WO2021132418A1 - 乳酸菌の発酵促進剤 - Google Patents

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WO2021132418A1
WO2021132418A1 PCT/JP2020/048328 JP2020048328W WO2021132418A1 WO 2021132418 A1 WO2021132418 A1 WO 2021132418A1 JP 2020048328 W JP2020048328 W JP 2020048328W WO 2021132418 A1 WO2021132418 A1 WO 2021132418A1
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WO
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acid
lactic acid
lactobacillus
fermentation
fermented milk
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PCT/JP2020/048328
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恵理 山本
麻美 土屋
玲子 渡部
佳代 藤原
Original Assignee
株式会社明治
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Priority to JP2023020336A priority patent/JP2023058649A/ja

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A23C9/13—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using additives
    • A23C9/1307—Milk products or derivatives; Fruit or vegetable juices; Sugars, sugar alcohols, sweeteners; Oligosaccharides; Organic acids or salts thereof or acidifying agents; Flavours, dyes or pigments; Inert or aerosol gases; Carbonation methods
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A23C9/123—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt
    • A23C9/1234—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt characterised by using a Lactobacillus sp. other than Lactobacillus Bulgaricus, including Bificlobacterium sp.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus

Definitions

  • the present invention relates to a novel fermentation accelerator for lactic acid bacteria.
  • Patent Document 1 a substance as a raw material for nucleic acid promotes fermentation of lactic acid bacteria
  • Patent Document 2 describes a microbial productivity improver containing an organic acid extract of cruciferous plant seeds as an active ingredient.
  • succinic acid is often used as a food additive because it is an umami substance but also has useful physiological functions such as an effect of suppressing weight gain, an effect of improving glucose tolerance, and an effect of suppressing cancer growth. From the viewpoint of stimulating consumer demand, it is preferable that succinic acid is also produced in fermented milk without using food additives.
  • the present invention provides a new technical means for promoting fermentation of lactic acid bacteria.
  • the present invention also provides new technical means for promoting the production of succinic acid by lactic acid bacteria in fermented milk.
  • the present inventors have recently found that at least one organic acid selected from malic acid and fumaric acid can promote fermentation of lactic acid bacteria. Furthermore, the present inventors have found that the organic acid can promote the production of succinic acid by lactic acid bacteria in fermented milk. The present invention is based on such findings.
  • a fermentation accelerator for lactic acid bacteria which comprises at least one organic acid selected from malic acid and fumaric acid.
  • the fermentation accelerator according to [1] which is used in combination with a nucleic acid raw material.
  • the nucleic acid raw material is at least one selected from the group consisting of formic acid and a compound having a purine skeleton in which a hydrogen atom is bonded to a carbon atom at the 2-position.
  • a lactic acid bacterium starter comprising lactic acid bacteria and at least one organic acid selected from malic acid and fumaric acid.
  • a method for producing fermented milk which comprises fermenting lactic acid bacteria in the presence of at least one organic acid selected from malic acid and fumaric acid.
  • nucleic acid raw material is at least one selected from a compound having a purine skeleton in which a hydrogen atom is bonded to formic acid and a carbon atom at the 2-position.
  • the fermented milk contains succinic acid.
  • the succinic acid is an endogenous organic acid produced by the lactic acid bacterium.
  • a fermented milk obtained by the method according to any one of [8] to [12]. The fermented milk containing lactic acid bacteria and succinic acid.
  • [18] The method for promoting fermentation of lactic acid bacteria according to [17], which further comprises a nucleic acid raw material.
  • a method for producing a lactic acid bacterium starter which comprises culturing a lactic acid bacterium in the presence of at least one organic acid selected from malic acid and fumaric acid.
  • the method according to [20] which comprises culturing lactic acid bacteria in the coexistence of the organic acid and a nucleic acid raw material.
  • the lactic acid bacterium starter comprises a lactic acid bacterium and at least one organic acid selected from malic acid and fumaric acid.
  • the lactic acid bacterium starter further contains succinic acid.
  • the succinic acid is an endogenous organic acid produced by the lactic acid bacterium.
  • Fermented milk having a succinic acid content of 0.15 mM or more with respect to the total amount of fermented milk.
  • the fermented milk according to [25] further comprising at least one organic acid selected from malic acid and fumaric acid.
  • [30] A method for promoting the production of lactic acid bacterium fermentation metabolites, which comprises fermenting lactic acid bacteria in the presence of at least one organic acid selected from malic acid and fumaric acid (hereinafter, also referred to as "production promotion method"). To do).
  • production promotion method also referred to as "production promotion method”.
  • [31] The method according to [30], wherein the lactic acid bacterium fermentation metabolite is extracellular polysaccharide (EPS).
  • EPS extracellular polysaccharide
  • the present invention fermentation of lactic acid bacteria can be promoted. Further, according to the present invention, the amount of succinic acid produced in fermented milk can be increased. INDUSTRIAL APPLICABILITY
  • the present invention can be advantageously utilized in promoting fermentation and metabolism of lactic acid bacteria and producing fermentation metabolites such as extracellular polysaccharides (EPS) and peptides in a short time. Further, the present invention can be advantageously used in increasing the amount of succinic acid produced by lactic acid bacteria and reducing the amount of succinic acid added as a food additive.
  • EPS extracellular polysaccharides
  • FIG. 1 is a chart showing the change in EPS concentration with respect to the culture time of Test Example 9.
  • the fermentation accelerator for lactic acid bacteria of the present invention is characterized in that it contains at least one organic acid selected from malic acid and fumaric acid.
  • the content of at least one organic acid selected from malic acid and fumaric acid in the fermentation accelerator is not particularly limited, and is, for example, 0.1 to 100% by mass, preferably 50 to 100% by mass. , More preferably 80 to 100% by mass.
  • a commercially available product as a food additive may be used, or a synthetic product, a preparation containing an organic acid, or the like may be used.
  • the fermentation accelerator may contain either an organic acid of malic acid or fumaric acid, or may contain both.
  • the mass ratio of malic acid to fumaric acid is not particularly limited, but is, for example, 0.1 to 10, preferably 0.2 to 5, and more preferably 0.5 to 0.5. It is 2, and even more preferably 0.6 to 1.5.
  • the form of malic acid in the malic acid fermentation accelerator is not particularly limited as long as it does not interfere with the effects of the present invention, and may be contained in the agent in either form of free acid or salt.
  • examples of such salts include alkali metal salts such as potassium and sodium, and alkaline earth metal salts such as calcium and magnesium.
  • the malic acid used for culturing may be an optical isomer, but is preferably L-malic acid.
  • the amount of malic acid or a salt thereof is, for example, in the range of 0.001 to 75 mM, preferably 0.01 to 50 mM, more preferably 0.1 to 10 mM, still more preferably, based on the total amount of the medium or raw milk. Can be added in an amount of 0.5-10 mM. Therefore, malic acid is preferably contained in the fermentation accelerator in the above amount.
  • the total amount of the medium or raw milk is the total amount of all the components other than the bacteria used for culturing, and is, for example, the total amount of the medium or raw milk, malic acid and / or fumaric acid, and the nucleic acid raw material.
  • the content of malic acid in the culture system of the present invention is measured by a high performance liquid chromatography (HPLC) method.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • Such a measurement can be carried out by using a commercially available HPLC apparatus (for example, manufactured by Shimadzu Corporation) and a column (for example, ICSep ICE-ORH-801 (TRANSGENOMIC)). More specifically, the above measurement can be performed under the following conditions.
  • Analyzer LC20 system manufactured by Shimadzu Corporation, Column: ICSep ICE-ORH-801, 6.5 mm I.D. D.
  • the form of fumaric acid in the fumaric acid fermentation accelerator is not particularly limited as long as it does not interfere with the effects of the present invention, and may be contained in the agent in either form of free acid or salt.
  • Examples of such salts include alkali metal salts such as potassium and sodium, alkaline earth metal salts such as calcium, and ammonium salts.
  • the content of fumaric acid or a salt thereof is, for example, 0.001 to 10 mM, preferably 0.01 to 7.5 mM, more preferably, with respect to the total amount of the medium or raw milk. It can be added in an amount of 0.1 to 5 mM, more preferably 0.1 to 2.5 mM. Therefore, it is preferable that fumaric acid is contained in the fermentation accelerator of the present invention in the above amount.
  • the content of fumaric acid in the culture system of the present invention can be measured by the same method as malic acid.
  • the fermentation accelerator of the present invention is preferably used in combination with a nucleic acid raw material from the viewpoint of more effectively promoting fermentation of lactic acid bacteria.
  • the nucleic acid raw material may be contained as a constituent component of the fermentation accelerator or may be used as a separate substance.
  • the nucleic acid raw material is not particularly limited as long as it does not interfere with the effects of the present invention, and preferred examples include formic acid and a compound having a purine skeleton in which a hydrogen atom is bonded to a carbon atom at the 2-position.
  • Formic acid is known as a raw material that constitutes the purine skeleton of nucleic acids.
  • the form of formic acid is not particularly limited as long as it does not interfere with the effects of the present invention, and may be contained in the agent in either form of free acid or salt.
  • Examples of such salts include alkali metal salts such as potassium and sodium, alkaline earth metal salts such as calcium, and ammonium salts.
  • the content of formic acid in the culture system of the present invention can be measured in the same manner as malic acid.
  • a compound having a purine skeleton has the following structure (purine skeleton): [The numbers in formula (I) represent the position numbers of carbon or nitrogen atoms] Indicates a substance having as a basic skeleton.
  • Compounds having a purine skeleton are also generally referred to as purines.
  • Compounds having a purine skeleton typically include purine bases, purine nucleosides, purine nucleotides, or salts thereof.
  • the compound having a purine skeleton used as a nucleic acid raw material of the present invention has a purine skeleton in which a hydrogen atom is bonded to a carbon atom at the 2-position of the purine skeleton (the carbon atom represented by 2 in the above formula (I)).
  • Such compounds include adenine and hypoxanthine (purine bases), purine nucleosides containing adenine and hypoxanthine as components, purine nucleotides containing adenine or hypoxanthine as components, and salts thereof.
  • the purine nucleoside is a substance in which a purine base and a sugar (ribose, deoxyribose, etc.) are bound, and may be a ribonucleoside or a deoxyribonucleoside.
  • Purine nucleosides containing adenine or hypoxanthine as components include, for example, adenosine and inosin (ribonucleoside), and deoxyadenosine and deoxyinosine (deoxyribonucleoside).
  • a purine nucleotide is a substance in which one or more phosphate groups are bonded to a purine nucleoside, and may be a ribonucleotide or a deoxyribonucleotide.
  • Purine nucleotides may be nucleoside monophosphates (nucleoside monophosphates), nucleoside diphosphates, or nucleoside triphosphates.
  • purine nucleotides containing adenine or hypoxanthin as components include adenylic acid (adenosine monophosphate or adenosine monophosphate; AMP), adenosine diphosphate (ADP), adenosine triphosphate (ATP), and deoxyadenosine monophosphate.
  • adenylic acid adenosine monophosphate or adenosine monophosphate
  • ADP adenosine diphosphate
  • ATP adenosine triphosphate
  • dAMP deoxyadenosine diphosphate
  • dATP deoxyadenosine triphosphate
  • inosinic acid inosinic acid or inosin monophosphate
  • IMP inosin diphosphate
  • IDP inosin triphosphate Acids
  • ITP deoxyinosinic monophosphate
  • dIDP deoxyinosin diphosphate
  • dITP deoxyinosin triphosphate
  • a compound having a purine skeleton in which a hydrogen atom is bonded to a carbon atom at the 2-position also includes a purine base, a purine nucleoside, or a derivative of a purine nucleotide.
  • the "derivative" refers to a compound in which a purine base, a purine nucleoside or a purine nucleotide portion, a sugar residue portion, and / or a phosphate group portion is chemically modified or a substituent is introduced.
  • the compound having a purine skeleton in which a hydrogen atom is bonded to a carbon atom at the 2-position may be a salt, for example, adenine, hypoxanthine, or a salt of a purine nucleoside or purine nucleotide containing adenine or hypoxanthine as a component.
  • preferred salts are alkali metal salts (eg, sodium salts, potassium salts), including, but not limited to, sodium adenylate and sodium inosinate.
  • the compound having a purine skeleton in which a hydrogen atom is bonded to a carbon atom at the 2-position is selected from the group consisting of, for example, adenine, hypoxanthine, adenosine, inosine, deoxyadenosine, deoxyadenosine, adenylic acid, inosinic acid, and salts thereof. It is preferably inosinic acid.
  • the content of inosinic acid in the culture system of the present invention can be measured using a kit by a fluorescence method, Inosine Assay Kit, and CELL BIOLABBS.
  • the fermentation accelerator of the present invention uses at least one compound having a purine skeleton in which a hydrogen atom is bonded to the carbon atom at the 2-position, preferably 1 to 4, for example, 1 to 3 or 1 to 2 in combination. You may.
  • the mass ratio of the organic acid to the nucleic acid raw material is not particularly limited, and is, for example, 0.005 to 500, preferably 0.05 to 200. It is more preferably 0.1 to 100.
  • the nucleic acid raw material contains an amount in which the content of the nucleic acid raw material is, for example, in the range of 0.001 to 75 mM, preferably 0.01 to 50 mM, and more preferably 0.1 to 10 mM with respect to the total amount of the medium or raw milk. , More preferably, it can be added in an amount of 0.5 to 2 mM.
  • the agent of the present invention can be provided as an agent containing the above-mentioned components and optionally food hygiene or pharmaceutically acceptable additives.
  • aqueous media such as water, solvents, solubilizers, lubricants, emulsifiers, tonicity agents, stabilizers, preservatives, preservatives, surfactants , Regulators, chelating agents, pH regulators, buffers, excipients, thickeners, colorants, fragrances or fragrances and the like.
  • the agent of the present invention may be in any form such as liquid, powder, granule, gel, solid, capsule inclusion body and the like.
  • the fermentation accelerator can be produced by appropriately mixing at least one organic acid selected from malic acid and fumaric acid with other optional components such as nucleic acid, and the resulting mixture is further added to a solvent. Dissolution, powdering, granulation, gelation, solidification, encapsulation and the like can be processed according to a known formulation technique.
  • the fermentation promoting action of the present invention involves culturing and fermenting lactic acid bacteria in raw milk to which a fermentation accelerator has been added, examining an index indicating the progress of the fermentation state, and as a result, a control (without adding the fermentation accelerator of the present invention). It can be confirmed by the fact that the fermentation is proceeding faster than the group).
  • the index indicating the progress of the fermentation state is not particularly limited, but for example, a decrease in the pH value of fermented milk accompanying an increase in the amount of lactic acid produced by fermentation of lactic acid bacteria can be used as an index.
  • the pH is, for example, pH 4.6.
  • pH 4.6 can be set as a pH at which fermentation is sufficiently performed in the production of normal fermented milk and fermentation is completed.
  • the pH can be measured using a commercially available pH meter.
  • the lactic acid bacteria used for fermentation are not particularly limited as long as they do not interfere with the effects of the present invention, and may be of animal origin or plant origin.
  • Preferred lactic acid bacteria of the present invention include Lactobacillus spp., Streptococcus spp., Lactococcus spp., Enterococcus spp., Enterococcus spp., Leuconostock spp. Combinations can be mentioned, but lactic acid bacteria containing Lactobacillus spp. Are preferred. Examples of lactic acid bacteria containing Lactobacillus include Lactobacillus, a combination of Lactobacillus and Streptococcus, a combination of Lactobacillus and Lactococcus, and the like. These lactic acid bacteria can be obtained from, for example, a storage organization such as ATCC, or commercially available ones can be used as appropriate.
