CN107007604B - 一种哌啶-溴酚-吲哚酮杂合体化合物在抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种哌啶‑溴酚‑吲哚酮杂合体(3‑(3‑溴‑5‑甲氧基‑4‑(2‑(哌啶‑1‑基)乙氧基)苯亚甲基)‑N‑(4‑溴苯基)‑2‑氧化吲哚啉‑5‑磺胺)在制备抗肿瘤药中的应用，特别是在制备抗肺癌药物中的应用。本发明经细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期和分子生物学等实验证明所发明化合物可有效抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，并影响肿瘤细胞周期，并对与肿瘤凋亡有关的蛋白有明显影响，具有显著的抗肿瘤活性。本发明为研制新型抗肿瘤药物提供了依据，具有很好的临床运用前景。所述哌啶‑溴酚‑吲哚酮杂合体可以作为药物有效成分，加以药物学上可接受的载体，制备抗肿瘤的药物组合物。

Description

一种哌啶-溴酚-吲哚酮杂合体化合物在抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于药物技术领域，具体地说，涉及哌啶-溴酚-吲哚酮杂合体(I)其药理活性和药学用途。该化合物可以用于预防和/或治疗各种因素引起的肿瘤或癌症等疾病。

背景技术

世界上恶性肿瘤的发生率继续呈上升趋势，世界卫生组织统计全球每年的癌症新发病率例达到1千万例，有700万例癌症死亡。癌症已经成为威胁人类生命健康的主要疾病之一。自2008年以来。肺癌取代肝癌成为我国死亡人数最多的恶性肿瘤，目前，我国每4例肿瘤死亡患者中就有1例是肺癌患者。随着环境污染日趋严重、人口老龄化加重、吸烟人数居高不下，我国的肺癌发病率和死亡率呈明显的上升趋势。

由于肿瘤的危险因素多样且缺乏有效的早期诊断手段，使得肿瘤的发病率居高不下。肿瘤严重威胁着人们的身体健康，同时给家庭和社会带来沉重的负担。手术是目前常用的治疗肿瘤的方式，但这种局部治疗不能防止肿瘤的复发和转移，仍需配合化学治疗，但是目前临床上可用的安全、低毒、有效的抗肿瘤药物非常少。因此，寻找高效、低毒、可选择性杀伤或抑制肿瘤细胞的新作用机制的新型抗肿瘤药物已成为抗肿瘤药物研发的重要方向。

海洋来源溴酚类化合物主要是指从海洋真菌、海藻、海绵、海鞘和苔藓虫等海洋动植物和微生物中分离得到的分子结构中含有一个或多个羟基和溴原子取代苯环的化合物，是海洋来源独具特色的一类化合物。目前对溴酚类化合物的活性筛选已经较为深入，获得了大量在抗氧化、抗菌、抗肿瘤、抗血栓、降血糖、生物拒食等方面具有良好生物活性的先导化合物[Mar.Drugs 2011,9(7),1273-1292；Bioorganic Chem.2015,60,49-57；Eur.J.Med.Chem.,2012,54,423-428.]。该类化合物在抗肿瘤活性方面潜在的应用开发价值也已经引起国内外研究者们的极大兴趣。

本发明涉及哌啶-溴酚-吲哚酮杂合体(I)在药物领域中的应用，现有技术中没有本发明提供的哌啶-溴酚-吲哚酮杂合体(I)及其作为有效成分的药物的报道，也没有该化合物物或其药物组合物应用在制备或治疗各种因素引起的肿瘤等疾病药物中的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供3-(3-溴-5-甲氧基-4-(2-(哌啶-1-基)乙氧基)苯亚甲基)-N-(4-溴苯基)-2-氧化吲哚啉-5-磺胺(I)药用用途，具体涉及在制备抗肿瘤药物中的应用；

本发明所采用的3-(3-溴-5-甲氧基-4-(2-(哌啶-1-基)乙氧基)苯亚甲基)-N-(4-溴苯基)-2-氧化吲哚啉-5-磺胺(I)是本实验室化学合成所得，其化学结构式如下：

