CN114920782B - 一种具有hpv阳转阴及抑菌功能的钌多吡啶配合物及其制备方法和应用 - Google Patents
一种具有hpv阳转阴及抑菌功能的钌多吡啶配合物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种具有HPV阳转阴及抑菌功能的钌多吡啶配合物及其制备方法和应用。该配合物由于其包含金属离子，带有电荷，相较于传统有机小分子而言，增强了其穿透细菌细胞膜的能力以及滞留效应，并且金属配合物的多配位构型使其可以进行不同配体的修饰，从而使其生物活性更高。经试验证明，本发明的具有HPV阳转阴功能的钌多吡啶配合物可以有效的抑制HPV病毒，实现HPV病毒感染阳转阴。并且能有效的抑制金黄色葡萄球菌的生长，没有诱导金黄色葡萄球菌的耐药性倾向。由此可见，本发明提供的具有HPV阳转阴及抑菌功能的钌多吡啶配合物在抑制病毒以及抑菌方面有一定的潜力。
Description
技术领域
本发明属于抗菌抗病毒医药技术领域，具体涉及一种具有HPV阳转阴及抑菌功能的钌多吡啶配合物及其制备方法和应用。
背景技术
目前学术界已经公认HPV感染是导致宫颈癌发生最主要的因素。HPV16病毒作为高危型致癌病毒，在宫颈癌的发生中其重要作用。永生化宫颈上皮细胞（H8细胞）是中国妇女正常宫颈上皮细胞在体外转染了HPV16E6、E7基因后转变成的永生化细胞株，因此H8细胞作为一种癌前状态的细胞对药物在对HPV16病毒的作用及对研发相应的抗HPV病毒制剂和预防、治疗宫颈癌具有重要的意义。
金黄色葡萄球菌(S.aureus)是临床上感染性疾病最常见的一种病原菌，可引起皮肤软组织、血液系统和下呼吸道等多个部位的感染，从而导致一系列疾病，例如心包炎、伪膜性肠炎、肺炎和败血症等。而近年来，由于耐药性菌株如耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)的出现，其对许多抗生素具有严重的抗药性，从而导致该类感染的治疗越发艰难。
细菌耐药性(Resistance to Drug )又称抗药性，系指细菌对于抗菌药物作用的耐受性，耐药性一旦产生，药物的化疗作用就明显下降。耐药性根据其发生原因可分为获得耐药性和天然耐药性。自然界中的病原体，如细菌的某一株也可存在天然耐药性。当长期应用抗生素时，占多数的敏感菌株不断被杀灭，耐药菌株就大量繁殖，代替敏感菌株，而使细菌对该种药物的耐药率不断升高。目前认为后一种方式是产生耐药菌的主要原因。为了保持抗生素的有效性，应重视其合理使用。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种具有HPV阳转阴及抑菌功能的钌多吡啶配合物及其制备方法，具体采用以下的技术方案：
一种具有HPV阳转阴及抑菌功能的钌多吡啶配合物，所述配合物具有式I所示的结构：
其中，选自以下任一结构：
。
优选地，所述配合物具有Ru-1、Ru-2或Ru-3所示的结构：
；
；
。
本发明的具有HPV阳转阴功能的钌多吡啶配合物可以靶向识别HPV病毒的DNA，在识别到HPV病毒的DNA之后，可以通过特定的作用机制，破坏病毒的DNA，从而达到抑制HPV病毒感染。钌多吡啶配合物包含金属离子，带有电荷，而带正电的有机分子链与细菌细胞膜表面的阴离子相结合，从而破坏了微生物的细胞膜组成，使细胞内物质泄露，导致菌体死亡。由于其包含金属离子，带有电荷，相较于传统有机小分子而言，增强了其穿透细菌细胞膜的能力以及滞留效应，并且金属配合物的多配位构型使其可以进行不同配体的修饰，从而使其生物活性更高。经实验证明，本发明的具有HPV阳转阴功能的钌多吡啶配合物对HPV16的抑制HC50为282.9nm，在浓度为0.5 μg/mL时对HPV16细胞H8的抑制率约为58.32%。在3.0-25.0 μg/mL能有效的抑制金黄色葡萄球菌的生长，没有诱导金黄色葡萄球菌的耐药性倾向；并且，与具有同一母核的对比例配合物相比，其抗金黄色葡萄球菌性能更佳。
本发明还提供了上述钌多吡啶配合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）在氩气条件下，将式Ⅰ-a结构的化合物与式Ⅰ-b结构的化合物在乙腈中加热回流，冷却至室温后，萃取分离，合并有机相，减压蒸发溶剂得到粗产物，提纯，得到式Ⅰ-c结构的中间体；
