳中。

乳酸菌发酵剂可以与核酸原料一起组合使用。因此，根据本发明的其它方式，可提供乳酸菌发酵剂，其用于与核酸原料组合使用，且包含乳酸菌、及选自苹果酸和富马酸中的至少1种有机酸。上述乳酸菌发酵剂优选与核酸原料组合使用，上述组合使用中，可以将核酸原料与上述乳酸菌发酵剂一起作为独立的个体添加至培养基或原料乳中，也可以在上述乳酸菌发酵剂中混合核酸原料作为构成成分并作为整体地使用。通过组合使用乳酸菌发酵剂和核酸原料，从而能够更有效地促进乳酸菌的发酵。因此，根据一个方式，上述乳酸菌发酵剂也可以包含核酸原料。乳酸菌发酵剂中的苹果酸、富马酸、核酸原料、乳酸菌的各方式均可以与关于本发明的发酵促进剂的记载同样。

乳酸菌发酵剂中的乳酸菌的活菌数没有特别限定，例如为1.0×10⁴～1.0×10¹³cfu/g，优选为1.0×10⁵～1.0×10¹²cfu/g，更优选为1.0×10⁶～1.0×10¹¹cfu/g。

乳酸菌发酵剂中的乳酸菌与有机酸的质量比、乳酸菌与核酸原料的质量比、有机酸与核酸原料的质量比、有机酸中的苹果酸与富马酸的质量比可以与上述发酵促进剂中的质量比同样。

乳酸菌发酵剂可以由乳酸菌、及以上述有机酸、核酸原料、培养基成分为代表的任意成分来制造。以下对乳酸菌发酵剂的适合的制造方法的详情进行说明。

乳酸菌发酵剂的优选的制造方法包括：培养基制备工序、培养基杀菌工序、乳酸菌接种工序、培养工序(培养基发酵工序)、和有机酸等添加工序。

培养基制备工序是制备接种乳酸菌的培养基(例如，活化培养基)的工序。培养基只要不妨碍本发明的效果就没有特别限定，可列举出包含乳成分的培养基，例如优选包含脱脂乳、脱脂浓缩乳、脱脂奶粉(还原脱脂乳)、和这些脱脂乳成分的蛋白水解物、乳清、乳清浓缩物、乳清粉末(还原乳清)、和这些乳清成分的蛋白水解物、生乳、杀菌乳(全脂乳)、全脂浓缩乳、全脂奶粉(还原全脂乳)、以及这些全脂乳成分的蛋白水解物等的培养基，更优选包含脱脂乳、脱脂奶粉、和这些脱脂乳成分的蛋白水解物、乳清、乳清浓缩物、乳清粉末、和这些乳清成分的蛋白水解物的培养基，进一步优选包含脱脂乳、脱脂奶粉、乳清、乳清粉末等的培养基。另外，上述培养基可以与后述的原料乳相同。上述培养基优选进一步包含酵母提取物。上述培养基可以利用将上述各成分进行混合、溶解、分散、悬浮等公知的方法来制备。

培养基杀菌工序是通过例如加热对培养基制备工序中制备的培养基进行杀菌的工序。杀菌工序中，调整加热温度和加热时间进行加热处理至能够将培养基的杂菌杀死的程度即可。本发明中，优选将培养基加热至80℃以上、90℃以上、95℃以上、或100℃以上。加热杀菌可以使用公知的方法。例如，加热杀菌中，通过板式热交换器、管式热交换器、蒸汽喷射式加热装置、蒸汽注入式加热装置、通电式加热装置、高压釜装置等进行加热处理即可，也可以通过带有夹套的罐进行加热处理。需要说明的是，培养基的杀菌不限定于加热，例如也可以通过紫外线照射等公知的方法来进行。

乳酸菌添加(接种)工序是在杀菌后的培养基中添加(接种)乳酸菌的工序。作为在培养基中添加的乳酸菌，可以使用冷冻菌(例如，冷冻浓缩菌、冷冻粒料、冷冻干燥粉末等)。乳酸菌添加工序中，优选在培养基中以0.05质量％以上添加乳酸菌，更优选以0.05～10质量％添加，进一步优选以0.1～5质量％添加。

培养工序是在培养基中培养乳酸菌使乳酸菌增殖而得到乳酸发酵剂的工序。乳酸菌的培养时间没有特别限定，例如可列举出3～36小时，优选为5～30小时、更优选为10～24小时。需要说明的是，在多次培养而得到乳酸菌发酵剂的情况下，上述培养时间是指1次的培养时间。

另外，培养工序中，培养基的温度优选保持在30℃以上的发酵温度范围内。特别是，培养基的温度优选保持在30～50℃下，更优选保持在35～50℃下。另外，培养工序中，优选在不搅拌培养基的情况下预先进行静置。此处，“静置”是指不对培养基进行搅拌，例如可以是移动收纳培养基的容器的情况，只要在培养基内未进行搅拌就属于“静置”。如此，通过在培养工序之间静置培养基，从而能够促进乳酸菌的增殖，能够缩短至培养结束所需的时间。