  • Lactobacillus spp. are Lactobacillus delbruecchii, Lactobacillus acidofilus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus gasseri (Lactobacillus reuteri), Lactobacillus salivalius, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus kefilanofacilus Lactobacillus jhonsii, Lactobacillus casei, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus amilovacillus lavactobacillus amyloves , And Lactobacillus sakei.
  • Lactobacillus spp. are Lactobacillus delbrucky, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus ramnosus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus salibarius, Lactobacillus pentosas and the like.
  • the preferred Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus ramnosus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus salivalius and Lactobacillus pentosas are Lactobacillus acidophilus JCM 1132T strain and Lactobacillus gasseri JCM, respectively.
  • Examples include 1131T strain, Lactobacillus ramnosus JCM 1136T strain, Lactobacillus reuteri JCM 1112T strain, Lactobacillus salivalius JCM 1231T strain, and Lactobacillus pentosas JCM 1558T strain.
  • Lactobacillus delbrucky for example, Lactobacillus delbruecchii subsp. Bulgaricus (Lactobacillus delbruckii subspecies bulgarix; Lactobacillus delbruecchii subsp.). Lactis (Lactobacillus delbrucky subspecies lactis), Lactobacillus delbruecchii subsp. Delbruecchii (Lactobacillus delbrucky subspecies delbrucky), Lactobacillus delbruecchii subsp. Indicus (Lactobacillus delbrucky Subspecies Indicators) and the like can be mentioned.
  • Lactobacillus del Brooky is Lactobacillus del Brooky subspecies bulgaricus, and more preferably Lactobacillus delbrucky subspecies bulgaricus (2038 strain, OLL 1073R-1 strain, P1902901 strain). , OLL1171 strain, OLL1255 strain, OLL1247 strain, OLL205013 strain) and the like.
  • Lactobacillus kefilanofaciens include Lactobacillus kefiranofaciens subsp.
  • Kefirgranum (Lactobacillus kefirano faciens subspecies kefir granum) and the like can be mentioned, with preference given to Lactobacillus kefirano faciens subspecies kefir granum JCM 8572T and the like.
  • Lactobacillus acidophilus JCM 1132T strain Lactobacillus gasseri JCM 1131T strain, Lactobacillus ramnosus JCM 1136T strain, Lactobacillus reuteri JCM 1112T strain, Lactobacillus salivalius JCM 1231T strain, Lactobacillus pentos Lactobacillus kefilanofaciens subspecies kefiagranum JCM 8572T strain is from Japan Collection of Microorganisms (RIKEN BRC-JCM, Japan), Bioresource Center (RIKEN BRC), Incorporated Administrative Agency. , Can be obtained under the accession numbers JCM 1132T, JCM 1131T, JCM 1136T, JCM 1112T, JCM 1231T, JCM 1558T, and JCM 8572T, respectively.
  • Lactobacillus delbrucky subspecies bulgaricus 2038 strain can be isolated from "Meiji Bulgaria Yogurt” (registered trademark) in a commercially available selective medium for the genus Lactobacillus, Meiji Innovation Center Co., Ltd. ( ⁇ 192). -0919 Meiji Innovation Center, 1-29-1, Nanakuni, Hachioji-shi, Tokyo, Japan).
  • Lactobacillus del Brooky Subspecies Bulgarics OLL 1073R-1 strain was issued on February 22, 1999 by the Incorporated Administrative Agency Industrial Technology Research Institute Patent Organism Depositary Center (1-1-1, Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan). It was deposited in 6), then transferred to an international deposit, and the deposit number FERM BP-10741 was given.
  • Budapest Notification No. As described in 282 (http://www.wipo.int/treaties/en/notifications/budapest/treaty_budapest_282.html), the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (IPOD, NITE) is an independent administrative agency.
  • Lactobacillus delbrucky Subspecies Bulgalix P1902901 shares are stored by Meiji Innovation Center Co., Ltd. (Meiji Innovation Center, 1-27-1, Hachioji City, Hachioji City, Japan 192-0919).
  • Lactobacillus delbrucky Subspecies Bulgarics OLL1171 strain was sent to the Patent Microorganisms Depositary Center of the National Institute of Technology and Evaluation, which is an international depositary authority based on the provisions of the Butabest Treaty, on March 13, 2013, NITE BP- It has been deposited internationally as 01569.
  • Lactobacillus delbrucky Subspecies Bulgarics OLL1255 strain was sent to the Patent Microorganisms Depositary Center of the National Institute of Technology and Evaluation, which is an international depositary authority based on the provisions of the Butabest Treaty, on February 10, 2005, NITE BP- It has been deposited internationally as 76.
  • Lactobacillus delbrucky Subspecies Bulgarics OLL1247 strain was sent to the Patent Microorganisms Depositary Center of the National Institute of Technology and Evaluation, which is an international depositary authority based on the provisions of the Butabest Treaty, on March 6, 2014, NITE BP- It has been deposited internationally as 0814.
  • Lactobacillus delbrucky Subspecies Bulgarics OLL205013 strain was sent to the Patent Microorganisms Depositary Center of the National Institute of Technology and Evaluation, which is an international depositary authority based on the provisions of the Butabest Treaty, on February 3, 2017, NITE BP- It has been deposited internationally as 02411.
  • Streptococcus spp examples include Streptococcus thermophilus.
  • Lactococcus spp examples include Lactococcus lactis, Lactococcus plantarum, and Lactococcus raffinolactis.
  • Lactobacillus spp. And Streptococcus spp. Is preferably Lactobacillus delbrucky subspecies bulgaricus and Streptococcus thermophilus.
  • the mixing ratio of lactic acid bacteria, at least one organic acid selected from malic acid and fumaric acid, and nucleic acid raw materials is appropriately set according to the types and properties of lactic acid bacteria, medium, raw milk, temperature conditions, and other fermentation conditions. You may.
  • the mass ratio (lactic acid bacterium / organic acid) of lactic acid bacteria to at least one organic acid selected from malic acid and fumaric acid is, for example, 0.001 to 500,000, preferably 0.01 to 5,000, and more. It is preferably 0.1 to 500.
  • the mass ratio of the lactic acid bacterium to the nucleic acid raw material is, for example, 0.1 to 11000, preferably 1 to 11000, more preferably 10 to 1100, and further preferably 50 to 50. It is 550.
  • the amount of lactic acid bacteria is, for example, 0.001% by mass to 5% by mass, preferably 0.01% by mass to 2.5% by mass, and more preferably 0.01% by mass to 2% by mass, based on the total amount of the medium or raw milk. Even more preferably, it can be added in an amount of 0.1% by mass to 1% by mass.
  • Lactic Acid Bacteria Starter The organic acid selected from malic acid and fumaric acid as described above can be used as a lactic acid bacterium starter by using lactic acid bacteria together. Therefore, according to a preferred embodiment of the present invention, there is provided a lactic acid bacterium starter comprising a lactic acid bacterium and at least one organic acid selected from malic acid and fumaric acid.
  • the lactic acid bacterium starter includes a lactic acid bacterium prepared by culturing the lactic acid bacterium in a medium (for example, an activation medium) and undergoing intermediate fermentation.
  • the lactic acid bacterium starter preferably contains a lactic acid bacterium and a medium in which the lactic acid bacterium is cultured as a component. Therefore, the lactic acid bacterium starter may further contain succinic acid.
  • the succinic acid is preferably an endogenous organic acid produced by the lactic acid bacterium.
  • the lactic acid bacterium starter In addition to the lactic acid bacterium starter that is directly inoculated into the raw milk that is the source of fermented milk, the lactic acid bacterium starter is inoculated into another medium to further grow (scale up) the lactic acid bacterium. Is included.
  • Lactic acid bacteria starter is basically used to ferment raw milk to obtain fermented milk.
  • the lactic acid bacterium starter obtained by the present invention is further cultured in a medium at least once and then cultured. It also includes inoculating the raw milk with a later next-generation lactic acid bacterium starter.
  • the lactic acid bacterium starter may be used in combination with the nucleic acid raw material. Therefore, according to another aspect of the present invention, there is provided a lactic acid bacterium starter comprising a lactic acid bacterium and at least one organic acid selected from malic acid and fumaric acid for use in combination with a nucleic acid raw material.
  • the lactic acid bacterium starter is preferably used in combination with the nucleic acid raw material.
  • the nucleic acid raw material may be added to the medium or raw milk as a separate substance together with the lactic acid bacterium starter, and the nucleic acid raw material is mixed with the lactic acid bacterium starter as a constituent component. And may be used integrally.
  • the lactic acid bacterium starter may contain a nucleic acid raw material.
  • Each aspect of malic acid, fumaric acid, nucleic acid raw material, and lactic acid bacterium in the lactic acid bacterium starter can be the same as the description regarding the fermentation accelerator of the present invention.
  • the viable number of lactic acid bacteria in the lactic acid bacterium starter is not particularly limited, but is, for example, 1.0 ⁇ 10 4 to 1.0 ⁇ 10 13 cfu / g, preferably 1.0 ⁇ 10 5 to 1.0 ⁇ 10. It is 12 cfu / g, more preferably 1.0 ⁇ 10 6 to 1.0 ⁇ 10 11 cfu / g.
  • the mass ratio of lactic acid bacteria to organic acid in the lactic acid bacterium starter, the mass ratio of lactic acid bacteria to nucleic acid raw material, the mass ratio of organic acid to nucleic acid raw material, and the mass ratio of malic acid and fumaric acid in organic acid are the mass ratios in the above fermentation accelerator. It can be similar to the ratio.
  • the lactic acid bacterium starter can be produced from the lactic acid bacterium and an arbitrary component such as the above-mentioned organic acid, a nucleic acid raw material, and a medium component.
  • an arbitrary component such as the above-mentioned organic acid, a nucleic acid raw material, and a medium component.
  • a preferred method for producing a lactic acid bacterium starter includes a medium preparation step, a medium sterilization step, a lactic acid bacterium inoculation step, a culture step (medium fermentation step), and an organic acid addition step.
  • the medium preparation step is a step of preparing a medium for inoculating lactic acid bacteria (for example, an activation medium).
  • the medium is not particularly limited as long as it does not interfere with the effect of the present invention, and examples thereof include a medium containing a milk component, for example, skim milk, skim milk concentrate, skim milk powder (reduced skim milk), and proteins of these skim milk components.
  • a medium containing skim milk, skim milk powder, whey, whey powder and the like is even more preferable.
  • the said medium may be the same as the raw material milk described later.
  • the medium preferably further contains yeast extract.
  • the medium can be prepared by a known method such as mixing, dissolving, dispersing, and suspending each of the above components.
  • the medium sterilization step is a step of sterilizing the medium prepared in the medium preparation step by, for example, heating.
  • the heating temperature and the heating time may be adjusted to the extent that various germs in the medium can be sterilized.
  • a known method can be used for heat sterilization.
  • heat treatment may be performed by a plate type heat exchanger, a tube type heat exchanger, a steam injection type heating device, a steam infusion type heating device, an energization type heating device, an autoclave device, etc.
  • Heat treatment may be performed by the tank.
  • the sterilization of the medium is not limited to heating, and can also be performed by a known method such as irradiation with ultraviolet rays.
  • the lactic acid bacterium addition (inoculation) step is a step of adding (inoculating) lactic acid bacteria to the sterilized medium.
  • frozen bacteria for example, freeze-concentrated bacteria, frozen pellets, freeze-dried powder, etc.
  • the lactic acid bacterium addition step the lactic acid bacterium is preferably added in an amount of 0.05% by mass or more, more preferably 0.05 to 10% by mass, and 0.1 to 5% by mass with respect to the medium. It is more preferable to add it.
  • the culturing step is a step of culturing lactic acid bacteria in a medium, growing the lactic acid bacteria, and obtaining a lactic acid starter.
  • the culture time of the lactic acid bacterium is not particularly limited, but may be, for example, 3 to 36 hours, preferably 5 to 30 hours, and more preferably 10 to 24 hours.
  • the above-mentioned culturing time means one culturing time.
  • the temperature of the medium is preferably maintained in the fermentation temperature range of 30 ° C. or higher.
  • the temperature of the medium is preferably maintained at 30 to 50 ° C, more preferably 35 to 50 ° C.
  • "standing” means not stirring the medium. For example, even when moving the container containing the medium, if the inside of the medium is not stirred, "standing". Corresponds to. In this way, by allowing the medium to stand during the culturing step, the growth of lactic acid bacteria can be promoted and the time until the end of culturing can be shortened.
  • the organic acid addition step is a step of adding at least one organic acid selected from malic acid and fumaric acid and, if desired, a nucleic acid raw material.
  • the organic acid addition step may be carried out at any time before the culturing step, during the culturing step, or after the culturing step, but from the viewpoint of shortening the culturing time, it should be carried out before the culturing step or during the culturing step. Is preferable.
  • the step of adding an organic acid or the like can be carried out, for example, by collecting a predetermined amount of lactic acid bacteria or a lactic acid bacterium-containing medium thereof after the culturing step, and adding an organic acid and a nucleic acid raw material to the lactic acid bacterium or the lactic acid bacterium-containing medium as desired. it can. Further, the step of adding the organic acid or the like may be carried out, for example, by adding the organic acid and, if desired, the nucleic acid raw material to the medium before or during the culturing step.
  • the period before the culturing step is not particularly limited, and may be any time before the medium sterilization step, after the medium sterilization step, before the lactic acid bacterium addition step, after the lactic acid bacterium addition step, and at the same time as the lactic acid bacterium addition. May be good. It is preferable that the organic acid to be added is dissolved in water and the pH is adjusted to 6.0 to 7.0.
  • fermented milk can be efficiently produced by using the above-mentioned fermentation accelerator or lactic acid bacterium starter.
  • “fermented milk” includes “fermented milk”, “dairy product lactic acid bacteria beverage”, and “lactic acid bacteria beverage” defined by the ministry ordinance (Ministry Ordinance on Milk, etc.) concerning component standards of milk and dairy products.
  • fermented milk includes raw milk, milk, special milk, raw goat milk, sterilized goat milk, raw noodle milk, ingredient-adjusted milk, low-fat milk, non-fat milk, processed milk, etc.
  • Milk containing milk solids is fermented with lactic acid bacteria or yeast to make it paste-like or liquid, or frozen, and these include hard yogurt, soft yogurt (paste-like fermented milk), or drink yogurt (paste-like fermented milk). Liquid fermented milk) is included.
  • hard yogurt such as plain yogurt is produced by filling a container with raw materials and then fermenting (post-fermentation) (also referred to as “set yogurt”).
  • soft yogurt and drink yogurt are produced by atomizing or homogenizing fermented fermented milk (pre-fermented) and then filling it in a container (also referred to as “stirring yogurt”).
  • succinic acid is contained in fermented milk in a high content by fermenting lactic acid bacteria in the presence of malic acid, fumaric acid, and optionally a nucleic acid raw material, without using food additives.
  • a fermented milk containing lactic acid bacteria and succinic acid, wherein the succinic acid is an endogenous organic acid produced by the lactic acid bacteria. ..
  • the content of succinic acid in the fermented milk is, for example, 0.15 mM or more, preferably 0.2 mM or more, more preferably 0.7 mM or more, still more preferably 1 mM or more, still more preferably 3 mM or more with respect to the total amount of fermented milk. It is said that.
  • the preferred lower limit of the succinic acid content in the fermented milk of the present invention is 0.15 mM, preferably 1 mM, more preferably 3 mM, and the preferred upper limit is 50 mM, more preferably 20 mM, even more preferably 15 mM.
  • the succinic acid content in the fermented milk is preferably 1 mM or more with respect to the total amount of the fermented milk, for example. Is 1.5 mM or more, more preferably 3 mM or more.
  • the succinic acid content in the fermented milk is, for example, 0.5 mM or more, preferably 1 mM or more with respect to the total amount of fermented milk.