（2）将式Ⅰ-c结构的中间体、式Ⅰ-d结构的化合物于乙醇溶剂中加热回流反应，待反应完全后，用水稀释并用浓氨水中和，离心干燥，提纯，得到式Ⅰ-e结构的主配体；
（3）式Ⅰ-e结构的主配体与式Ⅰ-f结构的化合物、式Ⅰ-g结构的化合物或式Ⅰ-h结构的化合物进行反应，提纯，得到式Ⅰ所示的钌多吡啶配合物；
。
其中，所述步骤（1）中，式Ⅰ-a结构的化合物与式Ⅰ-b结构的化合物的摩尔比为1:6。所述步骤（2）中的提纯是在硅胶层析柱上用乙腈/硝酸钾水溶液=2：1的洗脱剂洗脱提纯；所述步骤（4）中的提纯是在硅胶层析柱上用乙醇/水=3：1的洗脱剂洗脱提纯。
上述的多吡啶钌配合物能够用于制备抑制HPV16型病毒药物和抑制金黄色葡萄球菌药物中。
本发明的有益效果为：本发明的具有HPV阳转阴功能的钌多吡啶配合物可以靶向识别HPV病毒的DNA，从而达到抑制HPV病毒感染的作用。由于其包含金属离子，带有电荷，相较于传统有机小分子而言，增强了其穿透细菌细胞膜的能力以及滞留效应，并且金属配合物的多配位构型使其可以进行不同配体的修饰，从而使其生物活性更高。经实验证明，本发明的具有HPV阳转阴功能的钌多吡啶配合物对HPV16的抑制HC50为282.9nm，在浓度为0.5 μg/mL时对HPV16细胞H8的抑制率约为58.32%。在3.0-25.0 μg/mL能有效的抑制金黄色葡萄球菌的生长，没有诱导金黄色葡萄球菌的耐药性倾向；并且，与具有同一母核的对比例配合物相比，其抗金黄色葡萄球菌性能更佳。由此可见，本发明提供的具有HPV阳转阴及抑菌功能的钌多吡啶配合物在抑制病毒以及抑菌方面有一定的潜力。
附图说明
图1所示为本发明配合物的反应路线图；
图2所示为本发明配合物Ru-3各组别浓度与抑制率拟合曲线的结果；
图3所示为本发明配合物Ru-3处理H8细胞后的细胞凋亡检测图；
图4所示为本发明配合物Ru-1～Ru-3对金黄色葡萄球菌的MIC测定图；
图5所示为本发明配合物Ru-3与对比例对金黄色葡萄球菌的MIC差异性对比；
图6所示为本发明配合物Ru-3不诱导金黄色葡萄球菌产生耐药性的实验。
具体实施方式
以下将结合实施例和附图对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地理解本发明的目的、方案和效果。
实施例1：
（1）制备中间体式Ⅰ-c：
将4-（4-溴丁氧基）苯甲醛（0.35 g，1.36 mmol），吗啉（0.532 mL ，6.12 mmol），KI（22.6 mg，0.14 mmol），K2CO3（0.752 g，5.44 mmol）在CH3CN（24 mL）中充分混合，在氩气条件下加热至90 ℃，回流所得混合物，通过薄层色谱检测反应过程，直至TLC显示不存在原料（约6 h）。冷却至室温后，将混合物用水/乙酸乙酯（20 mL/20 mL）萃取，合并有机相，减压蒸发溶剂得到粗产物。粗产物通过柱色谱法纯化（石油醚：乙酸乙酯＝1：1作为洗脱剂），得到所需的中间体。产率：78.4％。
（2）制备配体BPM：
将1,10-邻菲罗啉-5,6-二酮（0.176 g，0.836 mmol），中间体式Ⅰ-c（0.2 g，0.76mmol）、乙酸铵（1.17 g，15.2 mmol）的混合物在乙醇（15 mL）溶剂里加热回流10小时。将冷却的溶液用水稀释并用浓氨水中和。将溶剂用KPF6代替，洗涤并离心3次。然后干燥，得到粗产物，收集棕色沉淀物，并在硅胶上通过柱色谱法纯化，用[乙腈/水（硝酸钾）=2：1]作为洗脱剂，得到化合物，为棕黄色粉末。产率：82.22％。
（3）制备配合物Ru-1：
在氩气条件下，将cis-[Ru(bpy)2Cl2]（54.1 mg，0.1 mmol）和配体BMP（45.4 mg，0.1 mmol）的混合物于（乙醇/水=3：1）在85 ℃下加热24 h。冷却后，通过加入KPF6固体获得红棕色沉淀。减压蒸发溶剂，得到粗产物。将粗产物通过硅胶上的柱色谱法纯化，用二氯甲烷-甲醇的混合物（20：1，v/v）作为洗脱剂。再次添加KPF6溶液，获得红棕色沉淀。产率：43.4％。
（4）制备配合物Ru-2：