有机酸等添加工序是添加选自苹果酸和富马酸中的至少1种有机酸以及根据期望添加核酸原料的工序。有机酸等添加工序可以在培养工序前、培养工序中、培养工序后中的任意时期实施，但从缩短培养时间的观点出发，优选在培养工序前或培养工序中实施。有机酸等添加工序例如可以通过如下方式实施：在培养工序后，采集规定量的乳酸菌或含有该乳酸菌的培养基，在上述乳酸菌或含有乳酸菌的培养基中添加有机酸和根据期望添加核酸原料，从而实施。另外，有机酸等添加工序例如可以通过在培养工序前或培养工序中、在培养基中添加有机酸以及根据期望添加核酸原料而实施。此处，作为培养工序前，没有特别限定，可以是培养基杀菌工序之前、培养基杀菌工序之后，乳酸菌添加工序之前、乳酸菌添加工序之后、与乳酸菌的添加同时中的任意时期。优选将添加的有机酸溶解于水中将pH调节为6.0～7.0。

发酵乳

根据本发明，可以使用上述发酵促进剂或乳酸菌发酵剂有效地制造发酵乳。此处，“发酵乳”是指：关于乳和乳制品的成分标准等的部令(乳等部令)中规定的“发酵乳”，包括“乳制品乳酸菌饮料”、和“乳酸菌饮料”，也包括酸奶等。例如，发酵乳是指：用乳酸菌或酵母使生乳、牛奶、特殊牛奶、生山羊奶、杀菌山羊奶、生绵羊奶、配方牛奶、低脂肪牛奶、无脂肪牛奶和加工乳等乳或包含与其同等以上的非脂乳固体成分的乳等发酵，制成糊状或液态者或将这些冷冻而成者，这些中包括硬酸奶、软酸奶(糊状发酵乳)或可饮酸奶(液态发酵乳)。

通常，原味酸奶等硬酸奶可通过如下方式制造：将原料填充至容器中、然后使其发酵(后发酵)，从而制造(也称为“定型酸奶”)。另一方面，软酸奶、可饮酸奶可通过如下方式制造：对发酵的发酵乳(前发酵)进行微粒化处理、均质化处理后，填充于容器中，从而制造(也称为“搅拌酸奶”)。

根据本发明，通过在苹果酸、富马酸、进而根据期望核酸原料的存在下进行乳酸菌发酵，从而即使不使用食品添加剂，也能够在发酵乳中以高含量含有琥珀酸。因此，根据本发明的优选的方式，可提供一种发酵乳，其包含乳酸菌和琥珀酸，上述琥珀酸是通过上述乳酸菌而产生的内源性的有机酸。

发酵乳中的琥珀酸含量例如相对于发酵乳总量为0.15mM以上、优选为0.2mM以上、更优选为0.7mM以上、更进一步优选为1mM以上、进一步优选为3mM以上。本发明的发酵乳中的琥珀酸含量的优选的下限值为0.15mM、优选为1mM、更优选为3mM，优选的上限值为50mM、更优选为20mM、更进一步优选为15mM。根据本发明的优选的方式，使用德氏乳杆菌保加利亚亚种作为乳酸菌时，发酵乳中的琥珀酸含量例如相对于发酵乳总量为1mM以上、优选为1.5mM以上、更优选为3mM以上。另外，使用鼠李糖乳杆菌作为乳酸菌时，发酵乳中的琥珀酸含量例如相对于发酵乳总量为0.5mM以上、优选为1mM以上。另外，使用唾液乳杆菌作为乳酸菌时，发酵乳中的琥珀酸含量例如相对于发酵乳总量为0.15mM以上、优选为0.2mM以上。本发明的发酵乳中的琥珀酸的含量可利用高效液相色谱(HPLC)法进行测定。这样的测定可以通过使用市售的HPLC装置(例如岛津制作所株式会社制)和柱(例如，ICSep ICE-ORH-801(TRANSGENOMIC公司))而简便地进行。作为上述测定，例如可以根据以下的条件来进行。分析装置：岛津制作所株式会社制LC20 system、柱：ICSep ICE-ORH-801、6.5mm I.D.×300mm、连接2根而使用，流动相：7.5mM对甲苯磺酸、反应液：7.5mM对甲苯磺酸·150μM EDTA(2NA)·30mM Bis Tris、流速：0.5ml/分钟、注入量：10μl、炉温：55℃、检测：电导率检测器。