  • the succinic acid content in the fermented milk is, for example, 0.15 mM or more, preferably 0.2 mM or more, based on the total amount of the fermented milk.
  • the content of succinic acid in the fermented milk of the present invention is measured by a high performance liquid chromatography (HPLC) method.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • Such measurement can be easily performed by using a commercially available HPLC apparatus (for example, manufactured by Shimadzu Corporation) and a column (for example, ICSep ICE-ORH-801 (TRANSGENOMIC)). The measurement can be performed under the following conditions, for example.
  • Analyzer LC20 system manufactured by Shimadzu Corporation, Column: ICSep ICE-ORH-801, 6.5 mm I.D. D. ⁇ 300 mm, used by connecting two, mobile phase: 7.5 mM p-toluenesulfonic acid, reaction solution: 7.5 mM p-toluenesulfonic acid, 150 ⁇ M EDTA (2NA), 30 mM Bis Tris, flow velocity: 0.5 ml / min, injection volume: 10 ⁇ l, oven temperature: 55 ° C., detection: electrical conductivity detector.
  • Fermented milk may contain malic acid, fumaric acid, and a nucleic acid raw material because it is suitably produced in the presence of an organic acid such as malic acid or fumaric acid, and if desired, a nucleic acid raw material.
  • the content of malic acid in fermented milk is, for example, 0.1 to 50 mM, preferably 0.1 to 45 mM, and more preferably 0.5 to 45 mM.
  • the content of fumaric acid in the fermented milk is, for example, 0.1 to 10 mM, preferably 0.1 to 5 mM, and more preferably 0.5 to 1 mM.
  • the content of the nucleic acid raw material in the fermented milk is, for example, 0.0001 to 5% by mass, preferably 0.0001 to 1.5% by mass.
  • the fermented milk of the present invention contains more than twice as much succinic acid as the fermented milk to which at least one organic acid selected from malic acid and fumaric acid is not added at the time of production, and is preferably 2. It contains 5 times or more, more preferably 5 times or more. The upper limit is 30 times, preferably 20 times.
  • fermented milk can be produced using the above fermentation accelerator or lactic acid bacterium starter in the presence of organic acids such as malic acid and fumaric acid, and nucleic acid raw materials. Therefore, there is provided a method for producing fermented milk comprising fermenting raw milk with lactic acid bacteria in the presence of at least one organic acid selected from malic acid and fumaric acid. Further, according to a preferred embodiment, the method for producing fermented milk is to ferment lactic acid bacteria in the coexistence of the organic acid and the nucleic acid raw material. More specifically, the method for producing fermented milk preferably includes a raw milk preparation step, a raw milk sterilization step, a lactic acid bacterium starter inoculation step, and a fermentation step.
  • the raw milk preparation process is a step of preparing raw milk to be inoculated with a lactic acid bacterium starter.
  • "Raw milk” is a raw material for fermented milk such as yogurt, and is also called yogurt mix or fermented milk mix. In the present invention, known raw milk can be used as appropriate.
  • Raw milk includes both pre-sterilized and post-pasteurized milk.
  • raw milk Specific raw materials for raw milk include raw milk, sterilized milk, skim milk, full-fat milk powder, skim milk powder, buttermilk, butter, cream, whey protein concentrate (WPC), and whey protein isolate (WPI).
  • WPC whey protein concentrate
  • WPI whey protein isolate
  • ⁇ (alpha) -lactoalbumin (La), ⁇ (beta) -lactoglobulin (Lg) and the like may be included. Pre-warmed gelatin or the like may be added as appropriate.
  • Raw milk is known and can be prepared according to known methods.
  • Preferred raw milk includes, but is not limited to, raw milk, skim milk, skim milk powder, and cream. More preferable raw material milks include skim milk and skim milk powder.
  • the content of non-fat milk solids in the raw milk used in the present invention is not particularly limited as long as it does not interfere with the effects of the present invention, and is preferably 6 to 11% by mass, more preferably 7 to 10% by mass. is there.
  • the fat content in the raw milk is not particularly limited as long as it does not interfere with the effects of the present invention, and is preferably 0.01 to 10% by mass, more preferably 0.05 to 5% by mass, and even more preferably. Can exemplify 0.1 to 3% by mass, but is not limited thereto.
  • the raw milk sterilization step is a step of sterilizing the raw milk prepared in the raw milk preparation step by, for example, heating.
  • the raw milk is preferably sterilized. Examples of such sterilization include sterilization by heating.
  • the sterilization the heating temperature and the heating time can be adjusted to the extent that various germs in the raw material milk can be sterilized. For example, it is preferable to sterilize the raw milk at a temperature of 80 ° C. or higher, preferably 90 ° C. or higher.
  • a known method can be used for the heat treatment.
  • the lactic acid bacterium starter inoculation step is a step of inoculating (adding) the lactic acid bacterium starter to the above raw material milk.
  • a lactic acid bacterium starter obtained through the method for producing the lactic acid bacterium starter, a lactic acid bacterium starter prepared by a usual method and frozen, or a lactic acid bacterium starter dried after freezing can be used.
  • At least one organic acid selected from malic acid and fumaric acid and a nucleic acid raw material as an optional component are preferably added to the raw material milk as a constituent component in the lactic acid bacterium starter, but separately from the lactic acid bacterium starter. It may be contained in raw milk as an additive or as an intrinsic component.
  • the amount of each component of the lactic acid bacterium, the organic acid, and the nucleic acid raw material added to the raw material milk can be the same as the amount described in the above fermentation accelerator.
  • the fermentation process is a process of fermenting raw milk with a lactic acid bacterium starter.
  • the raw milk inoculated with the lactic acid bacterium starter is fermented while maintaining the fermentation temperature range to obtain fermented milk.
  • a known method can be used for the fermentation step. Fermentation conditions such as fermentation temperature can be appropriately adjusted in consideration of the types of raw milk and lactic acid bacteria (lactic acid bacteria starter), the type and flavor of the fermented milk to be prepared, and the like.
  • the fermentation temperature is about 30 to 50 ° C. If the temperature is within this range, lactic acid bacteria are generally easy to act, so that fermentation can be effectively promoted.
  • the fermentation temperature at this time is preferably about 30 to 45 ° C, more preferably about 35 to 43 ° C.
  • the fermentation time may be appropriately adjusted according to the lactic acid bacteria (lactic acid bacteria starter) used, the fermentation temperature, and the like.
  • the fermentation time can be adjusted by using the pH in the fermented milk as an index of 4.6.
  • the fermentation time is not limited, but may be, for example, 2 hours to 36 hours, preferably 2.5 hours to 24 hours, and more preferably 4 hours to 24 hours.
  • the pH can be measured using a commercially available pH meter.
  • the apparatus for producing fermented milk and the production conditions known ones can be used.
  • the post-fermented product has a fermentation chamber for fermenting after filling, and the pre-fermented product has a fermentation tank for fermenting and a line filter or homogenizer for crushing fermented milk curds.
  • a deoxidizer or the like can be appropriately adopted as a manufacturing condition.
  • succinic acid contained in fermented milk is an umami substance and is an organic acid having useful physiological functions such as weight gain suppressing action, glucose tolerance improving action, and cancer growth suppressing action. Therefore, according to one embodiment, the fermented milk of the present invention has a composition for improving umami, suppressing weight gain, improving glucose tolerance, or suppressing cancer growth. Provided as a thing.
  • At least one organic acid selected from malic acid and fumaric acid can be optionally combined with a nucleic acid raw material to promote fermentation of lactic acid bacteria. Therefore, according to another aspect of the present invention, a medium (for example, a medium containing a milk component) or raw milk is fermented by lactic acid bacteria in the presence of at least one organic acid selected from malic acid and fumaric acid.
  • a method for promoting fermentation of lactic acid bacteria is provided. Further, according to another preferred embodiment, the method for promoting fermentation of lactic acid bacteria includes fermenting lactic acid bacteria in the coexistence of the organic acid and the nucleic acid raw material.
  • a medium for example, a medium containing a milk component
  • a raw material milk or the like is fermented with lactic acid bacteria in the presence of at least one organic acid selected from malic acid and fumaric acid.
  • a method for producing or promoting the production of a lactic acid bacterium fermentation metabolite, which comprises the above, is provided. Further, according to another preferred embodiment, the method comprises fermenting lactic acid bacteria in the coexistence of the organic acid and the nucleic acid raw material.
  • the fermentation metabolite include succinic acid, extracellular polysaccharide (EPS), peptide and the like, and more preferably extracellular polysaccharide (EPS).
  • At least one organic acid selected from malic acid and fumaric acid for promoting fermentation of lactic acid bacteria is provided.
  • the organic acid is fermented by lactic acid bacteria in the coexistence of a nucleic acid raw material.
  • the use of at least one organic acid selected from malic acid and fumaric acid is provided in the production of a fermentation accelerator for lactic acid bacteria.
  • the said organic acid is used in combination with a nucleic acid raw material.
  • the use of at least one organic acid selected from malic acid and fumaric acid in the production of a lactic acid bacterium starter is provided.
  • the said organic acid is used in combination with a nucleic acid raw material.
  • the use of at least one organic acid selected from malic acid and fumaric acid in the production of fermented milk, in which lactic acid bacteria are fermented in the presence of the organic acid is provided that includes.
  • the said organic acid is used in combination with a nucleic acid raw material.
  • the fermented milk comprises succinic acid, which may be an endogenous organic acid produced by lactic acid bacteria.
  • Test Example 1 Lactobacillus delbruecchii subsp. Of malic acid or fumaric acid. Examination of fermentation promoting effect on bulgaricus (hereinafter, also referred to as "L. bulgaricus”) First, the following Lactobacillus delbruecchii subsp. Frozen bacteria of the bulgaricus strain were prepared. (1) Lactobacillus delbruecchii subsp. bulgaricus 2038 (hereinafter also referred to as "2038”) (2) Lactobacillus delbruecchii subsp. bulgaricus OLL1073R-1 (hereinafter, also referred to as "OLL 1073R-1”) (3) Lactobacillus delbruecchii subsp.
  • bulgaricus P1902901 (hereinafter, also referred to as “P1902901”) (4) Lactobacillus delbruecchii subsp. bulgaricus OLL1171 (hereinafter, also referred to as “OLL1171”) (5) Lactobacillus delbruecchii subsp. bulgaricus OLL1255 (hereinafter, also referred to as “OLL1255") (6) Lactobacillus delbruecchii subsp. bulgaricus OLL1247 (hereinafter, also referred to as “OLL1247”) (7) Lactobacillus delbruecchii subsp. bulgaricus OLL205013 (hereinafter, also referred to as "OLL205013”)
  • the above strain was activated in the activation medium before use.
  • As the activation medium a 10% by mass reduced skim milk medium containing 0.1% by mass yeast extract was sterilized at 121 ° C. for 7 minutes.
  • the 10% by mass reduced skim milk powder is skim milk powder (fat content 1% by mass, protein 34% by mass, lactose 54% by mass, ash content 8% by mass, non-fat milk solid content 96% by mass) (manufactured by Meiji Co., Ltd.). ) Is a 10% by mass aqueous solution (in the above medium, lactose content is 5.4% by mass, non-fat milk solid content is 9.6% by mass).
  • Frozen bacteria were added in an amount of 0.1% by mass (relative to the amount of the activation medium) to the above activation medium, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 16 hours to obtain an activation solution. 0.1% by mass (relative to the amount of activation medium) of the obtained activation solution was added to another activation medium, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 16 hours to obtain a lactic acid bacterium starter.
  • fermentation was carried out using a fermentation medium as the raw material milk.
  • a fumaric acid aqueous solution or a malic acid aqueous solution adjusted to pH about 6.5 with NaOH before sterilization was added so as to have a final concentration of 1 mM.
  • the pH of the fermentation medium was about 6.4.
  • the lactic acid bacterium starter of each strain obtained above was inoculated into the fermentation medium in an amount of 0.5% by mass (relative to the amount of the fermentation medium), statically cultured at 40 ° C., and fermented.
  • the fermentation time was defined as the time required to reach pH 4.6.
  • the pH was measured using a commercially available pH meter.
  • the results obtained are shown in Table 1. From Table 1, by adding malic acid or fumaric acid, L. It can be seen that the fermentation of all 7 bulgaricus strains was promoted. L. The fermentation promoting effects of malic acid and fumaric acid on bulgaricus were almost the same.
  • the fermentation shortening time varied from strain to strain and ranged from 40 minutes to 12 hours and 15 minutes.
  • Test Example 2-1 L. Examination of the concentrations of malic acid and fumaric acid showing a fermentation promoting effect on the bulgaricus 2038 strain Fermentation was carried out using a fermentation medium (raw milk). As the fermentation medium, a 10% reduced skim milk medium to which formic acid was added to a final concentration of 1 mM was sterilized at 95 ° C. was used. Further, to the fermentation medium, a fumaric acid aqueous solution or a malic acid aqueous solution adjusted to pH about 6.5 with NaOH before sterilization was added so as to have the final concentrations shown in Tables 3 and 4. In the above fermentation medium, L.
  • the lactic acid bacterium starter of the bulgaricus 2038 strain was inoculated at 0.5% (relative to the amount of fermentation medium), statically cultured at 40 ° C., and fermented.
  • the fermentation time was defined as the time required to reach pH 4.6.
  • the organic acid concentration after fermentation was measured as follows. 0.4 g of the obtained fermented product (fermented milk) was diluted 2-fold with pure water, and 20 ⁇ L of Calet's Reagent I (53.5% (w / v) zinc sulfate) was added and vortexed, and Calet's Reagent II (17) was added. .2% (w / v) potassium ferrocyanide) was added in an amount of 20 ⁇ l and vortexed. Centrifugated at 4 ° C., 20620 g for 10 minutes, and the supernatant was filtered through a 0.22 ⁇ m filter and analyzed under the conditions shown in Table 2.
  • Test Example 2-2 L. delbruecchii subsp.
  • the strains shown in Tables 6 and 7 were activated before use in a succinic acid production amount activating medium when malic acid and fumaric acid were added in bulgaricus.
  • As the activation medium a 10% by mass reduced skim milk medium containing 0.1% by mass yeast extract was sterilized at 121 ° C. for 7 minutes.
  • the 10% by mass reduced skim milk powder is skim milk powder (fat content 1% by mass, protein 34% by mass, lactose 54% by mass, ash content 8% by mass, non-fat milk solid content 96% by mass) (manufactured by Meiji Co., Ltd.).
  • Is a 10% by mass aqueous solution in the above medium, lactose content is 5.4% by mass, non-fat milk solid content is 9.6% by mass.
  • Frozen bacteria were added to the above-mentioned activation medium in an amount of 0.1% by mass (relative to the amount of the activation medium) and statically cultured at 37 ° C. for 16 hours to obtain an activation solution. 0.1% by mass (relative to the amount of activation medium) of the obtained activation solution was added to another activation medium, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 16 hours to obtain a lactic acid bacterium starter.
  • fermentation was carried out using a fermentation medium as the raw material milk.
  • a fumaric acid aqueous solution or a malic acid aqueous solution adjusted to pH about 6.5 with NaOH before sterilization was added so as to have a final concentration of 1 mM.
  • the pH of the fermentation medium was about 6.4.
  • the lactic acid bacterium starter of each strain obtained above was inoculated into the fermentation medium in an amount of 2.5% by mass (relative to the amount of the fermentation medium), statically cultured at 40 ° C., and fermented.
  • the fermentation time was defined as the time required to reach pH 4.6.
  • the pH was measured using a commercially available pH meter.
  • Tables 6 and 7. From Table 6, any L. Delbruecchii subsp. Also in the bulgaricus strain, the concentration of succinic acid was increased by the addition of malic acid and fumaric acid. Further, from Table 7, as in Test Example 1, by adding malic acid or fumaric acid, L. Fermentation of all 7 bulgaricus strains was promoted.