在氩气条件下，将cis-[Ru(dmbpy)2Cl2]（60.4 mg，0.1 mmol）和配体BMP（45.4 mg，0.1 mmol）的混合物于（乙醇/水=3：1）在85 ℃下加热24 h。冷却后，通过加入KPF6固体获得红棕色沉淀。减压蒸发溶剂，得到粗产物。将粗产物通过硅胶上的柱色谱法纯化，用二氯甲烷-甲醇的混合物（20：1，v/v）作为洗脱剂。再次添加KPF6溶液，获得红棕色沉淀。产率：46.5％。
（5）制备配合物Ru-3：
在氩气条件下，将cis-[Ru(dibpy)2Cl2]（70.9 mg，0.1 mmol）和配体BMP（45.4 mg，0.1 mmol）的混合物于（乙醇/水=3：1）在85 ℃下加热24 h。冷却后，通过加入KPF6固体获得红棕色沉淀。减压蒸发溶剂，得到粗产物。将粗产物通过硅胶上的柱色谱法纯化，用二氯甲烷-甲醇的混合物（20：1，v/v）作为洗脱剂。再次添加KPF6溶液，获得红棕色沉淀。产率：38.6％。
上述反应的反应路线如图1所示。
实施例2：
将一种具有对羟基苯的钌多吡啶配合物作为对比例，所属配合物结构如下：
体外抑制HPV16病毒实验
（1）永生化人宫颈上皮细胞HPV16E6基因抑制实验：将H8细胞取出在37 ℃恒温水浴中融化，平铺于培养瓶中，在37 ℃条件下培养24 h，传代培养。将细胞培养瓶中培养液倒出，并加入10 mL无菌 PBS 洗涤培养瓶两次；加入0.25%胰蛋白酶溶液1 mL与培养瓶中，平铺均匀，置于细胞培养箱中5% CO2、37 ℃条件下孵育10 min，倒置相差显微镜观察消化是否完全；加入5 mL完全培养基终止消化，然后置于15 mL无菌离心管中，离心机离心1500rpm，5 min，弃上清；5 mL 无菌 PBS 洗涤细胞2次，每次洗涤完后，离心机离心1500 rpm，5min，弃上清；加入3 mL 细胞稀释液，使用cell counter计数，计数3次取均值。用MTT法检测细胞活力，0.25%的胰酶消化对数期细胞，加少量血清终止反应，1500 r/min，离心5min，弃上清；将细胞沉淀用培养基吹打混匀，制成细胞悬液，细胞计数后调整其浓度至5*10^4 个/mL；将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入200 μL 细胞悬液；5% CO2、37 ℃培养箱继续培养，待细胞单层铺满孔底，加入浓度梯度的药物。按照药物作用时间点24 h取出96孔板检测：同时设置调零孔（培养基），空白对照孔（培养基、相同浓度药物溶媒），细胞对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质）。
由图2的拟合曲线结果可知，Ru-3具有明显的增殖抑制结果，抑制结果呈浓度依赖性，即浓度越高抑制率越高，其半数抑制浓度（EC50）为282.9 nM。
（2）细胞凋亡检测：调整细胞浓度为1×10^6 个/mL，分别加入含终浓度均为0.5 µg/mL 的药物，对照组加入等体积的培养液；培养48 h后，收集细胞，PBS洗涤2次，结合缓冲液重新悬浮细胞，加入FITC-Annexin V/PI，避光处理30 min后用流式细胞仪检测；正常细胞为Annexin V-P-，早期凋亡细胞为 Annexin V+P-，晚期凋亡细胞为 Annexin V+P+。
图3中结果显示，用0.5 μg/mL的待测药物Ru-3处理H8细胞48 h后，采用AnnexinV-FITC法检测其诱导细胞凋亡率发现，对照组细（DMSO对照组）细胞的凋亡率为3.45%，而实验待测药物 Ru-3组细胞凋亡率明显高于对照组（DMSO组），为 58.32%。
体外抗菌活性试验
（1）微量二倍稀释法测定MIC：将金黄色葡萄球菌Newman菌株在TSB培养基中培养直至OD600达到1。用新鲜的TSB培养基将细菌细胞数稀释至大约5×106CFU/mL（OD600=0.05）。随后，将50 µL不同浓度的钌配合物添加到200 µL的细菌悬液中。此时每孔的最终药物浓度从左到右依次为：200，100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.56，0.78，0.39 µg/mL；将混合物放入96孔板中，并在37 ℃下进一步孵育20小时后，观察结果。观察孔板的浑浊情况，其中澄清的给药孔所对应的最低药物浓度即为MIC(最低抑菌浓度)。