发酵乳可在苹果酸、富马酸等有机酸、进而根据期望核酸原料的存在下适宜地制造，因此也可以含有苹果酸、富马酸、核酸原料。

发酵乳中的苹果酸的含量例如为0.1～50mM，优选为0.1～45mM，进一步优选为0.5～45mM。

发酵乳中的富马酸的含量例如为0.1～10mM，优选为0.1～5mM，进一步优选为0.5～1mM。

发酵乳中的核酸原料的含量例如为0.0001～5质量％，优选为0.0001～1.5质量％。

本发明的发酵乳与在制造时未添加选自苹果酸和富马酸中的至少1种有机酸的发酵乳相比，可列举出包含2倍以上的琥珀酸，优选包含2.5倍以上、更优选包含5倍以上。上限值可列举出30倍，优选为20倍。

根据本发明，发酵乳可以使用上述发酵促进剂或乳酸菌发酵剂、并在苹果酸、富马酸等有机酸、核酸原料的存在下进行制造。因此，可提供制造发酵乳的方法，其包括：在选自苹果酸和富马酸中的至少1种有机酸的存在下通过乳酸菌使原料乳发酵。另外，根据优选的方式，制造发酵乳的方法在上述有机酸和核酸原料的共存下进行乳酸菌发酵。

更具体而言，制造发酵乳的方法优选包括原料乳制备工序、原料乳杀菌工序、乳酸菌发酵剂接种工序和发酵工序。

原料乳制备工序是制备接种乳酸菌发酵剂的原料乳的工序。“原料乳”是酸奶等发酵乳的原料，因此也被称为酸奶混合物、发酵乳混合物等。本发明中，可以适宜使用公知的原料乳。原料乳包括杀菌前的原料乳、杀菌后的原料乳。

原料乳的具体的原料中可以包括生乳、经杀菌处理的乳、脱脂乳、全脂奶粉、脱脂奶粉、酪乳、黄油、奶油、乳清蛋白浓缩物(WPC)、乳清蛋白分离物(WPI)、α-乳清蛋白(La)、β-乳球蛋白(Lg)等。也可以适宜添加预先加热的明胶等。原料乳是公知的，可以依据公知的方法来制备。

作为优选的原料乳，包括生乳、脱脂乳、脱脂奶粉、奶油，但不限定于这些。作为更优选的原料乳，可以列举出脱脂乳、脱脂奶粉。本发明中使用的原料乳中的非脂乳固体成分的含量只要不妨碍本发明的效果就没有特别限定，优选为6～11质量％、更优选为7～10质量％。另外，作为原料乳中的脂肪成分的含量，只要不妨碍本发明的效果就没有特别限定，可以示例出优选为0.01～10质量％、更优选为0.05～5质量％、进一步优选为0.1～3质量％，但不限定于这些。

原料乳杀菌工序是通过例如加热对原料乳制备工序中制备的原料乳进行杀菌的工序。原料乳优选进行杀菌。作为上述杀菌，例如可列举出基于加热的杀菌。作为杀菌，调整加热温度和加热时间进行加热处理至能够将原料乳的杂菌杀死的程度即可。例如，优选使原料乳达到80℃以上、优选为90℃以上来进行高温杀菌。加热处理可以使用公知的方法。

乳酸菌发酵剂接种工序是将乳酸菌发酵剂接种(添加)在上述原料乳中的工序。作为上述乳酸菌发酵剂，可以使用经过上述乳酸菌发酵剂的制造方法而得到的乳酸菌发酵剂或利用通常的方法而制备经冷冻的乳酸菌发酵剂、在冷冻后经干燥的乳酸菌发酵剂。

此处，选自苹果酸、富马酸中的至少1种有机酸、及任意成分的核酸原料优选作为乳酸菌发酵剂中的构成成分添加至原料乳中，但也可以与乳酸菌发酵剂分别地作为添加物或作为内源成分包含在原料乳中。原料乳中的乳酸菌、有机酸、核酸原料的各成分的添加量可以是与上述发酵促进剂中记载的量同样。

发酵工序是通过乳酸菌发酵剂使原料乳发酵的工序。发酵工序中，例如，通过边将接种有乳酸菌发酵剂的原料乳维持在发酵温度范围内边使其发酵而得到发酵乳。本发明中，发酵工序可以使用公知的方法。发酵温度等发酵条件可以考虑原料乳、乳酸菌(乳酸菌发酵剂)的种类、制备的发酵乳的种类、风味等进行适宜调整。作为具体的例子，作为发酵温度，可列举出30～50℃左右。若为该范围的温度，则通常乳酸菌容易发挥作用，因此能够有效地进行发酵。作为此时的发酵温度，优选为30～45℃左右、更优选为35～43℃左右。

发酵时间可以根据使用的乳酸菌(乳酸菌发酵剂)、发酵温度等进行适宜调整。例如，可以将发酵乳中的pH为4.6作为指标来调整发酵时间。作为上述发酵时间，没有限制，例如可列举出2小时～36小时，可以优选为2.5小时～24小时，更优选为4小时～24小时。pH可以使用市售的pH计来测定。

需要说明的是，用于制造发酵乳的装置、和制造条件可以使用公知者。例如，作为制造发酵乳的装置，后发酵制品可以使用在填充后进行发酵的发酵室，前发酵商品可以使用进行发酵的发酵罐和用于将发酵乳凝块破碎的管线过滤器、均质机等，作为制造条件，可以适宜采用脱氧装置等。

