CN115047117B - 一种同时测定利奈唑胺中3种遗传毒杂质的检测方法 - Google Patents
一种同时测定利奈唑胺中3种遗传毒杂质的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及药物分析技术领域，更具体而言，涉及一种同时测定利奈唑胺中3种遗传毒杂质的检测方法。3种遗传毒杂质为杂质K、杂质L和杂质M；检测方法使用高效液相色谱仪进行，流动相由流动相A和流动相B组成，采用梯度洗脱。具体操作步骤为：供试品溶液：溶液A；对照品溶液：溶液B、C和D；系统适用性溶液：溶液E；调节仪器：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A，流动相B，调节柱温，调节流动相流速和检测波长，采用梯度洗脱；测定：精密量取S1～S4制成的各溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。本发明根据产品结构特点及化合物性质，提供了一种采用高效液相色谱仪即可同时测定利奈唑胺中3种遗传毒杂质的检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，更具体而言，涉及一种同时测定利奈唑胺中3种遗传毒杂质的检测方法。
背景技术
利奈唑胺是第一个用于治疗革兰阳性球菌感染的噁唑烷酮类新型抗菌药物，具有良好的组织穿透力，给药后在组织和体液中分布广泛，具有独特的作用机制，由于本品的特殊结构，与其他抗菌药多无交叉耐药现象，在治疗多重耐药革兰阳性菌感染时具有很高的有效性和安全性，尤其对MRSA、耐万古霉素肠球菌(VREF)有良好的抗菌作用，是治疗耐万古霉素肠球菌感染的唯一药物。口服吸收迅速而且完全,F为100％，Tmax为1～2h，具有重要的临床地位。
然而，利奈唑胺原料合成工艺会引入多个遗传毒性杂质，遗传毒杂质在很低的浓度下即可诱导基因突变并导致染色体的断裂和重排，具有潜在的致癌性，可能会危害病人的健康，因此需要进行严格控制。原料药中微量的反应试剂或副产物等会作为杂质存在于终产品中，均需要子以关注。现有技术中常用液相质谱联用仪方法进行检测，检测成本高、耗时长且灵敏度不高给制药企业带来成本上的问题，不利于推广和使用。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一，为此，本发明的一个方面的目的在于，提供一种同时测定利奈唑胺中3种遗传毒杂质的检测方法。
本发明所述3种遗传毒杂质为杂质K、杂质L和杂质M；所述检测方法使用高效液相色谱仪进行，流动相由流动相A和流动相B组成。采用高效液相色谱法对利奈唑胺杂质进行测定时，流动相中流动相的比例对杂质的分离有较大影响，当采用固定比例的流动相A与流动相B进行检测时，难以将杂质很好的分离。
杂质K化学名称为3-氟-4-(4-吗啉基)-苯胺，结构式为
杂质L化学名称为(S)-N-缩水甘油邻苯二甲酰亚胺，结构式为
杂质M化学名称为2,3-二氢-酞嗪-1,4-二酮，结构式为
本发明所述检测方法的具体操作步骤为：
S1.供试品溶液：取利奈唑胺，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成溶液A；
S2.对照品溶液：取杂质K、杂质L和杂质M对照品，分别精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成溶液B、C和D；
S3.系统适用性溶液：取利奈唑胺与杂质K、杂质L、杂质M，分别精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成溶液E；
S4.调节仪器：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A，流动相B，调节柱温，调节流动相流速，调节检测波长，采用梯度洗脱；
S5.测定：精密量取S1～S4制成的各溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
优选的，所述S1中溶液A的浓度为1.8～2.2mg/ml。
优选的，所述S2中溶液B、C和D的浓度均为0.025～0.035μg/ml。
优选的，所述S3中溶液E每1ml中含杂质K、杂质L和杂质M各0.03μg，含利奈唑胺2mg。
优选的，所述S1～S3中溶剂为10％乙腈。
优选的，所述S4中色谱柱的规格为150×4.6mm，5μm，优选YMC-Pack ODS-AM C18150×4.6mm，5μm。
优选的，所述的流动相A为磷酸二氢钾缓冲液，磷酸盐缓冲液浓度为0.02mol/L(称取磷酸二氢钾2.72g，加水1000ml溶解)，用磷酸调节pH值至2.1，所述流动相B为10％乙腈；调节柱温为25～35℃，调节流动相流速为0.9ml/min～1.1ml/min，调节检测波长分别为218nm～222nm检测杂质L和杂质M，238nm～242nm检测杂质K。更进一步的通过本发明发现，当杂质L与杂质M检测波长为220nm，杂质K检测波长为240nm时，检测灵敏度高，能够有效的控制各杂质的含量。
优选的，所述采用梯度洗脱，流动相的总体积为100％计，