本发明将上述3-(3-溴-5-甲氧基-4-(2-(哌啶-1-基)乙氧基)苯亚甲基)-N-(4-溴苯基)-2-氧化吲哚啉-5-磺胺(I)进行了抗肿瘤细胞增殖活性实验、诱导肿瘤细胞凋亡实验、影响肿瘤细胞周期和蛋白免疫印迹(Western Blot)实验，实验结果表明，所述的3-(3-溴-5-甲氧基-4-(2-(哌啶-1-基)乙氧基)苯亚甲基)-N-(4-溴苯基)-2-氧化吲哚啉-5-磺胺(I)可显著抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡并能影响肿瘤细胞周期，并诱导凋亡相关蛋白的表达，具有显著抗肿瘤活性。

所述的3-(3-溴-5-甲氧基-4-(2-(哌啶-1-基)乙氧基)苯亚甲基)-N-(4-溴苯基)-2-氧化吲哚啉-5-磺胺(I)可以作为药物有效成分，加以药学上可接受的载体，制备抗肿瘤药物组合物。尤其用于制备抗肿瘤有关疾病的药物。

所述哌啶-溴酚-吲哚酮杂合体、哌啶-溴酚-吲哚酮杂合体化合物的药物学上可接受的盐及哌啶-溴酚-吲哚酮杂合体化合物的化学等价物中的一种或二种以上可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。所述药物组合物含有0.1–99％，优选为0.5–90％的所述哌啶-溴酚-吲哚酮杂合体化合物、哌啶-溴酚-吲哚酮杂合体化合物的药物学上可接受的盐及哌啶-溴酚-吲哚酮杂合体化合物的化学等价物中的一种或二种以上，其余为药物学上可接受的药用载体和/或赋形剂。

本发明具有如下优点：

本发明经抗肿瘤活性实验证明化合物可显著抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，影响肿瘤细胞周期，显著影响凋亡相关蛋白的表达。具有显著抗肿瘤活性。

附图说明

图1为3-(3-溴-5-甲氧基-4-(2-(哌啶-1-基)乙氧基)苯亚甲基)-N-(4-溴苯基)-2-氧化吲哚啉-5-磺胺(I)对肺癌细胞A549抑制作用图。

图2为3-(3-溴-5-甲氧基-4-(2-(哌啶-1-基)乙氧基)苯亚甲基)-N-(4-溴苯基)-2-氧化吲哚啉-5-磺胺(I)对肺癌细胞A549凋亡作用图。

图3为3-(3-溴-5-甲氧基-4-(2-(哌啶-1-基)乙氧基)苯亚甲基)-N-(4-溴苯基)-2-氧化吲哚啉-5-磺胺(I)对肺癌细胞A549凋亡作用形态学检测图。

图4为3-(3-溴-5-甲氧基-4-(2-(哌啶-1-基)乙氧基)苯亚甲基)-N-(4-溴苯基)-2-氧化吲哚啉-5-磺胺(I)对肺癌细胞A549细胞周期的影响图。

图5为3-(3-溴-5-甲氧基-4-(2-(哌啶-1-基)乙氧基)苯亚甲基)-N-(4-溴苯基)-2-氧化吲哚啉-5-磺胺(I)对肺癌细胞A549凋亡蛋白的影响

具体实施方式

实施例1 3-(3-溴-5-甲氧基-4-(2-(哌啶-1-基)乙氧基)苯亚甲基)-N-(4-溴苯基)-2-氧化吲哚啉-5-磺胺(I)对细胞增值活性的研究

1.实验药品

3-(3-溴-5-甲氧基-4-(2-(哌啶-1-基)乙氧基)苯亚甲基)-N-(4-溴苯基)-2-氧化吲哚啉-5-磺胺(I)由本实验室合成制备：将10毫升氯磺酸小心加入到50毫升三颈瓶中，在冰浴下加入2-吲哚酮10毫摩，室温搅拌后，65摄氏度反应1小时，冷却至室温，加入到冰水中，过滤干燥得到粉红色中间体；取1.15克中间体溶于50毫升四氢呋喃中，然后加入4-溴苯胺1.8克，加热到80摄氏度反应3小时，减压蒸除去THF，向残余固体中加PH＝3的25毫升稀盐酸，搅拌，抽滤得粉红色固体；然后将其溶于50毫升无水乙醇中，再加入3-溴-5-甲氧基-4-(2-(哌啶-1-基)乙氧基)苯苯甲醛5毫摩尔，滴加100微升哌啶为催化剂，回流反应3小时，冷却，过滤，水洗沉淀并真空干燥得淡黄色固体。采用DMSO助溶，配置成20mg/ml储存液长期保存，实验用最大浓度为5，10，20μg/ml。