如上所述，发酵乳中包含的琥珀酸是鲜味物质，并且是具有体重增加抑制作用、耐糖能改善作用、癌增殖抑制作用之类的有用的生理功能的有机酸。因此，根据1个方式，本发明的发酵乳可以以用于提高鲜味、用于抑制体重增加、用于改善耐糖能或者用于抑制癌症的增殖的组合物的形式提供。

其它方式

如上所述，根据本发明，通过将选自苹果酸和富马酸中的至少1种有机酸与根据期望的核酸原料组合，从而能够促进乳酸菌的发酵。因此，根据本发明的其它方式，可提供乳酸菌的发酵促进方法，其包括在选自苹果酸和富马酸中的至少1种有机酸的存在下，通过乳酸菌使培养基(例如，包含乳成分的培养基)或原料乳等发酵。另外，根据优选的其它方式，上述乳酸菌的发酵促进方法包括在上述有机酸和核酸原料的共存下进行乳酸菌发酵。

如上所述，根据本发明，可以促进乳酸菌的发酵、代谢，在短时间内产生发酵代谢物。因此，根据本发明的进一步的其它方式，可提供乳酸菌发酵代谢物的产生方法或产生促进方法，其包括在选自苹果酸和富马酸中的至少1种有机酸的存在下使培养基(例如，包含乳成分的培养基)或原料乳等乳酸菌发酵。另外，根据优选的其它方式，上述方法包括在上述有机酸和核酸原料的共存下进行乳酸菌发酵。作为上述发酵代谢物，可优选列举出琥珀酸、细胞外多糖(EPS)、肽等，更优选为细胞外多糖(EPS)。

另外，根据本发明的进一步的其它方式，可提供用于促进乳酸菌的发酵的、选自苹果酸和富马酸中的至少1种有机酸。另外，根据优选的进一步的其它方式，上述有机酸在核酸原料的共存下使乳酸菌发酵。

另外，根据本发明的进一步的其它方式，可提供选自苹果酸和富马酸中的至少1种有机酸在制造乳酸菌的发酵促进剂中的应用。另外，根据优选的进一步的其它方式，上述有机酸与核酸原料组合使用。

另外，根据本发明的进一步的其它方式，可提供选自苹果酸和富马酸中的至少1种有机酸在制造乳酸菌发酵剂中的应用。另外，根据优选的进一步的其它方式，上述有机酸与核酸原料组合使用。

另外，根据本发明的进一步的其它方式，可提供选自苹果酸和富马酸中的至少1种有机酸在制造发酵乳中的应用，其包括在该有机酸的存在下进行乳酸菌发酵。另外，根据优选的进一步的其它方式，上述有机酸与核酸原料组合使用。更根据优选的进一步的其它方式，上述发酵乳包含琥珀酸，该琥珀酸可以是通过乳酸菌而产生的内源性的有机酸。

上述的乳酸菌的发酵促进方法、有机酸、和使用的各方式可以依据关于本发明的发酵促进剂、乳酸菌发酵剂、发酵乳的制造方法的记载来实施。

实施例

以下，通过实施例对本发明进行更具体地说明，但本发明的保护范围不限定于这些示例。需要说明的是，只要没有特别记载，则本发明中使用的全部比率基于质量。另外，只要没有特别记载，则本说明书所述的单位和测定方法基于JIS标准。

试验例1：苹果酸或富马酸对德氏乳杆菌保加利亚亚种(以下也称为 “L.bulgaricus”)的发酵促进效果的研究

首先，准备下述的德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)菌株的冷冻菌。

(1)德式乳杆菌保加利亚亚种2038(以下也称为“2038”)

(2)德式乳杆菌保加利亚亚种OLL1073R-1(以下也称为“OLL 1073R-1”)

(3)德式乳杆菌保加利亚亚种P1902901(以下也称为“P1902901”)

(4)德式乳杆菌保加利亚亚种OLL1171(以下也称为“OLL1171”)

(5)德式乳杆菌保加利亚亚种OLL1255(以下也称为“OLL1255”)

(6)德式乳杆菌保加利亚亚种OLL1247(以下也称为“OLL1247”)

(7)德式乳杆菌保加利亚亚种OLL205013(以下也称为“OLL205013”)

在活化培养基中，使上述的菌株活化后使用。作为活化培养基，使用在121℃下对包含0.1质量％酵母提取物的10质量％还原脱脂乳培养基进行7分钟杀菌而得到的物质。此处，10质量％还原脱脂乳培养基为脱脂奶粉(脂肪成分1质量％、蛋白质34质量％、乳糖54质量％、灰分8质量％、非脂乳固体成分96质量％)(株式会社明治制)的10质量％水溶液(上述培养基中，乳糖含量5.4质量％、非脂乳固体成分9.6质量％)。在上述活化培养基中添加冷冻菌(相对于活化培养基量)0.1质量％，在37℃下进行16小时静置培养，得到活化液。将得到的活化液0.1质量％(相对于活化培养基量)添加至另外的活化培养基中，在37℃下静置培养16小时，得到乳酸菌发酵剂。