在0～20分钟，流动相A的体积由92％递减为85％，流动相B的体积由8％递增为15％；
在20～30分钟，流动相A的体积由85％递减为70％，流动相B的体积由15％递增为30％；
在30～45分钟，流动相A的体积由70％递减为30％，流动性B的体积由30％递增为70％。
优选的，所述S5中取溶液100μl，注入液相色谱仪测量。
本发明所具有的有益效果如下：
本发明根据产品结构特点及化合物性质，提供了一种采用高效液相色谱仪即可同时测定利奈唑胺中3种遗传毒杂质的检测方法。采用梯度洗脱色谱条件，进一针能同时测定上述3种极性差别较大的遗传毒杂质，各杂质与利奈唑胺均可有效分离，并满足各杂质的限度要求(检测限低于1ppm)，而且灵敏度高，检测成本和操作难度大大降低。
本发明方法采用设备简单、分析速度快、检测成本低，能够快速、简便、准确地控制遗传毒杂质的量，降低药物安全风险。本发明方法专属性强、重现性高，便于对利奈唑胺遗传毒杂质监控，有利于利奈唑胺遗传毒性杂质检测方法普及。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是本发明实施例一系统适用性溶液色谱示意图；
图2是本发明实施例二杂质K定量限溶液色谱示意图；
图3是本发明实施例二杂质M定量限溶液色谱示意图；
图4是本发明实施例二杂质L定量限溶液色谱示意图；
图5是本发明实施例三杂质K线性示意图；
图6是本发明实施例三杂质M线性示意图；
图7是本发明实施例三杂质L线性示意图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施例对本发明进行进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于此描述的方式来实施，因此，本发明的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。
本实施例提供一种采用高效液相色谱仪同时测定利奈唑胺中3种遗传毒杂质的检测方法，采用以下条件进行测定：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱的规格为YMC-Pack ODS-AM C18150×4.6mm,5μm；流动相A：磷酸二氢钾缓冲液(称取磷酸二氢钾2.72g，加水1000ml溶解，用磷酸调节pH值至2.1)；流动相B：10％乙腈；流速：0.9ml/min～1.1ml/min；柱温：25～35℃；检测波长：218nm～222nm(杂质L、杂质M)、238nm～240nm(杂质K)；采用梯度洗脱，流动相的总体积为100％计。
在0～20分钟，流动相A的体积由92％递减为85％，流动相B的体积由8％递增为15％；
在20～30分钟，流动相A的体积由85％递减为70％，流动相B的体积由15％递增为30％；
在30～45分钟，流动相A的体积由70％递减为30％，流动性B的体积由30％递增为70％。
用溶剂(10％乙腈)将利奈唑胺稀释为1.8～2.2mg/ml，优选2mg/ml作为供试品溶液。
用溶剂(10％乙腈)将杂质K对照品、杂质L对照品和杂质M对照品分别稀释为0.025～0.035μg/ml，优选0.03μg/ml作为对照品溶液。
用溶剂(10％乙腈)稀释利奈唑胺对照品、杂质K对照品、杂质L对照品和杂质M对照品，制成每1ml中含杂质K、杂质L和杂质M各0.03μg，含利奈唑胺2mg的溶液，作为系统适用性溶液。
各溶液的具体配置过程及本发明方法的实验验证过程及结果见实验例一至四。
发明实施例一
系统适用性试验
供试品溶液：取利奈唑胺适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中含2mg的溶液。
对照品溶液：取杂质K、杂质L、杂质M对照品各适量，分别精密称定，用10％乙腈溶解并定量稀释制成每1ml中含0.03μg的溶液。
系统适用性溶液：取利奈唑胺与杂质K、杂质L、杂质M各适量，分别精密称定，加10％乙腈溶解并定量稀释制成每1ml中含杂质K、杂质L和杂质M各0.03μg，含利奈唑胺2mg的溶液。
色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A：磷酸盐缓冲液(称取磷酸二氢钾2.72g，加水1000ml溶解，用磷酸调节pH值至2.1)，流动相B：10％乙腈，柱温：30℃，流速：1.0ml/min，检测波长：220nm(杂质L、杂质M)、240nm(杂质K)，采用梯度洗脱。
测定：精密量取上述溶液100μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果如下
表1～2所示，系统适用性色谱图如图1所示。
表1.专属性-杂质定位试验结果
| 序号 | 杂质K峰面积 | 杂质M峰面积 | 杂质L峰面积 |
| 1 | 9078 | 22023 | 35154 |
| 2 | 9073 | 22089 | 34840 |
| 3 | 9079 | 22081 | 34723 |
| 4 | 9056 | 22016 | 34651 |
| 5 | 9045 | 22028 | 34428 |