  • Test Example 3 L. delbruecchii subsp. Examination of the fermentation promoting effect of fumaric acid on lactic acid bacteria species other than bulgaricus First, reference strains of the following strains other than Lactobacillus delbrucky subspecies bulgaricus were prepared. (8) Lactobacillus acidofilus JCM 1132T (9) Lactobacillus gasseri JCM 1131T (10) Lactobacillus rhamnosus JCM 1136T (11) Lactobacillus reuteri JCM 1112T (12) Lactobacillus salivalius JCM 1231T (13) Lactobacillus pentosus JCM 1558T
  • the above strain was activated in the activation medium before use.
  • As the activation medium a 10% reduced skim milk medium containing 0.1% yeast extract was sterilized at 121 ° C. for 7 minutes. 1% of frozen bacteria was added to the above-mentioned activation medium (relative to the amount of the activation medium), and the cells were allowed to stand at 37 ° C. for 24 hours to obtain an activation solution. 1% of the obtained activation solution (relative to the amount of activation medium) was added to another activation medium, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 24 hours to obtain a lactic acid bacterium starter.
  • fermentation was performed using a fermentation medium (raw milk).
  • an aqueous fumaric acid solution adjusted to a pH of about 6.5 with NaOH before sterilization was added to the fermentation medium so as to have a final concentration of 1 mM.
  • the fermentation medium was inoculated with 1% of the lactic acid bacteria starter of each strain activated above (relative to the amount of the fermentation medium), statically cultured at 37 ° C., and fermented.
  • the fermentation time was defined as the time required to reach pH 4.6.
  • Table 8 By adding fumaric acid, L. Acidofilus, L. Gasseri, L. Rhamnosus, L. et al. Reuteri, L. et al. Salivalius, and L. Fermentation was promoted by pentosus.
  • Test Example 4 L. delbruecchii subsp. Examination of the fermentation promoting effect of malic acid on lactic acid bacteria species other than bulgaricus First, reference strains of the following bacterial species were prepared. (12) Lactobacillus salivalius JCM 1231T (13) Lactobacillus pentosus JCM 1558T (14) Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum JCM 8572T
  • Test Example 5 L. rhamnosus, L. et al. Measurement of Malic Acid, Fumaric Acid and Succinic Acid Concentrations in Salivalius L. rhamnosus, L. et al. The measurement of the organic acid concentration after the completion of fermentation of salivalius was carried out in the same manner as in Test Example 2-1. The results obtained are shown in Table 10. By adding malic acid or fumaric acid, L. rhamnosus, L. et al. The production of succinic acid was promoted in salivalius.
  • Test Example 6 Lactobacillus delbruecchii subsp. Of fumaric acid when inosinic acid is added. Examination of fermentation promoting effect on bulgaricus Lactobacillus delbruecchii subsp. Frozen bacteria of the bulgaricus strain were prepared. (1) Lactobacillus delbruecchii subsp. bulgaricus 2038 (2) Lactobacillus delbruecchii subsp. bulgaricus OLL1073R-1 (3) Lactobacillus delbruecchii subsp. bulgaricus P1902901 (4) Lactobacillus delbruecchii subsp.
  • bulgaricus OLL1171 Lactobacillus delbruecchii subsp. bulgaricus OLL1255 (6) Lactobacillus delbruecchii subsp. bulgaricus OLL1247 (7) Lactobacillus delbruecchii subsp. bulgaricus OLL205013
  • the above strain was activated in the activation medium before use.
  • As the activation medium a 10% reduced skim milk medium containing 0.1% yeast extract was sterilized at 121 ° C. for 7 minutes. 1% of frozen bacteria was added to the above-mentioned activation medium (relative to the amount of the activation medium), and the cells were allowed to stand at 37 ° C. for 24 hours to obtain an activation solution. 1% of the obtained activation solution (relative to the amount of activation medium) was added to another activation medium, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 24 hours to obtain a lactic acid bacterium starter.
  • fermentation was performed using a fermentation medium (raw milk).
  • an aqueous fumaric acid solution adjusted to a pH of about 6.5 with NaOH before sterilization was added to the fermentation medium so as to have a final concentration of 1 mM.
  • the fermentation medium was inoculated with 1% of the lactic acid bacteria starter of each strain activated above (relative to the amount of the fermentation medium), statically cultured at 37 ° C., and fermented.
  • the fermentation time was defined as the time required to reach pH 4.6.
  • the pH was measured using a pH meter. The results obtained are shown in Table 11. From Table 11, by adding fumaric acid, L. Fermentation of all 7 bulgaricus strains was promoted.
  • Test Example 7 L. malic acid when inosinic acid was added. delbruecchii subsp. Examination of fermentation promoting effect on bulgaricus Lactobacillus delbruecchii subsp. Frozen bacteria of the bulgaricus strain were prepared. (1) Lactobacillus delbruecchii subsp. bulgaricus 2038 (2) Lactobacillus delbruecchii subsp. bulgaricus OLL1073R-1 (3) Lactobacillus delbruecchii subsp. bulgaricus P1902901 (4) Lactobacillus delbruecchii subsp. bulgaricus OLL1171 (5) Lactobacillus delbruecchii subsp. bulgaricus OLL1247
  • Test Example 8 When inosinic acid was added, malic acid or fumaric acid was added to L. delbruecchii subsp. Effect of bulgaricus on succinic acid production The strains shown in Tables 13 and 14 were activated in the activation medium before use.
  • As the activation medium a 10% by mass reduced skim milk medium containing 0.1% by mass yeast extract was sterilized at 121 ° C. for 7 minutes.
  • the 10% by mass reduced skim milk powder is skim milk powder (fat content 1% by mass, protein 34% by mass, lactose 54% by mass, ash content 8% by mass, non-fat milk solid content 96% by mass) (manufactured by Meiji Co., Ltd.).
  • Is a 10% by mass aqueous solution in the above medium, lactose content is 5.4% by mass, non-fat milk solid content is 9.6% by mass.
  • Frozen bacteria were added to the above-mentioned activation medium in an amount of 0.1% by mass (relative to the amount of the activation medium) and statically cultured at 37 ° C. for 16 hours to obtain an activation solution. 0.1% by mass (relative to the amount of activation medium) of the obtained activation solution was added to another activation medium, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 16 hours to obtain a lactic acid bacterium starter.
  • fermentation was carried out using a fermentation medium as the raw material milk.
  • a 10% by mass reduced skim milk medium to which inosinic acid was added so as to have a final concentration of 1 mM was sterilized at 95 ° C.
  • a fumaric acid aqueous solution or a malic acid aqueous solution adjusted to pH about 6.5 with NaOH before sterilization was added so as to have a final concentration of 1 mM.
  • the pH of the fermentation medium was about 6.4.
  • the lactic acid bacterium starter of each strain obtained above was inoculated into the fermentation medium in an amount of 2.5% by mass (relative to the amount of the fermentation medium), statically cultured at 40 ° C., and fermented.
  • the fermentation time was defined as the time required to reach pH 4.6.
  • the pH was measured using a commercially available pH meter.
  • the results obtained are shown in Tables 13 and 14. From Table 13, in the medium containing inosinic acid, any L. Delbruecchii subsp. Also in the bulgaricus strain, the concentration of succinic acid was increased by the addition of malic acid and fumaric acid. Therefore, not only in the formic acid-added medium but also in the inosinic acid-added medium, by adding malic acid and fumaric acid, L. Delbruecchii subsp. It was shown that the amount of succinic acid produced by bulgaricus increased. Further, from Table 14, as in Test Example 6, by adding malic acid or fumaric acid, L. Fermentation of all 7 bulgaricus strains was promoted.
  • Test Example 9 Malic acid or fumaric acid is L. delbruecchii subsp. Effects of bulgaricus on proliferative and metabolite production Lactobacillus delbruecchii subsp. Frozen bacteria of the bulgaricus OLL1073R-1 strain were prepared.
  • the composition of the medium was as shown in Table 15 below. Ingredients other than anhydrous crystalline glucose were dissolved in Elix water, adjusted to pH 6.65 with sodium hydroxide, and then weighed up to 70% of the amount charged in the medium. Anhydrous crystalline glucose was dissolved in Elix water and weighed up to 30% of the amount charged in the medium. When malic acid or fumaric acid was added, it was dissolved in Elix water to a final concentration of 4 mM together with raw material components other than anhydrous crystalline glucose. The sugar solution and the raw material components other than sugar were sterilized by heating in an autoclave treatment at 110 ° C. for 1 minute, and then aseptically mixed and used.