然后，使用发酵培养基作为原料乳进行发酵。作为发酵培养基，使用将以成为终浓度1mM的方式添加了甲酸的10质量％还原脱脂乳培养基以95℃杀菌后所得者。另外，在上述发酵培养基中，以成为终浓度1mM的方式添加在杀菌前用NaOH调节为pH约6.5的富马酸水溶液或苹果酸水溶液。上述发酵培养基的pH为约6.4。将上述中得到的各菌株的乳酸菌发酵剂在上述发酵培养基中接种(相对于发酵培养基量)0.5质量％，在40℃下进行静置培养，进行发酵。发酵时间是达到pH4.6所需的时间。pH使用市售的pH计进行测定。将得到的结果示于表1。由表1可知，通过添加苹果酸或富马酸，从而促进了全部7株保加利亚乳杆菌的发酵。苹果酸和富马酸对于L.bulgaricus的发酵促进效果几乎为同等。发酵缩短时间因菌株不同而异，为40分钟～12小时15分钟。

[表1]

表1苹果酸、富马酸对德氏乳杆菌保加利亚亚种的发酵促进效果

试验例2-1：对于保加利亚乳杆菌2038株显示出发酵促进效果的苹果酸、富马酸的 浓度的研究

使用发酵培养基(原料乳)进行发酵。作为发酵培养基，使用对以成为终浓度1mM的方式添加了甲酸的10％还原脱脂乳培养基进行了95℃温度杀菌所得到的物质。另外，在上述发酵培养基中，以成为表3、4中记载的终浓度的方式添加在杀菌前用NaOH调节为pH约6.5的富马酸水溶液或苹果酸水溶液。在上述发酵培养基中接种保加利亚乳杆菌2038株的乳酸菌发酵剂(相对于发酵培养基量)0.5％，在40℃下进行静置培养，进行发酵。发酵时间是达到pH4.6所需的时间。

如下方式进行发酵结束后的有机酸浓度的测定。用纯水将得到的发酵物(发酵乳)0.4g稀释2倍，添加卡瑞试剂I(53.5％(w/v)硫酸锌)20μL并进行涡漩，添加卡瑞试剂II(17.2％(w/v)氰化钾)20μl并进行涡漩。进行4℃、20620g、10分钟离心分离，在表2的条件下分析用0.22μm过滤器将上清液过滤所得者。

[表2]

表2有机酸分析条件

将得到的结果示于表3～5。根据表3、4，保加利亚乳杆菌2038株在0.01～2.5mM的富马酸、0.01～50mM的苹果酸中确认了发酵促进效果。另外，苹果酸、富马酸即使在0.01mM这样的低浓度下也均显示出发酵促进效果。测定发酵后的有机酸浓度，结果添加的苹果酸、富马酸的浓度降低，琥珀酸的浓度上升(表5)。即，启示出添加的苹果酸、富马酸通过还原的TCA路径以苹果酸→富马酸→琥珀酸的方向被代谢。

[表3]

表3富马酸对德氏乳杆菌保加利亚亚种2038株的发酵促进效果

[表4]

表4苹果酸对德氏乳杆菌保加利亚亚种2038株的发酵促进效果

[表5]

表5德氏乳杆菌保加利亚亚种2038株发酵后的苹果酸、富马酸和琥珀酸的浓度

试验例2-2：德氏乳杆菌保加利亚亚种中的、添加苹果酸、富马酸时的琥珀酸产生 量

在活化培养基中，将表6和表7所示的菌株活化后使用。作为活化培养基，使用在121℃下将包含0.1质量％酵母提取物的10质量％还原脱脂乳培养基进行7分钟杀菌所得到的物质。此处，10质量％还原脱脂乳培养基为脱脂奶粉(脂肪成分1质量％、蛋白质34质量％、乳糖54质量％、灰分8质量％、非脂乳固体成分96质量％)(株式会社明治制)的10质量％水溶液(上述培养基中，乳糖含量5.4质量％、非脂乳固体成分9.6质量％)。在上述活化培养基中添加冷冻菌(相对于活化培养基量)0.1质量％，在37℃下静置培养16小时，得到活化液。将得到的活化液0.1质量％(相对于活化培养基量)添加至另外的活化培养基中，在37℃下静置培养16小时，得到乳酸菌发酵剂。