| 6 | 9088 | 21892 | 34302 |
| RSD(％) | 0.18 | 0.32 | 0.87 |
表2.专属性-进样精密度试验结果
结论：空白溶剂(10％乙腈)不干扰各杂质检测，各杂质之间，杂质与主峰之间分离，杂质K、杂质M、杂质L进样精密度的RSD均小于1.0％。进样精密度良好。本方法专属性良好。
发明实施例二
定量限与检测限试验
定量限和检测限是根据信噪比来确定。配制一定浓度的溶液，将测出的信号与空白处的信号(基线噪音)进行比较，计算有效检出浓度。信噪比约为10的浓度作为定量限，信噪比约为3的浓度作为检测限，结果如下表3～4所示。
表3.定量限试验结果
表4.检测限试验结果
结论：色谱图如图2所示，杂质K定量限浓度为0.0033μg/ml(相当于供试品浓度1.6ppm)，信噪比为12.71，重复进样6次，峰面积的RSD为4.06％；杂质K检测限浓度：0.0013μg/ml(相当于供试品浓度0.65ppm)，信噪比为5.38。
色谱图如图3所示，杂质M定量限浓度为0.0010μg/ml(相当于供试品浓度0.5ppm)，信噪比为11.14，重复进样6次，峰面积的RSD为6.97％；杂质M检测限浓度：0.0003μg/ml(相当于供试品浓度0.15ppm)，信噪比为4.30。
色谱图如图4所示，杂质L定量限浓度为0.0006μg/ml(相当于供试品浓度0.3ppm)，信噪比为8.47，重复进样6次，峰面积的RSD为9.28％。杂质L检测限浓度：0.0003μg/ml(相当于供试品浓度0.15ppm)，信噪比为4.23。
实施例三
线性与范围实验
线性溶液：取杂质K、杂质M、杂质L对照品各适量，精密称定，依次用10％乙腈溶解并稀释制成相当于检测浓度0.003％直至定量限一系列溶液，进行研究。
精密量取上述溶液100μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如下表5～7所示，杂质K、杂质M和杂质L线性图如图5～7所示。
| 相当于供试品浓度(％) | 浓度(μg/ml) | 峰面积 |
| 0.0033 | 0.065 | 17337 |
| 0.0025 | 0.049 | 13143 |
| 0.0016 | 0.033 | 8573 |
| 0.0008 | 0.016 | 4417 |
| 0.0003 | 0.007 | 1708 |
| 0.0002 | 0.003 | 1089 |
表5.杂质K范围试验结果
杂质K线性回归方程：y＝263888.7852x+88.7391，相关系数：r＝0.9998，Y轴截距相当于100％浓度响应值的百分比：1.04％。
| 相当于供试品浓度(％) | 浓度(μg/ml) | 峰面积 |
| 0.00330 | 0.066 | 41971 |
| 0.00248 | 0.050 | 31752 |
| 0.00165 | 0.033 | 20874 |
| 0.00083 | 0.017 | 10489 |
| 0.00033 | 0.007 | 4381 |
| 0.00005 | 0.0010 | 589 |
表6.杂质M范围试验结果
杂质M线性回归方程：y＝636054.4191x+29.9285，相关系数：r＝0.9999，Y轴截距相当于100％浓度响应值的百分比：0.14％。
| 相当于供试品检测浓度％ | 浓度(μg/ml) | 峰面积 |
| 0.0030 | 0.061 | 65295 |
| 0.00228 | 0.046 | 49121 |
| 0.00152 | 0.030 | 31742 |
| 0.00076 | 0.015 | 16088 |
| 0.00030 | 0.006 | 6227 |
| 0.00003 | 0.0006 | 557 |
表7.杂质L范围试验结果
杂质L线性回归方程：y＝1079168.9017x-332.6374，相关系数：r＝0.9999，Y轴截距相当于100％浓度响应值的百分比：1.05％。
结论：杂质K在0.003μg/ml～0.065μg/ml(相当于供试品浓度0.0002％～0.0033％)的浓度范围内，线性方程为y＝263888.7852x+88.7391，r＝0.9998，Y轴截距相当于100％响应值的百分比为1.04％，线性关系良好。
杂质M在0.0010μg/ml～0.066μg/ml(相当于供试品浓度0.00005％～0.0033％)的浓度范围内，线性方程为y＝636054.4191x+29.9285，r＝0.9999，Y轴截距相当于100％响应值的百分比为0.14％，线性关系良好。
杂质L在0.0006μg/ml～0.061μg/ml(相当于供试品浓度0.00003％～0.0030％)的浓度范围内，线性方程为y＝1079168.9017x-332.6374，r＝0.9999，Y轴截距相当于100％响应值的百分比为1.05％，线性关系良好。
实施例四
回收率实验
空白溶液：取利奈唑胺适量，用10％乙腈溶解并定量稀释制成每1ml中约含2mg的溶液。
对照品贮备液：分别取杂质K、杂质M、杂质L对照品适量，精密称定，加10％乙腈溶解并定量稀释制成每1ml中分别约含1μg的溶液。