2.细胞株

人非小细胞肺癌细胞(A549)购自中国科学院上海细胞库。用含质量浓度10％肽牛血清的DMEM培养基在37℃、体积分数为5％CO₂、完全饱和湿度条件下空气中常规培养，48h更换培养基，细胞生长达饱和状态时，用0.25％胰蛋白酶消化传代，2-3d传代1次，实验选用对数生长期细胞。

3.细胞活性检测

采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测化合物(I)对肺癌细胞A549细胞增值活性的影响。取对数期的肺癌细胞A549，胰酶消化重悬，调整细胞浓度为5×10⁴/mL，以100μL/孔接种96孔板，贴壁生长24h后，吸弃培养基，加入不同浓度浓度的化合物(I)(5,10,20μg/mL)，每个浓度设置三个复孔，并设定相应浓度的PBS溶媒对照及无细胞调零组。细胞在37℃、5％CO₂条件下培养48h，然后加入20μL，5mg/mL的MTT，于37℃、5％CO₂条件下孵育4h，吸弃上清，每孔加入150μL DMSO，震荡10分钟，酶标仪490nm波长下检测OD值。并计算细胞抑制率和半数抑制浓度(IC50)。

结果显示：化合物(I)对A549细胞具有较强的增殖抑制作用，其IC50为3.24μg/ml。细胞增殖抑制活性见下图1。

实施例2 3-(3-溴-5-甲氧基-4-(2-(哌啶-1-基)乙氧基)苯亚甲基)-N-(4-溴苯基)-2-氧化吲哚啉-5-磺胺(I)对A549凋亡的研究

1.实验细胞：

同实施例1

2.实验药物：

同实施例1

3.实验方法：

细胞凋亡检测采用AnnexinV/PI染色法。取对数期A549细胞，调整细胞浓度为5×10⁵/mL，接种于六孔板，于37℃，5％CO₂培养箱中培养24h，加入不同浓度浓度的化合物(I)(5,10,20μg/mL)，作用48h，同时设定空白组(PBS)。细胞用不含EDTA的胰酶消化，PBS洗涤三次，收集1～5×10⁵细胞，加入500μL的Binding Buffer悬浮细胞成细胞悬液后加入5μLAnnexin V-FITC和5μL Propidium Iodide，混匀后室温避光反应15min，于流式细胞仪进行检测。

结果显示，化合物(I)可诱导A549细胞发生凋亡，高浓度组凋亡比例可达68.9％，其促凋亡作用呈剂量依赖性，其抑制活性见下图2。

实施例3 3-(3-溴-5-甲氧基-4-(2-(哌啶-1-基)乙氧基)苯亚甲基)-N-(4-溴苯基)-2-氧化吲哚啉-5-磺胺(I)对A549凋亡形态学研究

1.实验细胞：

同实施例1

2.实验药物：

同实施例1

3.实验方法：

对细胞凋亡的形态学检测采用Hoechst染色法。取对数期A549细胞，调整细胞浓度为5×10⁵/mL，接种于六孔板，于37℃，5％CO₂培养箱中培养24h后，加入不同浓度浓度的化合物(I)(5,10,20μg/mL)，作用48h，同时设定空白组(PBS)。细胞用PBS洗涤三次，4％多聚甲醛室温固定15min，PBS洗涤三次后加入Hoechst 33258染料避光染色15min后与荧光显微镜下进行观察。