然后，使用发酵培养基作为原料乳进行发酵。作为发酵培养基，使用将以成为终浓度1mM的方式添加了甲酸的10质量％还原脱脂乳培养基以95℃杀菌后所得到的物质。另外，在上述发酵培养基中，以成为终浓度1mM的方式添加在杀菌前用NaOH调节为pH约6.5的富马酸水溶液或苹果酸水溶液。上述发酵培养基的pH为约6.4。将上述中得到的各菌株的乳酸菌发酵剂在上述发酵培养基中接种(相对于发酵培养基量)2.5质量％，在40℃下进行静置培养，进行发酵。发酵时间是达到pH4.6所需的时间。pH使用市售的pH计进行测定。将得到的结果示于表6和7。根据表6，对于任意的德氏乳杆菌保加利亚亚种株，通过添加苹果酸、富马酸，琥珀酸的浓度均上升。另外，根据表7，与试验例1同样地，通过添加苹果酸或富马酸，促进了全部7株保加利亚乳杆菌的发酵。

[表6]

表6发酵结束时(pH4.6)的发酵物中的有机酸浓度

[表7]

表7苹果酸、富马酸对于德氏乳杆菌保加利亚亚种的发酵促进效果

试验例3：富马酸的相对于除德氏乳杆菌保加利亚亚种以外的乳酸菌种的发酵促 进效果的研究

首先，准备德氏乳杆菌保加利亚亚种以外的以下的菌种的基准株。

(8)嗜酸乳杆菌JCM 1132T

(9)格氏乳杆菌JCM 1131T

(10)鼠李糖乳杆菌JCM 1136T

(11)罗伊氏乳杆菌JCM 1112T

(12)唾液乳杆菌JCM 1231T

(13)戊糖乳杆菌JCM 1558T

在活化培养基中，使上述的菌株活化后使用。作为活化培养基，使用在121℃下对包含0.1％酵母提取物的10％还原脱脂乳培养基进行7分钟杀菌所得到的物质。在上述活化培养基中添加冷冻菌(相对于活化培养基量)1％，在37℃下静置培养24小时，得到活化液。将得到的活化液1％(相对于活化培养基量)添加至另外的活化培养基中，在37℃下静置培养24小时，得到乳酸菌发酵剂。

然后，使用发酵培养基(原料乳)进行发酵。作为发酵培养基，使用对以成为终浓度1mM的方式添加了甲酸的10％还原脱脂乳培养基进行了95℃温度杀菌所得到的物质。另外，在上述发酵培养基中，以成为终浓度1mM的方式添加在杀菌前用NaOH调节为pH约6.5的富马酸水溶液。在上述发酵培养基中接种上述中活化的各菌株的乳酸菌发酵剂(相对于发酵培养基量)1％，在37℃下静置培养，进行发酵。发酵时间是达到pH4.6所需的时间。将得到的结果示于表8。通过添加富马酸，在嗜酸乳杆菌、格氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌、和戊糖乳杆菌中促进发酵。

[表8]

表8富马酸的发酵促进效果

试验例4：苹果酸对于除德氏乳杆菌保加利亚亚种以外的乳酸菌种的发酵促进效 果的研究

首先，准备以下的菌种的基准株。

(12)唾液乳杆菌JCM 1231T

(13)戊糖乳杆菌JCM 1558T

(14)马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种JCM 8572T

代替富马酸，添加苹果酸，除此以外与试验例3同样地进行。将得到的结果示于表9。通过添加苹果酸，唾液乳杆菌、戊糖乳杆菌和马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种中促进了发酵。

[表9]

表9苹果酸的发酵促进效果

试验例5：鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌中的苹果酸、富马酸和琥珀酸的浓度的测定

与试验例2-1同样地进行试验例3或4中的、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌的发酵结束后的有机酸浓度的测定。将得到的结果示于表10。通过添加苹果酸、富马酸，在鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌中促进了琥珀酸的产生。

[表10]

表10鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌发酵后的苹果酸、富马酸、及琥珀酸的浓度

试验例6：添加肌苷酸时的富马酸对于德式乳杆菌保加利亚亚种的发酵促进效果 的研究

准备下述的德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)菌株的冷冻菌。

(1)德式乳杆菌保加利亚亚种2038

(2)德式乳杆菌保加利亚亚种OLL1073R-1

(3)德式乳杆菌保加利亚亚种P1902901

(4)德式乳杆菌保加利亚亚种OLL1171

(5)德式乳杆菌保加利亚亚种OLL1255

(6)德式乳杆菌保加利亚亚种OLL1247

(7)德式乳杆菌保加利亚亚种OLL205013

在活化培养基中，使上述的菌株活化后使用。作为活化培养基，使用在121℃下对包含0.1％酵母提取物的10％还原脱脂乳培养基进行7分钟杀菌所得到的物质。在上述活化培养基中添加冷冻菌(相对于活化培养基量)1％，在37℃下静置培养24小时，得到活化液。将得到的活化液1％(相对于活化培养基量)添加至另外的活化培养基中，在37℃下静置培养24小时，得到乳酸菌发酵剂。