50％回收率溶液：取利奈唑胺约40mg，精密称定，置20ml量瓶中，加入对照品储备液0.3ml，用10％乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀。
100％回收率溶液：取利奈唑胺约40mg，精密称定，置20ml量瓶中，加入对照品储备液0.6ml，用10％乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀。
150％回收率溶液：取利奈唑胺约40mg，精密称定，置20ml量瓶中，加入对照品储备液0.9ml，用10％乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀。
精密量取上述溶液100μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果如下表8～10所示。
表8.杂质K准确度试验结果
表9.杂质M准确度试验结果
表10.杂质L准确度试验结果
结论：杂质K(240nm)的回收率在97.6％～101.6％之间，RSD为1.5％；准确度良好。杂质M(220nm)的回收率在97.0％～100.2％之间，RSD为1.3％；准确度良好。杂质L(220nm)的回收率在94.2％～109.6％之间，RSD为3.9％；准确度良好。
以上所述仅为本发明优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明还可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种同时测定利奈唑胺中3种遗传毒杂质的检测方法，其特征在于：所述3种遗传毒杂质为杂质K、杂质L和杂质M；所述检测方法使用高效液相色谱仪进行，流动相由流动相A和流动相B组成，采用梯度洗脱；所述杂质K为3-氟-4-(4-吗啉基)-苯胺，杂质L为(S)-N-缩水甘油邻苯二甲酰亚胺，杂质M为2,3-二氢-酞嗪-1,4-二酮；
色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A，流动相B，调节柱温，调节流动相流速，调节检测波长，采用梯度洗脱；
所述的流动相A为磷酸二氢钾缓冲液，磷酸盐缓冲液浓度为0.02mol/L，用磷酸调节pH值至2.1，所述流动相B为10%乙腈；调节柱温为25～35℃，调节流动相流速为0.9ml/min～1.1ml/min，调节检测波长分别为218nm～222nm检测杂质L和杂质M，238nm～242nm检测杂质K；
所述采用梯度洗脱，流动相的总体积为100%计，
在0～20分钟，流动相A的体积由92%递减为85%，流动相B的体积由8%递增为15%；
在20～30分钟，流动相A的体积由85%递减为70%，流动相B的体积由15%递增为30%；
在30～45分钟，流动相A的体积由70%递减为30%，流动性B的体积由30%递增为70%。
2.根据权利要求1所述的一种同时测定利奈唑胺中3种遗传毒杂质的检测方法，其特征在于：所述检测方法的具体操作步骤为：
S1.供试品溶液：取利奈唑胺，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成溶液A；
S2.对照品溶液：取杂质K、杂质L和杂质M对照品，分别精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成溶液B、C和D；
S3.系统适用性溶液：取利奈唑胺与杂质K、杂质L、杂质M，分别精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成溶液E；
S4.调节仪器：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A，流动相B，调节柱温，调节流动相流速，调节检测波长，采用梯度洗脱；
S5.测定：精密量取S1～S4制成的各溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
3.根据权利要求2所述的一种同时测定利奈唑胺中3种遗传毒杂质的检测方法，其特征在于：所述S1中溶液A的浓度为1.8～2.2mg/ml。
4.根据权利要求2所述的一种同时测定利奈唑胺中3种遗传毒杂质的检测方法，其特征在于：所述S2中溶液B、C和D的浓度均为0.025～0.035μg/ml。
5.根据权利要求2所述的一种同时测定利奈唑胺中3种遗传毒杂质的检测方法，其特征在于：所述S3中溶液E每1ml中含杂质K、杂质L和杂质M各0.03µg含利奈唑胺2mg。
6.根据权利要求2所述的一种同时测定利奈唑胺中3种遗传毒杂质的检测方法，其特征在于：所述S1～S3中溶剂为10%乙腈。
7.根据权利要求2所述的一种同时测定利奈唑胺中3种遗传毒杂质的检测方法，其特征在于：所述S4中色谱柱的规格为150×4.6mm，5μm。
8.根据权利要求2所述的一种同时测定利奈唑胺中3种遗传毒杂质的检测方法，其特征在于：所述S5中取溶液100µl，注入液相色谱仪测量。
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