结果显示，化合物(I)作用于A549细胞后，细胞出现明显的凋亡特征，如出现明显的固缩及小片段，其形态学观察见下图3。

实施例4 3-(3-溴-5-甲氧基-4-(2-(哌啶-1-基)乙氧基)苯亚甲基)-N-(4-溴苯基)-2-氧化吲哚啉-5-磺胺(I)对A549细胞周期的研究

1.实验细胞：

同实施例1

2.实验药物：

同实施例1

3.实验方法：

对细胞周期的分析采用PI单染的方法。取对数期A549细胞，调整细胞浓度为5×10⁵/mL，接种于六孔板，于37℃，5％CO₂培养箱中培养24h后，加入不同浓度浓度的化合物(I)(5,10,20μg/mL)，作用48h，同时设定空白组(PBS)。离心收集细胞，PBS洗涤两次，细胞用75％的冷乙醇重悬并置于-20℃过夜。细胞离心并用PBS洗涤两次，用PBS重悬细胞加入20μg/mL的RNase A于37℃孵育30min，然后细胞加入50μg/mL的PI室温避光孵育30min后于流式细胞仪进行检测。

结果显示，化合物(I)可诱导A549细胞发生G1期周期阻滞，其对A549周期阻滞见下图4。

实施例5 3-(3-溴-5-甲氧基-4-(2-(哌啶-1-基)乙氧基)苯亚甲基)-N-(4-溴苯基)-2-氧化吲哚啉-5-磺胺(I)对A549凋亡蛋白的研究

1.实验细胞：

同实施例1

2.实验药物：

同实施例1

3.实验方法：

取对数期A549细胞调整细胞浓度为5×10⁵/mL，接种于六孔板，于37℃，5％CO₂培养箱中培养24h后，加入不同浓度浓度的化合物(I)(5,10,20μg/mL)，作用48h，同时设定空白组(PBS)，用RIPA强裂解液提取各组细胞总蛋白。SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳(浓缩胶80V，分离胶120V)及转膜，转移蛋白至PVDF膜，将PVDF膜浸润在含5％脱脂奶粉的TBST中封闭1h，加入特异性一抗PARP,Bcl-2,Bax,caspase-3(1:1000)。4℃过夜，TBST缓冲液洗膜3次，加入HRP标记的二抗(1:10000)室温孵育1h，TBST缓冲液洗膜3次，最后用ECL显色，X感光片感光后，显影定影。β-actin作为内参蛋白。

结果显示，化合物(I)刺激A549细胞后，诱导Bax蛋白表达上调而下调Bcl-2的表达，同时激活PARP和caspase-3。结果见图5。

对比实施例3-(3-溴-5-甲氧基-4-(2-(哌啶-1-基)丁氧基)苯亚甲基)-N-(4-溴苯基)-2-氧化吲哚啉-5-磺胺对肿瘤细胞A549增殖活性的研究

1.实验细胞：

同实施例1

2.实验药物：

合成方法同实施例1

3.实验方法：

同实施例1

实验结果显示化合物3-(3-溴-5-甲氧基-4-(2-(哌啶-1-基)丁氧基)苯亚甲基)-N-(4-溴苯基)-2-氧化吲哚啉-5-磺胺对肿瘤细胞A549增殖抑制IC₅₀值大于50μg/ml。

Claims (4)

1.一种哌啶-溴酚-吲哚酮杂合体化合物或哌啶-溴酚-吲哚酮杂合体化合物的药物学上可接受的盐在制备抗肺癌药物中的应用，其特征在于：

所述哌啶-溴酚-吲哚酮杂合体化合物为3-(3-溴-5-甲氧基-4-(2-(哌啶-1-基)乙氧基)苯亚甲基)-N-(4-溴苯基)-2-氧化吲哚啉-5-磺胺；所述哌啶-溴酚-吲哚酮杂合体化合物为具有如下化学结构式，

2.按照权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述哌啶-溴酚-吲哚酮杂合体或哌啶-溴酚-吲哚酮杂合体化合物的药物学上可接受的盐以药物组合物的形式使用。

3.按照权利要求2所述的应用，其特征在于：

所述药物组合物含有0.1 – 99%的所述哌啶-溴酚-吲哚酮杂合体化合物或哌啶-溴酚-吲哚酮杂合体化合物的药物学上可接受的盐，其余为药物学上可接受的药用载体。

4.按照权利要求3所述的应用，其特征在于：

所述药物组合物含有0.5– 90%的所述哌啶-溴酚-吲哚酮杂合体化合物或哌啶-溴酚-吲哚酮杂合体化合物的药物学上可接受的盐，其余为药物学上可接受的药用载体。

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