图4中，通过观察孔板的浑浊程度来判断配合物Ru-1～Ru-3对金黄色葡萄球菌的抑菌效果，其中澄清的给药孔所对应的最低药物浓度即为MIC（最低抑菌浓度）。试验结果表明，Ru-1、Ru-2抑菌活性较差，而Ru-3表现出明显抑菌活性，且其对金黄色葡萄球菌的MIC＝3.125 µg/mL，说明Ru-3具有一定的抗菌活性。
图5中通过观察孔板的浑浊程度来判断配合物Ru-3与对比例对金黄色葡萄球菌的抑菌效果，其中澄清的给药孔所对应的最低药物浓度即为MIC（最低抑菌浓度）。试验结果表明，对比例的抗菌活性较差，而Ru-3表现出明显抑菌活性，且其对金黄色葡萄球菌的MIC＝3.125 µg/mL，说明Ru-3具有一定的抗菌活性且抗菌活性比具有相同叔丁基母核的三乙胺修饰配合物更佳。
（2）不诱导细菌产生耐药性的作用通过耐药实验测定：将金黄色葡萄球菌Newman菌株在TSB培养基中培养直至OD600达到1。用新鲜的TSB培养基将细菌细胞数稀释至大约5×106CFU/mL（OD600=0.05）。随后，将50 µL不同浓度的钌配合物添加到200 µL的细菌悬液中。此时每孔的最终药物浓度从左到右依次为：200，100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.56，0.78，0.39 µg/mL；将混合物放入96孔板中，并在37 ℃下进一步孵育24小时后，观察结果。观察孔板的浑浊情况，其中澄清的给药孔所对应的最低药物浓度即为MIC(最低抑菌浓度)。取24小时后未受到药物抑制的细菌37 ℃培养5小时，用培养的耐药菌重复最低抑菌浓度的测定，连续重复培养25天，记录药物对于耐药菌MIC（最低抑菌浓度）的变化。
图6中，通过观察孔板的浑浊程度来判断配合物Ru-3以及配体BMP对抗金黄色葡萄球菌的耐药数据图。试验结果表明，配合物Ru-3连续25天MIC（最低抑菌浓度）的变化较小，表明其不诱导金黄色葡萄球菌产生耐药性。而配体BMP连续25天测定的MIC（最低抑菌浓度）变化比较大，不能抵抗细菌的耐药性。
以上所述，只是本发明的较佳实施例而已，本发明并不局限于上述实施方式，只要其以相同的手段达到本发明的技术效果，都应属于本发明的保护范围。在本发明的保护范围内其技术方案和/或实施方式可以有各种不同的修改和变化。
Claims (6)
1.一种具有HPV阳转阴及抑菌功能的钌多吡啶配合物，其特征在于，所述配合物的阳离子部分具有式I所示的结构：
其中，选自以下任一结构：
。
2.一种权利要求1所述的钌多吡啶配合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）在氩气条件下，将式Ⅰ-a结构的化合物与式Ⅰ-b结构的化合物在乙腈中加热回流，冷却至室温后，萃取分离，合并有机相，减压蒸发溶剂得到粗产物，提纯，得到式Ⅰ-c结构的中间体；
（2）将式Ⅰ-c结构的中间体、式Ⅰ-d结构的化合物于乙醇溶剂中加热回流反应，待反应完全后，用水稀释并用浓氨水中和，离心干燥，提纯，得到式Ⅰ-e结构的主配体；
（3）式Ⅰ-e结构的主配体与式Ⅰ-f结构的化合物、式Ⅰ-g结构的化合物或式Ⅰ-h结构的化合物进行反应，提纯，得到钌多吡啶配合物；
。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，式Ⅰ-a结构的化合物与式Ⅰ-b结构的化合物的摩尔比为1：6。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中的提纯是在硅胶层析柱上用乙腈/硝酸钾水溶液=2：1的洗脱剂洗脱提纯。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中的提纯是在硅胶层析柱上用二氯甲烷/甲醇=20：1的洗脱剂进行洗脱提纯。
6.权利要求1所述的钌多吡啶配合物在制备抑制HPV16型病毒药物中的应用。
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