  • the EPS concentration was measured under the following conditions. 1.5 g of the culture solution was weighed, and MilliQ water was added to make 10 g. 100% trichloroacetic acid was added, the mixture was mixed well, and the supernatant was collected after centrifugation (4 ° C., 13400 g, 10 min). After suspending the precipitate by adding 5 ml of a 10% trichloroacetic acid solution, the mixture was centrifuged again to collect the supernatant. Twice the amount of cooled 99.5% ethanol was added to the supernatant, mixed by inversion, and then allowed to stand at ⁇ 20 ° C. overnight.
  • the supernatant was removed by centrifugation (4 ° C., 13400 g, 20 min), and 20 ml of cooled 66% ethanol was added to suspend the precipitate.
  • the supernatant was removed by centrifugation (4 ° C., 13400 g, 20 min), air-dried to remove ethanol, and MilliQ water was added to adjust the volume to 10 ml, which was used as an analysis sample.
  • the EPS concentration of the analytical sample was measured by the phenol-sulfuric acid method.

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Abstract

本発明は、リンゴ酸およびフマル酸から選択される少なくとも１つの有機酸を含んでなる、乳酸菌の発酵促進剤に関する。

Description

乳酸菌の発酵促進剤 関連出願の参照
　本特許出願は、２０１９年１２月２７日に出願された日本国特許出願２０１９－２３９４５５号に基づく優先権の主張を伴うものであり、かかる先の特許出願における全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
　本発明は、新規な乳酸菌の発酵促進剤に関する。
　微生物による発酵物や代謝物を工業的に生産するにあたり、発酵時間の短縮は、製造コストの削減や衛生管理の上で重要である。乳酸菌の発酵を促進して発酵時間を短縮する技術として、核酸の原料となる物質が、乳酸菌の発酵を促進することが報告されている（特許文献１）。また、特許文献２には、アブラナ科植物種子の有機酸抽出物等を有効成分とする微生物生産性向上剤が記載されている。しかしながら、発酵乳を工業的スケールで効率的に生産する観点からは、乳酸菌の代謝や発酵作用を簡便に促進する新たな技術的手段が依然として必要とされている。
　一方で、近年の健康志向の高まりに伴い、食品添加物の使用量を低減させて味わいのよい発酵乳を製造することが求められている。特に、コハク酸は、うま味物質でありながら、体重増加抑制作用や耐糖能改善作用、癌増殖抑制作用といった有用な生理機能も有することから、食品添加物としてしばしば使用される。消費者の需要を喚起する観点からは、コハク酸についても食品添加物を使用せず、発酵乳内で産生することが好ましい。
　近年、コハク酸の産生機構に関し、嫌気的条件ではピルビン酸またはフォスフォエノールピルビン酸から炭酸固定を介してオキザロ酢酸が生成し、ＴＣＡサイクルの逆ルートでコハク酸が生産する場合があることが報告されている（非特許文献１）。しかしながら、乳酸菌がＴＣＡサイクルの逆ルートを利用しうることについては、何ら報告はされていない。
星野達雄、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｃｕｌｔ．　Ｃｏｌｌ．，　２０１１，　２７（２），　ｐ．　８３－８８
特開２０１７－２２１１５７号公報 特開平０４－１４１０８３号公報
　本発明は、乳酸菌の発酵を促進するための新たな技術的手段を提供する。また、本発明は、発酵乳における乳酸菌のコハク酸の産生を促進するための新たな技術的手段を提供する。
　本発明者らは、今般、リンゴ酸およびフマル酸から選択される少なくとも１つの有機酸が乳酸菌の発酵を促進しうることを見出した。さらに、本発明者らは、上記有機酸が発酵乳における乳酸菌のコハク酸の産生を促進しうることを見出した。本発明は、かかる知見に基づくものである。
　本発明によれば、以下の発明が包含される。
［１］リンゴ酸およびフマル酸から選択される少なくとも１つの有機酸を含んでなる、乳酸菌の発酵促進剤。
［２］核酸原料と併用するための、［１］に記載の発酵促進剤。
［３］上記核酸原料が、ギ酸および２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物からなる群から選択される少なくとも一つのものである、［２］に記載の発酵促進剤。
［４］上記乳酸菌がラクトバチルス属菌を含んでなる、［１］～［３］のいずれか一つに記載の発酵促進剤。
［５］ラクトバチルス属菌が、ラクトバチルス・デルブルッキー、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・ラムノーサス、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・サリバリウスおよびラクトバチルス・ペントサスからなる群から選択される少なくとも一つである、［４］に記載の発酵促進剤。
［６］乳酸菌と、リンゴ酸およびフマル酸から選択される少なくとも１つの有機酸とを含んでなる、乳酸菌スターター。
［７］核酸原料をさらに含んでなる、［６］に記載の乳酸菌スターター。
［８］リンゴ酸およびフマル酸から選択される少なくとも１つの有機酸の存在下で乳酸菌発酵させることを含んでなる、発酵乳を製造する方法。
［９］上記有機酸と核酸原料の共存下で乳酸菌発酵させることを含んでなる、［８］に記載の方法。
［１０］上記核酸原料が、ギ酸および２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物から選択される少なくとも一つのものである、［９］に記載の方法。
［１１］上記発酵乳がコハク酸を含んでなる、［８］～［１０］のいずれか一つに記載の方法。
［１２］上記コハク酸が、上記乳酸菌により産生される内因性の有機酸である、［１１］に記載の方法。
［１３］［８］～［１２］のいずれか一つに記載の方法により得られる発酵乳であって、
　上記発酵乳が、乳酸菌とコハク酸とを含んでなる、発酵乳。
［１４］上記コハク酸が、前記乳酸菌により産生される内因性の有機酸である、［１３］に記載の発酵乳。
［１５］上記コハク酸の含有量が、発酵乳全量に対して０．１５ｍＭ以上である、［１４］に記載の発酵乳。
［１６］リンゴ酸およびフマル酸から選択される少なくとも１つの有機酸をさらに含んでなる、［１３］～［１５］のいずれかに記載の発酵乳。
［１７］リンゴ酸およびフマル酸から選択される少なくとも１つの有機酸の存在下で乳酸菌発酵させることを含んでなる、乳酸菌の発酵促進方法。
［１８］核酸原料をさらに含んでなる、［１７］に記載の乳酸菌の発酵促進方法。
［１９］上記核酸原料が、ギ酸および２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物から選択される少なくとも一つのものである、［１８］に記載の乳酸菌の発酵促進方法。
［２０］リンゴ酸およびフマル酸から選択される少なくとも１つの有機酸の存在下で乳酸菌を培養させることを含んでなる、乳酸菌スターターを製造する方法。
［２１］上記有機酸と核酸原料の共存下で乳酸菌を培養させることを含んでなる、［２０］に記載の方法。
［２２］上記乳酸菌スターターが、乳酸菌と、リンゴ酸およびフマル酸から選択される少なくとも１つの有機酸とを含んでなる、［２０］または［２１］に記載の方法。
［２３］上記乳酸菌スターターがコハク酸をさらに含んでなる、［２２］に記載の方法。
［２４］上記コハク酸が、前記乳酸菌により産生される内因性の有機酸である、［２３］に記載の方法。
［２５］コハク酸の含有量が、発酵乳全量に対して０．１５ｍＭ以上である発酵乳。
［２６］リンゴ酸およびフマル酸から選択される少なくとも１つの有機酸をさらに含んでなる、［２５］に記載の発酵乳。
［２７］上記コハク酸が、前記乳酸菌により産生される内因性の有機酸である、［２５］または［２６］に記載の発酵乳。
［２８］リンゴ酸およびフマル酸から選択される少なくとも１つの有機酸の存在下で乳酸菌発酵させることを含んでなる、乳酸菌発酵代謝物の産生方法。
［２９］乳酸菌発酵代謝物が細胞外多糖（ＥＰＳ）である、［２８］に記載の産生方法。
［３０］リンゴ酸およびフマル酸から選択される少なくとも１つの有機酸の存在下で乳酸菌発酵させることを含んでなる、乳酸菌発酵代謝物の産生を促進する方法（以下、「産生促進方法」とも記載する）。
［３１］乳酸菌発酵代謝物が細胞外多糖（ＥＰＳ）である、［３０］に記載の方法。
　本発明によれば、乳酸菌の発酵を促進させることができる。また、本発明によれば、発酵乳におけるコハク酸の産生量を増加させることができる。本発明は、乳酸菌の発酵や代謝を促進し、細胞外多糖（ＥＰＳ）やペプチド等の発酵代謝物を短時間で産生する上で有利に利用することができる。また、本発明は、乳酸菌のコハク酸の産生量を増加させ、コハク酸の食品添加物としての添加量を低減させる上で有利に利用することができる。
図１は、試験例９の培養時間に対するＥＰＳ濃度推移を示すチャートである。
発明の具体的説明
発酵促進剤
　本発明の乳酸菌の発酵促進剤は、リンゴ酸およびフマル酸から選択される少なくとも１つの有機酸を含んでなることを一つの特徴としている。
　発酵促進剤において、リンゴ酸およびフマル酸から選択される少なくとも１つの有機酸の含有量は、特に限定されず、例えば、０．１～１００質量％であり、好ましくは５０～１００質量％であり、より好ましくは８０～１００質量％である。
　発酵促進剤における有機酸の原料は、食品添加物としての市販品を使用してもよいし、合成品や有機酸を含む製剤等を使用してもよい。
　発酵促進剤は、リンゴ酸、フマル酸のいずれか一方の有機酸を含んでいてもよく、両者を含んでいてもよい。リンゴ酸とフマル酸との質量比（リンゴ酸／フマル酸）は、特に限定されないが、例えば、０．１～１０であり、好ましくは０．２～５であり、より好ましくは０．５～２であり、より一層好ましくは０．６～１．５である。
リンゴ酸
　発酵促進剤におけるリンゴ酸の形態は、本発明の効果を妨げない限り、特に限定されず、遊離酸または塩のいずれの形態で剤中に含有させてもよい。かかる塩としては、カリウムやナトリウム等のアルカリ金属塩またはカルシウムやマグネシウム等のアルカリ土類金属塩を挙げることができる。培養に使用されるリンゴ酸は光学異性体の別を問わないが、好ましくはＬ－リンゴ酸である。
　リンゴ酸またはその塩は、培地または原料乳全量に対して、例えば、０．００１～７５ｍＭの範囲となる量、好ましくは、０．０１～５０ｍＭ、より好ましくは０．１～１０ｍＭ、より一層好ましくは０．５～１０ｍＭとなる量で添加することができる。したがって、リンゴ酸は発酵促進剤に上記量となるように含まれることが好ましい。ここで、培地または原料乳全量とは、培養に用いられる菌以外の全ての成分の合計量であって、例えば、培地または原料乳、リンゴ酸および／またはフマル酸、ならびに核酸原料の合計量をいう。本発明の培養系におけるリンゴ酸の含有量は、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）法により測定される。このような測定は、市販のＨＰＬＣ装置（例えば島津製作所（株）製）およびカラム（例えば、ＩＣＳｅｐ　ＩＣＥ－ＯＲＨ－８０１（ＴＲＡＮＳＧＥＮＯＭＩＣ社））を用いることにより実施することができる。より具体的には、上記測定は、以下の条件により行うことができる。分析装置：島津製作所（株）製ＬＣ２０　ｓｙｓｔｅｍ、カラム：ＩＣＳｅｐ　ＩＣＥ－ＯＲＨ－８０１、６．５ｍｍ　Ｉ．Ｄ．　×　３００ｍｍ、２本連結して使用、移動相：７．５ｍＭ　ｐ－トルエンスルホン酸、反応液：７．５ｍＭ　ｐ－トルエンスルホン酸・１５０μＭ　ＥＤＴＡ（２ＮＡ）・３０ｍＭ　Ｂｉｓ　Ｔｒｉｓ、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ、注入量：１０μｌ、オーブン温度：５５℃、検出：電気伝導度検出器。
フマル酸
　発酵促進剤におけるフマル酸の形態は、本発明の効果を妨げない限り、特に限定されず、遊離酸または塩のいずれの形態で剤中に含有させてもよい。かかる塩としては、カリウムやナトリウム等のアルカリ金属塩、カルシウム等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等を挙げることができる。
　また、フマル酸は、培地または原料乳全量に対し、フマル酸またはその塩の含有量が、例えば、０．００１～１０ｍＭの範囲となる量、好ましくは０．０１～７．５ｍＭ、より好ましくは０．１～５ｍＭ、より一層好ましくは０．１～２．５ｍＭとなる量で添加することができる。したがって、フマル酸は本発明の発酵促進剤に上記量となるように含まれることが好ましい。本発明の培養系におけるフマル酸の含有量は、リンゴ酸と同様の方法で測定することができる。
核酸原料
　本発明の発酵促進剤は、乳酸菌の発酵をより効果的に促進する観点から、核酸原料と併用することが好ましい。核酸原料は発酵促進剤の構成成分として含まれていても別体として用いられてもよい。かかる核酸原料としては、本発明の効果を妨げない限り、特に限定されず、好適な例としては、ギ酸、２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物が挙げられる。
　ギ酸は、核酸のプリン骨格を構成する原料として知られている。ギ酸の形態は、本発明の効果を妨げない限り、特に限定されず、遊離酸または塩のいずれの形態で剤中に含有させてもよい。かかる塩としては、カリウムやナトリウム等のアルカリ金属塩、カルシウム等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等を挙げることができる。本発明の培養系におけるギ酸の含有量は、リンゴ酸と同様の方法で測定することができる。
　プリン骨格を有する化合物とは、以下の構造（プリン骨格）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 ［式（Ｉ）中の数字は炭素原子または窒素原子の位置番号を表す］
を基本骨格として有する物質を示す。プリン骨格を有する化合物は、一般にプリン体とも総称される。プリン骨格を有する化合物としては、典型的には、プリン塩基、プリンヌクレオシド、プリンヌクレオチド、またはそれらの塩が挙げられる。
　本発明の核酸原料として用いるプリン骨格を有する化合物は、プリン骨格の２位の炭素原子（上記式（Ｉ）中、２で表す炭素原子）に水素原子が結合したプリン骨格を有する。そのような化合物としては、アデニンおよびヒポキサンチン（プリン塩基）、アデニンおよびヒポキサンチンを構成要素として含むプリンヌクレオシド、アデニンまたはヒポキサンチンを構成要素として含むプリンヌクレオチド、並びにそれらの塩が挙げられる。
　プリンヌクレオシドは、プリン塩基と糖（リボース、またはデオキシリボース等）が結合した物質であり、リボヌクレオシドであってもデオキシリボヌクレオシドであってもよい。アデニンまたはヒポキサンチンを構成要素として含むプリンヌクレオシドとしては、例えば、アデノシンおよびイノシン（リボヌクレオシド）、ならびにデオキシアデノシンおよびデオキシイノシン（デオキシリボヌクレオシド）が挙げられる。
　プリンヌクレオチドは、プリンヌクレオシドに１つ以上のリン酸基が結合した物質であり、リボヌクレオチドであってもデオキシリボヌクレオチドであってもよい。プリンヌクレオチドは、ヌクレオシド一リン酸（ヌクレオシドモノリン酸）、ヌクレオシド二リン酸、またはヌクレオシド三リン酸であってよい。アデニンまたはヒポキサンチンを構成要素として含むプリンヌクレオチドとしては、例えば、アデニル酸（アデノシン一リン酸またはアデノシンモノリン酸；ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、イノシン酸（イノシン一リン酸またはイノシンモノリン酸；ＩＭＰ）、イノシン二リン酸（ＩＤＰ）、イノシン三リン酸（ＩＴＰ）、デオキシイノシン一リン酸（ｄＩＭＰ）、デオキシイノシン二リン酸（ｄＩＤＰ）、およびデオキシイノシン三リン酸（ｄＩＴＰ）が挙げられる。
　２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物は、プリン塩基、プリンヌクレオシド、またはプリンヌクレオチドの誘導体も包含する。本発明において「誘導体」とは、プリン塩基、プリンヌクレオシドもしくはプリンヌクレオチドのプリン塩基部分、糖残基部分、および／またはリン酸基部分を化学修飾した、あるいは置換基を導入した化合物をいう。
　２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物は、塩、例えば、アデニン、ヒポキサンチン、またはアデニンもしくはヒポキサンチンを構成要素として含むプリンヌクレオシドもしくはプリンヌクレオチドの塩であってよい。本発明において、好ましい塩はアルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩）であり、例えばアデニル酸ナトリウムおよびイノシン酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物は、例えば、アデニン、ヒポキサンチン、アデノシン、イノシン、デオキシアデノシン、デオキシイノシン、アデニル酸、イノシン酸、およびそれらの塩からなる群から選択されるものであり、好ましくはイノシン酸である。なお、本発明の培養系におけるイノシン酸の含有量は、蛍光法によるキット、Ｉｎｏｓｉｎｅ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ、ＣＥＬＬ　ＢＩＯＬＡＢＳ社を用いて測定することができる。
　本発明の発酵促進剤は、上記の２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物を少なくとも１種、好ましくは１～４種、例えば１～３種または１～２種併用してもよい。
　核酸原料を有機酸と併用する場合、有機酸と核酸原料との質量比（有機酸／核酸原料）は、特に限定されず、例えば、０．００５～５００であり、好ましくは０．０５～２００であり、より好ましくは０．１～１００である。
　また、核酸原料は、培地または原料乳全量に対し、核酸原料の含有量が、例えば、０．００１～７５ｍＭの範囲となる量、好ましくは０．０１～５０ｍＭ、より好ましくは０．１～１０ｍＭ、より一層好ましくは０．５～２ｍＭとなる量で添加することができる。
　また、本発明の剤は、上記成分と共に、所望により食品衛生上または薬学的に許容可能な添加剤を配合した剤として提供することができる。食品衛生上または薬学的に許容可能な添加剤として、水等の水性媒体、溶剤、溶解補助剤、滑沢剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、保存剤、防腐剤、界面活性剤、調整剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、賦形剤、増粘剤、着色剤、芳香剤または香料等が挙げられる。
　本発明の剤は、液体、粉末、顆粒、ゲル、固体、カプセル封入体等の任意の形態であってよい。
　発酵促進剤は、リンゴ酸およびフマル酸から選択される少なくとも１つの有機酸と、核酸をはじめとするその他の任意成分を適宜混合して製造することができる、得られる混合物は、さらに溶媒への溶解、粉末化、顆粒化、ゲル化、固体化、カプセル封入等は公知の製剤技術に従って処理することができる。