然后，使用发酵培养基(原料乳)进行发酵。作为发酵培养基，使用对以成为终浓度1mM的方式添加10％肌苷酸的还原脱脂乳培养基进行了95℃温度杀菌所得到的物质。另外，在上述发酵培养基中，以成为终浓度1mM的方式添加在杀菌前用NaOH调节为pH约6.5的富马酸水溶液。在上述发酵培养基中接种上述中活化的各菌株的乳酸菌发酵剂(相对于发酵培养基量)1％，在37℃下静置培养，进行发酵。发酵时间是达到pH4.6所需的时间。pH使用pH计进行测定。将得到的结果示于表11。根据表11，通过添加富马酸，促进了全部7株保加利亚乳杆菌的发酵。

[表11]

表11添加肌苷酸时的富马酸对于德氏乳杆菌保加利亚亚种的发酵促进效果

试验例7：肌苷酸添加时的苹果酸对于德式乳杆菌保加利亚亚种的发酵促进效果 的研究

准备下述的德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)菌株的冷冻菌。

(1)德式乳杆菌保加利亚亚种2038

(2)德式乳杆菌保加利亚亚种OLL1073R-1

(3)德式乳杆菌保加利亚亚种P1902901

(4)德式乳杆菌保加利亚亚种OLL1171

(5)德式乳杆菌保加利亚亚种OLL1247

代替富马酸，添加苹果酸，除此以外与试验例6同样地进行。将得到的结果示于表12。通过添加苹果酸，在L.bulgaricus 2038株、OLL1073R-1株、P1902901株、OLL1171株、和OLL1247株中促进了发酵。

[表12]

表12添加肌苷酸时的苹果酸对德氏乳杆菌保加利亚亚种的发酵促进效果

试验例8：添加肌苷酸时，苹果酸或富马酸对德氏乳杆菌保加利亚亚种的琥珀酸产 生所带来的影响

在活化培养基中，将表13和14所示的菌株活化后使用。作为活化培养基，使用在121℃对包含0.1质量％酵母提取物的10质量％还原脱脂乳培养基进行7分钟杀菌所得到的物质。此处，10质量％还原脱脂乳培养基为脱脂奶粉(脂肪成分1质量％、蛋白质34质量％、乳糖54质量％、灰分8质量％、非脂乳固体成分96质量％)(株式会社明治制)的10质量％水溶液(上述培养基中，乳糖含量5.4质量％、非脂乳固体成分9.6质量％)。在上述活化培养基中添加冷冻菌(相对于活化培养基量)0.1质量％，在37℃下静置培养16小时，得到活化液。将得到的活化液0.1质量％(相对于活化培养基量)添加至另外的活化培养基中，在37℃下静置培养16小时，得到乳酸菌发酵剂。

然后，使用发酵培养基作为原料乳进行发酵。作为发酵培养基，使用对以成为终浓度1mM的方式添加了肌苷酸的10质量％还原脱脂乳培养基进行了95℃温度杀菌所得到的物质。另外，在上述发酵培养基中，以成为终浓度1mM的方式添加在杀菌前用NaOH调节为pH约6.5的富马酸水溶液或苹果酸水溶液。上述发酵培养基的pH为约6.4。将上述中得到的各菌株的乳酸菌发酵剂在上述发酵培养基中接种(相对于发酵培养基量)2.5质量％，在40℃下进行静置培养，进行发酵。发酵时间是达到pH4.6所需的时间。pH使用市售的pH计进行测定。将得到的结果示于表13和14。根据表13，在含有肌苷酸的培养基中，在任意的德氏乳杆菌保加利亚亚种株中，通过添加苹果酸、富马酸，琥珀酸的浓度均上升。因此，不仅在添加甲酸的培养基中显示出，在添加肌苷酸的培养基中，通过添加苹果酸、富马酸，也显示出德氏乳杆菌保加利亚亚种的琥珀酸产生量增加。另外，根据表14，与试验例6同样地，通过添加苹果酸或富马酸，促进了全部7株保加利亚乳杆菌的发酵。

[表13]

表13发酵结束时(pH4.6)的发酵物中的有机酸浓度

[表14]

表14苹果酸、富马酸对于德氏乳杆菌保加利亚亚种的发酵促进效果

试验例9：苹果酸或富马酸对德氏乳杆菌保加利亚亚种的增殖性和代谢物生产所 带来的影响

准备德式乳杆菌保加利亚亚种OLL1073R-1菌株的冷冻菌。

培养基的组成依据下表15。将除无水结晶葡萄糖以外的原料成分溶解于Elix水中，使用氢氧化钠调节至pH6.65后，定容至培养基投入量的70％的重量。将无水结晶葡萄糖溶解于Elix水中，定容至培养基投入量的30％的重量。添加苹果酸或富马酸时，与除无水结晶葡萄糖以外的原料成分一起以成为终浓度4mM的方式溶解于Elix水中进行添加。

需要说明的是，糖液、除糖以外的原料成分分别在110℃下、1分钟的高压釜处理中进行加热杀菌后，无菌地进行混合而使用。

[表15]