　本発明の発酵促進作用は、発酵促進剤を添加した原料乳において乳酸菌を培養し発酵させて、その発酵状態の進行を示す指標を調べ、その結果、対照（本発明の発酵促進剤を添加しない群）と比較して発酵がより速く進行していることにより確認することができる。発酵状態の進行を示す指標としては、特に限定されるものではないが、例えば、乳酸菌の発酵により生成する乳酸量の増加に伴う発酵乳のｐＨ値の低下を指標として用いることができる。かかるｐＨとして例えばｐＨ４．６である。ここで、ｐＨ４．６は、通常の発酵乳の製造において十分に発酵が行われ、発酵を終了するｐＨとして設定しうる。対照と比較して、ｐＨ４．６に到達するまでの時間が短縮された場合には、発酵促進剤が乳酸菌に対する発酵促進作用を有すると判断することができる。ｐＨは市販のｐＨ計を用いて測定することができる。
乳酸菌
　本発明において、発酵に用いる乳酸菌は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されず、動物由来のものであっても植物由来のものであってもよい。
　本発明の好ましい乳酸菌としては、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属菌、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属菌、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属菌、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属菌、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、ラクトバチルス属菌を含む乳酸菌が好ましい。ラクトバチルス属菌を含む乳酸菌としては、例えば、ラクトバチルス属菌、ラクトバチルス属菌とストレプトコッカス属菌との組み合わせ、ラクトバチルス属菌とラクトコッカス属菌との組み合わせ等が挙げられる。これら乳酸菌は、例えば、ＡＴＣＣ等の保管機関等から入手するか、市販されているものを適宜使用することができる。
　ラクトバチルス属菌としては、例えば、ラクトバチルス・デルブルッキー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・ペントサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｅｎｔｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ）、ラクトバチルス・ヘルベティクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・アミロボラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｖｏｒｏｕｓ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、およびラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓａｋｅｉ）等が挙げられる。好ましいラクトバチルス属菌は、ラクトバチルス・デルブルッキー、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・ラムノーサス、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・ペントサス等である。ここで、好ましいラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・ラムノーサス、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・サリバリウスおよびラクトバチルス・ペントサスとしては、それぞれラクトバチルス・アシドフィルス　ＪＣＭ　１１３２Ｔ株、ラクトバチルス・ガセリ　ＪＣＭ　１１３１Ｔ株、ラクトバチルス・ラムノーサス　ＪＣＭ　１１３６Ｔ株、ラクトバチルス・ロイテリ　ＪＣＭ　１１１２Ｔ株、ラクトバチルス・サリバリウス　ＪＣＭ　１２３１Ｔ株、およびラクトバチルス・ペントサス　ＪＣＭ　１５５８Ｔ株等が挙げられる。
　また、ラクトバチルス・デルブルッキーとしては、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス；ラクトバチルス・ブルガリクス）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｌａｃｔｉｓ（ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティス）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ（ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・デルブルッキー）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｉｎｄｉｃｕｓ（ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・インディクス）等が挙げられる。好ましいラクトバチルス・デルブルッキーは、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス等であり、より好ましくは、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス（２０３８株、ＯＬＬ　１０７３Ｒ－１株、Ｐ１９０２９０１株、ＯＬＬ１１７１株、ＯＬＬ１２５５株、ＯＬＬ１２４７株、ＯＬＬ２０５０１３株）等である。ラクトバチルス・ケフィラノファシエンスとしては、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ　ｓｕｂｓｐ．　ｋｅｆｉｒｇｒａｎｕｍ（ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス・サブスピーシーズ・ケフィアグラナム）等が挙げられ、好ましくはラクトバチルス・ケフィラノファシエンス・サブスピーシーズ・ケフィアグラナム　ＪＣＭ　８５７２Ｔ等である。
　また、ラクトバチルス・アシドフィルス　ＪＣＭ　１１３２Ｔ株、ラクトバチルス・ガセリ　ＪＣＭ　１１３１Ｔ株、ラクトバチルス・ラムノーサス　ＪＣＭ　１１３６Ｔ株、ラクトバチルス・ロイテリ　ＪＣＭ　１１１２Ｔ株、ラクトバチルス・サリバリウス　ＪＣＭ　１２３１Ｔ株、ラクトバチルス・ペントサス　ＪＣＭ　１５５８Ｔ株、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス・サブスピーシーズ・ケフィアグラナム　ＪＣＭ　８５７２Ｔ株は、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター（ＲＩＫＥＮ　ＢＲＣ）微生物材料開発室（Ｊａｐａｎ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）（ＲＩＫＥＮ　ＢＲＣ－ＪＣＭ、日本）から、それぞれ受託番号ＪＣＭ　１１３２Ｔ、ＪＣＭ　１１３１Ｔ、ＪＣＭ　１１３６Ｔ、ＪＣＭ　１１１２Ｔ、ＪＣＭ　１２３１Ｔ、ＪＣＭ　１５５８Ｔ、ＪＣＭ　８５７２Ｔの下で入手することができる。
　ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス２０３８株は、「明治ブルガリアヨーグルト」（登録商標）から、市販のラクトバチルス属用の選択培地にて単離することができ、株式会社明治（〒１９２－０９１９　日本国東京都八王子市七国１－２９－１　明治イノベーションセンター）により保管されている。
　ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスＯＬＬ　１０７３Ｒ－１株は、１９９９年２月２２日付で独立行政法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託され、その後、国際寄託に移管され受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０７４１が付与されている。なお、Ｂｕｄａｐｅｓｔ　Ｎｏｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｎｏ．　２８２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｉｐｏ．ｉｎｔ／ｔｒｅａｔｉｅｓ／ｅｎ／ｎｏｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ／ｂｕｄａｐｅｓｔ／ｔｒｅａｔｙ＿ｂｕｄａｐｅｓｔ＿２８２．ｈｔｍｌ）に記載されるとおり、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＩＰＯＤ、ＮＩＴＥ）が独立行政法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ、ＡＩＳＴ）から特許微生物寄託業務を承継したため、現在は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ、ＮＩＴＥ）に受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０７４１のもとで寄託されている。
　ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスＰ１９０２９０１株は、株式会社明治（〒１９２－０９１９　日本国東京都八王子市七国１－２９－１　明治イノベーションセンター）により保管されている。
　ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスＯＬＬ１１７１株は、ブタベスト条約の規定に基づく国際寄託当局である独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、２０１３年３月１３日付でＮＩＴＥ　ＢＰ－０１５６９として国際寄託されている。
　ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスＯＬＬ１２５５株は、ブタベスト条約の規定に基づく国際寄託当局である独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、２００５年２月１０日付でＮＩＴＥ　ＢＰ－７６として国際寄託されている。
　ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスＯＬＬ１２４７株は、ブタベスト条約の規定に基づく国際寄託当局である独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、２０１４年３月６日付でＮＩＴＥ　ＢＰ－０１８１４として国際寄託されている。
　ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスＯＬＬ２０５０１３株は、ブタベスト条約の規定に基づく国際寄託当局である独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、２０１７年２月３日付でＮＩＴＥ　ＢＰ－０２４１１として国際寄託されている。
　ストレプトコッカス属菌としては、例えば、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）等が挙げられる。
　ラクトコッカス属菌としては、例えば、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトコッカス・ラフィノラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ）等が挙げられる。
　ラクトバチルス属菌とストレプトコッカス属菌との組み合わせとしては、好ましくは、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスおよびストレプトコッカス・サーモフィルスが挙げられる。
　乳酸菌と、リンゴ酸およびフマル酸から選択される少なくとも１つの有機酸や、核酸原料との混合割合は、乳酸菌や培地、原料乳の種類や性質、温度条件その他の発酵条件に応じて適宜設定してもよい。
　乳酸菌と、リンゴ酸およびフマル酸から選択される少なくとも１つの有機酸との質量比（乳酸菌／有機酸）は、例えば、０．００１～５０００００であり、好ましくは０．０１～５０００であり、より好ましくは０．１～５００である。
　乳酸菌と、上記核酸原料との質量比（乳酸菌／核酸原料）は、例えば、０．１～１１０００であり、好ましくは１～１１０００であり、より好ましくは１０～１１００であり、さらに好ましくは５０～５５０である。
　乳酸菌は、培地または原料乳全量に対し、例えば、０．００１質量％～５質量％、好ましくは０．０１質量％～２．５質量％、より好ましくは０．０１質量％～２質量％、より一層好ましくは０．１質量％～１質量％となる量で添加することができる。
乳酸菌スターター
　上述のようなリンゴ酸およびフマル酸から選択される有機酸は、乳酸菌を共に使用して乳酸菌スターターとして使用することができる。したがって、本発明の好ましい実施態様によれば、乳酸菌と、リンゴ酸およびフマル酸から選択される少なくとも１つの有機酸とを含んでなる、乳酸菌スターターが提供される。
　乳酸菌スターターは、乳酸菌を培地（例えば、賦活培地）で培養し、中間発酵を経て調製されたものを含む。乳酸菌スターターは、乳酸菌とそれを培養した培地とを構成要素として含むことが好ましい。したがって、乳酸菌スターターはコハク酸をさらに含んでいてもよい。ここで、上記コハク酸は、上記乳酸菌により産生される内因性の有機酸であることが好ましい。また、乳酸菌スターターには、発酵乳の元となる原料乳に直接接種するものの他に、この乳酸菌スターターを別の培地に接種して、乳酸菌をさらに増殖（スケールアップ）させた次世代以降のものが含まれる。
　乳酸菌スターターは、基本的に、原料乳を発酵させて発酵乳を得るのに使用される。なお、乳酸菌スターターの使用には、本発明によって得られた乳酸菌スターターを原料乳に直接接種することの他に、本発明によって得られた乳酸菌スターターを培地でさらに１回以上培養して、その培養後の次世代以降の乳酸菌スターターを原料乳に接種することをも含む。
　乳酸菌スターターは、核酸原料と共に併用してもよい。したがって、本発明の別の態様によれば、核酸原料との併用のための、乳酸菌と、リンゴ酸およびフマル酸から選択される少なくとも１つの有機酸とを含んでなる乳酸菌スターターが提供される。上記乳酸菌スターターは核酸原料と併用することが好ましく、上記併用においては、核酸原料を上記乳酸菌スターターと共に別体として培地または原料乳に添加してもよく、上記乳酸菌スターターに核酸原料を構成成分として混合して一体的に使用してもよい。乳酸菌スターターと核酸原料とを併用することにより、より効果的に乳酸菌の発酵を促進することができる。したがって、一つの態様によれば、上記乳酸菌スターターは核酸原料を含んでいてもよい。乳酸菌スターターにおけるリンゴ酸、フマル酸、核酸原料、乳酸菌の各態様はいずれも、本発明の発酵促進剤に関する記載と同様とすることができる。
　乳酸菌スターターにおける乳酸菌の生菌数は、特に限定されないが、例えば、１．０×１０４～１．０×１０１３ｃｆｕ／ｇであり、好ましくは１．０×１０５～１．０×１０１２ｃｆｕ／ｇであり、より好ましくは１．０×１０６～１．０×１０１１ｃｆｕ／ｇである。
　乳酸菌スターターにおける乳酸菌と有機酸との質量比、乳酸菌と核酸原料との質量比、有機酸と核酸原料との質量比、有機酸におけるリンゴ酸およびフマル酸の質量比は、上記発酵促進剤における質量比と同様とすることができる。
　乳酸菌スターターは、乳酸菌と、上記有機酸や、核酸原料や培地成分をはじめとする任意成分とから製造することができる。以下、乳酸菌スターターの好適な製造方法の詳細について説明する。
　乳酸菌スターターの好ましい製造方法は、培地調製工程、培地殺菌工程、乳酸菌接種工程、培養工程（培地発酵工程）、および有機酸等添加工程を含む。
　培地調製工程は、乳酸菌を接種する培地（例えば、賦活培地）を調製する工程である。培地は、本発明の効果を妨げない限り、特に限定されないが、乳成分を含む培地が挙げられ、例えば、脱脂乳、脱脂濃縮乳、脱脂粉乳（還元脱脂乳）、およびこれら脱脂乳成分のタンパク質分解物、ホエイ、ホエイ濃縮物、ホエイ粉（還元ホエイ）、およびこれらホエイ成分のタンパク質分解物、生乳、殺菌乳（全脂乳）、全脂濃縮乳、全脂粉乳（還元全脂乳）、およびこれら全脂乳成分のタンパク質分解物等を含む培地が好ましく、脱脂乳、脱脂粉乳、およびこれら脱脂乳成分のタンパク質分解物、ホエイ、ホエイ濃縮物、ホエイ粉、およびこれらホエイ成分のタンパク質分解物を含む培地がより好ましく、脱脂乳、脱脂粉乳、ホエイ、ホエイ粉等を含む培地がさらに好ましい。また、上記培地は後述の原料乳と同一であっても良い。上記培地は酵母エキスをさらに含むことが好ましい。上記培地は、上記の各成分を混合、溶解、分散、懸濁する等の公知の手法により、調製することができる。
　培地殺菌工程は、培地調製工程で調製された培地を、例えば加熱によって殺菌する工程である。殺菌工程では、培地の雑菌を殺菌できる程度に、加熱温度および加熱時間を調整して加熱処理すればよい。本発明においては、培地を８０℃以上、９０℃以上、９５℃以上、または１００℃以上に加熱することが好ましい。加熱殺菌には、公知の方法を用いることができる。例えば、加熱殺菌では、プレート式熱交換器、チューブ式熱交換器、スチームインジェクション式加熱装置、スチームインフュージョン式加熱装置、通電式加熱装置、オートクレーブ装置等によって加熱処理を行えばよく、ジャケット付のタンクによって加熱処理を行ってもよい。なお、培地の殺菌は加熱に限られず、例えば紫外線照射等公知の方法によって行うこともできる。
　乳酸菌添加（接種）工程は、殺菌後の培地に、乳酸菌を添加（接種）する工程である。培地に添加する乳酸菌としては、凍結菌（例えば、凍結濃縮菌、凍結ペレット、凍結乾燥粉末等）を用いることができる。乳酸菌添加工程においては、乳酸菌を、培地に対して、０．０５質量％以上で添加することが好ましく、０．０５～１０質量％で添加することがより好ましく、０．１～５質量％で添加することがさらに好ましい。
　培養工程は、乳酸菌を培地で培養し、乳酸菌を増殖させ、乳酸スターターを得る工程である。乳酸菌の培養時間は、特に限定されないが、例えば、３～３６時間が挙げられ、好ましくは５～３０時間、より好ましくは１０～２４時間である。なお、乳酸菌スターターを複数回培養して得る場合には、上記培養時間は１回の培養時間をいう。
　また、培養工程において、培地の温度は、３０℃以上の発酵温度域に保持されていることが好ましい。特に、培地の温度は、３０～５０℃で保持されていることが好ましく、３５～５０℃で保持されていることがより好ましい。また、培養工程においては、培地を撹拌せずに静置しておくことが好ましい。ここで、「静置」とは、培地を攪拌しないことを意味するものであり、例えば培地を収容した容器を移動するような場合であっても、培地内が撹拌されないのであれば「静置」に該当する。このように、培養工程の間は培地を静置することで乳酸菌の増殖を促進し、培養終了までの時間を短縮することができる。
　有機酸等添加工程は、リンゴ酸およびフマル酸から選択される少なくとも１つの有機酸ならびに所望により核酸原料を添加する工程である。有機酸等添加工程は、培養工程前、培養工程中、培養工程後のいずれの時期に実施してもよいが、培養時間を短縮する観点からは、培養工程前または培養工程中に実施することが好ましい。有機酸等添加工程は、例えば、培養工程後において、乳酸菌またはその乳酸菌含有培地を所定量採取し、かかる乳酸菌またはその乳酸菌含有培地に有機酸および所望により核酸原料を添加することにより実施することができる。また、有機酸等添加工程は、例えば、培養工程前または培養工程中に培地に有機酸および所望により核酸原料を添加することにより実施してもよい。ここで、培養工程前としては、特に限定されず、培地殺菌工程の前、培地殺菌工程の後、乳酸菌添加工程の前、乳酸菌添加工程の後、乳酸菌の添加と同時のいずれの時期であってもよい。添加する有機酸は水に溶解しｐＨを６．０～７．０に調整することが好ましい。
発酵乳
　本発明によれば、上記発酵促進剤または乳酸菌スターターを使用して、発酵乳を効率的に製造することができる。ここで、「発酵乳」とは、乳および乳製品の成分規格等に関する省令（乳等省令）で定義される「発酵乳」、「乳製品乳酸菌飲料」、および「乳酸菌飲料」を包含し、ヨーグルト等も含まれる。例えば、発酵乳は、生乳、牛乳、特別牛乳、生山羊乳、殺菌山羊乳、生めん羊乳、成分調整牛乳、低脂肪牛乳、無脂肪牛乳および加工乳等の乳またはこれと同等以上の無脂乳固形分を含む乳等を、乳酸菌または酵母で発酵させ、糊状または液状にしたものまたはこれらを凍結したものをいい、これらにはハードヨーグルト、ソフトヨーグルト（糊状発酵乳）またはドリンクヨーグルト（液状発酵乳）が含まれる。
　一般的に、プレーンヨーグルト等のハードヨーグルトは、容器に原料を充填させ、その後に発酵させること（後発酵）により製造される（「セットヨーグルト」とも称される）。一方、ソフトヨーグルトやドリンクヨーグルトは、発酵させた発酵乳（前発酵）を微粒化処理や均質化処理した後に、容器に充填させることにより製造される（「撹拌ヨーグルト」とも称される）。
　本発明によれば、リンゴ酸やフマル酸、さらには所望により核酸原料の存在下で乳酸菌発酵させることにより、食品添加剤を使用しなくても、発酵乳中に高含有量でコハク酸を含有させることができる。したがって、本発明の好ましい態様によれば、乳酸菌とコハク酸とを含んでなる発酵乳であって、上記コハク酸が、上記乳酸菌により産生される内因性の有機酸である発酵乳が提供される。
　発酵乳中のコハク酸含有量は、例えば、発酵乳全量に対して０．１５ｍＭ以上、好ましくは０．２ｍＭ以上、より好ましくは０．７ｍＭ以上、より一層好ましくは１ｍＭ以上、さらに好ましくは３ｍＭ以上とされる。本発明の発酵乳におけるコハク酸含有量の好ましい下限値は、０．１５ｍＭ、好ましくは１ｍＭ、より好ましくは３ｍＭであり、好ましい上限値は５０ｍＭ、より好ましくは２０ｍＭ、より一層好ましくは１５ｍＭである。本発明の好ましい態様によれば、乳酸菌としてラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスを用いた場合は、発酵乳中のコハク酸含有量は、例えば、発酵乳全量に対して１ｍＭ以上、好ましくは１．５ｍＭ以上、より好ましくは３ｍＭ以上とされる。また、乳酸菌としてラクトバチルス・ラムノーサスを用いた場合は、発酵乳中のコハク酸含有量は、例えば、発酵乳全量に対して０．５ｍＭ以上、好ましくは１ｍＭ以上とされる。また、乳酸菌としてラクトバチルス・サリバリウスを用いた場合は、発酵乳中のコハク酸含有量は、例えば、発酵乳全量に対して０．１５ｍＭ以上、好ましくは０．２ｍＭ以上とされる。本発明の発酵乳におけるコハク酸の含有量は、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）法により測定される。このような測定は、市販のＨＰＬＣ装置（例えば島津製作所（株）製）およびカラム（例えば、ＩＣＳｅｐ　ＩＣＥ－ＯＲＨ－８０１（ＴＲＡＮＳＧＥＮＯＭＩＣ社））を用いることにより、簡便に行うことができる。上記測定としては、例えば、以下の条件により行うことができる。分析装置：島津製作所（株）製ＬＣ２０　ｓｙｓｔｅｍ、カラム：ＩＣＳｅｐ　ＩＣＥ－ＯＲＨ－８０１、６．５ｍｍ　Ｉ．Ｄ．　×　３００ｍｍ、２本連結して使用、移動相：７．５ｍＭ　ｐ－トルエンスルホン酸、反応液：７．５ｍＭ　ｐ－トルエンスルホン酸・１５０μＭ　ＥＤＴＡ（２ＮＡ）・３０ｍＭ　Ｂｉｓ　Ｔｒｉｓ、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ、注入量：１０μｌ、オーブン温度：５５℃、検出：電気伝導度検出器。
　発酵乳は、リンゴ酸やフマル酸等の有機酸、さらには所望により核酸原料の存在下で好適に製造されることから、リンゴ酸、フマル酸、核酸原料を含有していてもよい。
　発酵乳におけるリンゴ酸の含有量は、例えば、０．１～５０ｍＭであり、好ましくは０．１～４５ｍＭであり、さらに好ましくは０．５～４５ｍＭである。
　発酵乳におけるフマル酸の含有量は、例えば、０．１～１０ｍＭであり、好ましくは０．１～５ｍＭであり、さらに好ましくは０．５～１ｍＭである。
　発酵乳における核酸原料の含有量は、例えば、０．０００１～５質量％であり、好ましくは０．０００１～１．５質量％である。
　本発明の発酵乳は、製造時にリンゴ酸およびフマル酸から選択される少なくとも１つの有機酸を添加していない発酵乳に比べて、コハク酸を２倍以上含むことが挙げられ、好ましくは２．５倍以上、より好ましくは５倍以上含む。上限値は３０倍が挙げられ、好ましくは２０倍である。
　本発明によれば、発酵乳は、上記発酵促進剤または乳酸菌スターターを使用して、リンゴ酸やフマル酸等の有機酸や、核酸原料の存在下で製造することができる。したがって、リンゴ酸およびフマル酸から選択される少なくとも１つの有機酸の存在下で原料乳を乳酸菌により発酵させることを含んでなる、発酵乳を製造する方法が提供される。また、好ましい態様によれば、発酵乳を製造する方法は、上記有機酸と核酸原料の共存下で乳酸菌発酵させるものである。
　より具体的には、発酵乳を製造する方法は、原料乳調製工程、原料乳殺菌工程、乳酸菌スターター接種工程および発酵工程を含むことが好ましい。
　原料乳調製工程は、乳酸菌スターターを接種する原料乳を調製する工程である。「原料乳」は、ヨーグルト等の発酵乳の原料となるもので、ヨーグルトミックスや発酵乳ミックス等ともよばれる。本発明では、公知の原料乳を適宜用いることができる。原料乳には、殺菌前のものも、殺菌後のものも含まれる。
　原料乳の具体的な原料には、生乳、殺菌処理した乳、脱脂乳、全脂粉乳、脱脂粉乳、バターミルク、バター、クリーム、ホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ）、ホエイタンパク質単離物（ＷＰＩ）、α（アルファ）－ラクトアルブミン（Ｌａ）、β（ベータ）－ラクトグロブリン（Ｌｇ）等が含まれてもよい。あらかじめ温めたゼラチン等を適宜添加してもよい。原料乳は、公知であり、公知の方法に従って調製することができる。
　好ましい原料乳として、生乳、脱脂乳、脱脂粉乳、クリームが含まれるが、これらに限定されるものではない。より好ましい原料乳としては脱脂乳、脱脂粉乳を挙げることができる。本発明において使用される原料乳中の無脂乳固形分の含有量は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されず、好ましくは６～１１質量％、より好ましくは７～１０質量％である。また、原料乳中の脂肪分の含有量としては、本発明の効果を妨げない限り特に限定されず、好ましくは０．０１～１０質量％、より好ましくは０．０５～５質量％、さらに好ましくは０．１～３質量％を例示することができるが、これらに限定されるものではない。
　原料乳殺菌工程は、原料乳調製工程で調製された原料乳を、例えば加熱によって殺菌する工程である。原料乳は、殺菌されることが好ましい。かかる殺菌としては、例えば加熱による殺菌が挙げられる。殺菌としては、原料乳の雑菌を殺菌できる程度に、加熱温度および加熱時間を調整して加熱処理することができる。例えば、原料乳を８０℃以上、好ましくは９０℃以上に達温殺菌することが好ましい。加熱処理には、公知の方法を用いることができる。
　乳酸菌スターター接種工程は、上記原料乳に、乳酸菌スターターを接種（添加）する工程である。上記乳酸菌スターターとしては、上記乳酸菌スターターの製造方法を経て得られた乳酸菌スターターまたは通常の方法により調製され凍結された乳酸菌スターターや、凍結後に乾燥された乳酸菌スターターを用いることができる。
　ここで、リンゴ酸、フマル酸から選択される少なくとも１つの有機酸と、任意成分の核酸原料は、乳酸菌スターター中の構成成分として原料乳に添加されることが好ましいが、乳酸菌スターターとは別に、添加物としてまたは内因成分として原料乳中に含有させてもよい。原料乳における乳酸菌、有機酸、核酸原料の各成分の添加量は、上記発酵促進剤において記載した量と同様とすることができる。
　発酵工程は、乳酸菌スターターによって原料乳を発酵させる工程である。発酵工程では、例えば、乳酸菌スターターが接種された原料乳を発酵温度域に維持しながら発酵させて発酵乳を得る。本発明において、発酵工程には、公知の方法を用いることができる。発酵温度等の発酵条件は、原料乳や乳酸菌（乳酸菌スターター）の種類や、調製する発酵乳の種類や風味等を考慮して適宜調整することができる。具体的な例として、発酵温度として３０～５０℃程度が挙げられる。この範囲の温度であれば、一般的に乳酸菌が活動しやすいので、効果的に発酵を進めることができる。このときの発酵温度として、好ましくは３０～４５℃程度、より好ましくは３５～４３℃程度である。
　発酵時間は、使用する乳酸菌（乳酸菌スターター）や発酵温度等に応じて適宜調整すればよい。例えば、発酵乳中のｐＨが４．６になることを指標として発酵時間を調整することができる。かかる発酵時間としては、制限はされないが、例えば、２時間～３６時間が挙げられ、好ましくは２．５時間～２４時間であり、より好ましくは４時間～２４時間であってもよい。ｐＨは市販のｐＨ計を用いて測定することができる。
　なお、発酵乳を製造するための装置、および製造条件は、公知のものを用いることができる。例えば、発酵乳を製造する装置として、後発酵製品には、充填後に発酵を行う発酵室、前発酵商品には、発酵を行う発酵タンクおよび発酵乳カードを破砕するためのラインフィルターや均質機等を使用でき、製造条件として、脱酸素装置等を適宜採用することができる。
　発酵乳に含まれるコハク酸は、上述の通り、うま味物質であり、かつ、体重増加抑制作用や耐糖能改善作用、癌増殖抑制作用といった有用な生理機能を有する有機酸である。したがって、１つの態様によれば、本発明の発酵乳は、うま味を向上するための、体重増加を抑制するための、耐糖能を改善するための、または、癌の増殖を抑制するための組成物として提供される。
　その他の態様
　本発明によれば、上述の通り、リンゴ酸およびフマル酸から選択される少なくとも１つの有機酸を所望により核酸原料と組み合わせて、乳酸菌の発酵を促進することができる。したがって、本発明の別の態様によれば、リンゴ酸およびフマル酸から選択される少なくとも１つの有機酸の存在下で、培地（例えば、乳成分を含む培地）または原料乳等を乳酸菌により発酵させることを含んでなる、乳酸菌の発酵促進方法が提供される。また、好ましい別の態様によれば、上記乳酸菌の発酵促進方法は、上記有機酸と核酸原料の共存下で乳酸菌発酵させることを含んでなる。
　本発明によれば、上述のように、乳酸菌の発酵や代謝を促進し、発酵代謝物を短時間で産生することができる。したがって、本発明のさらに別の態様によれば、リンゴ酸およびフマル酸から選択される少なくとも１つの有機酸の存在下で、培地（例えば、乳成分を含む培地）または原料乳等を乳酸菌発酵させることを含んでなる、乳酸菌発酵代謝物の産生方法または産生促進方法が提供される。また、好ましい別の態様によれば、上記方法は、上記有機酸と核酸原料の共存下で乳酸菌発酵させることを含んでなる。上記発酵代謝物として、好ましくは、コハク酸、細胞外多糖（ＥＰＳ）、ペプチド等が挙げられ、より好ましくは、細胞外多糖（ＥＰＳ）である。
　また、本発明のさらに別の態様によれば、乳酸菌の発酵を促進するための、リンゴ酸およびフマル酸から選択される少なくとも１つの有機酸が提供される。また、好ましいさらに別の態様によれば、上記有機酸は、核酸原料の共存下で乳酸菌発酵させる。
　また、本発明のさらに別の態様によれば、乳酸菌の発酵促進剤の製造における、リンゴ酸およびフマル酸から選択される少なくとも１つの有機酸の使用が提供される。また、好ましいさらに別の態様によれば、上記有機酸は、核酸原料と併用される。
　また、本発明のさらに別の態様によれば、乳酸菌スターターの製造における、リンゴ酸およびフマル酸から選択される少なくとも１つの有機酸の使用が提供される。また、好ましいさらに別の態様によれば、上記有機酸は、核酸原料と併用される。
　また、本発明のさらに別の態様によれば、発酵乳の製造における、リンゴ酸およびフマル酸から選択される少なくとも１つの有機酸の使用であって、該有機酸の存在下で乳酸菌発酵させることを含んでなる使用が提供される。また、好ましいさらに別の態様によれば、上記有機酸は、核酸原料と併用される。より好ましいさらに別の態様によれば、上記発酵乳がコハク酸を含んでなり、該コハク酸は乳酸菌により産生される内因性の有機酸であってもよい。
　上述の、乳酸菌の発酵促進方法、有機酸、および使用の各態様は、本発明の発酵促進剤、乳酸菌スターター、発酵乳の製造方法に関する記載に準じて実施することができる。
　以下、実施例により、本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術範囲は、これらの例示に限定されるものではない。なお、特に記載しない限り、本発明で用いられる全ての比率は質量による。また、特に記載しない限り、本明細書に記載の単位および測定方法はＪＩＳ規格による。
試験例１：リンゴ酸またはフマル酸のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（以下、「Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ」ともいう）に対する発酵促進効果の検討
　まず、下記のラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　菌株の凍結菌を用意した。
（１）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　２０３８（以下、「２０３８」ともいう）
（２）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　ＯＬＬ１０７３Ｒ－１（以下、「ＯＬＬ　１０７３Ｒ－１」ともいう）
（３）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　Ｐ１９０２９０１（以下、「Ｐ１９０２９０１」ともいう）
（４）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　ＯＬＬ１１７１（以下、「ＯＬＬ１１７１」ともいう）
（５）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　ＯＬＬ１２５５（以下、「ＯＬＬ１２５５」ともいう）
（６）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　ＯＬＬ１２４７（以下、「ＯＬＬ１２４７」ともいう）
（７）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　ＯＬＬ２０５０１３（以下、「ＯＬＬ２０５０１３」ともいう）
　賦活培地にて、上記の菌株を賦活してから使用した。賦活培地としては、０．１質量％酵母エキスを含む１０質量％還元脱脂乳培地を１２１℃、７分殺菌したものを用いた。ここで、１０質量％還元脱脂乳培地は、脱脂粉乳（脂肪分１質量％、タンパク質３４質量％、乳糖５４質量％、灰分８質量％、無脂乳固形分９６質量％）（株式会社明治製）の１０質量％水溶液である（上記培地中、乳糖含量５．４質量％、無脂乳固形分９．６質量％）。上記賦活培地に凍結菌を（賦活培地量に対して）０．１質量％添加し、３７℃１６時間静置培養し、賦活液を得た。得られた賦活液０．１質量％（賦活培地量に対して）を別の賦活培地に添加し、３７℃で１６時間静置培養し、乳酸菌スターターを得た。
　その後、原料乳として発酵培地を用いて発酵を行った。発酵培地としては、ギ酸を終濃度１ｍＭとなるよう添加した１０質量％還元脱脂乳培地を９５℃達温殺菌したものを用いた。また、上記発酵培地には、殺菌前にＮａＯＨでｐＨ約６．５に調整したフマル酸水溶液またはリンゴ酸水溶液を、終濃度１ｍＭとなるよう添加した。上記発酵培地のｐＨは約６．４であった。上記で得られた各菌株の乳酸菌スターターを上記発酵培地に（発酵培地量に対して）０．５質量％接種し、４０℃で静置培養し、発酵を行った。発酵時間は、ｐＨ４．６に到達するまでに要した時間とした。ｐＨは市販のｐＨ計を用いて測定した。得られた結果を表１に示す。表１より、リンゴ酸またはフマル酸の添加により、Ｌ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　７株全ての発酵が促進されたことがわかる。Ｌ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓに対するリンゴ酸とフマル酸の発酵促進効果はほぼ同等であった。発酵短縮時間は株によって異なり、４０分～１２時間１５分であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
試験例２－１：Ｌ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　２０３８株に対して発酵促進効果を示すリンゴ酸、フマル酸の濃度の検討
　発酵培地（原料乳）を用いて発酵を行った。発酵培地としては、ギ酸を終濃度１ｍＭとなるよう添加した１０％還元脱脂乳培地を９５℃達温殺菌したものを用いた。また、上記発酵培地には、殺菌前にＮａＯＨでｐＨ約６．５に調整したフマル酸水溶液またはリンゴ酸水溶液を、表３、４に記載の終濃度となるよう添加した。上記発酵培地にＬ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　２０３８株の乳酸菌スターターを（発酵培地量に対して）０．５％接種し、４０℃で静置培養し、発酵を行った。発酵時間は、ｐＨ４．６に到達するまでに要した時間とした。
　発酵終了後の有機酸濃度の測定は以下の様に行った。得られた発酵物（発酵乳）０．４ｇを純水で２倍希釈し、カレッツ試薬Ｉ（５３．５％（ｗ／ｖ）硫酸亜鉛）を２０μＬ添加してボルテックスし、カレッツ試薬ＩＩ（１７．２％（ｗ／ｖ）フェロシアン化カリウム）を２０μｌ添加してボルテックスした。４℃、２０６２０ｇ、１０分遠心分離し、上清を０．２２μｍフィルターでろ過したものを表２の条件で分析した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　得られた結果を表３～５に示す。表３、４より、Ｌ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　２０３８株は０．０１～２．５ｍＭのフマル酸、０．０１～５０ｍＭのリンゴ酸において発酵促進効果が確認された。また、リンゴ酸、フマル酸ともに、０．０１ｍＭという低濃度でも発酵促進効果を示した。発酵後の有機酸濃度を測定した結果、添加したリンゴ酸やフマル酸の濃度が低下し、コハク酸の濃度が上昇していた（表５）。すなわち、添加したリンゴ酸やフマル酸は、還元的ＴＣＡ回路により、リンゴ酸→フマル酸→コハク酸の向きに代謝されていることが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
試験例２－２：Ｌ．　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓにおける、リンゴ酸、フマル酸添加時のコハク酸産生量
　賦活培地にて、表６および７に示す菌株を賦活してから使用した。賦活培地としては、０．１質量％酵母エキスを含む１０質量％還元脱脂乳培地を１２１℃、７分殺菌したものを用いた。ここで、１０質量％還元脱脂乳培地は、脱脂粉乳（脂肪分１質量％、タンパク質３４質量％、乳糖５４質量％、灰分８質量％、無脂乳固形分９６質量％）（株式会社明治製）の１０質量％水溶液である（上記培地中、乳糖含量５．４質量％、無脂乳固形分９．６質量％）。上記賦活培地に凍結菌を（賦活培地量に対して）０．１質量％添加し、３７℃で１６時間静置培養し、賦活液を得た。得られた賦活液０．１質量％（賦活培地量に対して）を別の賦活培地に添加し、３７℃で１６時間静置培養し、乳酸菌スターターを得た。