表15培养基组成

使用6N碳酸钾将上述培养基1.5kg调整至pH5.4，接种冷冻菌(相对于培养基量)0.30质量％，以0.5L/分钟的流量对上表面进行氮气通气，同时边在150rpm的条件下进行搅拌边在37℃下培养。

将EPS浓度相对于培养时间的变化示于图1。

如图1所示，确认了：与对照相比，添加了苹果酸或富马酸的情况下，EPS浓度增高。可知这是由于，通过添加苹果酸、富马酸，能够促进作为德氏乳杆菌保加利亚亚种的代谢产物的EPS的产生。另外，在添加了苹果酸或富马酸的情况下，与对照相比，在短时间内EPS浓度增高，因此再次确认了苹果酸或富马酸促进德氏乳杆菌保加利亚亚种的发酵。

EPS浓度的测定在下述的条件下进行。

称取培养液1.5g，添加超纯水(MilliQ)10g。加入100％三氯乙酸充分混合，进行离心分离(4℃、13400g、10分钟)后回收上清液。在沉淀中加入10％三氯乙酸溶液5ml进行悬浮后，再次进行离心分离并回收上清液。添加上清液的2倍量的冷却的99.5％乙醇，倾倒混合后在-20℃下静置一晩。

进行离心分离(4℃、13400g、20分钟)并去除上清液，加入冷却的66％乙醇20ml并将沉淀悬浮。进行离心分离(4℃、13400g、20分钟)并去除上清液，进行风干去除乙醇后，加入超纯水并定容至10ml，将所得者作为分析样品。分析样品的EPS浓度利用苯酚硫酸法进行测定。

由受理局填写

由国际局填写

PCT/RO/134表

Claims (26)

1.一种乳酸菌的发酵促进剂，其包含选自苹果酸和富马酸中的至少1种有机酸。

2.根据权利要求1所述的发酵促进剂，其用于与核酸原料组合使用。

3.根据权利要求2所述的发酵促进剂，其中，所述核酸原料为选自甲酸和具有在2位的碳原子上键合有氢原子的嘌呤骨架的化合物中的至少一种。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的发酵促进剂，其中，所述乳酸菌包含乳杆菌属菌。

5.根据权利要求4所述的发酵促进剂，其中，乳杆菌属菌为选自由德氏乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜酸乳杆菌、格氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌和戊糖乳杆菌组成的组中的至少一种。

6.一种乳酸菌发酵剂，其包含乳酸菌、及选自苹果酸和富马酸中的至少1种有机酸。

7.根据权利要求6所述的乳酸菌发酵剂，其还包含核酸原料。

8.一种制造发酵乳的方法，其包括在选自苹果酸和富马酸中的至少1种有机酸的存在下进行乳酸菌发酵。

9.根据权利要求8所述的方法，其包括在所述有机酸与核酸原料的共存下进行乳酸菌发酵。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其中，所述发酵乳包含琥珀酸。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述琥珀酸是由所述乳酸菌产生的内源性的有机酸。

12.一种发酵乳，其是利用权利要求8～11中任一项所述的方法而得到的发酵乳，

所述发酵乳包含乳酸菌和琥珀酸。

13.根据权利要求12所述的发酵乳，其中，所述琥珀酸是由所述乳酸菌产生的内源性的有机酸。

14.根据权利要求13所述的发酵乳，其中，所述琥珀酸的含量相对于发酵乳总量为0.15mM以上。

15.根据权利要求12～14中任一项所述的发酵乳，其还包含选自苹果酸和富马酸中的至少1种有机酸。

16.一种乳酸菌的发酵促进方法，其包括在选自苹果酸和富马酸中的至少1种有机酸的存在下进行乳酸菌发酵。

17.根据权利要求16所述的乳酸菌的发酵促进方法，其还包含核酸原料。

18.一种制造乳酸菌发酵剂的方法，其包括在选自苹果酸和富马酸中的至少1种有机酸的存在下培养乳酸菌。

19.根据权利要求18所述的方法，其包括在所述有机酸与核酸原料的共存下培养乳酸菌。

20.根据权利要求18或19所述的方法，其中，所述乳酸菌发酵剂包含乳酸菌、及选自苹果酸和富马酸中的至少1种有机酸。

21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述乳酸菌发酵剂还包含琥珀酸。

22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述琥珀酸是由所述乳酸菌产生的内源性的有机酸。

23.一种发酵乳，其中，琥珀酸的含量相对于发酵乳总量为0.15mM以上。

24.根据权利要求23所述的发酵乳，其还包含选自苹果酸和富马酸中的至少1种有机酸。

25.根据权利要求23或24所述的发酵乳，其中，所述琥珀酸是由所述乳酸菌产生的内源性的有机酸。

26.一种乳酸菌发酵代谢物的产生方法，其包括在选自苹果酸和富马酸中的至少1种有机酸的存在下进行乳酸菌发酵。

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