　その後、原料乳として発酵培地を用いて発酵を行った。発酵培地としては、ギ酸を終濃度１ｍＭとなるよう添加した１０質量％還元脱脂乳培地を９５℃達温殺菌したものを用いた。また、上記発酵培地には、殺菌前にＮａＯＨでｐＨ約６．５に調整したフマル酸水溶液またはリンゴ酸水溶液を、終濃度１ｍＭとなるよう添加した。上記発酵培地のｐＨは約６．４であった。上記で得られた各菌株の乳酸菌スターターを上記発酵培地に（発酵培地量に対して）２．５質量％接種し、４０℃で静置培養し、発酵を行った。発酵時間は、ｐＨ４．６に到達するまでに要した時間とした。ｐＨは市販のｐＨ計を用いて測定した。得られた結果を表６および７に示す。表６より、いずれのＬ．　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　株においても、リンゴ酸、フマル酸の添加により、コハク酸の濃度が上昇していた。また、表７より、試験例１と同様に、リンゴ酸またはフマル酸の添加により、Ｌ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　７株全ての発酵が促進された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
試験例３：Ｌ．　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ以外の乳酸菌種に対するフマル酸の発酵促進効果の検討
　まず、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス以外の以下の菌種の基準株を用意した。
（８）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ　ＪＣＭ　１１３２Ｔ
（９）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｇａｓｓｅｒｉ　ＪＣＭ　１１３１Ｔ
（１０）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｒｈａｍｎｏｓｕｓ　ＪＣＭ　１１３６Ｔ
（１１）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｒｅｕｔｅｒｉ　ＪＣＭ　１１１２Ｔ
（１２）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ　ＪＣＭ　１２３１Ｔ
（１３）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｅｎｔｏｓｕｓ　ＪＣＭ　１５５８Ｔ
　賦活培地にて、上記の菌株を賦活してから使用した。賦活培地としては、０．１％酵母エキスを含む１０％還元脱脂乳培地を１２１℃、７分殺菌したものを用いた。上記賦活培地に凍結菌を（賦活培地量に対して）１％添加し、３７℃で２４時間静置培養し、賦活液を得た。得られた賦活液１％（賦活培地量に対して）を別の賦活培地に添加し、３７℃で２４時間静置培養し、乳酸菌スターターを得た。
　その後、発酵培地（原料乳）を用いて発酵を行った。発酵培地としては、ギ酸を終濃度１ｍＭとなるよう添加した１０％還元脱脂乳培地を９５℃達温殺菌したものを用いた。また、上記発酵培地には、殺菌前にＮａＯＨでｐＨ約６．５に調整したフマル酸水溶液を、終濃度１ｍＭとなるよう添加した。上記発酵培地に上記で賦活した各菌株の乳酸菌スターターを（発酵培地量に対して）１％接種し、３７℃で静置培養し、発酵を行った。発酵時間は、ｐＨ４．６に到達するまでに要した時間とした。得られた結果を表８に示す。フマル酸の添加により、Ｌ．　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．　ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌ．　ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌ．　ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌ．　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、およびＬ．　ｐｅｎｔｏｓｕｓで発酵が促進された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
試験例４：Ｌ．　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ以外の乳酸菌種に対するリンゴ酸の発酵促進効果の検討
　まず、以下の菌種の基準株を用意した。
（１２）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ　ＪＣＭ　１２３１Ｔ
（１３）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｅｎｔｏｓｕｓ　ＪＣＭ　１５５８Ｔ
（１４）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ　ｓｕｂｓｐ．　ｋｅｆｉｒｇｒａｎｕｍ　ＪＣＭ　８５７２Ｔ
　フマル酸の代わりにリンゴ酸を添加する以外は試験例３と同様に行った。得られた結果を表９に示す。リンゴ酸の添加により、Ｌ．　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌ．　ｐｅｎｔｏｓｕｓおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ　ｓｕｂｓｐ．　ｋｅｆｉｒｇｒａｎｕｍで発酵が促進された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
試験例５：Ｌ．　ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌ．　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓにおけるリンゴ酸、フマル酸およびコハク酸の濃度の測定
　試験例３または４における、Ｌ．　ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌ．　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓの発酵終了後の有機酸濃度の測定を試験例２－１と同様に行った。得られた結果を表１０に示す。リンゴ酸やフマル酸の添加により、Ｌ．　ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌ．　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓにおいてコハク酸の産生が促進された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
試験例６：イノシン酸添加時のフマル酸のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓに対する発酵促進効果の検討
　下記のラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　菌株の凍結菌を用意した。
（１）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　２０３８
（２）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　ＯＬＬ１０７３Ｒ－１
（３）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　Ｐ１９０２９０１
（４）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　ＯＬＬ１１７１
（５）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　ＯＬＬ１２５５
（６）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　ＯＬＬ１２４７
（７）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　ＯＬＬ２０５０１３
　賦活培地にて、上記の菌株を賦活してから使用した。賦活培地としては、０．１％酵母エキスを含む１０％還元脱脂乳培地を１２１℃、７分殺菌したものを用いた。上記賦活培地に凍結菌を（賦活培地量に対して）１％添加し、３７℃で２４時間静置培養し、賦活液を得た。得られた賦活液１％（賦活培地量に対して）を別の賦活培地に添加し、３７℃で２４時間静置培養し、乳酸菌スターターを得た。
　その後、発酵培地（原料乳）を用いて発酵を行った。発酵培地としては、イノシン酸を終濃度１ｍＭとなるよう添加した１０％還元脱脂乳培地を９５℃達温殺菌したものを用いた。また、上記発酵培地には、殺菌前にＮａＯＨでｐＨ約６．５に調整したフマル酸水溶液を、終濃度１ｍＭとなるよう添加した。上記発酵培地に上記で賦活した各菌株の乳酸菌スターターを（発酵培地量に対して）１％接種し、３７℃で静置培養し、発酵を行った。発酵時間は、ｐＨ４．６に到達するまでに要した時間とした。ｐＨはｐＨ計を用いて測定した。得られた結果を表１１に示す。表１１より、フマル酸の添加により、Ｌ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　７株全ての発酵が促進された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
試験例７：イノシン酸添加時のリンゴ酸のＬ．　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓに対する発酵促進効果の検討
　下記のラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　菌株の凍結菌を用意した。
（１）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　２０３８
（２）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　ＯＬＬ１０７３Ｒ－１
（３）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　Ｐ１９０２９０１
（４）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　ＯＬＬ１１７１
（５）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　ＯＬＬ１２４７
　フマル酸の代わりにリンゴ酸を添加する以外は試験例６と同様に行った。得られた結果を表１２に示す。リンゴ酸の添加により、Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　２０３８株、ＯＬＬ１０７３Ｒ－１株、Ｐ１９０２９０１株、ＯＬＬ１１７１株、およびＯＬＬ１２４７株で発酵が促進された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
試験例８：イノシン酸添加時において、リンゴ酸またはフマル酸がＬ．　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓのコハク酸産生に与える影響
　賦活培地にて、表１３および１４に示す菌株を賦活してから使用した。賦活培地としては、０．１質量％酵母エキスを含む１０質量％還元脱脂乳培地を１２１℃、７分殺菌したものを用いた。ここで、１０質量％還元脱脂乳培地は、脱脂粉乳（脂肪分１質量％、タンパク質３４質量％、乳糖５４質量％、灰分８質量％、無脂乳固形分９６質量％）（株式会社明治製）の１０質量％水溶液である（上記培地中、乳糖含量５．４質量％、無脂乳固形分９．６質量％）。上記賦活培地に凍結菌を（賦活培地量に対して）０．１質量％添加し、３７℃で１６時間静置培養し、賦活液を得た。得られた賦活液０．１質量％（賦活培地量に対して）を別の賦活培地に添加し、３７℃で１６時間静置培養し、乳酸菌スターターを得た。
　その後、原料乳として発酵培地を用いて発酵を行った。発酵培地としては、イノシン酸を終濃度１ｍＭとなるよう添加した１０質量％還元脱脂乳培地を９５℃達温殺菌したものを用いた。また、上記発酵培地には、殺菌前にＮａＯＨでｐＨ約６．５に調整したフマル酸水溶液またはリンゴ酸水溶液を、終濃度１ｍＭとなるよう添加した。上記発酵培地のｐＨは約６．４であった。上記で得られた各菌株の乳酸菌スターターを上記発酵培地に（発酵培地量に対して）２．５質量％接種し、４０℃で静置培養し、発酵を行った。発酵時間は、ｐＨ４．６に到達するまでに要した時間とした。ｐＨは市販のｐＨ計を用いて測定した。得られた結果を表１３および１４に示す。表１３より、イノシン酸入りの培地において、いずれのＬ．　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　株においても、リンゴ酸、フマル酸の添加により、コハク酸の濃度が上昇していた。したがって、ギ酸添加培地のみならず、イノシン酸添加培地においても、リンゴ酸、フマル酸の添加により、Ｌ．　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓのコハク酸産生量が増加することが示された。また、表１４より、試験例６と同様に、リンゴ酸またはフマル酸の添加により、Ｌ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　７株全ての発酵が促進された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
試験例９：リンゴ酸またはフマル酸がＬ．　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの増殖性と代謝物生産に与える影響
　Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　ＯＬＬ１０７３Ｒ－１菌株の凍結菌を用意した。
　培地の組成は下表１５に従った。無水結晶ぶどう糖以外の原料成分をＥｌｉｘ水に溶解し、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ６．６５に調整した後、培地仕込み量の７割の重量にメスアップした。無水結晶ぶどう糖はＥｌｉｘ水に溶解し、培地仕込み量の３割の重量にメスアップした。リンゴ酸またはフマル酸を添加する場合、無水結晶ぶどう糖以外の原料成分とともにＥｌｉｘ水に終濃度４ｍＭとなるよう溶解して添加した。
　なお、糖液、糖以外の原料成分は、それぞれ１１０℃、１分間のオートクレーブ処理にて加熱殺菌した後、無菌的に混合して使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　６Ｎ炭酸カリウムを用いて上記培地１．５ｋｇをｐＨ５．４に調整し、凍結菌を（培地量に対して）０．３０質量％接種し、０．５Ｌ／ｍｉｎの流量で窒素上面通気をしつつ、１５０ｒｐｍの条件で撹拌しながら３７℃で培養した。
　培養時間に対するＥＰＳ濃度推移を図１に示す。
　図１に示す通り、リンゴ酸またはフマル酸を添加した場合では、コントロールと比較してＥＰＳ濃度が高まることを確認した。このことから、リンゴ酸、フマル酸添加によりＬ．　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの代謝産物であるＥＰＳの産生を促進することができることが分かった。また、リンゴ酸またはフマル酸を添加した場合では、コントロールと比較して短時間でＥＰＳ濃度が高まることから、リンゴ酸またはフマル酸は、Ｌ．　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの発酵を促進することが再確認できた。
　ＥＰＳ濃度の測定は、下記の条件で行った。
　培養液を１．５ｇ計りこみ、ＭｉｌｌｉＱ水を添加して１０ｇとした。１００％トリクロロ酢酸を加えてよく混合し、遠心（４℃、１３４００ｇ、１０ｍｉｎ）した後に上清を回収した。沈殿に１０％トリクロロ酢酸溶液を５ｍｌ加えて懸濁した後、再度遠心して上清を回収した。冷却した９９．５％エタノールを上清の２倍量添加し、転倒混和した後１晩－２０℃で静置した。
　遠心（４℃、１３４００ｇ、２０ｍｉｎ）して上清を除き、冷却した６６％エタノールを２０ｍｌ加えて沈殿を懸濁した。遠心（４℃、１３４００ｇ、２０ｍｉｎ）して上清を除き、風乾してエタノールを除去した後にＭｉｌｌｉＱ水を加えて１０ｍｌに定容したものを分析サンプルとした。分析サンプルのＥＰＳ濃度はフェノール硫酸法にて測定した。
[規則26に基づく補充 28.01.2021]　
Figure WO-DOC-FIGURE-134
[規則26に基づく補充 28.01.2021]　
Figure WO-DOC-FIGURE-134a

Claims (26)

  1. 　リンゴ酸およびフマル酸から選択される少なくとも１つの有機酸を含んでなる、乳酸菌の発酵促進剤。
  2. 　核酸原料と併用するための、請求項１に記載の発酵促進剤。
  3. 　前記核酸原料が、ギ酸および２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物から選択される少なくとも一つのものである、請求項２に記載の発酵促進剤。
  4. 　前記乳酸菌がラクトバチルス属菌を含んでなる、請求項１～３のいずれか一項に記載の発酵促進剤。
  5. 　ラクトバチルス属菌が、ラクトバチルス・デルブルッキー、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・ラムノーサス、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・サリバリウスおよびラクトバチルス・ペントサスからなる群から選択される少なくとも一つである、請求項４に記載の発酵促進剤。
  6. 　乳酸菌と、リンゴ酸およびフマル酸から選択される少なくとも１つの有機酸とを含んでなる、乳酸菌スターター。
  7. 　核酸原料をさらに含んでなる、請求項６に記載の乳酸菌スターター。
  8. 　リンゴ酸およびフマル酸から選択される少なくとも１つの有機酸の存在下で乳酸菌発酵させることを含んでなる、発酵乳を製造する方法。
  9. 　前記有機酸と核酸原料の共存下で乳酸菌発酵させることを含んでなる、請求項８に記載の方法。
  10. 　前記発酵乳がコハク酸を含んでなる、請求項８または９に記載の方法。
  11. 　前記コハク酸が、前記乳酸菌により産生される内因性の有機酸である、請求項１０に記載の方法。
  12. 　請求項８～１１のいずれか一項に記載の方法により得られる発酵乳であって、
    　前記発酵乳が、乳酸菌とコハク酸とを含んでなる、発酵乳。
  13. 　前記コハク酸が、前記乳酸菌により産生される内因性の有機酸である、請求項１２に記載の発酵乳。
  14. 　前記コハク酸の含有量が、発酵乳全量に対して０．１５ｍＭ以上である、請求項１３に記載の発酵乳。
  15. 　リンゴ酸およびフマル酸から選択される少なくとも１つの有機酸をさらに含んでなる、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の発酵乳。
  16. 　リンゴ酸およびフマル酸から選択される少なくとも１つの有機酸の存在下で乳酸菌発酵させることを含んでなる、乳酸菌の発酵促進方法。
  17. 　核酸原料をさらに含んでなる、請求項１６に記載の乳酸菌の発酵促進方法。
  18. 　リンゴ酸およびフマル酸から選択される少なくとも１つの有機酸の存在下で乳酸菌を培養させることを含んでなる、乳酸菌スターターを製造する方法。
  19. 　前記有機酸と核酸原料の共存下で乳酸菌を培養させることを含んでなる、請求項１８に記載の方法。
  20. 　前記乳酸菌スターターが、乳酸菌と、リンゴ酸およびフマル酸から選択される少なくとも１つの有機酸とを含んでなる、請求項１８または１９に記載の方法。
  21. 　前記乳酸菌スターターがコハク酸をさらに含んでなる、請求項２０に記載の方法。
  22. 　前記コハク酸が、前記乳酸菌により産生される内因性の有機酸である、請求項２１に記載の方法。
  23. 　コハク酸の含有量が、発酵乳全量に対して０．１５ｍＭ以上である発酵乳。
  24. 　リンゴ酸およびフマル酸から選択される少なくとも１つの有機酸をさらに含んでなる、請求項２３に記載の発酵乳。
  25. 　前記コハク酸が、前記乳酸菌により産生される内因性の有機酸である、請求項２３または２４に記載の発酵乳。
  26. 　リンゴ酸およびフマル酸から選択される少なくとも１つの有機酸の存在下で乳酸菌発酵させることを含んでなる、乳酸菌発酵代謝物の産生方法。
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